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Die 5-LO ist ein Schlüsselenzym der LT-Biosynthese. Sie katalysiert in einem ersten Schritt zunächst die Umsetzung freigesetzter AA zu 5-HPETE und wandelt diese anschließend in LTA4 um. LT sind starke Entzündungsmediatoren, die an entzündlichen und allergischen Reaktionen des Körpers beteiligt sind. Sie lösen eine Immunantwort aus und können zur Entstehung von Asthma bronchiale, allergischer Rhinitis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verschiedenen Krebserkrankungen beitragen [28]. NFS gehören zur Klasse der michaelreaktiven Verbindungen und inhibieren die 5-LO durch Interaktion mit katalytisch aktiven Cysteinresten in der Nähe der Substrateintrittspforte. Diese Tatsache macht michaelreaktive Verbindungen innerhalb der Entzündungsforschung zu einer interessanten Substanzklasse. Michaelreaktive Verbindungen besitzen eine durch Elektronenzug aktivierte Doppelbindung. Hierdurch verfügen diese Wirkstoffe über elekrophile Eigenschaften, wodurch sie leicht mit Nukleophilen reagieren können. Cysteine bestehen aus nukleophilen Thiolgruppen, die mit einer positiv polarisierten Doppelbindung, wie sie in michaelreaktiven Verbindungen vorliegt, reagieren können. Diese Tatsache kann sie zu effektiven und nachhaltigen Enzymaktivitätsmodulatoren machen. In dieser Arbeit wurde eine große Bandbreite verschiedenster michaelreaktiver Verbindungen auf ihre Fähigkeit untersucht, die 5-LO über Michael-Addition an ihren Cysteinen zu inhibieren. Zum einen wurden Pflanzeninhaltsstoffe mit antiinflammatorischen Eigenschaften, zugelassenene Wirkstoffe mit Michael-Akzeptorfunktion und zum anderen Verbindungen, die durch gezielte Struktursuche ausgewählt wurden, untersucht. Die Testung verschiedenster Strukturen sollte Aufschluss über strukturelle Voraussetzungen für die 5-LO-Inhibition durch Interaktion mit Cysteinen liefern. Hierfür wurden die Substanzen zunächst im intakten Zellsystem und schließlich am aufgereinigten Enzym (r5LO-wt) auf ihre 5-LO-inhibierenden Eigenschaften untersucht. Nachfolgende Messungen an r5LO-4C, deren vier prominente Cysteine durch Serin mutiert wurden, zeigten an, ob die Inhibition der 5-LO-Produktbildung cysteinabhängig war. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ganz bestimmte strukturelle Eigenschaften des Michael-Akzeptors, Voraussetzung für eine Interaktion mit den Cysteinen der 5-LO sind. Vor allem Verbindungen mit chinoidem Grundgerüst stellten sich als thiolreaktive Verbindungen heraus, die die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibierten. Weiterhin zeigten die erhaltenen Ergebnisse, dass die strukturelle Umgebung um die aktivierte Doppelbindung des Michael-Akzeptors enorme Auswirkungen auf die Thiolreaktivität hatte. TQ hemmte die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit Cysteinen, wohingegen die 5-LO-Inhibition durch Embelin unabhängig von Cysteinen zu sein schien. Eine daraufhin durchgeführte MALDI-MS-Analyse bestätigte die Bindung von NAPQI und TQ an die Cysteine 416 und 418. Durch diese Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass eine Reihe antiinflammatorisch wirksamer, natürlich vorkommender Verbindungen wie TQ, Plumbagin, Primin und auch synthetisch generierte Verbindungen wie AA861, CDDO, Methyl-BQ, Methoxy-BQ, Methoxy-Nitrostyren, NAPQI und OH-BQ die 5-LO über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibieren.
Alzheimer’s disease is a chronic neurodegenerative disease that causes problems with memory, thinking and behavior. The pathophysiological hallmarks of AD are extracellular senile plaques and intracellular neurofibrillary tangles. Amyloid plaques mainly contain the amyloid-β (Aβ) peptide, which appears as a cleavage product of the APP. APP is a type I transmembrane protein with a large extracellular domain and a short cytoplasmic tail. It is expressed in variety of tissues e.g. in neuronal tissue (brain, spinal cord, retina), and non-neuronal tissues (kidney, lung, pancreas, prostate gland, and thyroid gland) (Dawkins and Small, 2014). APP has been studied because of its link to AD, however, its role in normal brain function is poorly understood. APP is processed by two different pathways, amyloidogenic pathway and non-amyloidogenic pathway. In physiological condition, the majority of APP is processed via the non-amyloidogenic, thus leading to the generation of the secreted N-terminal APP processing product sAPPα. sAPPα is formed due to the cleavage of APP by α-secretase. In previous studies, our group has shown that sAPPα produce potent neuroprotective effect by altering gene expression, as well as by antagonizing several different types of neurotoxic stress stimuli (Copanaki et al., 2010; Kögel et al., 2003, 2005; Milosch et al., 2014). Several studies have shown that protein degradation is reduced in AD (Hong et al., 2014; Lipinski et al., 2010) but the role of APP and its cleavage products in protein degradation is still unknown. This thesis discusses about the physiological functions of APP in neuroprotection and protein homeostasis.
In the first part of the thesis (Section 4.1 - 4.4), the neuroprotective properties of yeast derived sAPPα and E1 (N-terminal domain of sAPPα) were investigated under serum and glucose deprivation conditions. In previous work, it was shown that recombinant sAPPα evoked a significant decrease in serum deprivation triggered cell death in human SH-SY5Y neuroblastoma cells and mouse embryonic fibroblast MEF cells. It was also observed that sAPPα induces the phosphorylation of Akt which leads to neuroprotection (Milosch et al., 2014). This study investigated whether this neuroprotection is associated with altered expression of downstream intracellular Akt targets such as FoxO, Bim, Bcl-xL and Mcl-1 under stress conditions. Here it was shown that sAPPα prevents activation and nuclear translocation of FoxO. FoxO act as a transcription factor for different proapoptotic genes such as Bim. It was also observed that Bim protein and mRNA expression was significantly reduced with sAPPα and E1 treatment. The expression of antiapoptotic protiens such as Bcl-xL and Mcl-1 were also examined and it was observed that sAPPα and E1 increases expression of both these proteins. Furthermore, it was previously demonstrated that uncleaved holo-APP functionally cooperates with sAPPα to activate Akt and provide neuroprotection (Milosch et al., 2014). Therefore, to investigate the function of the APP in sAPPα regulated Akt downstream proteins expressions, MEF APP KO cells were used. E1 and sAPPα only showed neuroprotective modulatory effect on these Akt downstream targets in MEF wt cells, but not in APP KO cells. In addition, sAPPα also showed neuroprotection in primary wt hippocampal neurons under trophic factor deprivation. Cellular fractionation experiments were also done to determine the role of sAPPα in cytochrome c release from mitochondria. It was observed that sAPPα treatment can inhibit mitochondrial cytochrome c release in wt MEF cells.
The second part of the thesis (Section 4.5 - 4.9) discusses about the role of sAPPα in protein homeostasis. It was observed that sAPPα prevents proteotoxic stress induced BAG3 protein expression in SH-SY5Y and MEF cells. This was also observed in mRNA levels which indicate a transcriptional regulation. Furthermore, treatment with sAPPα was also shown to decrease aggresomes formation. Aggresomes are perinuclear aggregates which are formed due to accumulation of damaged and misfolded proteins and BAG3 plays important role in their formation and the transport of degradation prone proteins into these structures. The analysis of proteasomal activity showed a reduced accumulation of proteasomal substrate d2 by sAPPα under proteasomal stress. In proteasomal activity assay, sAPPα was shown to increase the degradation of proteasomal substrate SUC-LLVY-AMC and the fluorigenic signal was measured spectrophotometrically. The sAPPβ fragment which is generated via the amyloidogenic pathway was also examined for its role in BAG3 expression and proteasomal degradation. sAPPβ, which has almost similar structure as sAPPα, only 17 amino acids at the C-terminus is missing, was failed to modulate BAG3 expression and proteostasis. This indicates that these biological effects are highly specific for sAPPα.
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Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.