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Phosphorylation of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase (SERCA1a) was studied with time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy. ATP and ATP analogs (ITP, 2'- and 3'-dATP) were used to study the effect of the adenine ring and the ribose hydroxyl groups on ATPase phosphorylation. All modifications of ATP altered conformational changes and phosphorylation kinetics. The differences compared with ATP increased in the following order: 3'-dATP > ITP > 2'-dATP. Enzyme phosphorylation with ITP results in larger absorbance changes in the amide I region, indicating larger conformational changes of the Ca(2+)-ATPase. The respective absorbance changes obtained with 3'-dATP are significantly different from the others with different band positions and amplitudes in the amide I region, indicating different conformational changes of the protein backbone. ATPase phosphorylation with 3'-dATP is also much ( approximately 30 times) slower than with ATP. Our results indicate that modifications to functional groups of ATP (the ribose 2'- and 3'-OH and the amino group in the adenine ring) affect gamma-phosphate transfer to the phosphorylation site of the Ca(2+)-ATPase by changing the extent of conformational change and the phosphorylation rate. ADP binding to the ADP-sensitive phosphoenzyme (Ca(2)E1P) stabilizes the closed conformation of Ca(2)E1P.
Die Infrarotspektroskopie in Verbindung mit photoaktivierbaren Substraten wurde zur Untersuchung von Substrat-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Dabei wurden Konformationsänderungen der Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums bei Bindung des Nukleotids, der Phosphorylierung der ATPase und der Hydrolyse des Phosphoenzyms beobachtet. Verwender wurden das native Substrat ATP und seine Analoga ADP, AMPPNP, 2'-deoxyATP, 3'-deoxyATP, ITP, AMP, Pyrophosphat, Ribosetriphosphat und TNP-AMP beobachtet. Diese Analoga waren an spezifischen funktionellen Gruppen des Substrats ATP modifiziert. Modifikation der 2'- und 3'-OH Gruppe des Ribosetriphosphats, der beta- und gamma-Phosphatgruppe und der Aminogruppe des Adenins reduzieren das Ausmaß an bindungsinduzierten Konformationsänderungen. Ein besonders starker Effekt wird für die 3'-OH Gruppe und die Aminogruppe des Adenins beobachtet. Dies zeigt die strukturelle Empfindlichkeit des Nukleotid-ATPase Komplexes auf einzelne Wechselwirkungen zwischen dem Nukleotid und der ATPase. Die Wechselwirkungen einer bestimmten Ligandengruppe mit der ATPase hängen von Wechselwirkungen anderer Ligandengruppen mit die ATPase ab. Die TNP-AMP Bindung verursacht teilweise gegenläufige und kleinere Konformationsänderungen verglichen mit ATP. Die Bindungweise von TNP-AMP ist unterschiedlich zu der von ATP, AMPPNP und anderen Tri- und Diphosphat Nucleotiden. Die Phosphorylierung der ATPase wurde mit ITP und 2'-deoxyATP beobachtet. Ca2E1P wurde in gleichem Ausmaß mit ITP und 2'-deoxyATP wie mit ATP akkumuliert, obwohl das Ausmaß der Konformationsänderungen bei Ca2E1P-Bildung geringer ist. Änderungen der 2'- und 3'-OH des Ribosetriphosphats und der Aminogruppe des Adenins beeinflussen die Reaktionsgeschwindigkeit der Phosphorylierung der ATPase. Es gibt keine direkte Verbindung zwischen dem Ausmaß der Konformationsänderung bei Nukleotid- Bindung und der Rate der Phosphorylierung. Das volle Ausmaß der ATP-induzierten Konformationsänderung ist nicht zwingend für die Phosphorylierung. Die Konformationen von Ca2E1N und Ca2E1P hängen vom Nukleotid ab. Dies weist darauf hin, dass die Struktur von ATPase Zuständen heterogener ist, als bisher erwartet. Die Aussagekraft und der Reichtum an Informationen in den Infrarotspektren zeigen, dass hiermit eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung von Enzym-Substrat-Wechsel-Wirkungen und das räumliche Abtasten von Bindungstaschen zur Verfügung steht.