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Nukleäre Rezeptoren (NRs) sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren, die an der Regulation unzähliger (patho-)physiologischer Prozesse im Körper beteiligt sind, wodurch sie interessante therapeutische Zielstrukturen darstellen. Unter ihnen zählen die PPARs (α, γ und δ) zur Hälfte der gut erforschten NRs. Sie haben als Lipidsensoren vor allem metabolische Funktionen und ihre synthetischen Liganden sind als Arzneistoffe zugelassen, sind anderen Therapieoptionen jedoch aufgrund geringerer Wirksamkeit und klassenspezifischer Nebenwirkungen unterlegen. Daher ist der Bedarf an neuen Konzepten zur selektiven Modulation der PPARs groß. Den gut studierten NRs gegenüber steht die andere Hälfte der NRs, deren Funktionen noch nicht umfassend verstanden sind. Nurr1 ist ein solcher NR, dem großes therapeutisches Potential bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer-Demenz und Multipler Sklerose zugeschrieben wird. Der konstitutiv aktive NR wird hauptsächlich im ZNS, und dort vor allem in dopaminergen Neuronen, exprimiert, wo er neuroprotektive und anti-entzündliche Effekte vermittelt. Trotz der jüngsten Erkenntnisse zu potenziellen endogenen Liganden der direkten Interaktion der Nurr1-Ligandbindedomäne (LBD) mit kleinen, wirkstoffartigen Molekülen, mangelt es an geeigneten chemischen Tools, um die Nurr1-Modulation als neues therapeutisches Konzept zu validieren. Ziel dieser Arbeit war daher die Identifikation, Entwicklung und Charakterisierung neuer tool compounds für die PPARs und Nurr1.
Das Konzept der Photopharmakologie eröffnet neue Möglichkeiten in der zeitlichen und räumlichen Kontrolle biologischer Effekte. Mit Hilfe computergestützten Designs wurden aus dem PPARγ-Agonist Rosiglitazon und dem pan-PPAR-Agonist GL479 Azobenzen-basierte photoschaltbare PPAR-Agonisten entwickelt und optimiert. Das Rosiglitazon-Azolog 36 wurde durch terminale Erweiterung als cis-präferenzieller selektiver PPARγ-Agonist erhalten, der durch Licht aktiviert werden konnte. Aus GL479 ging zum einen 38 als hochpotenter und selektiver PPARα-Agonist hervor, der in seiner trans-Konfiguration 35-mal potenter war als das entsprechende cis-Isomer. Zum anderen wurde ein dualer trans-präferenzieller PPARα- und -δ-Agonist (41) entwickelt. In einem eigens etablierten Fluoreszenz-Reportergenassay konnte durch die neuen photopharmakologischen Tools die PPAR-Aktivität in lebenden Zellen im zeitlichen Verlauf kontrolliert werden.
Auch die Identifikation und Charakterisierung endogener Liganden ist von großer Relevanz für die Modulation von NRs. Mit der Entdeckung der PPARγ-Aktivierung durch Garcinolsäure (48), einem Vitamin-E-Metaboliten, konnte ein neuer Aktivierungsmechanismus aufgedeckt werden, der ein besonderes Co-Regulator-Interaktionsprofil umfasst. Eine Co-Kristallstruktur der PPARγ-LBD im Komplex mit 48 zeigte, dass 48 sowohl die orthosterische als auch eine neue allosterische Bindestelle adressiert. Eine Genexpressionsanalyse in humanen Hepatozyten zeigte, dass sich dieser besondere Aktivierungsmechanismus von 48 auch in einer differenzierten Modulation der PPARγ-regulierten Genexpression widerspiegelte, woraus sich mögliche therapeutische Anwendungen für eine selektiv allosterische PPAR-Modulation ableiten lassen.
Der erste Ansatz zur Suche nach Nurr1-Modulatoren als tool compounds war von den Prostaglandinen A1 und A2 als potenziellen endogenen Nurr1-Liganden inspiriert. Da diese Entzündungsmediatoren durch Aktivität der Cyclooxygenasen (COX) 1 und 2 entstehen, entstand die Hypothese, dass synthetische COX-Inhibitoren, auch bekannt als nichtsteroidale Antirheumatika (NSARs), Nurr1 modulieren könnten. Dies konnte in einem Screening von 39 strukturell diversen NSARs im Gal4-Nurr1-Reportergenassay bestätigt werden. Mit Meclofenaminsäure als differenziellem Nurr1-Modulator sowie Oxaprozin und Parecoxib als den ersten inversen Nurr1-Agonisten konnte dabei außerdem gezeigt werden, dass die hohe konstitutive Nurr1-Aktivität bidirektional moduliert werden kann, und dass sowohl das Co-Regulator-Rekrutierungsprofil als auch das Dimerisierungsverhalten an der Vermittlung von Nurr1-Ligand-Effekten entscheidend beteiligt sind.
Die zweite Strategie beruhte auf den alten Antimalariawirkstoffen Amodiaquin (19) und Chloroquin (25), die zuvor als moderate Nurr1-Agonisten (EC50 Nurr1: 36 µM (19), 47 µM (25)) identifiziert wurden, aber aufgrund zahlreicher unspezifischer Effekte für den breiten Einsatz als tool compounds für Nurr1 ungeeignet sind. Eine Evaluation der einzelnen Strukturmerkmale dieses Chemotyps zeigte, dass das gemeinsame 7-Chlorochinolin-4-amin Grundgerüst ausreichend ist, um Nurr1 zu aktivieren (EC50 Nurr1: 259 µM). Basierend auf dieser Erkenntnis gingen durch gezielte Strukturmodifikationen dieses Grundgerüstes die Nurr1-Agonisten 71 und 73 hervor (EC50 Nurr1: 7,3 µM (71), 17 µM (73)), die die Leitstrukturen in ihrer Potenz übertrafen...
Nukleäre Rezeptoren sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren, die das pharmazeutische Interesse als Zielstrukturen für antientzündliche Wirkstoffe und andere Indikationen erwecken. Entzündungen werden durch Noxen physikalischer, chemischer oder mikrobiologischer Art hervorgerufen. Dabei reagiert das geschädigte Gewebe mit zahlreichen Vorgängen, die vaskuläre und zelluläre Reaktionen mit Immunantworten verknüpfen und nach der Wiederherstellung des ursprünglichen Zustands streben. Bei andauernder Wirkung können Entzündungen jedoch in einen schädlichen Prozess umschlagen, sodass in solchen Fällen eine therapeutische Intervention Notwendigkeit erlangt. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, neue Liganden nukleärer Rezeptoren als Kandidaten für antientzündliche Wirkstoffe zu identifizieren.
Leber X Rezeptoren (LXRs) sind Zielstrukturen für entzündliche und neurodegenerative Erkrankungen mit antiphlogistischem Potenzial. Zur Identifikation neuer LXR-Liganden wurde eine Datenbank mit zugelassenen Wirkstoffen mithilfe einer selbstorganisierenden Karte (SOM) auf Interaktion mit LXR gescreent. Die Retinoid X Rezeptor (RXR)-Agonisten Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) konnten in der anschließenden in vitro Charakterisierung als potente duale LXRalpha/LXRbeta-Partialagonisten mit moderater Aktivierungseffizienz bestätigt werden. Während 37 und 38 synthetische LXR-Vollagonisten partiell antagonisierten, führten sie mit dem endogenen Partialagonisten 22(R)-Hydroxycholesterol (4) zur additiven Aktivierung von LXR. Die Charakterisierung von Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) als duale LXR/RXR-Agonisten liefert nicht nur eine weitere Erklärung für in klinischen Studien beobachtete Nebenwirkungen, sondern könnte auch den Startpunkt zur Entwicklung neuer antientzündlicher LXR- und dualer LXR/RXR-Liganden bieten.
Der Peroxisomen Proliferator-aktivierte Rezeptor (PPAR) gamma ist ein nukleärer Rezeptor, der neben der Steigerung der Insulinsensitivität auch antientzündliche Effekte aufweist. Auf Grundlage seiner Y-förmigen und fettsäuremimetischen Struktur konnte das Urikosurikum Lesinurad (47) als PPARgamma-Partialagonist in vitro charakterisiert werden. Im Gegensatz zu PPARgamma-Vollagonisten wie Pioglitazon (31) oder Rosiglitazon (32) induzierte 47 nicht die Differenzierung muriner 3T3-L1 Zellen in reife Adipozyten, aber erhöhte in der humanen Leberzellkarzinomzelllinie HepG2 die Expression von Genen, welche die Insulinsensitivität und den Fettsäureabbau steigern könnten. Folglich erwies sich Lesinurad (47), das bei der Pharmakotherapie von Gicht Anwendung findet, als selektiver PPARgamma-Modulator (sPPARgammaM) ohne adipogene Nebenwirkungen. Insbesondere Patienten mit Komorbiditäten wie Diabetes mellitus Typ 2 oder anderen Erkrankungen des metabolischen Syndroms könnten von einer Behandlung mit 47 profitieren. Inwiefern PPARgamma an der Auflösung von Entzündungen bei Gicht beteiligt ist, bleibt in zukünftigen Studien zu klären.
Synthetische RXR-Agonisten haben ein vielversprechendes Potenzial zur Behandlung entzündlicher neurodegenerativer Erkrankungen, das jedoch von nachteiligen Eigenschaften dieser Rexinoide beeinträchtigt wird. Durch ein pharmakophorbasiertes Screening einer fokussierten Substanzbibliothek aus Fettsäuremimetika konnte ein fortschrittliches RXR-Ligandgerüst identifiziert werden. Eine geeignete Synthesestrategie wurde etabliert und die Leitstrukturen durch systematisches Studium der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) optimiert. In vitro Experimente wie Reportergenassays und die Quantifizierung der Zielgenexpression bestätigten die RXR-partialagonistische Aktivität der dabei entwickelten nanomolaren Verbindung 89. Mit seiner hohen Selektivität, gesteigerten wässrigen Löslichkeit sowie reduzierter Lipophilie und Toxizität könnte 89 die Probleme bisheriger synthetischer RXR-Agonisten überwinden. Seine Präferenz von RXRgamma hinsichtlich der Aktivierungseffizienz könnte richtungsweisend für die Entwicklung subtypselektiver Liganden sein.
Die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist eine Leberentzündung, die aus einer Steatose hervorgehen kann und deren multifaktorielle Natur eine hohe therapeutische Effizienz erfordert. Diese könnte durch duale Modulation der nukleären Rezeptoren Farnesoid X Rezeptor (FXR) und PPARdelta mit antientzündlichen Eigenschaften und unterschiedlichem Wirkprinzip erreicht werden. Zur Validierung dieses Ansatzes mit synergistischem Potenzial sollten duale PPARdelta/FXR-Agonisten ausgehend von einer in früheren Studien des Arbeitskreises identifizierten Leitstruktur mit moderater Potenz entwickelt werden. Dazu wurde ein fünfstufiges Verfahren zur Synthese von Derivaten der Leitstruktur erarbeitet und die Derivate hinsichtlich ihrer Aktivität auf den Zielstrukturen in vitro evaluiert. In systematischen SAR-Studien wurden dabei Strukturmotive charakterisiert, welche die Wirksamkeit und Maximalaktivierung auf PPARdelta und FXR steigerten. Darüber hinaus konnten Modifikationen identifiziert werden, welche eine Selektivität über PPARalpha und PPARgamma gewährten. Die Kombination dieser vorteilhaften Gruppen und Substituenten könnte neue Wirkstoffkandidaten zur Behandlung von NASH hervorbringen.
Insgesamt wurden in dieser Arbeit zahlreiche Wirkstoffe und Wirkstoffkandidaten erfolgreich als Liganden nukleärer Rezeptoren mit antientzündlichem Potenzial identifiziert. Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) können als Leitstruktur zur Entwicklung neuer selektiver LXR- oder dualer LXR/RXR-Agonisten dienen. Die PPARgamma-partialagonistische Aktivität von Lesinurad (47) könnte einen Fortschritt in der Therapie von Gicht mit metabolischen Begleiterkrankungen bewirken. Zudem könnten im Zuge dieser Arbeit synthetisierte Serien von RXR- und dualen PPARdelta/FXR-Partialagonisten neue Therapieoptionen bei neurodegenerativen Erkrankungen oder NASH ermöglichen.
Die Superfamilie der nukleären Rezeptoren umfasst 48 ligandenabhänige Transkriptionsfaktoren, die durch Veränderungen in der Genexpression unterschiedlichste (patho-)physiologische Vorgänge wie Metabolismus, Entzündungen und Zelldifferenzierung beeinflussen.
Für die Vertreter der Retinoid X Rezeptoren (RXRs) und Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPARs) wurden in den letzten Jahren vielversprechende Effekte auf neurodegenerative Erkrankungen berichtet. Beide Rezeptorklassen beeinflussen u.a. Bildung, Transport und Abbau des neurotoxischen Amyloid-β, das als eine der Ursachen für die Entstehung einer Alzheimer Demenz (AD) vermutet wird. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass durch gezielte Modulation der RXRs (besonders RXRγ) eine Remyelinisierung auto-immun demyelinisierter Neurone und damit eine regenerative Therapie für die Multiple Sklerose (MS) möglich sein könnte. Die aktuell zur Verfügung stehenden Liganden der RXRs besitzen unzureichende Subtypenselektivität und meist unvorteilhafte physikochemische Eigenschaften, die der weiteren Erforschung im Wege stehen. Um diese Hindernisse zu überwinden, sollten im Rahmen dieser Arbeit neuartige RXR-Agonisten synthetisiert und umfassend charakterisiert werden.
Ein kürzlich publizierter RXR-Agonist besitzt eine ungewöhnlich lineare Biphenylgrundstruktur und offenbart ein attraktives Aktivitätsprofil: Während alle drei RXR-Subtypen mit einem ähnlichen EC50-Wert (RXRα/β/γ = 12/12/14 µM) adressiert werden, führt die Bindung an RXRα nur zu einer minimalen Aktivierung (max. 5-fache Aktivierung im Vergleich zur Grundaktivität), während RXRβ und γ deutlich stärker aktiviert werden (60-70-fache Aktivierung). Da für diesen Chemotyp bislang noch keine systematischen Studien vorlagen, wurden seine Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) erforscht. Durch Synthese und in vitro Charakterisierung von 24 Derivaten konnten sowohl selektivitäts- als auch potenzfördernde Strukturmerkmale identifiziert werden, die sich auch kombinieren ließen. Es wurden ein RXRβ-selektives Derivat, mehrere RXRα/β-präferierende Analoga und ein potentes Derivat mit annähernd 100-fach gesteigerter Potenz ((EC50(RXRα/β/γ) = 0,08/0,15/0,22 µM) erhalten. Im Zuge der Charakterisierung wurden außerdem strukturelle Variationen identifiziert, die eine Umgehung des LXR/RXR-Heterodimers ermöglichen könnten. Zusätzlich gelang die Kristallisation der Ligandbindedomäne (LBD) von RXRα im Komplex mit dem potentesten Vertreter der Serie und offenbarte Potential für weitere Optimierungen, u.a. der Möglichkeit eine kovalente Bindung mit Cys432 zu etablieren und damit eine weitere Potenzsteigerung zu erreichen.
Neben der mangelnden Subtypenpräferenz behindern auch die ungünstigen physikochemischen Eigenschaften von RXR-Liganden die weitere Entwicklung von RXR-basierten Therapieoptionen. Deshalb sollte eine neue Leitstruktur mit überlegenen physikochemischen Eigenschaften identifiziert und durch systematische SAR-Untersuchungen weiterentwickelt werden. Für den experimentellen Wirkstoff Wy14,643, einem dualen Agonisten an PPARα und γ, wurden im Laufe der letzten vier Jahrzehnte wiederholt Effekte patentiert, die sich mit dem bislang bekannten Aktivitätsprofil nicht erklären ließen. Er zeigte u.a. in einem Tiermodell der MS einen immunmodulierenden Effekt und reduzierte in vitro die Bildung von Amyloid-β.Im Rahmen dieser Arbeit konnte Wy14,643 als potenter RXR-Agonist (EC50 (PPARα/γ/δ) = 36/54/- µM¸ EC50(RXRα/β/γ) = 9,1/13/31 µM) mit überlegenen physikochemischen Eigenschaften (z.B. Löslichkeit in Wasser = 48,6 mg/L) identifiziert und dadurch dessen Wirkungen erklärt werden.
Wy14,643 wurde als Startpunkt einer systematischen Untersuchung der Ligand-Rezeptor-Interaktionen sowohl an den PPARs und den RXRs ausgewählt. Dabei wurden ein potenter selektiver PPAR-Agonist und ein potenter und ausgeglichener panRXR/panPPAR-Agonist erhalten. Der panRXR/panPPAR-Agonist konnte im Komplex mit der LBD von PPARγ kristallisiert werden, wo der Ligand gleich doppelt gebunden vorliegt. Eines der Moleküle bindet in einer alternativen Bindungstasche. Diese Erkenntnis könnte die Grundlage für die Entwicklung einer neuen Klasse von PPARγ-Modulatoren legen.
Durch Kombination des erlangten SAR-Wissens wurde ein selektiver RXR-Agonist (EC50 (PPARα/γ/δ) = -/-/- µM¸ EC50(RXRα/β/γ) = 0,09/0,14/0,36 µM) mit annähernd 100-fach gesteigerter Potenz synthetisiert, der die günstigen physikochemischen Eigenschaften der Leitstruktur erhalten konnte (Löslichkeit in Wasser = 14,3 mg/L). Mit diesem Profil ist es gelungen einen RXR-Agonisten zu kreieren, der dem bisherigen Goldstandard Bexaroten bei vergleichbarer Potenz in physikochemischen Eigenschaften überlegen ist.
Die Kristallstruktur des RXR-selektiven Derivats im Komplex mit der LBD von RXRα zeigte einen orthosterischen Bindemodus und legte weitere Optimierungen nahe: So gibt es sowohl ungenutzten Raum, der zukünftig durch strukturbasierte Substitutionen adressiert werden könnte, als auch die Möglichkeit eine kovalente Bindung zum Rezeptor (Cys432) zu initiieren. Durch diese Arbeit konnten nicht nur eine Reihe von potenten RXR-Liganden identifiziert werden, durch die Entwicklung eines Sets aus PPAR-selektiven, dual PPAR/RXR-aktiven und RXR-selektiven Derivaten gleichen Chemotyps, entstand auch ein nützliches pharmakologisches Werkzeug zur weiteren Entschlüsselung des Zusammenspiels dieser Rezeptoren.
Die systematische Entwicklung einer Leitstruktur, wie sie in den vorangegangenen Projekten praktiziert wurde, kann je nach deren Komplexität eine kostenintensive und synthetisch anspruchsvolle Aufgabe darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine computergestützte Optimierung einer Leitstruktur als Teil einer selektiven Optimierung von Nebenaktivitäten (SOSA) etabliert, um den präparativen Aufwand der Strukturoptimierung zu reduzieren. Als Modellsubstanz wurde das Fettsäuremimetikum Cinalukast ausgewählt, das einen potenten Cysteinylleukotrienrezeptor 1 (CysLT1R)-Antagonisten darstellt, für den eine schwache Aktivität an PPARα entdeckt wurde. Ein automatisierter Arbeitsablauf testete eine virtuelle Bibliothek von annähernd 8000 Cinalukastanaloga auf ihre PPARα-Aktivität und die Derivate mit der besten vorhergesagten PPARα-Aktivität wurden durch maschinelles Lernen nach ihrem CysLT1R-Antagonismus klassifiziert. Die Synthese und Charakterisierung eines virtuell bevorzugten Derivats zeigte selektiven PPARα-Agonismus und konnte so den computergestützten Arbeitsablauf als wertvolles Instrument zur Optimierung von Fettsäuremimetika bestätigten.
Die vorliegende Arbeit hat bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von zwei neuen Chemotypen als RXR-Liganden erreicht. Die Klasse der Biphenyl-Analoga kann als Ausgangspunkt für eine weitere Entwicklung von subtypenselektiven RXR-Agonisten dienen und könnte gleichzeitig die gezielte Umgehung einzelner Heterodimere ermöglichen. Das Set aus drei Derivaten von Wy14,643 mit identischem Chemotyp, aber drastisch unterschiedlichen Aktivitätsprofilen an den PPARs und RXRs ermöglicht eine intensive pharmakologische Untersuchung der beiden Rezeptorfamilien und deren Zusammenspiel. Außerdem entstand aus dieser Klasse einer der zurzeit fortschrittlichsten RXR-Agonisten. Zukünftig kann außerdem der im Zuge der Arbeit etablierte computergestützte Arbeitsablauf die Optimierung von Fettsäuremimetika deutlich beschleunigen.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Die 5-LO ist ein Schlüsselenzym der LT-Biosynthese. Sie katalysiert in einem ersten Schritt zunächst die Umsetzung freigesetzter AA zu 5-HPETE und wandelt diese anschließend in LTA4 um. LT sind starke Entzündungsmediatoren, die an entzündlichen und allergischen Reaktionen des Körpers beteiligt sind. Sie lösen eine Immunantwort aus und können zur Entstehung von Asthma bronchiale, allergischer Rhinitis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verschiedenen Krebserkrankungen beitragen [28]. NFS gehören zur Klasse der michaelreaktiven Verbindungen und inhibieren die 5-LO durch Interaktion mit katalytisch aktiven Cysteinresten in der Nähe der Substrateintrittspforte. Diese Tatsache macht michaelreaktive Verbindungen innerhalb der Entzündungsforschung zu einer interessanten Substanzklasse. Michaelreaktive Verbindungen besitzen eine durch Elektronenzug aktivierte Doppelbindung. Hierdurch verfügen diese Wirkstoffe über elekrophile Eigenschaften, wodurch sie leicht mit Nukleophilen reagieren können. Cysteine bestehen aus nukleophilen Thiolgruppen, die mit einer positiv polarisierten Doppelbindung, wie sie in michaelreaktiven Verbindungen vorliegt, reagieren können. Diese Tatsache kann sie zu effektiven und nachhaltigen Enzymaktivitätsmodulatoren machen. In dieser Arbeit wurde eine große Bandbreite verschiedenster michaelreaktiver Verbindungen auf ihre Fähigkeit untersucht, die 5-LO über Michael-Addition an ihren Cysteinen zu inhibieren. Zum einen wurden Pflanzeninhaltsstoffe mit antiinflammatorischen Eigenschaften, zugelassenene Wirkstoffe mit Michael-Akzeptorfunktion und zum anderen Verbindungen, die durch gezielte Struktursuche ausgewählt wurden, untersucht. Die Testung verschiedenster Strukturen sollte Aufschluss über strukturelle Voraussetzungen für die 5-LO-Inhibition durch Interaktion mit Cysteinen liefern. Hierfür wurden die Substanzen zunächst im intakten Zellsystem und schließlich am aufgereinigten Enzym (r5LO-wt) auf ihre 5-LO-inhibierenden Eigenschaften untersucht. Nachfolgende Messungen an r5LO-4C, deren vier prominente Cysteine durch Serin mutiert wurden, zeigten an, ob die Inhibition der 5-LO-Produktbildung cysteinabhängig war. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ganz bestimmte strukturelle Eigenschaften des Michael-Akzeptors, Voraussetzung für eine Interaktion mit den Cysteinen der 5-LO sind. Vor allem Verbindungen mit chinoidem Grundgerüst stellten sich als thiolreaktive Verbindungen heraus, die die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibierten. Weiterhin zeigten die erhaltenen Ergebnisse, dass die strukturelle Umgebung um die aktivierte Doppelbindung des Michael-Akzeptors enorme Auswirkungen auf die Thiolreaktivität hatte. TQ hemmte die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit Cysteinen, wohingegen die 5-LO-Inhibition durch Embelin unabhängig von Cysteinen zu sein schien. Eine daraufhin durchgeführte MALDI-MS-Analyse bestätigte die Bindung von NAPQI und TQ an die Cysteine 416 und 418. Durch diese Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass eine Reihe antiinflammatorisch wirksamer, natürlich vorkommender Verbindungen wie TQ, Plumbagin, Primin und auch synthetisch generierte Verbindungen wie AA861, CDDO, Methyl-BQ, Methoxy-BQ, Methoxy-Nitrostyren, NAPQI und OH-BQ die 5-LO über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die humane Leukotrien A4-Hydrolase untersucht.
Die hLTA4H ist ein bifunktionelles Enzym, welches neben der Hydrolaseaktivität, welche für die Umwandlung des instabilen LTA4 zu LTB4 verantwortlich ist, auch eine Peptidaseaktivität aufweist. Beide Enzymaktivitäten spielen bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle, weshalb die LTA4H ein interessantes pharmakologisches Target darstellt. Aufgrund der gegensätzlichen Eigenschaften der beiden Aktivitäten der LTA4H (Produktion des proinflammatorischen LTB4 durch die Hydrolase-Aktivität, sowie der Abbau des PGP-Tripeptids durch die Peptidase-Aktivität) wird deutlich, dass die Entwicklung selektiver Hydrolase-Inhibitoren von Vorteil ist.
Das Protein der humanen LTA4H konnte erfolgreich kloniert werden und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Zur Gewinnung des reinen rekombinanten Proteins konnte ein Aufreinigungsprotokoll mittels Nickel-Affinitätschromatographie sowie anschließender Größenausschlusschromatographie etabliert werden. Durch die Testung unterschiedlicher Lysemethoden konnte die Ausbeute deutlich erhöht werden.
Um herauszufinden, ob es durch den potentiellen Inhibitor zu einer Hemmung der Enzymaktivität kommt, muss diese detektiert werden können. Hierfür wurde ein geeignetes fluoreszenzbasiertes Testsystem zur Detektion der Enzymaktivität der hLTA4H entwickelt. Dies lässt auch die Quantifizierung der Wirksamkeit der möglichen Inhibitoren zu. Mit Hilfe eines pharmakophorbasierten Ansatzes wurden 22 Testsubstanzen für die in vitro Testung ausgewählt. Nach der Evaluierung dieser Substanzen wurden weitere 14 Derivate der besten Verbindung ausgewählt und ihre inhibitorischen Eigenschaften an rekombinanter LTA4H getestet. Die Ergebnisse wurden mittels Differential Scanning Fluorimetrie validiert, wofür ein einfaches Protokoll etabliert werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 5 bereits bekannte Inhibitoren der LTA4H ausgewählt, um sie hinsichtlich ihres thermodynamischen Profils zu untersuchen. Hierzu wurden die ausgewählten Inhibitoren mittels Isothermer Titrationskalorimetrie vermessen. Die Dissoziationskonstanten der untersuchten Inhibitoren wurden ebenfalls mittels Differential Scanning Fluorimetrie bestimmt, wobei sich zeigte, dass diese Methode nicht zur präzisen Messung von Protein/Ligand Interaktionen herangezogen werden kann. Mittels eines in silico Ansatzes zur Vorhersage von stabilisierten und destabilisierten Wassermolekülen in der Bindetasche konnten die thermodynamischen Daten im strukturellen Kontext interpretiert werden. Durch diese Kombination konnten neue Erkenntnisse zum Design neuer Inhibitoren der LTA4H gewonnen werden.
Die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAPII) ist der zentrale Faktor für die Umsetzung des genetischen Codes in funktionelle Proteine. Durch die Transkription wird die statische Information der DNA in ein transient nutzbares RNA-Molekül umgewandelt. Bei diesem fundamentalen Prozess der Genexpression wird ein spezifischer DNA-Abschnitt des Genoms abgelesen und in die komplementäre RNA transkribiert, die entweder direkt regulatorische bzw. funktionelle Aufgaben in der Zelle übernimmt oder als Matrize für die Proteinbiosynthese dient. Zur Erhaltung der Funktionalität eines Organismus und zur schnellen und gezielten Reaktion auf exogene Reize ist eine strikte Regulation der Transkription und der zahlreichen beteiligten Faktoren notwendig. Aufgrund der zentralen Rolle in der Genexpression ist diese Regulation äußerst vielschichtig und erfordert eine feinabgestimmte Maschinerie an Enzymen und Transkriptionsfaktoren, deren genaue Wirkungsweise und Abhängigkeit noch nicht vollständig verstanden sind. Fehler in der Transkriptionsregulation werden mit einer Reihe von schwerwiegenden metabolischen Störungen und der möglichen malignen Transformation der betroffenen Zelle in Verbindung gebracht.
Während einige Regulationsmechanismen der RNAPII bereits seit längerer Zeit beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAPII-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAPII bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Transkriptionsinitiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieses promotornahen Arrests wird durch den positiven Transkriptions-Elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAPII und assoziierter Faktoren den Übergang in die produktive Transkriptionselongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch die Inkorporation in inhibierende Speicherkomplexe (7SK snRNPs), bestehend aus der 7SK snRNA und mehrerer assoziierter Proteine. Abseits des 7SK snRNP wurde P-TEFb als Bestandteil großer Multiproteinkomplexe identifiziert, die einen positiven Einfluss auf die Transkriptionselongation besitzen. Die Transition von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in diese sogenannten Superelongationskomplexe (SECs) stellt einen der zentralen Regulationsmechanismen der eukaryotischen Transkription dar, ist jedoch noch nicht ausreichend verstanden.
Ein zentrales Element aller SECs bilden die Mitglieder der AF4/FMR2-Proteinfamilie, darunter das AF4 Protein, dem neben der Erhaltung der strukturellen Integrität mittlerweile auch eine Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb zugeschrieben wird. Dabei scheint AF4 jedoch auf die Hilfe bislang noch nicht charakterisierter Faktoren angewiesen zu sein. AF4 ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die Translokation t(4;11)(q21;q23) bedingten, akuten lymphoblastischen Leukämie assoziiert.
Das zentrale Thema dieser Arbeit stellen Untersuchungen zum Transfer von P-TEFb aus dem 7SK snRNP zum AF4-Protein dar. Dabei konnte zunächst die DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 als Integraler Bestandteil der AF4-SECs identifiziert werden, der bereits eine Funktion in der Kontrolle des microRNA- wie auch des mRNA-Metabolismus zugeschrieben werden konnte. Aus diesem Grund wurde von uns eine mögliche Beteiligung von DDX6 an der Rekrutierung von P-TEFb zum AF4-SEC durch Modulationen der 7SK snRNA postuliert. Des Weiteren konnte eine Bindefähigkeit von DDX6 gegenüber der 7SK snRNA sowie eine direkte Korrelation zwischen des zellulären DDX6-Proteinlevel und der Akkumulation von P-TEFb im AF4-SEC nachgewiesen werden. Sowohl die Überexpression von DDX6 als auch die von AF4 resultierten in einer gesteigerten mRNA-Produktion, wobei die Ergebnisse auf einen kooperativen Mechanismus zwischen den beiden Proteinen in der Aktivierung der Transkription hindeuteten. Außerdem konnte die These einer DDX6-vermittelten Aktivierung von P-TEFb anhand von Expressionsanalysen des bekannten P-TEFb Zielgens HEXIM1, dessen Expression im Zusammenhang eines negativen Rückkopplungsmechanismus gesteigert wird, bestätigt werden. Damit konnte der DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 in dieser Arbeit das erste Mal eine entscheidende Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in den AF4-SEC, und somit an der Kontrolle der eukaryotischen Transkription, zugeschrieben werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Anaylsenmethoden zur Quantifizierung von Ceramiden und Prostanoiden in verschiedenen biologischen Matrices unter Verwendung von Nano-LC gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie entwickelt und bei diversen biologischen Fragestellungen angewendet.
Die analytische Methode zu Quantifizierung der Ceramide ermöglichte deren Bestimmung in einem Probenvolumen von 2 μL CSF. Diese neu entwickelte Methode ist die erste publizierte Nano-LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung der Ceramide in biologischen Proben, gleichzeitig ist es auch diejenige analytische Methode mit der höchsten Empfindlichkeit [171]. Die beschriebene Methode umfasste die Substanzen C8:0, C16:0, C18:1, C18:0, C20:0, C24:1 und C24:0 Ceramid, als interner Standard wurde C17:0 Ce-ramid verwendet. Die Probenaufarbeitung bestand in einer einfachen Proteinfällung und Verdünnung mit Methanol, die chromatografische Trennung der Analyten erfolgte mit einer RP-C8 Säule unter Verwendung eines Gradientenprogramms. Die Methode wurde anhand von FDA-Richtlinien bezüglich Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit und Autosampler-Stabilität validiert. Die erreichten Bestimmungsgrenzen betrugen 0,225 pg auf der Säule (2,25 pg/μL CSF) für alle Ceramide außer C24:0 Ceramid, für das der Wert von 0,75 pg auf der Säule (7,5 pg/μL CSF) ermittelt wurde. Mit der durchgeführten Validierung wurde die Zuverlässigkeit der Methode für die Quantifizierung der Ceramide in CSF gezeigt. Mit einem Standardadditionsexperiment konnte belegt werden, dass PBS als Ersatzmatrix für CSF geeignet ist und somit die Ergebnisse der Validierung mit dotierten PBS-Proben auf CSF-Proben übertragbar sind. Das entwickelte Verfahren wurde für die Quantifizierung der Analyten in murinen CSF-Proben im Rahmen eines Projekts zur Erforschung der Rolle der Ceramide bei Multipler Sklerose angewendet. Anhand der Ergebnisse wurde die Hypothese bestätigt, dass die Konzentration von C16:0 Ceramid in CSF von EAE-Mäusen erhöht ist.
Die zweite entwickelte Nano-LC-MS/MS-Methode ermöglichte die Quantifizierung der Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 in einer geringen Anzahl Immunzellen. Für eine erfolgreiche Bestimmung der Analyt-Konzentrationen waren nur 5.000 T-Zellen oder 40.000 Mastzellen erforderlich. Damit ist die beschriebene Methode geeignet für die Quantifizierung in Zellen, die durch Isolation aus tierischen Geweben oder Organen erhalten werden, ohne dass das Vereinigen mehrerer Proben erforderlich ist. Durch die Messung dieser bestimmten Zellpopulationen kann, im Unterschied zur Vermessung des gesamten Organs, eine differenziertere Analyse der Lokalisation der gemessenen Analyten erfolgen. Mittels der entwickelten Methode konnten die Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 quantifiziert werden. Als interner Standard stand für jedes dieser Prostanoide ein vierfach deuteriertes Strukturanalogon zur Verfügung. Die Aufarbeitung der Immunzell-Proben erfolgte durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat, die Chromatografie wurde mit einer RP-C8-Säule und einem Gradientenprogramm durchgeführt. Eine Validierung erfolgte für die Quantifizierung in T-Lymphozyten und Mastzellen für die Parameter Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit, Wiederfindung, Selektivität und Stabilität. Auch ein Standardadditionsexperiment mit beiden Matrices wurde durchgeführt. Die Bestimmungsgrenzen betrugen 75 fg auf der Säule für PGE2 und PGD2 sowie 112,5 fg für 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2, damit zeichnet sich die Methode durch höchste Empfindlichkeit aus. Die Me-thode wurde zur Messung der Prostanoid-Konzentration in T-Zellen, die im Rahmen eines Kontaktallergie-Modells aus dem Blut von unterschiedlich behandelten Mäusen isoliert worden waren, angewendet. Es konnte kein Unterschied in den Prostanoid-Konzentrationen in den T-Zellen sensibilisierter und nicht-sensibilisierter bzw. provozierter und nicht-provozierter Mäuse festgestellt werden. Bei einer zweiten Anwendung wurden die Prostanoide in murinen Mastzellen, die nach Zymosan-Injektion in die Hinterpfote zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Auslösen der Entzündung aus dem entstandenen Ödem isoliert worden waren, gemessen. Zusätzlich für diese Anwendung wurden einige Leukotriene in die Methode integriert. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen von PGE2, PGD2 und PGF2α in Mastzellen nach der Injektion von Zymosan-Injektion ansteigen, wobei die gemessenen Konzentrationen für PGE2 48 Stunden nach der Injektion verglichen mit denen nach 24 Stunden, bezogen auf die anderen beiden Prostaglandine, am stärksten ansteigen. Außerdem wurde mittels der für die Immunzellen entwickelten Methode die Prostanoide in murinem Urin, humanem Plasma und humaner Tränenflüssigkeit quantifiziert.
Zusammenfassend ermöglichen die entwickelten Methoden die Analyse geringer Ana-lytkonzentrationen in sehr kleinen Probenmengen und damit eine Reduktion von Versuchstierzahlen und Kosten.
In dieser Arbeit wurde YM155 anhand eines Neuroblastom-Zellmodells bezüglich seiner antitumoralen Wirkung, sowie möglicher Resistenzmechanismen untersucht. Mit Hilfe eines Viabilitäts-‚Screenings‘ wurde eine Auswahl von 113 chemosensitiven und chemoresistenten Neuroblastomzellen auf mögliche Kreuzresistenzen gegen YM155 untersucht. Hinsichtlich der IC50 Werte gegen YM155, lagen insgesamt 74 % der untersuchten Zelllinien im therapeutisch erreichbaren Bereich von unter 50 nM. Zusätzlich wurden Neuroblastom-, Mammakarzinom- und Prostatakarzinomzellen an eine klinisch relevante YM155 Konzentration adaptiert. Diese zeigten wiederum, dass durch die Adaptierung hervorgerufene Expressionsänderung des ABC-Transporters ABCB1 und des ‚solute carrier‘ Protein SLC35F2 eine bedeutsame Rolle hinsichtlich des Resistenzmechanismus gegen YM155 spielen. Durch den Einsatz von spezifischen ABCB1-Inhibitoren, als auch durch siRNA-vermittelte Reduzierung von ABCB1 konnte eine Abhängigkeit für die Wirksamkeit YM155 von ABCB1 in Neuroblastomzellen bestätigt werden. Des Weiteren wurde in den untersuchten Zelllinien ein Zusammenhang zwischen der Wirkung von YM155 und der Expression des ‚solute carrier‘ Proteins SLC35F2 hergestellt. Dazu wurden Zellen mit verminderter SLC35F2 Expression verwendet, welche durch Transduktion mit einem für eine SLC35F2 spezifische shRNA kodierenden Vektor etabliert wurden. Dabei führte eine verminderte SLC35F2 Expression zu einer starken Minderung der Sensitivität gegen YM155. Das Zusammenspiel dieser beiden Transporter und der damit verbundene Resistenzmechanismus gegen YM155, konnte in fast allen etablierten YM155-resistenten Zelllinien (UKF-NB-3rYM15520, 22RV1rYM155300, PC-3rYM15520, HCC-1806rYM15520 und MDA-MB-231rYM15520) gezeigt werden. Wobei diese Zellen unabhängig von der Tumorentität als Resistenzmechanismus gegen YM155 entweder eine signifikant induzierte ABCB1 Expression (verstärkter YM155 Efflux) und/oder eine verminderte SLC35F2 Expression (verringerter YM155 Influx) entwickelten. Außerdem konnte mit Hilfe der p53-depletierten Zelllinie UKF-NB-3pc-p53 eine Abhängigkeit der YM155 Wirkung vom Tumorsuppressor p53 nachgewiesen werden, wobei es durch die Depletierung von p53 zu einer verminderten Sensitivität der Zellen gegen YM155 kam. Zudem kam es durch die Nutlin-3 hervorgerufene p53 Aktivierung und Akkumulierung zu einer Verstärkung der YM155 Wirkung in den untersuchten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der p53 Status von Zellen einen Einfluss auf deren YM155 Resistenz haben kann. Da in der Behandlung von Neuroblastomen neben der Chemotherapie auch Bestrahlung eingesetzt wird, wurde zusätzlich untersucht ob eine Adaptierung von Neuroblastomzellen an YM155 zu einer verminderten Sensitivität gegen Bestrahlung führen kann. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten UKF-NB-3 Zelllinien (UKF-NB-3 und UKF-NB-3rYM15520) eine ähnliche Sensitivität gegenüber der Bestrahlung aufwiesen, konnte kein Zusammenhang zwischen einer Adaptierung an YM155 und der Ausbildung einer Bestrahlungsresistenz gezeigt werden.
Ein weiterer wichtiger Teil dieser Arbeit war es, den primären Wirkmechanismus von YM155 in Neuroblastomzellen zu untersuchen. In vorangegangenen Studien wurde die vom Hersteller beschriebene Wirkung von YM155 als Survivin-Inhibitor in Frage gestellt. Stattdessen soll der primäre Apoptose-induzierende Effekt in erster Linie durch DNA-Schäden hervorgerufen werden, während die Survivin Inhibierung lediglich darauf folgen soll. In einer zeitlichen und konzentrationsabhängigen Kinetik der YM155 Behandlung konnte in UKF-NB-3 Zellen der genaue Zeitpunkt der Survivin-Inhibierung und der Induktion der DNA-Schadensantwort ermittelt werden. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass in Neuroblastomzellen als Antwort auf die YM155 Behandlung zuerst eine Survivin-Inhibierung erfolgt, und die DNA-Schadensantwort als Folge dieser induziert wird. Darüber hinaus belegte die siRNA-vermittelte Survivin-Inhibierung in UKF-NB-3 und UKF-NB-6, dass eine fehlende Survivin Expression die DNA-Schadensantwort induziert.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals in YM155 adaptierten Neuroblastomzellen der Resistenzmechanismus gegen YM155 näher untersucht werden und darüber hinaus wurde demonstriert, dass die Wirkung von YM155 in Neuroblastomzellen nicht auf die Induktion der DNA-Schadensantwort beruht, sondern primär auf die Survivin-Inhibierung zurückzuführen ist.