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Almost two decades ago, microRNAs were discovered as novel posttranscriptional regulators of gene expression. Since then, research efforts have uncovered their involvement in the control of various cellular processes including migration, proliferation and cell survival. Even more complex events, such as the formation of new blood vessels or organ development, have been shown to be tightly regulated and orchestrated by microRNAs. Due to their crucial regulatory role in tissue homeostasis in vertebrates, it does not come as a big surprise that dysregulated microRNA ex-pression is associated with pathology of diverse diseases. In this regard, the miR-17-92 cluster is a prime example since it has become famous for its amplified expression in tumours and its on-cogenic potential. Our lab demonstrated the expression of the members of the miR-17-92 cluster, namely miR-17, -18a, -19a, -20a, -19b and -92a, in endothelial cells and provided evidence for the anti-angiogenic activity of miR-92a in ECs as well as its important regulatory role in tissue re-covery after ischemia. In this work we addressed the function of the remaining members of the miR-17-92 cluster, i.e. miR-17, miR-18a, miR-19a and miR-20a, in endothelial cells and angiogenesis. Surprisingly, the individual members all displayed anti-angiogenic properties in endothelial cells in vitro, although overexpression of the whole cluster in transformed colonocytes was shown to promote tumour angiogenesis in a mouse model. In this context, we provide evidence that the individual miRs differentially affect the paracrine angiogenic activity of endothelial and tumour cells. Moreover, Antagomir-mediated inhibition of miR-17/20 in a mouse tumour model did not affect tumour angi-ogenesis, although miR-17/20 inhibition profoundly increased vascularization of Matrigel plugs. Thus, our research efforts suggest a differential involvement of the members of the miR-17-92 cluster in physiological and tumour angiogenesis. Additionally, we identified Janus kinase (JAK) 1 as a novel miR-17 target in endothelial cells and demonstrated the involvement of JAK1 in angio-genesis and in the phosphorylation of STAT3 in response to different cytokines in vitro. Overall, inhibition of specific members of the miR-17-92 cluster might represent an attractive therapeutic strategy to enhance angiogenesis in ischemic diseases. In the second part of the present work we investigated the therapeutic value of Antagomir-mediated microRNA inhibition in animal models of pulmonary arterial hypertension. Collectively, inhibition of miR-17 by the respective Antagomir revealed a significant improvement of pulmonary hemodynamics and cardiac function in both the chronic hypoxia mouse model and the mono-crotaline-induced lung injury rat model. Histomorphometric analysis of the lungs of the pulmonary hypertensive mice and rats uncovered a significant reduction of disease associated musculariza-tion of pulmonary arteries in Antagomir-17 treated animals compared to the control animals indicating interference with smooth muscle cell proliferation or survival. Probing of lung tissue of the pulmonary hypertensive rats for selected miR-17 targets uncovered a profound increase in the expression of the cyclin dependent kinase inhibitor p21 in the Antagomir-17 treated rats suggest-ing that inhibition of miR-17 impairs proliferation by impeding cell cycle progression. Analysis of miR-17 function in human smooth muscle cells in vitro corroborated the results from the animal experiments by demonstrating pro-proliferative activity of miR-17 and decreased levels of p21 in these cells. Collectively, our results indicate that Antagomir-17 improves pulmonary hemodyna-mics and cardiac function by interfering with vascular remodelling within the lung. Hence, inhibi-tion of miR-17 might be of therapeutic value to ameliorate the disease pattern in pulmonary arte-rial hypertension. In summary, the present work provides insights into the regulatory functions of members of the miR-17-92 cluster, especially miR-17, in blood vessels and suggests that specific inhibition of members of the miR-17-92 cluster might be a novel option to treat vascular diseases.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) is a pulsed EPR method that can reliably and precisely provide structural information regarding duplex RNAs and DNAs by measuring long-range distances (1.5-7 nm) utilizing distance-dependent magnetic dipole-dipole interaction between two nitroxide spin labels. In this thesis the application field of PELDOR spectroscopy has been expanded. For the first time the global architecture of tertiary folded RNA has been mapped in vitro. Moreover, the first application of PELDOR for determining structural aspects of RNA and DNA molecules inside cells has been presented. RNA has the central role in cellular processes and gene regulation. It can adopt complex three dimensional structures, which in combination with its conformational dynamics is essential for its function as biological catalyst, structural scaffold and regulator of gene expression. Riboswitches are cis-acting RNA segments that modulate gene expression by direct binding of small molecules with high affinity and specificity. Neomycin-responsive riboswitch is an engineered riboswitch developed by combination of in vitro selection and in vivo screening. Upon insertion into the 5‟ untranslated region of mRNA and binding the cognate ligand it is able to inhibit translational initiation in yeast. Using enzymatic probing the secondary structure had been postulated comprising global stem-loop architecture with a terminal and an internal loop. In the first part of this thesis, the global conformational arrangement of this 27 nucleotides long RNA element has been studied by means of site-directed spin labeling and PELDOR spectroscopy. Spin-labeled neomycin-responsive riboswitch mutants were synthesized via a Sonogashira cross-coupling reaction between 5-membered pyrroline ring based nitroxide radical (TPA) and 5-iodo-uridine. The labeling positions were chosen outside of the binding pocket and UV melting curves revealed that spin-labeling neither disturbs the secondary structure nor interferes with ligand binding. Efficient ligand binding was proven by thermal stabilization of 20.3±3.3 oC upon addition of neomycin, as well as by cw EPR spectra. PELDOR time traces with long observation time windows and with good signal to noise ratio and modulation depth were recorded for all double-labeled samples allowing a reliable data analysis. The fact that there were no shifts in the measured distances upon addition of neomycin implied the existence of a prearranged tertiary structure of the neomycin-sensing riboswitch without a significant global conformational change induced by ligand binding. Measured distances were in very good agreement with the NMR structure of the ligand-bound state of the riboswitch indicating the intrinsic propensity of the global RNA architecture toward its energetically favored ligand-bound form at low temperature. The results harvested in this work represent the first application of PELDOR for mapping the global structure of a tertiary folded RNA. In the second part of this thesis the possibility of applying PELDOR on nucleic acids (NAs) in cellular environment has been investigated. It was shown before that global NA structure depends on matrix conditions, such as concentration of ions and small molecules, molecular crowding, viscosity and interactions with proteins. Therefore, PELDOR spectroscopy on a double-labeled 12-base pair DNA duplex, the 14-mer cUUCGg tetraloop hairpin RNA and the 27-mer neomycin-sensing riboswitch has been used to obtain long-range distance constraints on such systems in Xenopus laevis oocytes and to compare them with in vitro measurements. The reduced lifetime of nitroxide spin labels under cellular conditions has been a major challenge in these measurements. Investigation of nitroxide reduction kinetics in-cell has revealed that the 5-membered pyrrolidine and pyrroline rings are significantly slower reduced compared to 6-membered piperidine ring based nitroxides. Due to prolonged lifetime of the TPA nitroxides covalently attached to NA molecules PELDOR signals could be measured with good signal-to-noise ratios up to 70 minutes of incubation time. The partial loss of coupled spin labels due to nitroxide reduction only led to a decrease in the modulation depth upon increasing the incubation time. No alterations in the measured distances between in vitro and in-cell experiments implies the existence of stable overall conformations of the 14-mer cUUCGg tetraloop hairpin RNA and the 27-mer neomycin-sensing riboswitch, whereas the 12-bp duplex DNA experiences stacking in-cell but retaining the secondary structure. Thus, for the first time nanometer distance measurements were performed inside cells, clearly laying a foundation for the application of PELDOR spectroscopy to study biological processes in cells, such as diffusion, interaction with proteins and other factors or chemical reactions.
In Nervensystemen werden zahlreiche Informationen wahrgenommen und verarbeitet um ein adäquates Verhalten hervorzurufen. Für die Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge hierbei wurden verschiedene Methoden entwickelt, die eine gezielte Manipulation neuronaler Prozesse ermöglichen. Durch Analyse der resultierenden Effekte können dabei synaptische Proteine, einzelne Neuronen oder neuronale Netzwerke funktionell charakterisiert werden. Bisherige Ansätze verfügen jedoch nur über eine geringe zeitliche und räumliche Auflösung oder erlauben lediglich eine eingeschränkte Anwendung im frei beweglichen Tier.
Diese Nachteile können durch die heterologe Expression von lichtgesteuerten, mikrobiellen Rhodopsinen zur gezielten Manipulation des Membranpotentials umgangen werden. So induziert die Photoaktivierung des Kationenkanals Channelrhodopsin 2 (ChR2; (Nagel et al., Curr Biol 2005)) eine Depolarisation, während die Chloridpumpe Halorhodopsin (NpHR; (Zhang et al., Nature 2007)) für die Hyperpolarisation verwendet werden kann. Dabei ermöglichen die schnellen Kinetiken der Rhodopsine eine zeitlich präzise Steuerung des Membranpotentials. Durch Auswahl geeigneter Promotoren ist zudem oftmals eine zell spezifische Expression möglich. Dieser Ansatz wird daher allgemein als Optogenetik bezeichnet.
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst konventionelle Techniken genutzt, um die Funktion von zwei assoziierten Proteinen eines Acetylcholin Rezeptors in C. elegans zu untersuchen. Des Weiteren wurden verschiedene Methoden für den Fadenwurm entwickelt und angewendet, die die Vorteile optogenetischer Techniken für die funktionelle Charakterisierung synaptischer Proteine und neuronaler Netzwerke nutzbar machen. Hierbei erlaubt die Transparenz von C. elegans die optogenetische Stimulation im lebenden Organismus unter nicht invasiven Bedingungen. Weitere Vorteile von C. elegans als neurobiologischem Modellorganismus liegen in seiner einfachen Handhabung (Hope, 1999) und der stereotypen Entwicklung seines Nervensystems mit bekannten anatomischen Ausprägungen (Sulston and Horvitz, Dev Biol 1977; Varshney et al., PLoS Comput Biol 2011; White et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1986). Durch ihre Häufigkeit und die experimentelle Zugänglichkeit wird hierbei die neuromuskuläre Synapse oftmals zur Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung genutzt (Von Stetina et al., Int Rev Neurobiol 2006). Durch pharmakologische (Lewis et al., Neuroscience 1980; McIntire et al., Nature 1993; Miller et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1996; Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) und elektrische Stimulation (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) können dabei Defekte der Transmission hervorgehoben werden, während Verhaltensexperimente oder elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme in Muskelzellen eine quantitative Analyse ermöglichen (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999).
Diese Methoden wurden für die funktionelle Charakterisierung von NRA 2 und NRA 4 verwendet, die beide als akzessorische Proteine zusammen mit dem Levamisol sensitiven Acetylcholin Rezeptor der Körperwandmuskelzellen aufgereinigt wurden (Gottschalk et al., EMBO J 2005). Dabei konnte gezeigt werden, dass NRA 2 und NRA 4 im Endoplasmatischen Retikulum (ER) der Muskelzellen einen Komplex bilden, der die Sensitivität von beiden nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren gegenüber verschiedenen cholinergen Agonisten verändert. In diesem Zusammenhang wurde auch nachgewiesen, dass die Oberflächenexpression einzelner Untereinheiten der beiden Rezeptoren durch NRA 2/4 beeinflusst wird. Diese Resultate legen die Vermutung nahe, dass beide Proteine die Zusammensetzung der Rezeptoren und somit ihre pharmakologischen Eigenschaften modulieren. Denkbar ist dabei eine regulatorische Funktion bei der Assemblierung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Rezeptor oder bei der Kontrolle des ER Austritts von Rezeptoren mit bestimmter Zusammensetzung. In dieser Hinsicht konnte jedoch keine Interaktion von NRA 2/4 mit der Notch Signalkaskade nachgewiesen werden, wie sie für die homologen Proteine nicalin und NOMO in Vertebraten gezeigt wurde (Haffner et al., J Biol Chem 2007; Haffner et al., EMBO J 2004).
Für die Untersuchung synaptischer Proteine durch optogenetische Techniken wurde ChR2(H134R) selektiv in cholinergen oder GABAergen Motorneuronen exprimiert, um die akute und lichtgesteuerte Freisetzung des jeweiligen Neurotransmitters zu ermöglichen. Die resultierende Stimulation bzw. Inhibition von Muskelzellen wurde hierbei durch elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme und durch Analyse von Kontraktionen respektive Relaxationen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass Störungen der synaptischen Reizweiterleitung die Ausprägung und Dynamik dieser lichtinduzierten Effekte beeinflussen und dadurch charakterisiert werden können. So zeigten beispielsweise Mutanten von Synaptojanin und Endophilin nachlassende Effekte bei anhaltender oder wiederholter Stimulation, was durch die gestörte Regeneration synaptischer Vesikel erklärt werden kann (Harris et al., J Cell Biol 2000; Schuske et al., Neuron 2003; Verstreken et al., Neuron 2003).
Die hohe Sensitivität dieser Methode wurde im Nachfolgenden dazu verwendet, die Inhibition cholinerger Motorneuronen durch den metabotropen GABAB Rezeptor zu untersuchen, der in C. elegans aus den beiden Untereinheiten GBB 1 und GBB 2 gebildet wird (Dittman and Kaplan, J Neurosci 2008; Vashlishan et al., Neuron 2008). Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass diese heterosynaptische Inhibition verschiedene lokomotorische Verhaltensweisen der Tiere beeinflusst. Für die mechanistische Untersuchung wurden anschließend cholinerge Motorneuronen durch ChR2(H134R) photoaktiviert, während resultierende Kontraktionseffekte in Abhängigkeit von GBB 1/2 analysiert wurden. Um hierbei die Funktion von GBB 1/2 durch erhöhte GABA Konzentrationen hervorzuheben, wurden zusätzlich GABAerge Motorneuronen optogenetisch stimuliert oder die Wiederaufnahme von GABA aus dem synaptischen Spalt durch Mutation des Membran ständigen GABA Transporters blockiert. So konnte gezeigt werden, dass GBB 1/2 eine akute Inhibition der cholinergen Motorneuronen bewirken, was vermutlich für die Regulation von Bewegungsabläufen eine wichtige Rolle spielt. Die geringe Dynamik der GBB 1/2 induzierten Effekte deutet allerdings darauf hin, dass die synaptische Aktivität durch den metabotropen Rezeptor kaum nachhaltig moduliert wird.
In nachfolgenden Versuchen wurde die optogenetische Stimulation von Motorneuronen außerdem mit der elektronenmikroskopischen Analyse der präsynaptischen Feinstruktur kombiniert. Dadurch konnte die Dynamik der Exozytose und Endozytose synaptischer Vesikel (SV) in Abhängigkeit von neuronaler Aktivität untersucht werden. So wurde gezeigt, dass synaptische Vesikel nahe der aktiven Zone während einer 30 sekündigen Hyperstimulation nahezu komplett aufgebraucht waren. Die vollständige Regeneration der SV Pools benötigte anschließend etwa 12 Sekunden und erfolgte zunächst in der Peripherie der aktiven Zone, was auf eine laterale Heranführung der Vesikel schließen lässt. Nach etwa 20 Sekunden erholte sich ebenfalls die Wirksamkeit der Stimulation von Muskelzellen durch die Motorneuronen, was durch elektrophysiologische Messungen der photo induzierten post synaptischen Ströme gezeigt wurde. Während der Hyperstimulation bildeten sich außerdem große vesikuläre Strukturen, die sich anschließend nach etwa acht Sekunden wieder aufgelöst hatten. In Analogie zu vergleichbaren Experimenten in anderen Organismen liegt die Vermutung nahe, dass es sich dabei um Zwischenprodukte der so genannten Bulk Phase Endozytose handelt, die das Clathrin abhängige Recycling von synaptischen Vesikeln bei starker neuronaler Aktivität ergänzt (Heuser and Reese, J Cell Biol 1973; Miller and Heuser, J Cell Biol 1984; Richards et al., Neuron 2000). Bemerkenswerterweise war der Abbau der vesikulären Strukturen in Synaptojanin und Endophilin defizienten Tieren stark verzögert. Denkbar ist, dass beide Proteine für die Synthese von synaptischen Vesikeln aus den vesikulären Zwischenprodukten der Bulk Phase Endozytose wichtig sind, analog zur ihrer Funktion bei der Clathrin abhängigen Endozytose an der Plasmamembran.
Durch die zielgerichtete Manipulation der Zellaktivität ermöglichen optogenetische Techniken außerdem die funktionelle Charakterisierung von Neuronen und neuronalen Netzwerken. Um die zelluläre Spezifität dieses Ansatzes zu erhöhen, wurde ein Tracking System entwickelt das die Position frei beweglicher Tiere in Echtzeit bestimmt und nachverfolgt. Dadurch konnte die Photoaktivierung optogenetischer Proteine auf definierte Bereiche der Fadenwürmer und somit auf ausgewählte Neuronen innerhalb der Expressionsmuster von verwendeten Promotoren eingeschränkt werden. Des Weiteren ermöglichte hierbei die Auswertung translatorischer Parameter die Analyse verschiedener lokomotorischer Merkmale wie Geschwindigkeit, Bewegungsbahn oder Ausprägung der Körperbiegungen. Dieses System wurde beispielhaft für die konzertierte Photoaktivierung durch ChR2(H134R) bzw. Photoinhibition durch MAC von zwei verschiedenen Gruppen von Neuronen angewendet, um die Integration mechanosensorischer Informationen durch Command Interneuronen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde zudem eine Rekombinase basierte Methode für optogenetische Proteine adaptiert, die die Transkription auf die zelluläre Schnittmenge von zwei verschiedenen Promotoren einschränkt und somit die Spezifität der Expression erhöht. Idealerweise kann dieser Ansatz außerdem mit der gezielten Photoaktivierung kombiniert werden, um die zelluläre Selektivität optogenetischer Anwendungen weiter zu verbessern.
Weiterhin ist die Anwendung optogenetischer Techniken bisher durch intrinsische Eigenschaften der verwendeten Rhodopsine auf die relativ kurzzeitige Manipulation des Membranpotentials von Zellen beschränkt. So benötigt ChR2 durch die schnelle Schließung seines offenen Kanals eine kontinuierliche Photoaktivierung, um eine andauernde Depolarisation hervorzurufen. Dies ist jedoch potentiell mit phototoxischen und – besonders bei C. elegans – phototaktischen Nebeneffekten verbunden. Deswegen wurden diverse Mutanten von ChR2 mit stark verlangsamter Inaktivierung (Berndt et al., Nat Neurosci 2009) für ihren Nutzen zur Langzeit Stimulation von erregbaren Zellen im Nematode getestet. Dabei wurde gezeigt, dass ChR2(C128S) durch einen kurzen Photostimulus mit vergleichsweise niedriger Intensität eine anhaltende Depolarisation über mehrere Minuten auslösen kann. Die wiederholte Stimulation in ASJ Neuronen ermöglichte zudem eine langzeitige Depolarisation über mehrere Tage, wodurch die genetisch veranlagte Entwicklung von Tieren manipuliert werden konnte. Durch gezielte Punktmutation konnten außerdem relevante Eigenschaften von ChR2(C128S) für die Langzeit Stimulation weiter verbessert werden.
Als weiteres optogenetisches Werkzeug wurde zudem die Photoaktivierbare Adenylatzyklase alpha (PACa) aus Euglena gracilis (Iseki et al., Nature 2002; Ntefidou et al., Plant Physiol 2003; Schroder-Lang et al., Nat Methods 2007) für die akute und lichtgetriebene Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP in C. elegans etabliert. Die Photoaktivierung von PACa in cholinergen Motorneuronen verstärkte dabei die Neurotransmitterfreisetzung und induzierte hyperlokomotorische Phänotypen, vergleichbar zu Mutanten mit erhöhten cAMP Konzentrationen.
Zusammengefasst wurden diverse optogenetische Techniken für C. elegans entwickelt und optimiert, die die zellspezifische und nicht invasive Manipulation des Membranpotentials beziehungsweise die Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP durch Licht im frei beweglichen Tier ermöglichen. Diese Methoden können zur gezielten Störung neuronaler Aktivität angewendet werden, um dadurch neurobiologische Fragestellungen im Fadenwurm zu untersuchen. Dies wurde beispielhaft für die Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung und die funktionelle Analyse neuronaler Netzwerke demonstriert. Denkbar ist außerdem, diese für C. elegans etablierten Methoden vergleichbar in anderen Modellorganismen anzuwenden. So sind die Fruchtfliege ebenso wie der Zebrafisch Embryo bereits für optogenetische Techniken erprobt (Arrenberg et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2009; Schroll et al., Curr Biol 2006). Für Säugetiere wie die Maus, die Ratte und den Makaken wurden zudem bereits Ansätze entwickelt, die die gezielte Photostimulation in lebenden und frei beweglichen Tieren ermöglichen (Han et al., Neuron 2009; Wentz et al., J Neural Eng 2011; Yizhar et al., Nature 2011; Zhang et al., Nat Rev Neurosci 2007).
Seit einigen Jahrzehnten ist Lysozym eines der am meisten erforschten Proteine in der Literatur und wird hauptsächlich als Modell Protein zur Aufklärung der Faltungs- und Entfaltungsprozesse genutzt. Da die Frage nach Fehlfaltung und deren Verknüpfung mit neurodegenerativen Krankheiten bis zum heutigen Tag nicht vollständig geklärt ist, besteht hier ein großer Spielraum für weitere Forschungsansätze. In der vorliegenden Arbeit wurden daher zwei Modellsysteme verwendet, Hühereiweiß-Lysozym und menschliches Lysozym, jeweils in ihrem nicht-nativen ungefalteten Zustand. Diese ungefalteten Ensembles wurden mit Hilfe NMR spektroskopischer Methoden untersucht und ergaben sehr detaillierte, zum Teil auch überraschende neue Einblicke in Struktur und Dynamik der beiden Proteine und liefern somit wichtige Erkenntnisse zu Faltungs- und Aggregationsprozessen. ...
Membrane proteins (MPs) constitute about 30% of the genome and are essential in many cellular processes. In particular structural characterisation of MPs is challenged by their hydrophobic nature resulting in expression difficulties and structural instability upon extraction from the membrane. Despite these challenges, progress in sample preparation and the techniques to solve MP structures has led to 281 unique MP structures as of January 2011. Through the combination of a cell-free expression system and selective labelling strategies, this thesis aimed to advance the structure determination of α-helical MPs by NMR spectroscopy and resulted in the structure determination of a seven-ransmembrane-helix protein. Results were obtained for the 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) and proteorhodopsin (PR). The detergent-based cell-free expression mode proved most efficient for production of both targets, but optimisation of FLAP and PR followed different routes. The presence of a retinal cofactor in PR greatly facilitated the search for an appropriate hydrophobic environment. For structural studies, NMR spectra of FLAP indicated favourable properties of the lysolipid LPPG. In contrast, PR was stable and homogenous in the short-chain lipid diC7PC. As NMR spectra of α-helical MPs are generally characterised by broad lines and signal overlap, selective labelling strategies were essential in the assignment process of both targets. For the backbone assignment of FLAP the transmembrane segment-enhanced (TMS) labelling was developed, employing the six amino acids AFGILV. These residues cluster predominantly in transmembrane helices and form long stretches allowing a large extent of backbone assignment. Besides that, the combinatorial labelling enables identification of unique pairs in the sequence based on a mixture of 15N and 1-13C-labelled amino acids. To find the optimal labelling pattern for a given primary structure, the UPLABEL algorithm has been made available and successfully applied in the backbone assignment of PR. Both selective labelling approaches greatly benefitted from the use of a cell-free expression system to reduce isotope scrambling. Additionally, the de novo structure of PR was determined with an average backbone rmsd of 1.2 Å based on TALOS-derived backbone torsion angles, intrahelical hydrogen bond restraints and distance restraints from the NOE and paramagnetic relaxation enhancement (PRE). A major bottleneck in the NMR structure determination of MPs concerns the number of long-range distances which are often limited. In PR, side chain assignment was enabled by stereo-array isotope labelling as well as selective labelling which provided 33 long-range NOEs. These NOEs stabilised the symmetry of the seven helix bundle. With a total number of 1031, the majority of long-range distances were derived from PREs. The structure of PR reveals differences to its homologues such as the absence of an anti-parallel β-sheet between helices B and C and allows conclusions towards the mechanism of colour tuning.
Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces
parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49
und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12).
In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten
mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden.
Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des
jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen
muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese-
Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des
Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces
lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als
Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium
keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei
wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten.
Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit
den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert
zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI
und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen
Elementen erlauben.
Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor
leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der
mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf
R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten
inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung
geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der
gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur
Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur
Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der
blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht
abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin.
Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der
Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des
Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein
isoliert werden konnte.
Das Ziel meiner Arbeit ist die zuverlässige quantenchemische Beschreibung der Absorptionsspektren von mittelgroßen Molekülen und das Studium von photoaktiven Pigmenten. Nach einer kurzen Einführung in das Thema "elektronisch angeregte Zustände und Photoreaktionen" beschreibe ich die Formalismen, die den verwendeten Rechenmethoden zu Grunde liegen und diskutiere die Anwendbarkeit auf größere Moleküle. Hierbei liegt ein Hauptaugenmerk auf den dichtefunktionaltheoriebasierten Methoden (DFT-Methoden), vor allem auf den Eigenschaften der zeitabhängigen Dichtefunktionaltheorie (engl.: time dependent density functional theory, TDDFT). Anschließend erfolgt eine Zusammenfassung der im Laufe dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse.
Die moderne Quantenchemie befasst sich mit der Anwendung der in den 20er und 30er Jahren des 20. Jahrhunderts entwickelten Quantenmechanik auf chemische Probleme. Zum theoretischen Studium von Molekülen gibt es verschiedene Ansätze. Zum einen gibt es die hochgenauen ab initio Methoden, die Näherungsverfahren zur elektronischen Schrödingergleichung sind. Sie haben den Vorteil systematisch verbesserbar und auf einem sehr soliden theoretischen Gerüst aufgebaut zu sein. Die Genauigkeit der Rechnungen kann die von experimentellen Ergebnissen erreichen, allerdings beschränkt der hohe Rechenaufwand die Anwendung solcher ab initio Methoden auf kleine Moleküle wie Wasser, Methan oder Benzol.
Am anderen Ende des Spektrums der quantenchemischen Methoden sind die "semiempirischen Methoden" angesiedelt. Sie erfordern nur einen sehr geringen Rechenaufwand, wodurch es möglich ist, sehr große Systeme mit mehr als 1000 Atomen zu beschreiben. Allerdings führt der Ansatz, verschiedene Terme der Schrödingergleichung durch an experimentelle Daten gefittete Parameter zu ersetzen, zu einer geringen Genauigkeit und unvorhersehbaren Fehlern. Dies schränkt die standardmäßige Anwendung dieser Methoden stark ein, und eine Verifizierung durch genauere Methoden ist oftmals erforderlich.
Zwischen diesen beiden Polen (hoch genau aber sehr hoher Rechenaufwand und geringer Rechenaufwand, dafür aber ungenau) stehen die auf der Dichtefunktionaltheorie (DFT) basierenden Methoden. Sie zeichnen sich durch eine gute Genauigkeit bei vergleichsweise geringem Rechenaufwand aus. Dadurch hat sich die DFT in den letzten Jahren zur beliebtesten Methode für das Studium mittelgroßer Moleküle mit bis zu 400 Atomen entwickelt. DFT ist eine formal exakte Methode, bei der die berechneten Größen aus der Elektronendichte des Systems abgeleitet werden. Elektronenaustausch- und Korrelationseffekte werden durch Funktionale, den sogenannten Austauschkorrelationsfunktionalen (engl.: exchange correlation functionals, xc-functionals) beschrieben.
Die zeitabhängige Dichtefunktionaltheorie (time dependent DFT, TDDFT) ermöglicht die Beschreibung elektronisch angeregter Zustände mit einer guten Genauigkeit, aber zu einem Bruchteil des Rechenaufwands von ab initio Methoden, was TDDFT zur Methode der Wahl für das Studium der Photochemie mittelgroßer Moleküle macht. Die Fehler in den Anregungsenergien sind in der Regel systematischer Natur und den verwendeten xc-funktionalen geschuldet. Dennoch kann TDDFT nicht als "black box" Methode verwendet werden, da nicht alle elektronischen Zustände gleich gut beschrieben werden. Während energetisch niedrig liegende, lokale π -> π* und n -> π* Zustände oftmals in sehr guter Übereinstimmung mit dem Experiment sind, können Rydberg und Ladungstransferzustände (engl.: charge transfer states, ct-states) Fehler von mehreren Elektronenvolt in der Anregungsenergie haben. Doppelt oder höher angeregte Zustände können mit standard TDDFT Methoden nicht beschrieben werden. Dies kann zu Problemen bei ausgedehnten π-Systemen führen, da z.B. die angeregten Zustände von Polyenen einen hohen Doppelanregungscharakter besitzen. Trotz alledem ist TDDFT eine sinnvolle Methode zum Studium elektronisch angeregter Zustände, da ihre Probleme bekannt sind und vor allem ihr Ursprung in der Theorie gut verstanden ist. Die meisten Probleme können durch die intelligente Wahl der verwendeten xc-Funktionale vermieden werden. Kombiniert man TDDFT mit der Konfigurationswechselwirkungsmethode mit Einfachanregungen (engl.: configuration ineraction singles, CIS) erhält man sehr zuverlässig und mit vergleichbar geringem Rechenaufwand die richtige Energiereihenfolge der angeregten Zustände. Mit dieser Methode war es in dieser Arbeit möglich, die komplexe Photochemie von Bisazomethinpigmenten zu untersuchen und die experimentellen statischen und zeitaufgelösten Spektren auf molekularer Ebene zu interpretieren. Es konnte sowohl der Mechanismus aufgeklärt werden, der für die Fluoreszenzlöschung in den nicht-fluoreszierenden Derivaten verantwortlich ist, als auch die unerwartet komplizierte Photochemie der fluoreszierenden Moleküle schlüssig erklärt werden. Auch die Photoisomerisierung von Z-Hemithioindigo-Hemistilbene (HTI) zu seine E-Form wurde mit dieser Methode untersucht.
Clathrin-mediated endocytosis (CME) involves spatially and temporally restricted molecular dynamics.
Although protein kinases and the actin cytoskeleton contribute to the process, whether and how
functions of kinases and actin are integrated remains unknown. Here, we demonstrate that neural
Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP) and protein kinase CK2 form a complex and localize on
clathrin-coated vesicles (CCVs). N-WASP binds to and is phosphorylated by CK2, thereby reducing the
kinase activity of CK2. By contrast, N-WASP-promoted actin polymerization is decreased upon both
phosphorylation and binding of CK2. Knockdown of N-WASP and CK2, alone or in combination, results
in impaired endocytosis of epidermal growth factor (EGF) and increased cell-surface levels of EGF
receptor (EGFR). In order to rescue the phenotype of N-WASP-CK2 knockdown cells, both N-WASP and
CK2 activities and abilities to assemble in a complex are required. In summary, this study shows that the
N-WASP-CK2 complex integrates in a single circuit different activities contributing to CME of EGFR and
that the interplay between the two proteins optimizes this process.
5-lipoxygenase (5-LO) catalyzes the first two steps in leukotriene (LT) biosynthesis. In a two step reaction the enzyme oxygenates arachidonic acid (AA) to form the highly unstable epoxide leukotriene A4 (LTA4) in dehydrating a hydroperoxide intermediate (20). LTA4 can then be further metabolized by two terminal synthases yielding either the potent chemoattractant leukotriene B4 (LTB4) or the cysteinyl leukotrienes (CysLTs). 5-LO enzyme expression is primarily found in mature leukocytes (22) where it can either reside in the cytoplasm or in the nucleus associated with euchromatin (29). Its enzymatic activity is embedded in a complicated network in intact cells regulating LT synthesis by various factors dependent on the cell type and nature of stimulus. Factors such as the amount of free AA released by phospholipase A2 enzymes, levels of enzymes involved, catalytic activity per enzyme molecule and availability of different small molecules influence 5-LO activity (36).
The 5-LO derived LTs are lipid mediators which were shown to primarily mediate inflammatory and allergic reactions and their role in the pathogenesis of asthma is well defined. CysLTs are among the most potent bronchoconstrictors yet studied in man and play an important role in airway remodeling. LTB4 has no bronchoconstrictory effects in healthy and asthmatic humans but displays potent chemoattractant properties on neutrophils and increases leukocyte adhesion to the vessel wall endothelium (22). Therefore, LTB4 enhances the capacity of macrophages and neutrophils to ingest and kill microbes. In concert with LTB4, histamine and prostaglandin E2 (PGE2) CysLTs are thought to maintain the tone of the human airways (82).
Besides their well studied role in asthma, 5-LO derived LTs have also been implicated to play a role in cardiovascular diseases and cancer. In contrast to healthy tissues, LT pathway enzymes and receptors were found to be abundantly expressed in cancer tissues, atherosclerotic lesions in the aorta, heart and carotid artery (86). Pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumour cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway (92, 93). In several studies LTs were found to exhibit cardiovascular actions by promotion of plasma leakage in postcapillary venules, coronary artery vasoconstriction and impaired ventricular contraction leading to reduced coronary blood flow and cardiac output (24). Unfortunately, the precise molecular mechanisms through which LTs influence carcinogenesis and cardiovascular diseases are still incompletely understood.
In contrast, an increasing number of studies questions the correlation between 5-LO and cancer (95-97) since extreme LT concentrations were applied to induce proliferative effects in the majority of the publications. A few studies exist which show susceptibility towards 5-LO products in physiological concentrations or achieve anti-proliferation by applying low concentrations of 5-LO inhibitors (98) ...