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Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.
Dopamin-D2- und -D3-Rezeptorliganden als pharmakologische Werkzeuge und potenzielle Arzneistoffe
(2007)
Mit der Identifizierung der D2-ähnlichen Rezeptoren D2, D3 und D4 um das Jahr 1990 herum, begann die Erforschung deren physiologischer Bedeutung und die Suche nach selektiv bindenden Liganden. Die einzelnen Rezeptorsubtypen unterscheiden sich in ihrer Struktur, chromosomalen Lokalisation, Expressionsrate, anatomischen Verteilung und intrazellulären Signalweiterleitung. Verglichen mit D2-Rezeptoren sind D3-Rezeptoren insgesamt geringer an ihrer Zahl, weisen aber ein charakteristisches Verteilungsmuster im ZNS auf. Um eine vorwiegende Wirkung über D3-Rezeptoren hervorrufen zu können, ist eine Bindungsselektivität der Liganden gegenüber D2-Rezeptoren erforderlich, durch die die unterschiedliche Häufigkeit der beiden Rezeptorsubtypen wieder ausgeglichen wird. In einer richtungsweisenden Arbeit wurde 2003 die Rolle der D3-Rezeptoren in der Therapie des Morbus Parkinson und der Entstehung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien aufgezeigt. Neuste Untersuchungen geben valide Hinweise auf klinisch relevante neuroprotektive und neuroregenerative Effekte bei Behandlung der neurodegenerativen Erkrankung mit D3-Rezeptoragonisten. Das Rückfallrisiko ehemals Drogenabhängiger durch mit dem Suchtstoff in Zusammenhang gebrachte Umweltstimuli ist entscheidend mit dem gleichen Rezeptorsubtyp verbunden. Die mögliche Behandlung Drogenabhängiger mit D3-Rezeptorliganden wird gegenwärtig intensiv untersucht. Mangels geeigneter Tiermodelle bisher wenig erforscht ist die therapeutische Bedeutung der D3-Rezeptorliganden bei schizophrenen Erkrankungen.Möglicherweise liegt hier ein besonderes Potential in der Behandlung von Negativsymptomen. Der im Handel befindliche Arzneistoff Pramipexol (Sifrol®) diente als Leitstruktur für die Synthese zahlreicher Liganden an D2- und D3-Rezeptoren. Weitere Leitstrukturen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit identifiziert und variiert. In einem ersten Schritt wurde die Bedeutung der 2-Aminogruppe an der Thiazolstruktur des Pramipexols untersucht. Sollte diese entgegen der in der Literatur verbreiteten Ansicht für die Ligand-Rezeptorinteraktion entbehrlich sein, könnten Verbindungen mit höherer Lipophilie und damit optimierter ZNS-Gängigkeit geschaffen werden. Für das L-Etrabamin, einem 2-unsubstituierten Derivat des Pramipexols, wurde bereits 1978 in einem Patent eine dopaminerge Aktivität beschrieben. Entgegen der in der Literatur verbreiteten Auffassung konnten durch Austausch der Aminogruppe gegen verschiedene Substituenten affine Derivate des Pramipexols entwickelt werden. Darüber hinausgehende Veränderungen der Leitstruktur dienten dem Aufbau umfangreicher Struktur-Wirkungsbeziehungen. Die Entwicklung einer konvergenten Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung einer größeren Anzahl komplexer zusammengesetzter Etrabaminderivate. Die Umsetzung von Pramipexolderivaten zu den entsprechenden Diazoniumsalzen und anschließende Reduktion mit Hypophosphoriger Säure verbesserte die Verfügbarkeit von Etrabamin und seinen Derivaten gegenüber in der Literatur beschriebenen Synthesen. Das resultierende Etrabaminderivat konnte mit Aldehyden unter Verwendung komplexer Hydride reduktiv alkyliert werden. Die Aldehyde wurden entweder durch Acetalhydrolyse oder durch SWERN-Oxidation von Alkoholen erhalten. ....
Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine aggressive Krankheit des hämatopoetischen Systems. Die Gegenwart des Philadelphia - Chromosoms (Ph), das die Translokation t(9;22) kodiert, oder die t(4,11) definieren Hochrisiko - ALL - Patienten mit einer besonders schlechten Prognose (Hoelzer and Gokbuget 2000; Hoelzer et al. 2002; Hoelzer et al. 2002)]. Das Ph Chromosom führt je nach Bruchpunkt der Translokation zur Expression von p185(BCR-ABL) oder p210(BCR-ABL). Die Fusion der Abl-Tyrosin Kinase an Bcr führt zur konstitutiven Aktivierung der Abl-Kinase, die hauptsächlich für die Transformation der Zellen verantwortlich ist. Die Überlebensrate durch aktuelle zytostatische Therapien der Ph+ ALL liegt bei 0-10%, trotz initialer Komplettremission (CR) von 80%, die ähnlich hoch wie die von Ph– Patienten ist. Imatinib (GleevecTM, GlivecTM, früher STI571) ist ein spezifischer Inhibitor der Abl – Kinase mit hoher Effizienz für die Behandlung der Ph+ ALL. Trotz der effektiven Hemmung von BCR-ABL durch Imatinib kommt es beinahe immer zum Rezidiv. Dies verschlechtert weiter die Prognose (Donato et al. 2004). Die Entstehung von Mutationen ist die häufigste Ursache für Resistenz gegen Imatinib, Nilotinib und/oder Dasatinib - Therapie. In dieser Arbeit wurden alternative Therapiestrategien für die Behandlung der ALL untersucht. Dazu wurden zwei Ansätze gewählt, wobei 1.) Gene identifiziert wurden, die zur Imatinib – Resistenz führen, um der Resistenzentwicklung vorzubeugen oder die Resistenz zu überwinden. Weiterhin wurde 2.) versucht die aberrante Transkription leukämischer Zellen zu verhindern. Dazu wurde die Inhibition der Histon – Deazetylierung, die für die aberrante Remodellierung des Chromatins verantwortlich ist, untersucht. ...
Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen bestehend aus dem Amyloidbeta-Peptid (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der AD spielt. Mit Hilfe von dissoziierten Hirnzellen von NMRI, Thy1-APP-, P301L Tau- und JNK-Knockout-Mäusen wurden Veränderungen, verursacht durch genetisch, alters- und geschlechtsbedingten Risikofaktoren, auf die mitochondriale Funktion untersucht. Die Abeta-Belastung der untersuchten Thy1-APP Mäuse führte zu einer mitochondrialen Fehlfunktion durch intrazelluläres Abeta und damit zu einem Energiedefizit. Aß hemmte die Atmungskette, vor allem die COX-Aktivität, indem es an die COX-Untereinheit bindet und damit die Anlagerung von Cytochrom C verhindert. Eine zusätzliche Mutation wie PS1M146L verursacht eine größere und früher einsetzende Abeta-Akkumulation im Gehirn der Mäuse und führte zu größerer mitochondrialer Schädigung im Vergleich zu den APP transgenen Mäusen. Der Grad der Abeta-Schädigung ist auch von dem Aggregationszustand von Abeta abhängig. Eine Akkumulation von intra- und extrazellulären Oligomeren reicht aus, um das mitochondriale Membranpotential zu erniedrigen. Die Aß-Belastung nimmt im Alter zu und es bilden sich ab dem 6. Monat Amyloid-Plaques im Gehirn der Thy1-APP Mäuse aus, die zu einem veränderten Verhältnis von Bcl-xL und Bax in Richtung Bax führten. Bax und Bcl-2 sind an der Bildung der mitochondrialen Pore beteiligt. Durch die Öffnung der mitochondrialen Pore sinkt das mitochondriale Membranpotential und die ATP-Spiegel. Bax begünstigt zusätzlich die Freisetzung von Cytochrom C und Smac. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die geringen ATP-Spiegel und die Cytochrom C Freisetzung werden mit der Apoptose in Verbindung gebracht und erklären die erhöhte Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber oxidativem Stress. Desweiteren muss die JNK3 berücksichtigt werden. Sie ist der mitochondrialen Fehlfunktion vorgeschaltet und löst eine degenerative Apoptose aus. Abeta und Tau werden bei der Entstehung von AD miteinander in Verbindung gebracht. Dieser Synergismus führt zu einer mitochondrialen Fehlfunktion im Kortex der Mäuse. Aufgrund des unveränderten Transmembranpotentials der dissoziierten Hirnzellen im Gehirn der Thy1APP Mäuse ab dem 6. Monat scheinen nur die aggregierten Polypeptide für die Neurotoxizität bei der AD eine Rolle zu spielen. Die COX-Aktivität wurde im Alter ebenfalls wieder verbessert und stabilisierte dadurch die ATPSpiegel. Die P301L-Taumäuse entwickeln ebenfalls erst im Alter neurofibrilläre Bündel (NFT) durch die Akkumulation von hyperphosphorylierten Tau. Ab dem 2. Lebensjahr der Mäuse wurde ein starker signifikanter Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATPSpiegel beobachtet. Der Anstieg der ROS-Spiegel der zwei Jahre alten Mäuse führte direkt zu einer Reduzierung der Komplex-I-Aktivität. Für diese Neurotoxizität scheint die Bildung der NFT verantwortlich zu sein. Die Wirkung von Ginkgo-biloba-Extrakt (EGb 761) und Piracetam auf die mitochondriale Fehlfunktion in jungen und alten NMRI-Mäusen untersucht. Eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials und die Normalisierung der ATP-Spiegel konnte mit Hilfe von EGb 761 und Piracetam festgestellt werden. Besonders bei alten Mäusen konnte die schon angefangene mitochondriale Fehlfunktion fast komplett kompensiert werden. EGb 761 und Piracetam waren in der Lage nach zweiwöchiger Behandlung der APP transgenen Mäusen die löslichen Abeta-Spiegel im Gehirn signifikant zu senken. Durch diese Entlastung wurde die durch Abeta-verursachte Destabilisierung der mitochondrialen Membranen aufgehoben und die Mitochondrien vor oxidativen Schädigungen geschützt. Drei wichtige Angriffspunkte werden aufgrund der Daten für Piracetam vorgeschlagen: 1. die Senkung der Abeta-Spiegel im Gehirn, 2. die Stabilisierung der mitochondrialen Membranen und eine dadurch verbesserte Membranfluidität und 3. die Verbesserung der mitochondrialen Funktion vor altersbedingten Schädigungen. Die drei Punkte sind miteinander verknüpft, aufgrunddessen, dass Abeta die mitochondriale Membranen destabilisiert und dies zu einer mitochondrialen Fehlfunktion führen kann. Die neuroprotektiven Effekte von EGb 761 wurden durch 1. Senkung der Aß-Spiegel, 2. Mitochondrienmembranstabilisierende Wirkungen, 3. antioxidative Effekte, und 4. durch Modulation von Chloridkanälen hervorgerufen. In APP transgenen Mäusen wird trotz gleicher APP Expression in weiblichen Mäuse eine erhöhte Beta-Sekretasespaltung von APP mit verstärkter Bildung von C99 und Abeta (unlösliches und lösliches) im Vergleich zu den männlichen Tieren gebildet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass die erhöhten Abeta-Spiegel und der damit verbundene oxidative Stress in transgenen Mäusen zusätzlich die Mitochondrien der weiblichen Tiere besonders schädigen und die Atmungskette beeinträchtigen. Damit bestätigt sich, dass das Geschlecht ein weiterer Risikofaktor der AD ist. Daher unterstützen die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Befunde grundsätzlich die weitere Erforschung pharmakologischer Ansätze besonders von Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zur Verbesserung kognitiver Störungen als Therapie oder auch zur Prophylaxe der Alzheimer Krankheit. Der Schutz von EGb 761 und Piracetam auf die Mitochondrien vor oxidativem Stress kann daher zur Vorbeugung vor allgemeinen Alterungsprozessen dienen. Abeta und Tau spielen zusammen beim Untergang der Neurone eine große Rolle. Therapien, welche die Ablagerungen von Abeta im Gehirn verringern, sollten in einem frühen Stadium der Krankheit besonders wirksam sein. In einem späteren Stadium wären hingegen zusätzlich Medikamente nötig, die gegen die neurofibrilläre Bündel gerichtet sind. Damit ließe sich theoretisch der fortschreitende Zelluntergang bei Alzheimerpatienten zu mindestens verlangsamen.
P2X-Rezeptoren sind ligandengesteuerte Kationenkanäle, die durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Bisher wurden sieben Isoformen kloniert (P2X1-P2X7), die eine gemeinsame Topologie besitzen, bestehend aus intrazellulären N- und C-Termini, zwei Transmembranregionen und einer großen Ektodomäne. Um funktionelle Ionenkanäle ausbilden zu können, müssen P2X-Untereinheiten in Homo- oder Heterotrimere assemblieren. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit war das Identifizieren von Proteindomänen, die zu der Trimerisierung von P2X-Untereinheiten beitragen. Hierzu diente in erster Linie die humane P2X5- (hP2X5-) Untereinheit, der durch Herausspleißen von Exon 10 eine Region fehlt, die in der Literatur als eventuell wichtig für die Assemblierung beschrieben wird. Exon 10 kodiert 22 Aminosäuren, die in der distalen Ektodomäne und der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion liegen. Das Fehlen dieser Aminosäuren führt zu Untereinheiten, die nicht in der Lage sind, zu trimerisieren und funktionelle Ionenkanäle auszubilden. Durch das schrittweise Einsetzen der von Exon 10 kodierten Aminosäuren in die hP2X5-Untereinheit sowie die Expression verschiedener Alanin-Mutanten mit nachfolgender Analyse durch Blaue-Native-PAGE konnte gezeigt werden, dass das fehlerhafte Assemblierungsverhalten der hP2X5-Untereinheit in erster Linie durch das Fehlen der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion bewirkt wird. Zusätzliche gezielte Mutationen und die Konstruktion von Deletionsmutanten ergaben weiterhin, dass die zweite Transmembranregion vornehmlich als hydrophober Membrananker dient, um die korrekte Topologie und Positionierung von Assemblierungsdomänen zu gewährleisten. Die wichtigsten Assemblierungs-informationen scheinen in der Ektodomäne zu liegen. Die einzige Aminosäure in der zweiten Transmembranregion, die einen spezifischen Einfluss auf die Trimerisierung von hP2X5-Untereinheiten hatte, war 355D. Einzelmutationen in dieser Position zeigten, dass nur Aminosäuren, deren Seitenketten in der Membran interhelikale Wasserstoffbrücken ausbilden können, eine effiziente Trimerisierung ermöglichen. Dieses Ergebnis legte den Schluss nahe, dass 355D die Assemblierung unterstützt, indem es die Interaktion zwischen den Untereinheiten über eine Wasserstoffbrückenbildung stabilisiert. Die Suche nach einem potentiellen Interaktionspartner von 355D in der ersten Transmembranregion durch Einzelmutationen und Cystein-Crosslinking war allerdings nicht erfolgreich. Dies könnte bedeuten, dass die beiden Transmembranregionen jeweils benachbarter Untereinheiten nicht, wie für P2X2-Untereinheiten gezeigt, in einer „head to tail“-Orientierung angeordnet sind, sondern nur die zweiten Transmembranregionen miteinander in Kontakt stehen. Limitierte Proteolyse von hP2X5-Rezeptormutanten ergab einen engen Zusammenhang zwischen der Trimerisierung und der Resistenz gegenüber einer Proteolyse durch Trypsin. Daraus folgt, dass trimerisierungsfähige P2X-Mutanten korrekt gefaltet sind, während ein Verlust der Trimerisierungsfähigkeit eine Fehlfaltung anzeigt. Neben dem hP2X5-Rezeptor wurden auch Ratten-P2X1- (rP2X1-) Rezeptoren untersucht. rP2X1-Konstrukte, die lediglich aus der Ektodomäne sowie einem abspaltbaren Signalpeptid bestanden, konnten zwar partiell multimerisieren, aber keine definierten Trimere bilden. Die Analyse weiterer Konstrukte zeigte, dass beide Transmembranregionen für die Trimerisierung wichtig sind, auch wenn sie keine spezifischen Assemblierungsinformationen enthalten. Ein systematisches Alanin-Scanning der gesamten Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit ergab, dass die Ektodomäne multiple Sequenzmotive enthält, die zu der Trimerisierung beitragen. Die genaue Rolle der identifizierten Sequenzmotive muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Zusätzlich wurden Chimären aus rP2X1- und Ratten-P2X6- (rP2X6-) Untereinheiten untersucht. Da rP2X6-Untereinheiten nicht in der Lage sind zu trimerisieren, könnten sie in Kombination mit Sequenzelementen aus rP2X1-Untereinheiten ermöglichen, trimerisierungsrelevante Proteindomänen zu identifizieren. Es zeigte sich, dass eine Chimäre, die die Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit und die Transmembranregionen und zytosolischen Domänen der rP2X6-Untereinheit enthielt, trimerisieren konnte, während die umgekehrte Chimäre dies nicht vermochte. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass die Motive, die für die Trimerisierung von P2X-Untereinheiten essentiell sind, in der Ektodomäne liegen. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse, dass die Transmembranregionen bei der Assemblierung im Wesentlichen eine Funktion als hydrophobe Membrananker haben, die die korrekte Topologie und Positionierung der extrazellulären Assemblierungsdomänen ermöglichen. Die initiale Assemblierung wird durch die Ausbildung einer interhelikalen Wasserstoffbrücke über 355D stabilisiert. Somit können die wichtigsten Assemblierungsdomänen in Kontakt treten, die in der Ektodomäne lokalisiert sind.
Extrazelluläre Ablagerungen aus aggregierten Abeta-Peptiden stellen das pathologische Hauptmerkmal der Alzheimer Demenz dar. Schrittweise Veränderungen der Gleichgewichtsspiegel an Abeta im Gehirn begründen den Beginn der Amyloid Kaskaden Hypothese, in deren Folge es zu einer vermehrten Bildung und Aggregation von Abeta kommt. Im Zuge dieser Arbeit wurde im Zellmodell untersucht, welche Faktoren die Aggregation und die Bildung von Abeta initiieren bzw. verstärken. Etliche Arbeiten deuten darauf hin, dass der Amyloid-Metabolismus eng mit dem zellulären Cholesteringehalt verknüpft ist. In den hier verwendeten Modellsystemen bestätigte sich dieser Befund, da die Reduktion von Cholesterin durch Lovastatin und selektive Inhibitoren der Cholesterinbiosynthese mit einer signifikanten Abnahme der Abeta-Produktion einherging. Der Statin-Effekt konnte dabei nachweislich auf die Cholesterinreduktion bezogen und gegenüber pleitropen Isoprenoid-Effekten abgegrenzt werden, da die Inhibition der Isoprenoid- Transferasen FTase und GGTase zu keiner verminderten Abeta-Sekretion führte. Für eine mechanistische Analyse wurde die Rolle des freien Cholesterins als determinierender Faktor der Membranfluidität untersucht. Die APP-Prozessierung ist in der Membran lokalisiert und unterliegt daher dem Einfluss von Cholesterin als Modulator der physikalisch-chemischen Membraneigenschaften. Die Reduktion von Cholesterin bewirkt eine Zunahme der Membranfluidität, während hohe Cholesterinspiegel zu einer starren Membran führen. Beide Zustände wurden unabhängig vom Cholesteringehalt durch den Membranfluidizer Benzyl-Alkohol und den Membranrigidizer Pluronic F68 simuliert. Die Zunahme der Membranfluidität nach der Behandlung mit Benzyl Alkohol resultierte in einer signifikant verminderten Abeta-Sekretion. Pluronic F68 hingegen führte cholesterinunabhängig zu einer Abnahme an Membranfluidität, die mit einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung einherging. Die Befunde weisen die Membranfluidität explizit als regulatorisches Element der Abeta-Produktion aus. Benzyl Alkohol und Pluronic F68 zeigten außerdem eine starke Beeinflussung der Membranorganisation in Bezug auf die Formation von Lipid Rafts als potentielle Domänen der amyloidogenen APP-Prozessierung. Benzyl Alkohol führte zu einer diffusen Lokalisation von GM-1 und Cholesterin, während Pluronic F68 eine Kondensation der Raftlipide bewirkte. Abeta selbst interagiert mit der Plasmamembran und stört deren Integrität. Eine Reihe von Daten deutet darauf hin, dass Abeta spezifisch an Komponenten der Lipid Rafts bindet. Die vorliegende Arbeit bestätigt die Kolokalisation von GM-1 und Abeta und belegt, dass die Interaktion zu einer Abnahme der Membranfluidität führt. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Abeta zu einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung führt und so einen selbstverstärkenden Mechanismus der Abeta-Produktion initiiert. Der Effekt konnte in proliferierenden Zellen durch langfristige Inhibition der Abeta-Sekretion rückgängig gemacht werden. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell entworfen, in dem die Aggregation von gebundenem Abeta zu einer Vernetzung von Lipid Rafts führt und so die amyloidogene APP-Prozessierung stimuliert. Die Hypothese wurde mit Hilfe von Antikörperinduzierter Quervernetzung von GM-1 überprüft und bestätigt. Zusammengenommen zeigt die vorliegende Arbeit, dass 1.) die Lovastatin-induzierte Abnahme der Abeta-Sekretion in den verwendeten Zellmodellen auf die Reduktion von Cholesterin, bzw. die daraus resultierende Zunahme der Membranfluidität zurückzuführen ist, 2.) die Membranfluidität unabhängig vom Cholesteringehalt Einfluss auf die APP-Prozessierung nimmt, wobei eine fluide Membran die nicht-amyloidogene und eine starre Membran die amyloidogene APP-Prozessierung begünstigt, 3.) die Vernetzung bzw. Kondensation von Lipid Rafts zu einer verstärkten amyloidogenen Prozessierung führt und 4.) Abeta selbst durch Bindung an die Membran diesen Zustand bedingt und damit einen Teufelskreislauf initiiert, in dem es die eigene Produktion stimuliert. Damit fügt die Arbeit dem Puzzle um die Genesis der sporadischen Form der Alzheimer Demenz einige Stücke hinzu und bietet neue Aspekte für die therapeutische Intervention der Erkrankung an.
Ibuprofen gehört zu den am meisten verwendeten nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) und ist in niedriger Dosierung von 200-400 mg als sogenanntes OTC (over the counter) Analgetikum frei erhältlich. Obwohl es in den meisten Fällen als razemische Mischung aus S- und R-Ibuprofen verabreicht wird, ist mittlerweile auch das reine S-Ibuprofen (Dexibuprofen) als Medikament erhältlich. Während S-Ibuprofen ein potenter COX-Inhibitor ist, zeigt R-Ibuprofen in den klinisch relevanten Konzentrationen keine COX-Hemmung. Seit längerem ist bekannt, dass NSAIDs bei einer kontinuierlichen Einnahme über mehrere Jahre die Initiierung und Proliferation von Tumoren hemmen. Die Hemmung der Cyclooxygenase wird dabei als ein wichtiger Mechanismus für die antikarzinogene Wirkung angesehen, doch für viele NSAIDs sind auch schon COX unabhängige Mechanismen beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wurde unter Verwendung zweier Tumorzelllinien mit unterschiedlicher COX-2 Expression und dem Einsatz von beiden Ibuprofen Enantiomeren untersucht, inwieweit COX unabhängige Mechanismen für die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen verantwortlich sind. Sowohl die COX-2 defizienten HCT-15 als auch die COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen wurden durch Behandlung mit S- oder R-Ibuprofen in ihrer Proliferaton gehemmt. Dabei führte die Behandlung mit S- und R-Ibuprofen für 24 h zu einem G1-Zellzyklusblock und nach 72 h zu einem signifikanten Anstieg von apoptotischen Zellen, was im Western-Blot Assay durch eine verminderte Cyclin A und B Expression, einer erhöhten Expression des Zellzyklusinhibitors p27KIP1 und PARP-Spaltung bestätigt wurde. Dabei zeigten beide Enantiomere in den Tumorzellen eine gleich starke antiproliferative und apoptotische Wirkung. Eine Messung der intrazellulären S- und R-Ibuprofen Konzentrationen ergab außerdem, dass in den verwendeten Tumorzellen keine unidirektionale Konfigurationsinversion von R- zu S-Ibuprofen stattgefunden hat. In den COX-2 exprimierenden HCA-7 Zellen waren die antikarzinogenen Effekte von S- und R-Ibuprofen schwächer ausgeprägt als in den HCT-15 Zellen, was jedoch auf eine niedrigere intrazelluläre S- bzw. R-Ibuprofen Konzentration zurückzuführen war. Diese Ergebnisse zeigen auf jeden Fall, dass COX unabhängige Mechanismen bei der antikarzinogenen Wirkung von S- und R- Ibuprofen eine Rolle spielen. Dass auch COX abhängige Mechanismen an der antikarzinogenen Wirkung von Ibuprofen beteiligt sind, konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Abnahme an PGE2 nach S-Ibuprofen Behandlung in den COX-2 exprimierenden Tumorzellen beobachtet. In welchem Ausmaß aber die COX Hemmung an der antikarzinogenen Wirkung von S-Ibuprofen in den COX-2 exprimierenden (Hemmung der PGE2 Synthese) und möglicherweise auch in den COX-2 defizienten Zellen (Anstieg an Arachidonsäure und daraus resultierend an Ceramid) beteiligt war, konnte anhand der Ergebnisse nicht geklärt werden. Es kann jedoch angenommen werden, dass S-Ibuprofen zumindest in den COX exprimierenden HCA-7 Zellen sowohl über COX Hemmung als auch über COX unabhängige Mechanismen antiproliferativ und apoptotisch wirkt. Auch im Tumormodell der Maus wurde bei einer täglichen i.p. Applikation von 15 mg/kg S- oder R-Ibuprofen eine Hemmung des Tumorwachstums beobachtet. Dabei betrug die unidirektionale Inversion von R- zu S-Ibuprofen ca. 54 %. Die Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen führte in beiden Zelllinien außerdem zu einer Akkumulation des Tumorsuppressors p53, der an der Regulierung von Zellzyklus und Apoptose beteiligt ist. Daher wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht, ob S- und R-Ibuprofen die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarrest über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors p53 und dessen Zielgene vermitteln. Verwendet wurde eine HCT-116 Zelllinien, in der beide p53 Allele durch homologe Rekombination inaktiviert waren (p53-/-). Im Gegensatz zu den HCT-116 p53wt Zellen führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53 defizienten Zellen zu keinem signifikanten G1-Zellzyklusblock und auch die Apoptoserate war in diesen Zellen deutlich geringer als in p53wt Zellen. In vivo zeigte eine tägliche i.p. Injektion von 15 mg/kg S- bzw. R-Ibuprofen bei den Mäusen mit p53-/- Tumoren keine signifikante Wachstumshemmung. Im Vergleich dazu wurde die Proliferation der HCT-116 p53wt Tumore durch die R-Ibuprofen Behandlung signifikant gehemmt, und auch die mit S-Ibuprofen behandelten Tieren zeigten deutlich kleinere Tumore als die Gruppe mit den p53 defizienten Tumoren. Nach der Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde in beiden HCT-116 Zelllinien eine erhöhte Expression des Membranrezeptors p75NTR beobachtet. Außerdem führte die Behandlung mit S- bzw. R-Ibuprofen in den p53wt Zellen, im Gegensatz zu den p53 defizienten Zellen, zu einer vermehrten Bax Expression und einem Anstieg an Bax Protein in der mitochondrialen Fraktion. Schließlich wurde gezeigt, dass die erhöhte p53 Konzentration in den Zellen zumindest teilweise über den p75NTR Rezeptor reguliert wird, da durch die externe Zugabe des Liganden NGF die Ibuprofen induzierte Akkumulation von p53 in den HCT-116 p53wt Zellen wieder aufgehoben wurde. Da in vitro in den HCA-7 Zellen nicht nur die Behandlung mit S-Ibuprofen, sondern auch die mit R-Ibuprofen zu einer Hemmung der PGE2 Synthese führte, wurde im dritten Teil der Arbeit die Wirkung von S- und R-Ibuprofen auf die Expression der PGE-Synthasen und auf die mPGES-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden HeLa Zellen verwendet, deren mPGES-1 Expression durch die Zugabe von IL-1ß und TNF-alpha stimmuliert wurde. Nach gleichzeitiger Inkubation mit S- bzw. R-Ibuprofen wurde keine Inhibierung der mPGES-1, mPGES-2 oder cPGES Expression beobachtet. Auch die Enzymaktivität von mPGES-1 wurde weder durch die Inkubation mit S-Ibuprofen noch mit R-Ibuprofen beeinflußt. Die bei der Inkubation mit R-Ibuprofen auftretende Hemmung der PGE2 Synthese konnte in der vorliegenden Arbeit nicht abschließend erklärt werden und bietet somit einen interessanten Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte mit der Aktivierung des Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptors eine Rationale und ein möglicher Wirkmechanismus für die traditionelle Anwendung von Gewürz- und Arzneipflanzen bei der Therapie des Typ 2 Diabetes aufgezeigt werden. Vor diesem Hintergrund wurden über fünfzig traditionell bei Diabetes angewandte Pflanzen ausgewählt und mit Ethanol extrahiert. Die erhaltenen Trockenextrakte wurden daraufhin in einem von mir etablierten Reporter-Gen Assay auf eine mögliche Aktivierung der drei Subtypen des PPAR hin untersucht. Von den getesteten Extrakten wurde für fünfundzwanzig, also annähernd die Hälfte, eine signifikante Aktivierung des PPARgamma nachgewiesen. Von diesen zeigten wiederum vierzehn außerdem eine signifikante Aktivierung des PPARalpha, lediglich drei dieser Extrakte zeigten auch eine signifikante Aktivierung des PPARdelta. Somit konnte ich eine mögliche Rationale und einen potentiellen Wirkmechanismus für die volksmedizinische Anwendung dieser Pflanzen bei Diabetes aufzeigen. Von den wirksamen Extrakten wiesen am PPARgamma sieben eine ausreichend hohe Aktivität auf, dass wir auch bei niedrigeren Testkonzentrationen noch einen signifikanten Effekt und somit eine Konzentrationsabhängigkeit des aufzeigen konnten. Für PPARa konnten wir lediglich für drei der Extrakte eine Konzentrationsabhängigkeit aufzeigen, bei PPARdelta für keinen der Extrakte. Die beiden am stärksten aktiven Extrakte aus Rosmarinus offic. und Salvia offic. zeigten bereits ab etwa 10 mg/L signifikante Aktivität am PPARgamma, so dass wir für diese beiden Extrakte mit 20 bzw. 40 mg/L EC50-Konstanten bestimmen konnten. Diese halbmaximale Aktivierungskonstante liegt damit für den potenteren Rosmarin-Extrakt lediglich um den Faktor 200 höher als die des bei Diabetes eingesetzten Arzneistoffs Pioglitazon (Actos®). Die weitere Untersuchung dieser beiden Extrakte ergab, dass in beiden Carnosolsäure bzw. Carnosol enthalten waren, welche bei der Untersuchung im Reporter-Gen Assay EC50-Konzentrationen von 20 bzw. 40 mikroM für die Aktivierung des PPARgamma aufwiesen. Damit sind diese Reinsubstanzen bereits nur noch um den Faktor siebzig schwächer wirksam als Pioglitazon. Vergleicht man hingegen mit Bezafibrat (Cedur®), einem als Lipidsenker eingesetzten Arzneistoff, welcher aufgrund seiner pan-PPAR-agonistischen Wirkung mit EC50-Konzentrationen von je etwa 50 mikroM von besonderem Interesse ist, so sind die beiden Diterpene Carnosolsäure und Carnosol im Hinblick auf PPARgamma äquipotent oder eher stärker aktiv. Der Gehalt an diesen beiden Diterpenen in den von mir hergestellten Extrakten war nun zwar mit in Summe drei bzw. neun Prozent um den Faktor zehn bzw. drei zu niedrig, als dass sich der PPARgamma Agonismus der beiden Extrakte hierdurch hinreichend erklären ließe. Allerdings konnten wir für einen kommerziell erhältlichen und auf 40% Carnosolsäure angereicherten Rosmarin-Extrakt einen EC50-Wert von 10 mg/L bestimmen für die Aktivierung von PPARgamma bestimmen. Eine Aktivität, welche sich zu 70% allein auf den Gehalt an Carnosolsäure zurückführen lässt. Neben dem Nachweis der PPARgamma Aktivität von Carnosolsäure und Carnosol einerseits und der von ethanolischen Rosmarin- und Salbei-Extrakten andererseits, konnte ich somit einen hinreichenden Beweis führen, dass Carnosolsäure zumindest für Rosmarin, vermutlich auch für Salbei, als eines der aktiven Prinzipien anzusehen ist. Meine Befunde liefern damit eine mögliche Erklärung und Wirkmechanismus für die in Tiermodellen gefundene hypoglykämische Wirksamkeit von Rosmarin, Salbei und Carnosolsäure. Darüber hinaus legen meine Untersuchungen nahe, dass in beiden Pflanzen weitere PPARgamma Aktivatoren enthalten sind. Da Carnosol selbst bereits ein Oxidationsprodukt der Carnosolsäure darstellt, kämen hier weitere auch bereits beschriebene Oxidationsprodukte sicherlich in Frage. Diese Oxidationsprodukte stellen allerdings zumeist nur labile Übergangsprodukte dar und sind aus diesem Grunde auch als nicht Reinstoffe erhältlich. Der Nachweis einer PPAR Aktivität könnte somit angesichts der benötigten Inkubationsdauer im Reporter-Gen Assay so nicht geführt werden. Neben den bereits angeführten Ergebnissen ist die hohe Rate von positiven Treffern in meinem Screening selbst einer der interessantesten Befunde. Die signifikante Aktivierung von PPARgamma durch nahezu die Hälfte der getesteten Extrakte lässt die Vermutung zu, dass PPAR agonistische Substanzen im Pflanzenreich sehr weit verbreitet sein könnten. Zwar bestehen zu Recht Vorbehalte gegenüber der Testung von Vielstoff-Gemischen bzw. den hierbei erhaltenen Ergebnissen. Viele pflanzliche Inhaltsstoffe z.B. Gerbstoffe können zu einer unspezifischen Hemmung der Aktivität von Enzyme führen. Das verwendete Testsystem setzt allerdings neben Membrangängigkeit der aktiven Prinzipien die spezifische Aktivierung der Expression eines Gens, dessen Aktivität anschließend bestimmt wird, voraus. Die Art des verwendeten Assay macht damit die Erfassung unspezifischer Effekte eher unwahrscheinlich. Darüberhinaus mag für die Güte der Ergebnisse meines Screenings sprechen, dass unabhängig von uns für einige der gescreenten Pflanzen z.B. Kurkuma und Chili mit den Kurkuminoiden und Capsaicin kürzlich PPAR aktive Prinzipien beschrieben wurden. Vielmehr lässt sich die Hypothese formulieren, dass eine ganze Reihe sekundärer pflanzlicher Inhaltsstoffe zumindest mäßig aktive PPAR Agonisten darstellen. An prominenter Stelle wäre hier die Substanzklasse der Terpene zu nennen, von denen eine ganze Reihe sowohl linearer etwa Farnesol und Phytansäure, als auch cyclischer z.B. Tumeron, Abietansäure, Oleanolsäure und Ursolsäure bereits als PPAR-Aktivatoren beschrieben wurden. Angesichts der hohen Lipophilie dieser Substanz-Klasse und einer relativ großen und wenig selektierenden Bindungstasche des PPAR lässt sich auch für andere Terpene ein PPAR Agonismus erwarten. Der positive Effekt, den eine überwiegend pflanzliche Ernährung nach epidemiologischen Erkenntnissen auf die Gesundheit bewirkt, mag deshalb in Teilen auf PPAR-agonistische Prinzipien zurückzuführen sein. Neben dem höheren Anteil an mehrfach ungesättigen Fettsäuren im Vergleich zu tierischer Nahrung könnten enthaltene Terpene hier durchaus einen relevanten Beitrag leisten. In einem weiteren in Kooperation durchgeführten Projekt konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die schwache Aktivität des phenolischen Stilben-Derivats Resveratrol am PPARgamma einen Beitrag leistet zur Beeinflussung des Polyamin-Stoffwechsels und der hierdurch bedingten Regulation der Zell-Proliferation. Weiterhin konnte mit Hilfe der in unserem Reporter-Gen Assay erhaltenen Ergebnisse gezeigt werden, dass ein virtuelles Computer-basiertes Screening einer Substanzbibliothek effektiv ist, bei der Findung von PPAR Leitstrukturen.
Bei inflammatorischen Schmerzen kann durch Hemmung der COX-2 im Rückenmark die zentrale Sensibilisierung reduziert werden. Da die Hemmung der gesamten COX-2 vermittelten Prostaglandinsynthese jedoch zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wird in jüngster Zeit diskutiert, ob eine selektive Hemmung der PGE2 Synthese auf Ebene der mPGES-1 für die Therapie passagerer Schmerzen sinnvoller ist. Um die funktionellen Rollen von COX-2 und mPGES-1 im Rückenmark zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit die Folgen einer COX-Inhibierung und mPGES-1-Deletion auf den spinalen Eicosanoidmetabolismus, die neuronale Erregbarkeit, die Synthese proinflammatorischer Zytokine und das nozizeptive Verhalten untersucht. Das proinflammatorische Zytokin TNFa induzierte in primären Rückenmarksneuronen eine COX-2- und mPGES-1-Expression und eine erhöhte PGE2 Synthese. Diese Induktion der PGE2 Synthese konnte durch den selektiven COX-2 Inhibitor Rofecoxib und den „selektiven COX-1 Inhibitor“ SC-560 gleichermaßen potent gehemmt werden. Da der Effekt von SC-560 unerwartet war, wurde sein Wirkmechanismus genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen weder die COX-2 und mPGES-1 Expression, die PLA2 Aktivität, die mPGES-1 Aktivität noch den PGE2 Transport hemmte. Durch Experimente mit Zellen aus COX-1-/- Mäusen konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen die COX-2 unabhängig von COX-1 in nanomolaren Konzentrationen inhibiert. Da dieses Ergebnis den postulierten COX-1-selektiven Eigenschaften von SC-560 widersprach, wurde nach der Ursache für den Verlust der COX-1-Selektivität gesucht. Es zeigte sich, dass SC-560 in einer zellfreien in vitro Synthese und im Vollbluttest mit klarer Selektivität COX-1 hemmt. In kultivierten Rückenmarkszellen, RAW-Makrophagen und Blutzellen (Monozyten und Thrombozyten) inhibiert SC-560 allerdings d beide COX-Isoformen potent. Es wurde dadurch deutlich, dass die zelluläre Einbindung von COX-2 sowie ein niedriger Proteingehalt im extrazellulären Medium die halbmaximalen Konzentrationen (IC50) für die COX-2-Hemmung durch SC-560 stark reduzieren kann und hierdurch die COX-1-Selektivität der Substanz verloren geht. Neben einer COX-2 Hemmung verursachte auch eine mPGES-1-Deletion in Rückenmarkskulturen sowie im adulten Rückenmark eine Reduktion der PGE2 Synthese. Überrachenderweise bewirkte jedoch die mPGES-1-Defizienz im Gegensatz zur COX-2 Hemmung durch Etoricoxib im Zymosanmodell keine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie. Um die Ursache für die unterschiedliche antihyperalgetische Wirkung der COX-2-Hemmung und mPGES-1-Deletion zu finden, wurden zunächst die Konsequenzen für die gesamte Prostaglandinsynthese untersucht. Die Analyse mittels LC-MS/MS zeigte, dass im Rückenmark mPGES-1-defizienter Mäuse verstärkt PGI2, PGF2a und PGD2 synthetisiert wird. Da für alle drei Prostaglandine bereits pronozizeptive Effekte beschrieben wurden, wurde die Expression von den entsprechenden Rezeptoren im Rückenmark und die Konsequenzen der Rezeptoraktivierung auf die neuronale Erregbarkeit untersucht. Mittels „calcium imaging“ wurde demonstriert, dass selektive IP Rezeptoragonisten in Rückenmarksneuronen eine PKA und PKC vermittelte Phosphorylierung der NMDA Rezeptoren verursachen und die Aktivierbarkeit der NMDA Rezeptoren sensibilisieren. Eine Verstärkung des NMDA induzierten Calciumeinstromes konnte nach Applikation der anderen Prostaglandine nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen daher, dass in mPGES-1-defizienten Mäusen durch die Umleitung der Prostaglandinsynthese zu Prostacyclin die exzitatorischen NMDA Rezeptoren sensibilisiert und hierdurch die antihyperalgitische Wirkung von PGE2-Synthesehemmung kompensiert werden kann. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass mPGES-1 als Zielmolekül für die Schmerztherapie eher nicht eignet ist. mPGES-1-defiziente Tiere zeigten in inflammatorischen Schmerzmodellen ein normales nozizeptives Verhalten. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es nach einer mPGES-1 Deletion im Rückenmark zwar zur Reduktion der PGE2 Synthese aber auch gleichzeitig zur verstärkten Synthese anderer pronozizeptiv wirkender Prostaglandine kommt.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.