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Nukleäre Rezeptoren (NRs) sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren, die an der Regulation unzähliger (patho-)physiologischer Prozesse im Körper beteiligt sind, wodurch sie interessante therapeutische Zielstrukturen darstellen. Unter ihnen zählen die PPARs (α, γ und δ) zur Hälfte der gut erforschten NRs. Sie haben als Lipidsensoren vor allem metabolische Funktionen und ihre synthetischen Liganden sind als Arzneistoffe zugelassen, sind anderen Therapieoptionen jedoch aufgrund geringerer Wirksamkeit und klassenspezifischer Nebenwirkungen unterlegen. Daher ist der Bedarf an neuen Konzepten zur selektiven Modulation der PPARs groß. Den gut studierten NRs gegenüber steht die andere Hälfte der NRs, deren Funktionen noch nicht umfassend verstanden sind. Nurr1 ist ein solcher NR, dem großes therapeutisches Potential bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer-Demenz und Multipler Sklerose zugeschrieben wird. Der konstitutiv aktive NR wird hauptsächlich im ZNS, und dort vor allem in dopaminergen Neuronen, exprimiert, wo er neuroprotektive und anti-entzündliche Effekte vermittelt. Trotz der jüngsten Erkenntnisse zu potenziellen endogenen Liganden der direkten Interaktion der Nurr1-Ligandbindedomäne (LBD) mit kleinen, wirkstoffartigen Molekülen, mangelt es an geeigneten chemischen Tools, um die Nurr1-Modulation als neues therapeutisches Konzept zu validieren. Ziel dieser Arbeit war daher die Identifikation, Entwicklung und Charakterisierung neuer tool compounds für die PPARs und Nurr1.
Das Konzept der Photopharmakologie eröffnet neue Möglichkeiten in der zeitlichen und räumlichen Kontrolle biologischer Effekte. Mit Hilfe computergestützten Designs wurden aus dem PPARγ-Agonist Rosiglitazon und dem pan-PPAR-Agonist GL479 Azobenzen-basierte photoschaltbare PPAR-Agonisten entwickelt und optimiert. Das Rosiglitazon-Azolog 36 wurde durch terminale Erweiterung als cis-präferenzieller selektiver PPARγ-Agonist erhalten, der durch Licht aktiviert werden konnte. Aus GL479 ging zum einen 38 als hochpotenter und selektiver PPARα-Agonist hervor, der in seiner trans-Konfiguration 35-mal potenter war als das entsprechende cis-Isomer. Zum anderen wurde ein dualer trans-präferenzieller PPARα- und -δ-Agonist (41) entwickelt. In einem eigens etablierten Fluoreszenz-Reportergenassay konnte durch die neuen photopharmakologischen Tools die PPAR-Aktivität in lebenden Zellen im zeitlichen Verlauf kontrolliert werden.
Auch die Identifikation und Charakterisierung endogener Liganden ist von großer Relevanz für die Modulation von NRs. Mit der Entdeckung der PPARγ-Aktivierung durch Garcinolsäure (48), einem Vitamin-E-Metaboliten, konnte ein neuer Aktivierungsmechanismus aufgedeckt werden, der ein besonderes Co-Regulator-Interaktionsprofil umfasst. Eine Co-Kristallstruktur der PPARγ-LBD im Komplex mit 48 zeigte, dass 48 sowohl die orthosterische als auch eine neue allosterische Bindestelle adressiert. Eine Genexpressionsanalyse in humanen Hepatozyten zeigte, dass sich dieser besondere Aktivierungsmechanismus von 48 auch in einer differenzierten Modulation der PPARγ-regulierten Genexpression widerspiegelte, woraus sich mögliche therapeutische Anwendungen für eine selektiv allosterische PPAR-Modulation ableiten lassen.
Der erste Ansatz zur Suche nach Nurr1-Modulatoren als tool compounds war von den Prostaglandinen A1 und A2 als potenziellen endogenen Nurr1-Liganden inspiriert. Da diese Entzündungsmediatoren durch Aktivität der Cyclooxygenasen (COX) 1 und 2 entstehen, entstand die Hypothese, dass synthetische COX-Inhibitoren, auch bekannt als nichtsteroidale Antirheumatika (NSARs), Nurr1 modulieren könnten. Dies konnte in einem Screening von 39 strukturell diversen NSARs im Gal4-Nurr1-Reportergenassay bestätigt werden. Mit Meclofenaminsäure als differenziellem Nurr1-Modulator sowie Oxaprozin und Parecoxib als den ersten inversen Nurr1-Agonisten konnte dabei außerdem gezeigt werden, dass die hohe konstitutive Nurr1-Aktivität bidirektional moduliert werden kann, und dass sowohl das Co-Regulator-Rekrutierungsprofil als auch das Dimerisierungsverhalten an der Vermittlung von Nurr1-Ligand-Effekten entscheidend beteiligt sind.
Die zweite Strategie beruhte auf den alten Antimalariawirkstoffen Amodiaquin (19) und Chloroquin (25), die zuvor als moderate Nurr1-Agonisten (EC50 Nurr1: 36 µM (19), 47 µM (25)) identifiziert wurden, aber aufgrund zahlreicher unspezifischer Effekte für den breiten Einsatz als tool compounds für Nurr1 ungeeignet sind. Eine Evaluation der einzelnen Strukturmerkmale dieses Chemotyps zeigte, dass das gemeinsame 7-Chlorochinolin-4-amin Grundgerüst ausreichend ist, um Nurr1 zu aktivieren (EC50 Nurr1: 259 µM). Basierend auf dieser Erkenntnis gingen durch gezielte Strukturmodifikationen dieses Grundgerüstes die Nurr1-Agonisten 71 und 73 hervor (EC50 Nurr1: 7,3 µM (71), 17 µM (73)), die die Leitstrukturen in ihrer Potenz übertrafen...
Die Superfamilie der nukleären Rezeptoren umfasst 48 ligandenabhänige Transkriptionsfaktoren, die durch Veränderungen in der Genexpression unterschiedlichste (patho-)physiologische Vorgänge wie Metabolismus, Entzündungen und Zelldifferenzierung beeinflussen.
Für die Vertreter der Retinoid X Rezeptoren (RXRs) und Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPARs) wurden in den letzten Jahren vielversprechende Effekte auf neurodegenerative Erkrankungen berichtet. Beide Rezeptorklassen beeinflussen u.a. Bildung, Transport und Abbau des neurotoxischen Amyloid-β, das als eine der Ursachen für die Entstehung einer Alzheimer Demenz (AD) vermutet wird. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass durch gezielte Modulation der RXRs (besonders RXRγ) eine Remyelinisierung auto-immun demyelinisierter Neurone und damit eine regenerative Therapie für die Multiple Sklerose (MS) möglich sein könnte. Die aktuell zur Verfügung stehenden Liganden der RXRs besitzen unzureichende Subtypenselektivität und meist unvorteilhafte physikochemische Eigenschaften, die der weiteren Erforschung im Wege stehen. Um diese Hindernisse zu überwinden, sollten im Rahmen dieser Arbeit neuartige RXR-Agonisten synthetisiert und umfassend charakterisiert werden.
Ein kürzlich publizierter RXR-Agonist besitzt eine ungewöhnlich lineare Biphenylgrundstruktur und offenbart ein attraktives Aktivitätsprofil: Während alle drei RXR-Subtypen mit einem ähnlichen EC50-Wert (RXRα/β/γ = 12/12/14 µM) adressiert werden, führt die Bindung an RXRα nur zu einer minimalen Aktivierung (max. 5-fache Aktivierung im Vergleich zur Grundaktivität), während RXRβ und γ deutlich stärker aktiviert werden (60-70-fache Aktivierung). Da für diesen Chemotyp bislang noch keine systematischen Studien vorlagen, wurden seine Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) erforscht. Durch Synthese und in vitro Charakterisierung von 24 Derivaten konnten sowohl selektivitäts- als auch potenzfördernde Strukturmerkmale identifiziert werden, die sich auch kombinieren ließen. Es wurden ein RXRβ-selektives Derivat, mehrere RXRα/β-präferierende Analoga und ein potentes Derivat mit annähernd 100-fach gesteigerter Potenz ((EC50(RXRα/β/γ) = 0,08/0,15/0,22 µM) erhalten. Im Zuge der Charakterisierung wurden außerdem strukturelle Variationen identifiziert, die eine Umgehung des LXR/RXR-Heterodimers ermöglichen könnten. Zusätzlich gelang die Kristallisation der Ligandbindedomäne (LBD) von RXRα im Komplex mit dem potentesten Vertreter der Serie und offenbarte Potential für weitere Optimierungen, u.a. der Möglichkeit eine kovalente Bindung mit Cys432 zu etablieren und damit eine weitere Potenzsteigerung zu erreichen.
Neben der mangelnden Subtypenpräferenz behindern auch die ungünstigen physikochemischen Eigenschaften von RXR-Liganden die weitere Entwicklung von RXR-basierten Therapieoptionen. Deshalb sollte eine neue Leitstruktur mit überlegenen physikochemischen Eigenschaften identifiziert und durch systematische SAR-Untersuchungen weiterentwickelt werden. Für den experimentellen Wirkstoff Wy14,643, einem dualen Agonisten an PPARα und γ, wurden im Laufe der letzten vier Jahrzehnte wiederholt Effekte patentiert, die sich mit dem bislang bekannten Aktivitätsprofil nicht erklären ließen. Er zeigte u.a. in einem Tiermodell der MS einen immunmodulierenden Effekt und reduzierte in vitro die Bildung von Amyloid-β.Im Rahmen dieser Arbeit konnte Wy14,643 als potenter RXR-Agonist (EC50 (PPARα/γ/δ) = 36/54/- µM¸ EC50(RXRα/β/γ) = 9,1/13/31 µM) mit überlegenen physikochemischen Eigenschaften (z.B. Löslichkeit in Wasser = 48,6 mg/L) identifiziert und dadurch dessen Wirkungen erklärt werden.
Wy14,643 wurde als Startpunkt einer systematischen Untersuchung der Ligand-Rezeptor-Interaktionen sowohl an den PPARs und den RXRs ausgewählt. Dabei wurden ein potenter selektiver PPAR-Agonist und ein potenter und ausgeglichener panRXR/panPPAR-Agonist erhalten. Der panRXR/panPPAR-Agonist konnte im Komplex mit der LBD von PPARγ kristallisiert werden, wo der Ligand gleich doppelt gebunden vorliegt. Eines der Moleküle bindet in einer alternativen Bindungstasche. Diese Erkenntnis könnte die Grundlage für die Entwicklung einer neuen Klasse von PPARγ-Modulatoren legen.
Durch Kombination des erlangten SAR-Wissens wurde ein selektiver RXR-Agonist (EC50 (PPARα/γ/δ) = -/-/- µM¸ EC50(RXRα/β/γ) = 0,09/0,14/0,36 µM) mit annähernd 100-fach gesteigerter Potenz synthetisiert, der die günstigen physikochemischen Eigenschaften der Leitstruktur erhalten konnte (Löslichkeit in Wasser = 14,3 mg/L). Mit diesem Profil ist es gelungen einen RXR-Agonisten zu kreieren, der dem bisherigen Goldstandard Bexaroten bei vergleichbarer Potenz in physikochemischen Eigenschaften überlegen ist.
Die Kristallstruktur des RXR-selektiven Derivats im Komplex mit der LBD von RXRα zeigte einen orthosterischen Bindemodus und legte weitere Optimierungen nahe: So gibt es sowohl ungenutzten Raum, der zukünftig durch strukturbasierte Substitutionen adressiert werden könnte, als auch die Möglichkeit eine kovalente Bindung zum Rezeptor (Cys432) zu initiieren. Durch diese Arbeit konnten nicht nur eine Reihe von potenten RXR-Liganden identifiziert werden, durch die Entwicklung eines Sets aus PPAR-selektiven, dual PPAR/RXR-aktiven und RXR-selektiven Derivaten gleichen Chemotyps, entstand auch ein nützliches pharmakologisches Werkzeug zur weiteren Entschlüsselung des Zusammenspiels dieser Rezeptoren.
Die systematische Entwicklung einer Leitstruktur, wie sie in den vorangegangenen Projekten praktiziert wurde, kann je nach deren Komplexität eine kostenintensive und synthetisch anspruchsvolle Aufgabe darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine computergestützte Optimierung einer Leitstruktur als Teil einer selektiven Optimierung von Nebenaktivitäten (SOSA) etabliert, um den präparativen Aufwand der Strukturoptimierung zu reduzieren. Als Modellsubstanz wurde das Fettsäuremimetikum Cinalukast ausgewählt, das einen potenten Cysteinylleukotrienrezeptor 1 (CysLT1R)-Antagonisten darstellt, für den eine schwache Aktivität an PPARα entdeckt wurde. Ein automatisierter Arbeitsablauf testete eine virtuelle Bibliothek von annähernd 8000 Cinalukastanaloga auf ihre PPARα-Aktivität und die Derivate mit der besten vorhergesagten PPARα-Aktivität wurden durch maschinelles Lernen nach ihrem CysLT1R-Antagonismus klassifiziert. Die Synthese und Charakterisierung eines virtuell bevorzugten Derivats zeigte selektiven PPARα-Agonismus und konnte so den computergestützten Arbeitsablauf als wertvolles Instrument zur Optimierung von Fettsäuremimetika bestätigten.
Die vorliegende Arbeit hat bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von zwei neuen Chemotypen als RXR-Liganden erreicht. Die Klasse der Biphenyl-Analoga kann als Ausgangspunkt für eine weitere Entwicklung von subtypenselektiven RXR-Agonisten dienen und könnte gleichzeitig die gezielte Umgehung einzelner Heterodimere ermöglichen. Das Set aus drei Derivaten von Wy14,643 mit identischem Chemotyp, aber drastisch unterschiedlichen Aktivitätsprofilen an den PPARs und RXRs ermöglicht eine intensive pharmakologische Untersuchung der beiden Rezeptorfamilien und deren Zusammenspiel. Außerdem entstand aus dieser Klasse einer der zurzeit fortschrittlichsten RXR-Agonisten. Zukünftig kann außerdem der im Zuge der Arbeit etablierte computergestützte Arbeitsablauf die Optimierung von Fettsäuremimetika deutlich beschleunigen.
Zeit ist einer jener Begriffe, für die man die Augustinische Charakterisierung gelten lassen wollte, es sei klar, was sie bedeuten, solange nicht danach gefragt werde (Augustinus Confessiones Lib. XI, 17). Die Frage aber nach dem, was "Zeit" eigentlich ist, erscheint umso berechtigter, als es insbesondere die Naturwissenschaften sind, die für sich in Anspruch nehmen, hier Antworten geben zu können. Die zu erwartenden Antworten wären danach wesentlich empirischer Natur – also direkt oder indirekt experimentell gestützt und mithin Ergebnis dieser Forschung. ...
Nukleäre Rezeptoren sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren, die das pharmazeutische Interesse als Zielstrukturen für antientzündliche Wirkstoffe und andere Indikationen erwecken. Entzündungen werden durch Noxen physikalischer, chemischer oder mikrobiologischer Art hervorgerufen. Dabei reagiert das geschädigte Gewebe mit zahlreichen Vorgängen, die vaskuläre und zelluläre Reaktionen mit Immunantworten verknüpfen und nach der Wiederherstellung des ursprünglichen Zustands streben. Bei andauernder Wirkung können Entzündungen jedoch in einen schädlichen Prozess umschlagen, sodass in solchen Fällen eine therapeutische Intervention Notwendigkeit erlangt. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, neue Liganden nukleärer Rezeptoren als Kandidaten für antientzündliche Wirkstoffe zu identifizieren.
Leber X Rezeptoren (LXRs) sind Zielstrukturen für entzündliche und neurodegenerative Erkrankungen mit antiphlogistischem Potenzial. Zur Identifikation neuer LXR-Liganden wurde eine Datenbank mit zugelassenen Wirkstoffen mithilfe einer selbstorganisierenden Karte (SOM) auf Interaktion mit LXR gescreent. Die Retinoid X Rezeptor (RXR)-Agonisten Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) konnten in der anschließenden in vitro Charakterisierung als potente duale LXRalpha/LXRbeta-Partialagonisten mit moderater Aktivierungseffizienz bestätigt werden. Während 37 und 38 synthetische LXR-Vollagonisten partiell antagonisierten, führten sie mit dem endogenen Partialagonisten 22(R)-Hydroxycholesterol (4) zur additiven Aktivierung von LXR. Die Charakterisierung von Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) als duale LXR/RXR-Agonisten liefert nicht nur eine weitere Erklärung für in klinischen Studien beobachtete Nebenwirkungen, sondern könnte auch den Startpunkt zur Entwicklung neuer antientzündlicher LXR- und dualer LXR/RXR-Liganden bieten.
Der Peroxisomen Proliferator-aktivierte Rezeptor (PPAR) gamma ist ein nukleärer Rezeptor, der neben der Steigerung der Insulinsensitivität auch antientzündliche Effekte aufweist. Auf Grundlage seiner Y-förmigen und fettsäuremimetischen Struktur konnte das Urikosurikum Lesinurad (47) als PPARgamma-Partialagonist in vitro charakterisiert werden. Im Gegensatz zu PPARgamma-Vollagonisten wie Pioglitazon (31) oder Rosiglitazon (32) induzierte 47 nicht die Differenzierung muriner 3T3-L1 Zellen in reife Adipozyten, aber erhöhte in der humanen Leberzellkarzinomzelllinie HepG2 die Expression von Genen, welche die Insulinsensitivität und den Fettsäureabbau steigern könnten. Folglich erwies sich Lesinurad (47), das bei der Pharmakotherapie von Gicht Anwendung findet, als selektiver PPARgamma-Modulator (sPPARgammaM) ohne adipogene Nebenwirkungen. Insbesondere Patienten mit Komorbiditäten wie Diabetes mellitus Typ 2 oder anderen Erkrankungen des metabolischen Syndroms könnten von einer Behandlung mit 47 profitieren. Inwiefern PPARgamma an der Auflösung von Entzündungen bei Gicht beteiligt ist, bleibt in zukünftigen Studien zu klären.
Synthetische RXR-Agonisten haben ein vielversprechendes Potenzial zur Behandlung entzündlicher neurodegenerativer Erkrankungen, das jedoch von nachteiligen Eigenschaften dieser Rexinoide beeinträchtigt wird. Durch ein pharmakophorbasiertes Screening einer fokussierten Substanzbibliothek aus Fettsäuremimetika konnte ein fortschrittliches RXR-Ligandgerüst identifiziert werden. Eine geeignete Synthesestrategie wurde etabliert und die Leitstrukturen durch systematisches Studium der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) optimiert. In vitro Experimente wie Reportergenassays und die Quantifizierung der Zielgenexpression bestätigten die RXR-partialagonistische Aktivität der dabei entwickelten nanomolaren Verbindung 89. Mit seiner hohen Selektivität, gesteigerten wässrigen Löslichkeit sowie reduzierter Lipophilie und Toxizität könnte 89 die Probleme bisheriger synthetischer RXR-Agonisten überwinden. Seine Präferenz von RXRgamma hinsichtlich der Aktivierungseffizienz könnte richtungsweisend für die Entwicklung subtypselektiver Liganden sein.
Die nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) ist eine Leberentzündung, die aus einer Steatose hervorgehen kann und deren multifaktorielle Natur eine hohe therapeutische Effizienz erfordert. Diese könnte durch duale Modulation der nukleären Rezeptoren Farnesoid X Rezeptor (FXR) und PPARdelta mit antientzündlichen Eigenschaften und unterschiedlichem Wirkprinzip erreicht werden. Zur Validierung dieses Ansatzes mit synergistischem Potenzial sollten duale PPARdelta/FXR-Agonisten ausgehend von einer in früheren Studien des Arbeitskreises identifizierten Leitstruktur mit moderater Potenz entwickelt werden. Dazu wurde ein fünfstufiges Verfahren zur Synthese von Derivaten der Leitstruktur erarbeitet und die Derivate hinsichtlich ihrer Aktivität auf den Zielstrukturen in vitro evaluiert. In systematischen SAR-Studien wurden dabei Strukturmotive charakterisiert, welche die Wirksamkeit und Maximalaktivierung auf PPARdelta und FXR steigerten. Darüber hinaus konnten Modifikationen identifiziert werden, welche eine Selektivität über PPARalpha und PPARgamma gewährten. Die Kombination dieser vorteilhaften Gruppen und Substituenten könnte neue Wirkstoffkandidaten zur Behandlung von NASH hervorbringen.
Insgesamt wurden in dieser Arbeit zahlreiche Wirkstoffe und Wirkstoffkandidaten erfolgreich als Liganden nukleärer Rezeptoren mit antientzündlichem Potenzial identifiziert. Alitretinoin (37) und Bexaroten (38) können als Leitstruktur zur Entwicklung neuer selektiver LXR- oder dualer LXR/RXR-Agonisten dienen. Die PPARgamma-partialagonistische Aktivität von Lesinurad (47) könnte einen Fortschritt in der Therapie von Gicht mit metabolischen Begleiterkrankungen bewirken. Zudem könnten im Zuge dieser Arbeit synthetisierte Serien von RXR- und dualen PPARdelta/FXR-Partialagonisten neue Therapieoptionen bei neurodegenerativen Erkrankungen oder NASH ermöglichen.
Der Name Histamin hat seinen Ursprung aus dem griechischen Wort "histos" (Gewebe) und spielt auf sein breites Spektrum an Aktivitäten, sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen an. Histamin ist eines der Moleküle mit welchem man sich im letzten Jahrhundert am intensivsten beschäftigt hat.
Im Jahr 1907 wurde das Histamin erstmals synthetisiert. Drei Jahre später gelang es, dieses Monoamin erstmals aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea zu isolieren. Weitere 17 Jahre vergingen, ehe Best et al. Histamin aus der humanen Leber und der humanen Lunge isolieren konnten. Best konnte somit beweisen, dass dieses biogene Amin einen natürlichen Bestandteil des menschlichen Körpers darstellt. Nach der Entdeckung wurden dem Histamin mehrere Effekte zugeschrieben. Dale et al. beobachteten, dass Histamin einen stimulierenden Effekt auf die glatte Muskulatur des Darms und des Respirationstraktes hat, stimulierend auf die Herzkontraktion wirkt, Vasodepression und ein schockähnliches Syndrom verursacht.
Popielski demonstrierte, dass Histamin dosisabhängig einen stimulierenden Effekt auf die Magensäuresekretion von Hunden hat. Lewis wiederum beschrieb erstmals, dass Histamin einen Effekt auf der Haut hervorruft. Dies zeigte sich durch verschiedene Merkmale, wie geröteter Bereich aufgrund der Vasodilatation und Quaddeln aufgrund der erhöhten Gefäßpermeabilität. Des Weiteren wurde Histamin eine mediatorische Eigenschaft bei anaphylaktischen und allergischen Reaktionen zugeschrieben. Zusätzlich spielt das biogene Amin eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS), unter anderem beim Lernen, bei der Erinnerung, beim Appetit und beim Schlaf-Wach-Rhythmus. Von den zahlreichen physiologischen Effekten des Histamins ist seine Rolle bei Entzündungsprozessen, der Magensäuresekretion und als Neurotransmitter am besten verstanden.
Die 5-LO ist ein Schlüsselenzym der LT-Biosynthese. Sie katalysiert in einem ersten Schritt zunächst die Umsetzung freigesetzter AA zu 5-HPETE und wandelt diese anschließend in LTA4 um. LT sind starke Entzündungsmediatoren, die an entzündlichen und allergischen Reaktionen des Körpers beteiligt sind. Sie lösen eine Immunantwort aus und können zur Entstehung von Asthma bronchiale, allergischer Rhinitis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verschiedenen Krebserkrankungen beitragen [28]. NFS gehören zur Klasse der michaelreaktiven Verbindungen und inhibieren die 5-LO durch Interaktion mit katalytisch aktiven Cysteinresten in der Nähe der Substrateintrittspforte. Diese Tatsache macht michaelreaktive Verbindungen innerhalb der Entzündungsforschung zu einer interessanten Substanzklasse. Michaelreaktive Verbindungen besitzen eine durch Elektronenzug aktivierte Doppelbindung. Hierdurch verfügen diese Wirkstoffe über elekrophile Eigenschaften, wodurch sie leicht mit Nukleophilen reagieren können. Cysteine bestehen aus nukleophilen Thiolgruppen, die mit einer positiv polarisierten Doppelbindung, wie sie in michaelreaktiven Verbindungen vorliegt, reagieren können. Diese Tatsache kann sie zu effektiven und nachhaltigen Enzymaktivitätsmodulatoren machen. In dieser Arbeit wurde eine große Bandbreite verschiedenster michaelreaktiver Verbindungen auf ihre Fähigkeit untersucht, die 5-LO über Michael-Addition an ihren Cysteinen zu inhibieren. Zum einen wurden Pflanzeninhaltsstoffe mit antiinflammatorischen Eigenschaften, zugelassenene Wirkstoffe mit Michael-Akzeptorfunktion und zum anderen Verbindungen, die durch gezielte Struktursuche ausgewählt wurden, untersucht. Die Testung verschiedenster Strukturen sollte Aufschluss über strukturelle Voraussetzungen für die 5-LO-Inhibition durch Interaktion mit Cysteinen liefern. Hierfür wurden die Substanzen zunächst im intakten Zellsystem und schließlich am aufgereinigten Enzym (r5LO-wt) auf ihre 5-LO-inhibierenden Eigenschaften untersucht. Nachfolgende Messungen an r5LO-4C, deren vier prominente Cysteine durch Serin mutiert wurden, zeigten an, ob die Inhibition der 5-LO-Produktbildung cysteinabhängig war. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ganz bestimmte strukturelle Eigenschaften des Michael-Akzeptors, Voraussetzung für eine Interaktion mit den Cysteinen der 5-LO sind. Vor allem Verbindungen mit chinoidem Grundgerüst stellten sich als thiolreaktive Verbindungen heraus, die die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibierten. Weiterhin zeigten die erhaltenen Ergebnisse, dass die strukturelle Umgebung um die aktivierte Doppelbindung des Michael-Akzeptors enorme Auswirkungen auf die Thiolreaktivität hatte. TQ hemmte die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit Cysteinen, wohingegen die 5-LO-Inhibition durch Embelin unabhängig von Cysteinen zu sein schien. Eine daraufhin durchgeführte MALDI-MS-Analyse bestätigte die Bindung von NAPQI und TQ an die Cysteine 416 und 418. Durch diese Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass eine Reihe antiinflammatorisch wirksamer, natürlich vorkommender Verbindungen wie TQ, Plumbagin, Primin und auch synthetisch generierte Verbindungen wie AA861, CDDO, Methyl-BQ, Methoxy-BQ, Methoxy-Nitrostyren, NAPQI und OH-BQ die 5-LO über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Anaylsenmethoden zur Quantifizierung von Ceramiden und Prostanoiden in verschiedenen biologischen Matrices unter Verwendung von Nano-LC gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie entwickelt und bei diversen biologischen Fragestellungen angewendet.
Die analytische Methode zu Quantifizierung der Ceramide ermöglichte deren Bestimmung in einem Probenvolumen von 2 μL CSF. Diese neu entwickelte Methode ist die erste publizierte Nano-LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung der Ceramide in biologischen Proben, gleichzeitig ist es auch diejenige analytische Methode mit der höchsten Empfindlichkeit [171]. Die beschriebene Methode umfasste die Substanzen C8:0, C16:0, C18:1, C18:0, C20:0, C24:1 und C24:0 Ceramid, als interner Standard wurde C17:0 Ce-ramid verwendet. Die Probenaufarbeitung bestand in einer einfachen Proteinfällung und Verdünnung mit Methanol, die chromatografische Trennung der Analyten erfolgte mit einer RP-C8 Säule unter Verwendung eines Gradientenprogramms. Die Methode wurde anhand von FDA-Richtlinien bezüglich Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit und Autosampler-Stabilität validiert. Die erreichten Bestimmungsgrenzen betrugen 0,225 pg auf der Säule (2,25 pg/μL CSF) für alle Ceramide außer C24:0 Ceramid, für das der Wert von 0,75 pg auf der Säule (7,5 pg/μL CSF) ermittelt wurde. Mit der durchgeführten Validierung wurde die Zuverlässigkeit der Methode für die Quantifizierung der Ceramide in CSF gezeigt. Mit einem Standardadditionsexperiment konnte belegt werden, dass PBS als Ersatzmatrix für CSF geeignet ist und somit die Ergebnisse der Validierung mit dotierten PBS-Proben auf CSF-Proben übertragbar sind. Das entwickelte Verfahren wurde für die Quantifizierung der Analyten in murinen CSF-Proben im Rahmen eines Projekts zur Erforschung der Rolle der Ceramide bei Multipler Sklerose angewendet. Anhand der Ergebnisse wurde die Hypothese bestätigt, dass die Konzentration von C16:0 Ceramid in CSF von EAE-Mäusen erhöht ist.
Die zweite entwickelte Nano-LC-MS/MS-Methode ermöglichte die Quantifizierung der Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 in einer geringen Anzahl Immunzellen. Für eine erfolgreiche Bestimmung der Analyt-Konzentrationen waren nur 5.000 T-Zellen oder 40.000 Mastzellen erforderlich. Damit ist die beschriebene Methode geeignet für die Quantifizierung in Zellen, die durch Isolation aus tierischen Geweben oder Organen erhalten werden, ohne dass das Vereinigen mehrerer Proben erforderlich ist. Durch die Messung dieser bestimmten Zellpopulationen kann, im Unterschied zur Vermessung des gesamten Organs, eine differenziertere Analyse der Lokalisation der gemessenen Analyten erfolgen. Mittels der entwickelten Methode konnten die Prostanoide PGE2, PGD2, 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2 quantifiziert werden. Als interner Standard stand für jedes dieser Prostanoide ein vierfach deuteriertes Strukturanalogon zur Verfügung. Die Aufarbeitung der Immunzell-Proben erfolgte durch Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat, die Chromatografie wurde mit einer RP-C8-Säule und einem Gradientenprogramm durchgeführt. Eine Validierung erfolgte für die Quantifizierung in T-Lymphozyten und Mastzellen für die Parameter Linearität, Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit, Wiederfindung, Selektivität und Stabilität. Auch ein Standardadditionsexperiment mit beiden Matrices wurde durchgeführt. Die Bestimmungsgrenzen betrugen 75 fg auf der Säule für PGE2 und PGD2 sowie 112,5 fg für 6-keto PGF1α, PGF2α und TXB2, damit zeichnet sich die Methode durch höchste Empfindlichkeit aus. Die Me-thode wurde zur Messung der Prostanoid-Konzentration in T-Zellen, die im Rahmen eines Kontaktallergie-Modells aus dem Blut von unterschiedlich behandelten Mäusen isoliert worden waren, angewendet. Es konnte kein Unterschied in den Prostanoid-Konzentrationen in den T-Zellen sensibilisierter und nicht-sensibilisierter bzw. provozierter und nicht-provozierter Mäuse festgestellt werden. Bei einer zweiten Anwendung wurden die Prostanoide in murinen Mastzellen, die nach Zymosan-Injektion in die Hinterpfote zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Auslösen der Entzündung aus dem entstandenen Ödem isoliert worden waren, gemessen. Zusätzlich für diese Anwendung wurden einige Leukotriene in die Methode integriert. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen von PGE2, PGD2 und PGF2α in Mastzellen nach der Injektion von Zymosan-Injektion ansteigen, wobei die gemessenen Konzentrationen für PGE2 48 Stunden nach der Injektion verglichen mit denen nach 24 Stunden, bezogen auf die anderen beiden Prostaglandine, am stärksten ansteigen. Außerdem wurde mittels der für die Immunzellen entwickelten Methode die Prostanoide in murinem Urin, humanem Plasma und humaner Tränenflüssigkeit quantifiziert.
Zusammenfassend ermöglichen die entwickelten Methoden die Analyse geringer Ana-lytkonzentrationen in sehr kleinen Probenmengen und damit eine Reduktion von Versuchstierzahlen und Kosten.
In dieser Arbeit wurde YM155 anhand eines Neuroblastom-Zellmodells bezüglich seiner antitumoralen Wirkung, sowie möglicher Resistenzmechanismen untersucht. Mit Hilfe eines Viabilitäts-‚Screenings‘ wurde eine Auswahl von 113 chemosensitiven und chemoresistenten Neuroblastomzellen auf mögliche Kreuzresistenzen gegen YM155 untersucht. Hinsichtlich der IC50 Werte gegen YM155, lagen insgesamt 74 % der untersuchten Zelllinien im therapeutisch erreichbaren Bereich von unter 50 nM. Zusätzlich wurden Neuroblastom-, Mammakarzinom- und Prostatakarzinomzellen an eine klinisch relevante YM155 Konzentration adaptiert. Diese zeigten wiederum, dass durch die Adaptierung hervorgerufene Expressionsänderung des ABC-Transporters ABCB1 und des ‚solute carrier‘ Protein SLC35F2 eine bedeutsame Rolle hinsichtlich des Resistenzmechanismus gegen YM155 spielen. Durch den Einsatz von spezifischen ABCB1-Inhibitoren, als auch durch siRNA-vermittelte Reduzierung von ABCB1 konnte eine Abhängigkeit für die Wirksamkeit YM155 von ABCB1 in Neuroblastomzellen bestätigt werden. Des Weiteren wurde in den untersuchten Zelllinien ein Zusammenhang zwischen der Wirkung von YM155 und der Expression des ‚solute carrier‘ Proteins SLC35F2 hergestellt. Dazu wurden Zellen mit verminderter SLC35F2 Expression verwendet, welche durch Transduktion mit einem für eine SLC35F2 spezifische shRNA kodierenden Vektor etabliert wurden. Dabei führte eine verminderte SLC35F2 Expression zu einer starken Minderung der Sensitivität gegen YM155. Das Zusammenspiel dieser beiden Transporter und der damit verbundene Resistenzmechanismus gegen YM155, konnte in fast allen etablierten YM155-resistenten Zelllinien (UKF-NB-3rYM15520, 22RV1rYM155300, PC-3rYM15520, HCC-1806rYM15520 und MDA-MB-231rYM15520) gezeigt werden. Wobei diese Zellen unabhängig von der Tumorentität als Resistenzmechanismus gegen YM155 entweder eine signifikant induzierte ABCB1 Expression (verstärkter YM155 Efflux) und/oder eine verminderte SLC35F2 Expression (verringerter YM155 Influx) entwickelten. Außerdem konnte mit Hilfe der p53-depletierten Zelllinie UKF-NB-3pc-p53 eine Abhängigkeit der YM155 Wirkung vom Tumorsuppressor p53 nachgewiesen werden, wobei es durch die Depletierung von p53 zu einer verminderten Sensitivität der Zellen gegen YM155 kam. Zudem kam es durch die Nutlin-3 hervorgerufene p53 Aktivierung und Akkumulierung zu einer Verstärkung der YM155 Wirkung in den untersuchten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der p53 Status von Zellen einen Einfluss auf deren YM155 Resistenz haben kann. Da in der Behandlung von Neuroblastomen neben der Chemotherapie auch Bestrahlung eingesetzt wird, wurde zusätzlich untersucht ob eine Adaptierung von Neuroblastomzellen an YM155 zu einer verminderten Sensitivität gegen Bestrahlung führen kann. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten UKF-NB-3 Zelllinien (UKF-NB-3 und UKF-NB-3rYM15520) eine ähnliche Sensitivität gegenüber der Bestrahlung aufwiesen, konnte kein Zusammenhang zwischen einer Adaptierung an YM155 und der Ausbildung einer Bestrahlungsresistenz gezeigt werden.
Ein weiterer wichtiger Teil dieser Arbeit war es, den primären Wirkmechanismus von YM155 in Neuroblastomzellen zu untersuchen. In vorangegangenen Studien wurde die vom Hersteller beschriebene Wirkung von YM155 als Survivin-Inhibitor in Frage gestellt. Stattdessen soll der primäre Apoptose-induzierende Effekt in erster Linie durch DNA-Schäden hervorgerufen werden, während die Survivin Inhibierung lediglich darauf folgen soll. In einer zeitlichen und konzentrationsabhängigen Kinetik der YM155 Behandlung konnte in UKF-NB-3 Zellen der genaue Zeitpunkt der Survivin-Inhibierung und der Induktion der DNA-Schadensantwort ermittelt werden. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass in Neuroblastomzellen als Antwort auf die YM155 Behandlung zuerst eine Survivin-Inhibierung erfolgt, und die DNA-Schadensantwort als Folge dieser induziert wird. Darüber hinaus belegte die siRNA-vermittelte Survivin-Inhibierung in UKF-NB-3 und UKF-NB-6, dass eine fehlende Survivin Expression die DNA-Schadensantwort induziert.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals in YM155 adaptierten Neuroblastomzellen der Resistenzmechanismus gegen YM155 näher untersucht werden und darüber hinaus wurde demonstriert, dass die Wirkung von YM155 in Neuroblastomzellen nicht auf die Induktion der DNA-Schadensantwort beruht, sondern primär auf die Survivin-Inhibierung zurückzuführen ist.
Eine spezifische Immuntherapie der Allergie, wie sie für die Pollen- und Bienengiftallergie angewandt wird, ist für Nahrungsmittelallergien wegen des hohen Risikos lebensbedrohlicher Nebenwirkungen und fehlender Wirksamkeit nicht etabliert. Somit bleibt vielen Nahrungsmittelallergikern nur die Vermeidung der allergieauslösenden Lebensmittel zur Prävention allergischer Reaktionen.
Neuartige Ansätze zur Immuntherapie von Allergien beschreiben unter anderem die Verwendung sogenannter hypoallergener Proteine. Diese sind meist Allergene, deren Struktur dahingehend verändert wurde, dass sie trotz intakter Immunogenität eine reduzierte IgE-Bindungseigenschaft und damit eine verminderte Allergenität aufweisen. Studien am Hauptallergen der Birke haben gezeigt, dass sowohl die Mutation von IgE relevanten Epitopen, als auch Multimerisierungen der Birkenpollenallergene zu solchen Hypoallergenen führen.
Mit dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit sich solche gezielten Mutationen und Oligomerisierungen auf die Hauptallergene von Sellerie und Karotte übertragen lassen. Ein weiterer Punkt der Studie lag darin, zu untersuchen, ob Oligomerisierung allein oder in Kombination mit Mutationen einen größeren Einfluss auf die immunogenen Eigenschaften bewirkt.
Wichtig für die Konzeption hypoallergener Proteine ist das Wissen, um wichtige IgE bindende Epitope auf Allergenen. Für das Hauptallergen aus Birke (Bet v 1) ist die exponierte P-Loop-Region als wichtiges Epitop beschrieben. Die Sellerieallergie ist in Mitteleuropa oft auf eine IgE-Kreuzreaktivität mit Bet v 1 zurückzuführen, weshalb auch das Hauptallergen aus Sellerie (Api g 1), von welchem zwei Isoformen beschrieben sind, näher im Bereich der P-Loop-Region untersucht wurde. Die in dieser Arbeit als stärker IgE bindende bestätigte Isoform Api g 1.01 zeigt allerdings genau in dieser Region eine wichtige Abweichung von Bet v 1, weshalb eine Mutante hergestellt wurde, welche in diesem Bereich dem Bet v 1 angepasst wurde. Mit Hilfe von IgE-Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass diese Veränderung zu einer Verstärkung der Bindung von IgE aus Seren von Birkenpollenallergikern führte, während Seren von Sellerieallergikern, die ausschließlich auf die Isoform Api g 1.01 sensibilisiert waren, eher eine unveränderte IgE-Bindung an diese Mutante zeigten. Seren von Patienten, die auf beide Isoformen sensibilisiert waren, zeigten wie die Birkenpollenallergiker eine erhöhte Reaktivität auf diese Mutante. Da die zweite Isoform, Api g 1.02, allerdings nur eine geringe Relevanz bei der Sellerieallergie spielt, kann durch die Ergebnisse mit dieser Mutante gefolgert werden, dass die P-Loop-Region für die birkenpollenassoziierte Sellerieallergie ein weniger wichtiges IgE-Epitop ist, als für das homologe Birkenpollenallergen. Die gerichtete Mutation der P-Loop-Region kann somit bei Api g 1.01 nicht als Strategie zur Herstellung hypoallergener Derivate in Betracht gezogen werden. Weiterführende Studien bezüglich der relevanten IgE-Epitope des Hauptallergens aus Sellerie sind demnach nötig.
Ein weiterer wichtiger Ansatz zur Herstellung hypoallergener Mutanten ist die Zerstörung der dreidimensionalen Struktur von allergenen Proteinen, so dass keine Konformationsepitope mehr vorhanden sind, welche hauptsächlich für die IgE-Bindung verantwortlich sind. In der Regel sind solche Proteine nicht mehr in der Lage IgE im Patientenserum zu binden, können aber in vivo eine zelluläre Immunogenität auslösen.
Dazu wurden neben den jeweiligen Isoformen der Hauptallergene von Sellerie (Api g 1) und Karotte (Dau c 1) auch 111P-Mutanten dieser Proteine rekombinant hergestellt, welche eine zerstörte Sekundärstruktur aufwiesen. Sowohl für Sellerie als auch für Karotte, waren die mutierten Proteine nicht mehr in der Lage, die jeweiligen spezifischen IgE-Antikörper in Patientenserum zu erkennen. Sie wiesen somit eine reduzierte Allergenität auf, was sie zu möglichen geeigneten Kandidaten für eine Immuntherapie machen. Wichtig für einen Mechanismus zur effektiven Immuntherapie ist aber auch die Induktion von blockierenden IgG-Antikörpern, welche unter anderem das Allergen binden und somit verhindern, dass es zu einer Kreuzvernetzung von IgE kommt, welches über den FceRI-Rezeptor auf der Oberfläche von Mastzellen gebunden ist. In dieser Studie konnte mittels eines Mausmodells in vivo gezeigt werden, dass die beiden Isoformen Dau c 1.01 und Dau c 1.02 des Hauptallergens aus Karotte, welche keine intakten IgE-Epitope mehr aufwiesen trotzdem noch in der Lage waren solche blockierenden Antikörper zu induzieren. Die Funktionalität dieser Antikörper mit IgE um das Allergen zu konkurrieren, wurde mittels Inhibition der Bindung von humanem IgE an das entsprechende Allergen durch Zugabe der entsprechenden Mausseren, welche die gebildeten IgG Antikörper enthielten, nachgewiesen und war vergleichbar mit der Inhibitionswirkung von Seren der Mäuse, die mit den Wildtyp-Allergenen immunisiert wurden. Wurden Proteine eingesetzt, die nicht nur eine zerstörte Struktur aufwiesen, sondern auch noch als Dimer der beiden Dau c 1 Isoformen mit zerstörter Struktur vorlagen (Dau c 1FP111P), so konnte eine verstärkte Induktion von blockierenden Antikörpern mit erhöhter IgE-Inhibitionswirkung beobachtet werden. Somit ist die Multimerisierung von Allergenen bei gleichzeitiger Zerstörung der Struktur ein geeigneter Ansatz zur Herstellung von hypoallergenen Proteinen.
Da Immuntherapeutika möglichst nicht in der Lage sein sollten allergische Reaktionen auszulösen, indem sie mit bestehenden IgE-Antikörpern kreuzreagieren, wurden die hier untersuchten hypoallergenen Proteine auch in Kreuzreaktivitätsstudien eingesetzt. Diese haben gezeigt, dass nur hohe Immunisierungsdosen zur Induktion von IgE führten, welches mit den Wildtyp-Allergenen kreuzreaktiv war. Da aber zur Induktion von blockierenden IgG-Antikörpern bereits eine geringe Dosis an verändertem Allergen ausreichend war, ist dies zu vernachlässigen.
Mittels Untersuchungen von IgE-bindenden-Epitopen und gezielter Veränderung von Allergenen, konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass nicht nur die Zerstörung der Struktur oder die Oligomerisierung von Allergenen, sondern die Kombination der beiden Methoden eine geeignete Strategie zur Entwicklung neuer Reagenzien für die klassische spezifische Immuntherapie der Lebensmittelallergie darstellen kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die humane Leukotrien A4-Hydrolase untersucht.
Die hLTA4H ist ein bifunktionelles Enzym, welches neben der Hydrolaseaktivität, welche für die Umwandlung des instabilen LTA4 zu LTB4 verantwortlich ist, auch eine Peptidaseaktivität aufweist. Beide Enzymaktivitäten spielen bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle, weshalb die LTA4H ein interessantes pharmakologisches Target darstellt. Aufgrund der gegensätzlichen Eigenschaften der beiden Aktivitäten der LTA4H (Produktion des proinflammatorischen LTB4 durch die Hydrolase-Aktivität, sowie der Abbau des PGP-Tripeptids durch die Peptidase-Aktivität) wird deutlich, dass die Entwicklung selektiver Hydrolase-Inhibitoren von Vorteil ist.
Das Protein der humanen LTA4H konnte erfolgreich kloniert werden und in E. coli-Zellen exprimiert werden. Zur Gewinnung des reinen rekombinanten Proteins konnte ein Aufreinigungsprotokoll mittels Nickel-Affinitätschromatographie sowie anschließender Größenausschlusschromatographie etabliert werden. Durch die Testung unterschiedlicher Lysemethoden konnte die Ausbeute deutlich erhöht werden.
Um herauszufinden, ob es durch den potentiellen Inhibitor zu einer Hemmung der Enzymaktivität kommt, muss diese detektiert werden können. Hierfür wurde ein geeignetes fluoreszenzbasiertes Testsystem zur Detektion der Enzymaktivität der hLTA4H entwickelt. Dies lässt auch die Quantifizierung der Wirksamkeit der möglichen Inhibitoren zu. Mit Hilfe eines pharmakophorbasierten Ansatzes wurden 22 Testsubstanzen für die in vitro Testung ausgewählt. Nach der Evaluierung dieser Substanzen wurden weitere 14 Derivate der besten Verbindung ausgewählt und ihre inhibitorischen Eigenschaften an rekombinanter LTA4H getestet. Die Ergebnisse wurden mittels Differential Scanning Fluorimetrie validiert, wofür ein einfaches Protokoll etabliert werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 5 bereits bekannte Inhibitoren der LTA4H ausgewählt, um sie hinsichtlich ihres thermodynamischen Profils zu untersuchen. Hierzu wurden die ausgewählten Inhibitoren mittels Isothermer Titrationskalorimetrie vermessen. Die Dissoziationskonstanten der untersuchten Inhibitoren wurden ebenfalls mittels Differential Scanning Fluorimetrie bestimmt, wobei sich zeigte, dass diese Methode nicht zur präzisen Messung von Protein/Ligand Interaktionen herangezogen werden kann. Mittels eines in silico Ansatzes zur Vorhersage von stabilisierten und destabilisierten Wassermolekülen in der Bindetasche konnten die thermodynamischen Daten im strukturellen Kontext interpretiert werden. Durch diese Kombination konnten neue Erkenntnisse zum Design neuer Inhibitoren der LTA4H gewonnen werden.
Die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAPII) ist der zentrale Faktor für die Umsetzung des genetischen Codes in funktionelle Proteine. Durch die Transkription wird die statische Information der DNA in ein transient nutzbares RNA-Molekül umgewandelt. Bei diesem fundamentalen Prozess der Genexpression wird ein spezifischer DNA-Abschnitt des Genoms abgelesen und in die komplementäre RNA transkribiert, die entweder direkt regulatorische bzw. funktionelle Aufgaben in der Zelle übernimmt oder als Matrize für die Proteinbiosynthese dient. Zur Erhaltung der Funktionalität eines Organismus und zur schnellen und gezielten Reaktion auf exogene Reize ist eine strikte Regulation der Transkription und der zahlreichen beteiligten Faktoren notwendig. Aufgrund der zentralen Rolle in der Genexpression ist diese Regulation äußerst vielschichtig und erfordert eine feinabgestimmte Maschinerie an Enzymen und Transkriptionsfaktoren, deren genaue Wirkungsweise und Abhängigkeit noch nicht vollständig verstanden sind. Fehler in der Transkriptionsregulation werden mit einer Reihe von schwerwiegenden metabolischen Störungen und der möglichen malignen Transformation der betroffenen Zelle in Verbindung gebracht.
Während einige Regulationsmechanismen der RNAPII bereits seit längerer Zeit beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAPII-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAPII bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Transkriptionsinitiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieses promotornahen Arrests wird durch den positiven Transkriptions-Elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAPII und assoziierter Faktoren den Übergang in die produktive Transkriptionselongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch die Inkorporation in inhibierende Speicherkomplexe (7SK snRNPs), bestehend aus der 7SK snRNA und mehrerer assoziierter Proteine. Abseits des 7SK snRNP wurde P-TEFb als Bestandteil großer Multiproteinkomplexe identifiziert, die einen positiven Einfluss auf die Transkriptionselongation besitzen. Die Transition von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in diese sogenannten Superelongationskomplexe (SECs) stellt einen der zentralen Regulationsmechanismen der eukaryotischen Transkription dar, ist jedoch noch nicht ausreichend verstanden.
Ein zentrales Element aller SECs bilden die Mitglieder der AF4/FMR2-Proteinfamilie, darunter das AF4 Protein, dem neben der Erhaltung der strukturellen Integrität mittlerweile auch eine Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb zugeschrieben wird. Dabei scheint AF4 jedoch auf die Hilfe bislang noch nicht charakterisierter Faktoren angewiesen zu sein. AF4 ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die Translokation t(4;11)(q21;q23) bedingten, akuten lymphoblastischen Leukämie assoziiert.
Das zentrale Thema dieser Arbeit stellen Untersuchungen zum Transfer von P-TEFb aus dem 7SK snRNP zum AF4-Protein dar. Dabei konnte zunächst die DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 als Integraler Bestandteil der AF4-SECs identifiziert werden, der bereits eine Funktion in der Kontrolle des microRNA- wie auch des mRNA-Metabolismus zugeschrieben werden konnte. Aus diesem Grund wurde von uns eine mögliche Beteiligung von DDX6 an der Rekrutierung von P-TEFb zum AF4-SEC durch Modulationen der 7SK snRNA postuliert. Des Weiteren konnte eine Bindefähigkeit von DDX6 gegenüber der 7SK snRNA sowie eine direkte Korrelation zwischen des zellulären DDX6-Proteinlevel und der Akkumulation von P-TEFb im AF4-SEC nachgewiesen werden. Sowohl die Überexpression von DDX6 als auch die von AF4 resultierten in einer gesteigerten mRNA-Produktion, wobei die Ergebnisse auf einen kooperativen Mechanismus zwischen den beiden Proteinen in der Aktivierung der Transkription hindeuteten. Außerdem konnte die These einer DDX6-vermittelten Aktivierung von P-TEFb anhand von Expressionsanalysen des bekannten P-TEFb Zielgens HEXIM1, dessen Expression im Zusammenhang eines negativen Rückkopplungsmechanismus gesteigert wird, bestätigt werden. Damit konnte der DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 in dieser Arbeit das erste Mal eine entscheidende Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in den AF4-SEC, und somit an der Kontrolle der eukaryotischen Transkription, zugeschrieben werden.
Eine Erkrankung wird als monogen bezeichnet, wenn sie auf einen Gendefekt eines einzelnen Gens zurückzuführen ist. Durch einen angeborenen Gendefekt kann bei den sog. primären Immundefekten (PIDs) das Immunsystem von asymptomatisch bis lebensbedrohlich mehr oder weniger stark beeinträchtigt werden. Für lebensbedrohliche Immundefekte gilt die allogene Stammzelltransplantation eines passenden Spenders als einzig kurative Therapie. Weil jedoch für etwa 30 % aller Patienten kein passender Spender verfügbar ist, bietet die Gentherapie in Kombination mit einer autologen Stammzelltransplantation eine häufig lebensrettende Alternative. Dabei werden patienteneigene CD34+-Blutstammzellen isoliert, ex vivo mit einer funktionalen Kopie des defekten Gens genetisch modifiziert und anschließend zurück in den Patienten infundiert. Die dabei eingesetzten Genfähren basieren in der Regel auf viralen Vektoren, mit denen das gesunde Gen in die Patientenzellen eingeschleust wird. Retrovirale Vektoren wurden für die Gentherapie am häufigsten eingesetzt.
In mehreren klinischen Gentherapie-Studien zur Behandlung diverser PIDs kam es aufgrund insertionsbedingter Transaktivierung benachbarter Proto-Onkogene zur Leukämieentwicklung. Deswegen wurde gezielt an der Sicherheit retroviraler Genfähren gearbeitet. Insbesondere wurden die in der ersten Generation benutzten retroviralen Promotor/Enhancer-Elemente aus der U3-Region des 5’ LTRs deletiert (self-inactivating, SIN-Vektoren) und durch interne, gewebespezifische Promotoren ersetzt. Auf Genfallen basierende Vektoren (gene trap, GT-Vektoren) könnten eine sicherere Alternative zu den Standardvektoren bieten, weil sie zum einen auf den γ-retroviralen SIN-Vektoren basieren und zum anderen keinen internen Promotor enthalten, der zur Transaktivierung benachbarter Gene führen kann. Bei GT-Vektoren wird das integrierte Transgen von endogenen Promotoren kontrolliert, was zu einer robusteren Transgenexpression und zu einem erhöhten Sicherheitsprofil führen sollte.
Ziel dieser Arbeit war, GT-Vektoren hinsichtlich ihres Potentials als Vektoren für die Gentherapie zu bewerten. Dafür wurde zunächst die Gentransduktionseffizienz unterschiedlicher GT-Vektoren in murinen, embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) untersucht. In einem klassischen GT-Vektor ist das Therapiegen von einem 5‘ liegenden Spleißakzeptor (SA) und einer 3‘ liegenden Polyadenylierungssequenz (pA) flankiert. Dies bewirkt, dass das Therapiegen nach Integration in ein exprimiertes Gen als Fusionstranskript mit den 5‘ liegenden endogenen Genfragmenten exprimiert wird. Sind diese kodierend, entsteht ein Fusionsprotein, das die Funktionalität des Therapiegens beeinträchtigen kann. Zu Vermeidung einer derartigen Konstellation wurden drei Strategien zur Verhinderung N-terminaler Fusionen getestet: Die Fusion (i) einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und (ii) eines viralen Proteinspaltungspeptids (T2A) an das 5‘ Ende des Therapiegens sowie (iii) die Insertion von drei Stop-Codons hinter den SA. Die Versuche in mES-Zellen zeigten, dass die GT-Variante mit den Stop-Codons am effizientesten war, weshalb sie für alle weiteren Ansätze verwendet wurde.
Dieser Arbeit vorangegangen war die Entwicklung einer Genfallenstrategie zur Korrektur des septischen Granulomatose (X-CGD) verursachenden gp91phox (CYBB)-Gendefektes in einer gp91phox-defizienten Leukämiezelllinie (PLB-XCGD). Obwohl Genfallen transduzierte PLB-XCGD-Zellen das Therapiegen gp91phox exprimierten, war diese Expression im Vergleich zu den mit einem positiven, Promotor-enthaltenden Kontrollvektor (FES-gp91phox) transduzierten Zellen sehr gering. Deswegen war es notwendig eine effiziente Selektionsstrategie für Genfallenereignisse in hämatopoetischen Zellen zu entwickeln. Eine Strategie basierte auf einem FKBP12/Thrombopoetinrezeptor-Fusionsprotein, dessen Expression in hämatopoetischen BaF3 Zellen eine 25-fache Anreicherung von Genfallen exprimierenden Zellen nach Zugabe des chemischen Liganden AP20187 ermöglichte. Allerdings konnte dieses System in primären, hämatopoetischen Zellen leider nicht etabliert werden.
Die andere Selektionsstrategie basierte auf dem X-SCID Krankheitsmodell, in dem IL2RG-Mutationen, einer Untereinheit verschiedenster Zytokinrezeptoren (z. B. des IL-2-Rezeptors), zu einem kompletten Verlust von T-Zellen und somit zur Reduktion funktionaler B-Zellen führen. Nach ex vivo Korrektur und Transplantation der korrigierten, autologen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), kann eine Expansion der IL2RG exprimierenden T-Zellen erzielt werden. Initiale Versuche wurden an der IL2RG-/--Zelllinie ED-7R in vitro durchgeführt. Nachdem über die durchflusszytometrische Analyse der pSTAT5-Expression eine Aktivierung des IL2RG-abhängigen Signalweges in GT-IL2RG-Genfallen transduzierten ED-7R-Zellen nachgewiesen werden konnte, wurde in einem X-SCID-Mausmodell (IL2RG-/-) überprüft, ob es zu der erwarteten Anreicherung von IL2RG exprimierenden T-Zellen nach Transplantation autologer GT-IL2RG transduzierter HSZ kommt. Dabei wurde sowohl die immunologische Rekonstitution der Mäuse als auch die Funktionalität der rekonstituierten Lymphozyten untersucht. In der GT-Gruppe konnte nach Transplantation genetisch modifizierter Zellen weder ein Unterschied der absoluten Zahl an Lymphozyten (B-Zellen, T-Zellen) im Blut, noch ein erhöhter Prozentsatz der verschiedenen Lymphozyten-subpopulationen in KM, Milz oder Thymus beobachtet werden. Lediglich im Thymus einer Maus aus der GT-Gruppe konnten IL2RG exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Andererseits konnten aus der Milz transplantierter GT-Mäuse T-Zellen isoliert werden, die nach Interleukin-2-Stimulation STAT5-Phosphorylierung aufwiesen, was eine erfolgreiche obgleich geringe GT-IL2RG Transduktion belegt. Durch die Beurteilung des Engraftments, also des Anwachsens der transplantierten Spenderzellen im Empfängerorganismus, konnte gezeigt werden, dass die niedrigere IL2RG-Rekonstitutionseffizienz durch Genfallen nicht auf einem suboptimalen Engraftment, sondern auf einer zu geringen Anzahl an produktiven Genfallenereignissen beruht.
Zusammenfassend legen die Ergebnisse nahe, dass Genfallen zu diesem Zeitpunkt keine realistische Alternative gegenüber konventionellen Gentherapievektoren zur Korrektur monogener Bluterkrankungen bieten. Neue Entwicklungen, die eine Genkorrektur mittels sog. „Designer Endonukleasen“ vor Ort ermöglichen, werden sicherlich in der nahen Zukunft sämtliche, beliebig ins Genom integrierende Gentherapievektoren ersetzen.
Eine Erkrankung wird als monogen bezeichnet, wenn sie auf einen Gendefekt eines einzelnen Gens zurückzuführen ist. Durch einen angeborenen Gendefekt kann bei den sog. primären Immundefekten (PIDs) das Immunsystem von asymptomatisch bis lebensbedrohlich mehr oder weniger stark beeinträchtigt werden. Für lebensbedrohliche Immundefekte gilt die allogene Stammzelltransplantation eines passenden Spenders als einzig kurative Therapie. Weil jedoch für etwa 30 % aller Patienten kein passender Spender verfügbar ist, bietet die Gentherapie in Kombination mit einer autologen Stammzelltransplantation eine häufig lebensrettende Alternative. Dabei werden patienteneigene CD34+-Blutstammzellen isoliert, ex vivo mit einer funktionalen Kopie des defekten Gens genetisch modifiziert und anschließend zurück in den Patienten infundiert. Die dabei eingesetzten Genfähren basieren in der Regel auf viralen Vektoren, mit denen das gesunde Gen in die Patientenzellen eingeschleust wird. Retrovirale Vektoren wurden für die Gentherapie am häufigsten eingesetzt.
In mehreren klinischen Gentherapie-Studien zur Behandlung diverser PIDs kam es aufgrund insertionsbedingter Transaktivierung benachbarter Proto-Onkogene zur Leukämieentwicklung. Deswegen wurde gezielt an der Sicherheit retroviraler Genfähren gearbeitet. Insbesondere wurden die in der ersten Generation benutzten retroviralen Promotor/Enhancer-Elemente aus der U3-Region des 5’ LTRs deletiert (self-inactivating, SIN-Vektoren) und durch interne, gewebespezifische Promotoren ersetzt. Auf Genfallen basierende Vektoren (gene trap, GT-Vektoren) könnten eine sicherere Alternative zu den Standardvektoren bieten, weil sie zum einen auf den γ-retroviralen SIN-Vektoren basieren und zum anderen keinen internen Promotor enthalten, der zur Transaktivierung benachbarter Gene führen kann. Bei GT-Vektoren wird das integrierte Transgen von endogenen Promotoren kontrolliert, was zu einer robusteren Transgenexpression und zu einem erhöhten Sicherheitsprofil führen sollte.
Ziel dieser Arbeit war, GT-Vektoren hinsichtlich ihres Potentials als Vektoren für die Gentherapie zu bewerten. Dafür wurde zunächst die Gentransduktionseffizienz unterschiedlicher GT-Vektoren in murinen, embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) untersucht. In einem klassischen GT-Vektor ist das Therapiegen von einem 5‘ liegenden Spleißakzeptor (SA) und einer 3‘ liegenden Polyadenylierungssequenz (pA) flankiert. Dies bewirkt, dass das Therapiegen nach Integration in ein exprimiertes Gen als Fusionstranskript mit den 5‘ liegenden endogenen Genfragmenten exprimiert wird. Sind diese kodierend, entsteht ein Fusionsprotein, das die Funktionalität des Therapiegens beeinträchtigen kann. Zu Vermeidung einer derartigen Konstellation wurden drei Strategien zur Verhinderung N-terminaler Fusionen getestet: Die Fusion (i) einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und (ii) eines viralen Proteinspaltungspeptids (T2A) an das 5‘ Ende des Therapiegens sowie (iii) die Insertion von drei Stop-Codons hinter den SA. Die Versuche in mES-Zellen zeigten, dass die GT-Variante mit den Stop-Codons am effizientesten war, weshalb sie für alle weiteren Ansätze verwendet wurde.
Dieser Arbeit vorangegangen war die Entwicklung einer Genfallenstrategie zur Korrektur des septischen Granulomatose (X-CGD) verursachenden gp91phox (CYBB)-Gendefektes in einer gp91phox-defizienten Leukämiezelllinie (PLB-XCGD). Obwohl Genfallen transduzierte PLB-XCGD-Zellen das Therapiegen gp91phox exprimierten, war diese Expression im Vergleich zu den mit einem positiven, Promotor-enthaltenden Kontrollvektor (FES-gp91phox) transduzierten Zellen sehr gering. Deswegen war es notwendig eine effiziente Selektionsstrategie für Genfallenereignisse in hämatopoetischen Zellen zu entwickeln. Eine Strategie basierte auf einem FKBP12/Thrombopoetinrezeptor-Fusionsprotein, dessen Expression in hämatopoetischen BaF3 Zellen eine 25-fache Anreicherung von Genfallen exprimierenden Zellen nach Zugabe des chemischen Liganden AP20187 ermöglichte. Allerdings konnte dieses System in primären, hämatopoetischen Zellen leider nicht etabliert werden.
Die andere Selektionsstrategie basierte auf dem X-SCID Krankheitsmodell, in dem IL2RG-Mutationen, einer Untereinheit verschiedenster Zytokinrezeptoren (z. B. des IL-2-Rezeptors), zu einem kompletten Verlust von T-Zellen und somit zur Reduktion funktionaler B-Zellen führen. Nach ex vivo Korrektur und Transplantation der korrigierten, autologen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), kann eine Expansion der IL2RG exprimierenden T-Zellen erzielt werden. Initiale Versuche wurden an der IL2RG-/--Zelllinie ED-7R in vitro durchgeführt. Nachdem über die durchflusszytometrische Analyse der pSTAT5-Expression eine Aktivierung des IL2RG-abhängigen Signalweges in GT-IL2RG-Genfallen transduzierten ED-7R-Zellen nachgewiesen werden konnte, wurde in einem X-SCID-Mausmodell (IL2RG-/-) überprüft, ob es zu der erwarteten Anreicherung von IL2RG exprimierenden T-Zellen nach Transplantation autologer GT-IL2RG transduzierter HSZ kommt. Dabei wurde sowohl die immunologische Rekonstitution der Mäuse als auch die Funktionalität der rekonstituierten Lymphozyten untersucht. In der GT-Gruppe konnte nach Transplantation genetisch modifizierter Zellen weder ein Unterschied der absoluten Zahl an Lymphozyten (B-Zellen, T-Zellen) im Blut, noch ein erhöhter Prozentsatz der verschiedenen Lymphozyten-subpopulationen in KM, Milz oder Thymus beobachtet werden. Lediglich im Thymus einer Maus aus der GT-Gruppe konnten IL2RG exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Andererseits konnten aus der Milz transplantierter GT-Mäuse T-Zellen isoliert werden, die nach Interleukin-2-Stimulation STAT5-Phosphorylierung aufwiesen, was eine erfolgreiche obgleich geringe GT-IL2RG Transduktion belegt. Durch die Beurteilung des Engraftments, also des Anwachsens der transplantierten Spenderzellen im Empfängerorganismus, konnte gezeigt werden, dass die niedrigere IL2RG-Rekonstitutionseffizienz durch Genfallen nicht auf einem suboptimalen Engraftment, sondern auf einer zu geringen Anzahl an produktiven Genfallenereignissen beruht.
Zusammenfassend legen die Ergebnisse nahe, dass Genfallen zu diesem Zeitpunkt keine realistische Alternative gegenüber konventionellen Gentherapievektoren zur Korrektur monogener Bluterkrankungen bieten. Neue Entwicklungen, die eine Genkorrektur mittels sog. „Designer Endonukleasen“ vor Ort ermöglichen, werden sicherlich in der nahen Zukunft sämtliche, beliebig ins Genom integrierende Gentherapievektoren ersetzen.
Biopharmazeutika sind heutzutage ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelmarktes. Ihr komplexer Aufbau und ihre Mikroheterogenität erfordern eine genaue strukturelle Charakterisierung auf verschiedenen Ebenen der Moleküle, wobei die Anwendung neuer Methoden von den entsprechenden Richtlinien durchaus erwünscht ist. Die Massenspektrometrie als Analysemethode hat sich in diesem Gebiet bereits fest etabliert. Verschiedenste massenspektrometrische Untersuchungen können an den intakten Biopharmazeutika sowie an größeren und kleineren Bruchstücken derselben durchgeführt werden. Trotzdem wird meist auf wenige, lange etablierte Protokolle zurückgegriffen, die häufig mit langwieriger Probenvorbereitung verbunden sind. Bei der Analyse der Glykosylierung wird immer noch die chromatographische Trennung mit anschließender Detektion durch UV- oder Fluoreszenzmessung bevorzugt.
In dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten der Massenspektrometrie bei der Analyse von Biopharmazeutika genauer untersucht werden. Dazu gehört auch, den hohen Informationsgehalt der üblichen chromatographischen Auftrennung von Peptiden aus einem proteolytischen Verdau vollständig zu nutzen. Es wurde gezeigt, dass die manuelle Auswertung der Analyse zusätzliche Ergebnisse bringt, und dass gleichzeitig eine Analyse von posttranslationalen und prozessbedingten Modifikationen möglich ist. Zudem wurde der Verdau mit der Protease Trypsin auf das jeweilige Biopharmazeutikum und auf das Ziel der Analyse optimiert. Da mit Trypsin eine vollständige Sequenzabdeckung nicht erreichbar war, wurden zusätzlich verschiedene weniger spezifische Proteasen angewendet. Alle untersuchten weniger spezifischen Proteasen (Elastase, Chymotrypsin und Thermolysin) waren für eine solche Analyse gut geeignet. Die Komplementarität von MALDI- und ESI-MS-Analysen konnte durch ihre Kombination optimal ausgeschöpft werden. Zudem wurden weitere Methoden zur Erhöhung der Sequenzabdeckung wie die Derivatisierung der Peptide mit TMTzero vorgestellt.
Für die Analyse intakter Biopharmazeutika wurden neben der Größenausschlusschromatograph und gelelektrophoretischen Trennungen sowohl MALDI- als auch ESI-MS-Analysen verwendet. Die Trennung großer Proteinmoleküle in kleinere Untereinheiten erleichterte dabei die massenspektrometrische Analyse maßgeblich. Die Fragmentierung der Biopharmazeutika mittels MALDI-ISD war für die Bestimmung der Protein-N- und C-Termini sehr gut geeignet.
Die Analyse der Glykosylierung wurde an den freien N-Glykanen aus einem PNGaseF-Verdau sowie an Glykopeptiden aus einem Verdau mit Pronase durchgeführt. Die freien N-Glykane konnten zudem für die MALDI-MS-Analyse mit der MALDI-Matrix 3-Aminochinolin direkt auf dem Probenteller derivatisiert werden. Die Derivatisierung und Vermessung der N-Glykane wurde zunächst an verschiedenen Standardoligosacchariden, Humanmilcholigosacchariden und N-Glykanen aus Standardglykoproteinen optimiert. Durch die Fragmentierung der N-Glykane konnten diese sequenziert und isomere Strukturen unterschieden werden.
Bei einem Pronaseverdau wurden Proteine so weit verdaut, dass nur noch einzelne Aminosäuren bzw. Di- oder Tripeptide übrig blieben. Lediglich die Glykosylierungsstellen waren durch die voluminösen Glykanstrukturen vor dem Verdau geschützt und behielten eine kurze Peptidsequenz, die für eine Identifizierung der Glykosylierungsstelle ausreichend war. So konnten die N- und O-Glykopeptide direkt ohne Aufreinigung mittels MALDI-MS aus den Verdauansätzen analysiert werden, ohne dass nicht glykosylierte Peptide störten. Das Verdauprotokoll wurde zunächst an mehreren Standard-N- und -O-Glykoproteinen optimiert und anschließend auf die untersuchten Biopharmazeutika angewendet. N- und O-Glykopeptide konnten sogar nebeneinander analysiert werden. Die hohe Massengenauigkeit des verwendeten MALDI LTQ-Orbitrap Massenspektrometers ließ eine eindeutige Identifizierung der Glykopeptide mit Hilfe eines dafür entwickelten Programms zu. Weiterhin konnte die Identifizierung durch die Fragmentierung der Glykopeptide unterstützt werden.
Somit konnten in dieser Arbeit verschiedene massenspektrometrische Analysen von Biopharmazeutika neu entwickelt, optimiert oder vereinfacht werden. Dabei wurden für jede Strukturebene (intaktes Molekül, größere und kleinere Fragmente) sowohl Ansätze mit MALDI-MS als auch mit ESI-MS verfolgt. Einige Methoden, die in der Proteomforschung bereits Anwendung fanden, konnten erfolgreich auf Biopharmazeutika übertragen werden. Die Arbeit zeigt, dass die Massenspektrometrie ein großes Potential in der Analyse der Biopharmazeutika besitzt, das aber bisher noch nicht vollständig ausgeschöpft wird. Durch die Wahl der richtigen Methoden und der geeigneten Instrumentierung wird eine vollständige strukturelle Charakterisierung ermöglicht.
In silico Methoden spielen in der Wirkstoffentwicklung eine immer größere Bedeutung. Sie können eine Größe Hilfe in der Analyse des Targets oder beim Screening von neuen Liganden sein. Ihre Stärken liegen vorallem in der Zeit- und Kostenreduzierung während einer
Wirkstoffentwicklung.
Ziel der Arbeit war die Entwicklung neuer COX-2 Liganden mit Hilfe von in silico Methoden. Weil von der mCOX-2 keine Kristallstruktur in der PDB publiziert war, begann die Arbeit mit der Modellierung der mCOX-2. Dafür wurde aus der Sequenz der hCOX-2 aus UniProt mit der ID P35354 mit Hilfe der Kristallstruktur 3LN1 ein Homologie Modell entwickelt und im Anschluss über eine Validierungsmethode, den Ramachandran Plot, analysiert. Der Ramachandran Plot zeigte, dass 93.7% der Aminosäuren in favorisierten Regionen, 6.1% in
erlaubten Regionen, 0.2% in geduldeten Regionen und 0.0% in unerlaubten Regionen lagen. Mit diesem Modell wurde eine MD-Simulation durchgeführt, um die Energie des Modells zu
minimieren.
Die neuen Verbindungen wurden über drei verschiedene Ansätze designt. Im ersten Ansatz wurde die Software DOGS verwendet. Dabei handelt es sich um ein de novo Design Programm, welches nicht nur neue Verbindungen entwickelt, sondern auch deren Syntheseweg vorschlägt. Die vorgeschlagenen Verbindungen wurden über eine Docking-Studie analysiert, wobei die Verbindungen aus Abbildung 15 identifiziert werden konnten. Verbindung 22 wurde ohne weitere Variationen synthetisiert. Die Verbindungen 71 und 86 wurden aus der modellierten Verbindung 87, welche von DOGS vorgeschlagen wurde, weiterentwickelt. Dabei wurde Verbindung 71 als ein Fragment von Verbindung 85 entwickelt. Verbindung 86 wurde direkt aus Verbindung 87 entwickelt, wobei einige Variationen durchgenommen wurde. Hierbei sollte vorallem die Form von Verbindung 87 beibehalten werden.
Literatur verwendet, um ausgehend von den Verbindungen APHS und ASS neue COX-2 Inhibitoren zu entwickeln (siehe Abb. 16). Dabei wurden mehrere Verbindungen designt, wovon Verbindung 3 als ein leichter Inhibitor identifiziert werden konnte. 3 enthält keine für COX-Inhibitoren typische polare Gruppe, besitzt dafür aber eine Acetylgruppe, die gemäß in silico Untersuchungen in der Lage sein könnte, Ser530 in COX-2 zu acetylieren.
In der letzten Studie wurden mit Hilfe eines Fragment-basierten Designs neue Verbindungen entwickelt, wobei das Benzensulfonamid von Celecoxib aus der Kristallstruktur 1PTH extrahiert und mit kleinen Fragmente verknüpft wurde, welche zuvor über eine Docking-Studie analysiert wurden. Hieraus entwickelte sich Verbindung 35, die in einer kleinen SAR-Studie zu 70 optimiert werden konnte. Dabei konnte das Sulfonamid, welches typisch für Coxibe ist, gegen eine Carbonsäure ausgetauscht werden (69). Erst durch eine Vergrößerung der Verbindung um einen Benzyl-Rest am sekundären Amin von 69 führte zur potenten Verbindung 70.
Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit fünf neue COX-2 Inhibitoren als Leitstrukturen entwickelt werden. Dabei kamen fortschrittliche in silico Methoden wie die De-Novo Design Software DOGS aber auch rationale Designmethoden zum Einsatz. Beide Methoden boten Vor- und Nachteile und haben jeweils zu guten Ergebnissen geführt. Bei der Entwicklung der vielversprechendsten Leitstrukturen 70 und 71 wurden die Vorteile beider Ansätze kombiniert.
Pharmakophore sind ein zentrales Konzept der medizinischen Chemie. Im Liganden-basierten Design abstrahieren sie physikochemische Eigenschaften einer Menge aktiver Liganden und lassen dadurch Rückschlüsse auf die möglichen Interaktionen mit einem Target zu. Umgekehrt werden im Struktur-basierten Design Kristallstrukturen von Proteinen genutzt um zu modellieren, welche Eigenschaften die Bindetasche besitzt und welche Eigenschaften das entsprechende Gegenstück möglicher Liganden habe sollte. Diese Informationen können genutzt werden, um neue Substanzen zu identifizieren, welche die im Pharmakophore-Modell modellierten Interaktionen mit dem Target eingehen können. Durch die Abstraktion können hierbei sowohl Verbindungen mit neuen Grundgerüsten (scaffold) als auch mit veränderten funktionellen Gruppen gefunden werden. Im ersten Fall spricht man dabei von „scaffold hopping“, der letzte Fall ist eng verbunden mit dem Konzept des bioisosteren Ersatzes.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Pharmakophore genutzt, um in drei Studien neue Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade zu finden. Die Arachidonsäurekaskade ist ein Stoffwechselweg in der aus Arachidonsäure eine Reihe von Lipidmediatoren synthetisiert wird. Viele dieser Mediatoren spielen eine entscheidende Rolle in Entzündungsprozessen und damit einhergehenden Krankheitsbildern. Es wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen aus einer Menge bekannter Liganden entwickelt.
In der ersten Studie wurde ein Struktur-basiertes Pharmakophor-Modell der Bindetasche der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) erstellt, welches die möglichen, relevanten Interaktionsmöglichkeiten abbilden sollte. Dieses Pharmakophor-Modell wurde zum Screening einer Datenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen genutzt und führte zu zwei Verbindungen mit IC50-Werten im niedrigen mikromolaren Bereich sowie einer dritten Verbindung mit einem bisher nicht für Inhibitoren der sEH beschriebenem Chemotyp. Zwar war diese Verbindung in höheren Konzentration unlöslich war, jedoch erreichten Derivate ebenfalls IC50-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich und könnten als mögliche Startpunkte für eine neue Substanzklasse von sEH-Inhibitoren dienen.
In einer zweiten Studie wurde ein Liganden-basierter Ansatz gewählt um neue Inhibitoren der Leukotrien-A4 Hydrolase (LTA4H) zu suchen. Im Rahmen dieser Studie wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen entwickelt, welche auf einem wachsenden neuronalen Gas basiert, einer Methode aus dem Bereich des maschinellen Lernens. Die Methode wurde retrospektiv anhand mehrerer Benchmark-Datensätze validiert. Unter anderem wurde überprüft, inwiefern die Methode in der Lage ist die bioaktive Konformation eines Liganden vorherzusagen. Hierzu wurden, ausgehend von co-kristallisierten Liganden, automatisch Modelle generiert, welche im Anschluss genutzt wurden um Konformations-Datenbanken der Liganden zu durchsuchen. Je näher die beste gefundene Konformation an der co-kristallisierten Konformation lag, desto besser war das erzeugte Modell. Die entwickelte Methode war in nahezu allen Fällen in der Lage ein Modell zu erzeugen, mit welchem die durchschnittliche Abweichung zwischen co-kristallisierter und gefundener Konformation unter 2 Å lag. Im Rahmen der Studie wurde die neu entwickelte Methode auch in einem prospektiven Virtual Screening nach neuen Liganden der LTA4H genutzt. Hierzu wurden basierend auf 24 Kristallstrukturen mehrere Pharmakophor-Modelle für LTA4H-Liganden erstellt. Durch zusätzliche Nutzung des ESshape3D Fingerprints konnte außerdem die Form der Bindetasche der LTA4H erfasst werden. Diese Modelle wurden anschließend eingesetzt um eine Datenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen zu durchsuchen und führten zur Identifizierung von zwei Substanzen mit IC50-Werten im unteren mikromolaren Bereich. Des Weiteren war die neue Methode in der Lage, den Bindemodus des genutzten Referenzinhibitors vorherzusagen, welcher durch Röntgenstrukturanalyse bestätigt wurde.
In zwei weiteren Studien wurde versucht, duale Inhibitoren der sEH und der 5-Lipoxygenase (5-LO) zu finden. Die erste dieser beiden Studien nutzte hierfür „duale“ Pharmakophor-Modelle: für beide Targets wurde basierend auf einer Vielzahl publizierter, aktiver Liganden eine Reihe von Pharmakophor-Modellen erstellt. Diese Modelle wurden paarweise miteinander verglichen; Modelle, welche eine ausreichend hohe Überlappung an Features besaßen, dienten als Ausgangspunkt für die Suche nach potentiell dualen Liganden. Durch die Suche in einer Fragment-Datenbank konnten neun Verbindungen identifiziert werden, welche eine Aktivität gegenüber einem der beiden Targets zeigten. Diese Verbindungen besaßen zum Teil noch nicht in der Literatur für sEH- oder 5 LO Inhibitoren beschriebene Strukturmerkmale. Eine der Verbindungen war außerdem in der Lage beide Targets im niedrigen mikromolaren Bereich zu inhibieren und könnte als Ausgangspunkt zur Entwicklung weiterer dualer 5-LO/sEH-Inhibitoren dienen. In der zweiten Studie wurde eine auf selbst-organisierenden Karten (SOM) basierende Methode genutzt um potentiell duale Liganden zu suchen. Hierzu wird je eine SOM mit repräsentativen (Sub-) Strukturen von Liganden beider Targets trainiert. Die DrugBank, eine Datenbank zugelassener Wirkstoffe, dient hierbei als Hintergrundverteilung und stellt den Raum wirkstoffartiger chemischer Strukturen dar. Durch einen automatischen Vergleich der trainierten SOMs können mögliche gemeinsame Substrukturen identifiziert werden. Die Anwendung dieser Methode auf bekannte Inhibitoren der sEH und der 5-LO identifizierte neun Fragmente, die auf einem der beiden Targets, sowie fünf Fragmente welche auf beiden Targets im niedrigen mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Eine Substruktursuche nach einem dieser Fragmente in einer internen Datenbank lieferte eine Verbindung, welche beide Targets im nanomolaren Bereich inhibiert und eine vielversprechender Basis als Leitstruktur für die Entwicklung dualer 5-LO/sEH-Inhibitoren darstellt.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mehrere Ansätze vorgestellt wie Pharmakophore in der Wirkstoffsuche eingesetzt werden können. Im Rahmen mehrerer Virtual Screenings konnten eine Reihe neuer Inhibitoren gefunden werden, einige mit nicht zuvor beschriebenen Strukturmerkmalen für das jeweilige Target. Es wurde außerdem eine neue Methode zur automatischen Generierung von Pharmakophor-Modellen entwickelt, welche sowohl retrospektiv als auch prospektiv validiert wurde.
Patienten mit einer BCR/ABL positiven (Ph+) akuten lymphatischen Leukämie (ALL) bilden die größte genetisch definierte Untergruppe der ALL und gelten wegen ihrer schlechten Prognose als Höchstrisiko ALL. Die bisherigen Therapieergebnisse werden durch die Kombination von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) wie Imatinib und Chemotherapeutika verbessert, sind aber durch das Auftreten von Resistenzen gegen TKI in ihrer langfristigen Wirkung limitiert. Die derzeitige Forschung fokussiert sich weitestgehend auf konstitutive aktive Kinasen, die für die leukämische Transformation verantwortlich sind. Allerdings kann die Deregulation von Phosphatasen, die als Gegenspieler von Kinasen fungieren, durch eine verminderte Inaktivierung dieser Kinasen, ebenso zur Leukämogenese beitragen, indem ihre physiologische Funktion vermindert wird. Im Vorfeld konnte bereits gezeigt werden, dass die deregulierte Protein Tyrosin Phosphatase 1B (PTP1B) bei Ph+ Leukämien eine partielle Resistenz gegenüber TKI vermitteln kann.1 Darüber hinaus zeigen von Juric et al. (2007)2 publizierte Microarrays von 54 Ph+ ALL Patienten eine transkriptionelle Hochregulierung der Phosphatase „Supressor of T-Cell receptor Signalling 1“ (STS-1).2 STS-1 (TULA-2) gehört zusammen mit STS-2 (TULA-1) zur Familie der STS/TULA Proteine, von denen keine weiteren Mitglieder bekannt sind. STS-1 dephosphoryliert diverse Rezeptor-Tyrosin-Kinasen wie z.B. den T-Cell Receptor (TCR) und den Epidermal-Growth-Factor Receptor (EGFR) und verhindert somit deren Internalisierung und proteosomalen Abbau.3 Weitere durch STS-1 dephosphorylierte Substrate sind die Proteintyrosinkinase Syk, die eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung des B-Cell-Receptors (BCR) spielt sowie andere SRC-Kinasen (z.B. FYN).4 Aufgrund der oben beschriebenen Zusammenhänge zwischen STS-1 und der Ph+ ALL ist die Untersuchung einer möglichen funktionellen Bedeutung von STS-1 bei der Entwicklung einer mutationsunabhängigen Resistenz von Ph+ ALL Inhalt dieser Arbeit. Als Modellsystem dienen in der hier vorliegenden Arbeit aus der BCR/ABL Zelllinie Sup B15 abgeleitete TKI resistente Zellen (Sup B15 RT). Imatinib ist in diesen immer noch in der Lage BCR/ABL zu binden und führt zu einer Verschiebung der Dosiswirkungskurve ohne Apoptose zu induzieren. Mutationen in der Tyrosinkinase Domäne von BCR/ABL konnten als zugrunde liegender Resistenzmechanismus durch Sequenzanalysen ausgeschlossen werden, ebenso wie zusätzliche Translokationen oder genomischen Amplifikationen von BCR/ABL. Eine Analyse der STS-1 Expression zeigte sowohl transkriptionell als auch auf Proteinebene eine deutliche Herunterregulierung von STS-1 in Sup B15 RT Zellen. Die Interaktion zwischen STS-1 und BCR/ABL wurde in verschiedenen Zellmodellen gezeigt. Dabei konnten bezüglich der Interaktion keine Unterschiede zwischen dem p210BCR/ABL und p185BCR/ABL Fusionsprotein festgestellt werden. Auch die „Gatekeeper“ Mutation T315I hatte keinen Einfluss auf die Interaktion. Die Unabhängigkeit der Bindung von STS-1 und BCR/ABL von einer aktiven BCR/ABL Kinase wurde durch die Zugabe von Imatinib gezeigt. Lediglich auf endogenem Level konnte eine Imatinib vermittelte Reduktion der Interaktion nachgewiesen werden. Durch die Verwendung unterschiedlich trunkierter BCR/ABL Proteine wurde gezeigt, dass STS-1 sowohl mit c-ABL als auch mit dem ABL-Anteil von BCR/ABL interagiert und dass eine Oligomerisierung für diese Interaktion nicht notwendig ist. Als Folge der Interaktion kommt es zu einer Dephosphorylierung von BCR/ABL durch STS-1, wobei vor allem die im ABL Anteil lokalisierten und für die Autophosphorylierung wichtigen Tyrosine 245 und 412 dephosphoryliert werden. Mittels eines Proliferations-Kompetitions-Assay konnte gezeigt werden, dass STS-1 sowohl die Proliferationsrate reduziert als auch erheblich die Sensitivität von SupB15 RT Zellen gegenüber Imatinib steigert. Dieser Befund steht im Einklang mit der Annahme, dass diese Sensitivitätssteigerung durch eine gegenüber den sensitiven Sup B15 WT deutlich verminderte STS-1 Expression bedingt ist. Dexamethason in klinisch relevanten Konzentrationen (10-6 M - 10-9 M) konnte sowohl in SupB15 WT als auch in SupB15 RT Zellen die STS-1 Expression um ein Vielfaches steigern und führte in Kombination mit 1 μM Imatinib sogar in den resistenten Zellen zu einer hoch signifikanten Inhibition der Proliferation sowie einer gesteigerten Apoptose. Die Resultate dieser Arbeit rücken Phosphatasen und im speziellen STS-1 in einen stärkeren Fokus, wenn es um die Bildung von Resistenzen geht. Dadurch können sich eine Vielzahl neuer Behandlungsstrategien sowie neue Ansätze für die klinische Wirkstoffforschung ergeben.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind im Immunsystem essentiell für die Verarbeitung von Signalen, die von Chemokinen, Lipiden und anderen Botenstoffen ausgehen. Ihre Existenz gewährleistet, dass Leukozyten sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Umständen ihren Funktionen als Immunzellen nachkommen können. Grundlegend wichtig für das angeborene Immunsystem sind die GPCR, die die Weiterleitung ihrer Signale über G-Proteine vom Typ Gi vermitteln. Die Migration, Adhäsion und Differenzierung von Leukozyten wird jedoch auch maßgeblich durch G12/13-gekoppelte Rezeptoren reguliert, wobei die kleine GTPase RhoA als Effektormolekül eine wichtige Rolle spielt. Die Bedeutung der G12/13-gekoppelten Signaltransduktion in Makrophagen ist allerdings weitgehend unverstanden. Mit Hilfe einer Mauslinie, in der speziell und ausschließlich in myeloiden Zellen die beiden G-Protein-Untereinheiten Gα12 und Gα13 durch ein konstitutiv aktives Cre-Rekombinase-System inaktiviert wurden (Lys-Gα12/Gα13-KO), sollte nun die Funktion und der genaue Mechanismus des G12/13-gekoppelten Signalweges in Monozyten und Makrophagen aufgeklärt werden und somit neue Erkenntnisse zur Rolle der GPCR im Immunsystem gewonnen werden.
Eine erste Untersuchung der peripheren Immunzellpopulationen des Lys-Gα12/Gα13-KO ergab, dass residente Gewebemakrophagen, im Speziellen die des Peritoneums, in ihrer Anzahl erhöht sind. In einer vertieften Analyse der residenten peritonealen Makrophagen (rpMP) konnte gezeigt werden, dass der Verlust von Gα12/13 zu Veränderung im Zytoskelett der Makrophagen führt. Die Zellen entwickeln einen Phänotyp mit besonders langen und verzweigten Filopodien und zeigen Ein-schränkungen in ihrer basalen Beweglichkeit.
Über diesen morphologischen Befund hinaus, konnte in einer Studie zur Gen-expression in diesen Zellen festgestellt werden, dass Gα12/13-defiziente Makrophagen verstärkt proinflammatorische Gene wie Nos2, die Cyclooxygenase 2 aber auch verschiedene Chemokine wie Cxcl10 oder Cytokine wie Il-6 oder Tnfα exprimieren. Ein ähnlicher Phänotyp in Bezug auf Morphologie und Genexpression wurde bei der Untersuchung von Makrophagen, die aus Knochenmark des Lys-Gα12/Gα13-KO generiert wurden, beobachtet.
Als vermutlich verantwortlicher G12/13-gekoppelter Rezeptor konnte der S1P-Rezeptor-subtyp 2 (S1P2) identifiziert werden. Mit Hilfe von Inhibitoren für die G12/13-gekoppelte Signaltransduktionskaskade konnte gezeigt werden, dass über die kleine GTPase RhoA die NF-κB-abhängige Genaktivität reguliert werden kann. Vermutlich aktiviert RhoA dazu die Rho Kinase ROCK, die wiederum das untergeordnete Effektormolekül Rac1 hemmen kann. Im Falle des Lys-Gα12/Gα13-KO führt eine reduzierte Aktivierung von RhoA insgesamt zu einer eingeschränkten Hemmung dieses Signalweges und im Folgenden zu einer außer Kontrolle geratenen Induktion entzündungsrelevanter Gene und damit einhergehend auch zu einer Veränderung des Milieus in der Bauchhöhle dieser Tiere.
Obwohl die Immunantwort in diesen Tieren auf klassische Pathogene wie Lipopolylsaccharide (LPS) unverändert ist, konnte ein Anstieg an peritonealen B-Zellen festgestellt werden. Diese B-Zellen, insbesondere B1 B-Zellen, sind als wichtige Produzenten von natürlichen Antikörpern gegen endogene Pathogene bekannt. Die Analyse von Plasma aus Lys-Gα12/Gα13-KO-Mäusen ergab einen erhöhten Titer für natürliche Antikörper wie beispielsweise gegen oxidierte Formen von atherogenen Lipoproteinen. Diese Erkenntnis führte zu der Frage, ob die ursprünglich pro-inflammatorischen Veränderungen der peritonealen Makrophagen einen indirekten, positiven Einfluss auf die Entwicklung einer Atherosklerose haben können. Interessanterweise sind die Tiere des Lys-Gα12/Gα13-KO signifikant vor Atherosklerose geschützt und die Existenz der natürlichen Antikörper in atherosklerotischen Läsionen wird als Hinweis für ihre protektive Rolle im Krankheitsverlauf angesehen. In einem therapeutischen Ansatz mit peritonealen Zellen konnte in Atherosklerose-gefährdeten Tieren die Progression dieser Gefäßerkrankung eingedämmt werden.
Die hier durchgeführte Studie hat durch in vitro und in vivo Versuche mit Lys-Gα12/Gα13-KO-Mäusen dazu beitragen, das Verständnis der Rolle der G12/13-gekoppelten Signaltransduktion im Immunsystem zu verbessern.
Die Komplexität der verschiedenen Funktionen einzelner Effektormoleküle einerseits und die Interaktionen unterschiedlicher Immunzellpopulationen andererseits lassen jedoch vermuten, dass noch weitreichende Untersuchungen an GPCR und G-Proteinen nötig sind, um diese für den Organismus bedeutsamen Informationssysteme voll-ständig zu verstehen und weiter therapeutisch nutzbar zu machen.
In einer vorangegangenen Studie konnten bereits duale sEH / PPAR-Modulatoren identifiziert werden, welche allerdings nicht in vivo applizierbar waren 73. Der Vorteil des Multi-Target-Liganden Ansatzes konnte demnach nicht evaluiert werden. Das Ziel der folgende Arbeit beschreibt demnach Design, Synthese und Charakterisierung in vivo applizierbarer sEH / PPAR-Modulatoren. Dieser Prozess sollte in drei Phasen gliederte werden:
o Identifizieren einer geeigneten Strukturklasse
o Etablieren einer Struktur-Aktivitäts-Beziehung zu beiden Targets
o Leitstrukturoptimierung
Die gesuchte Zielverbindung sollte nach oraler in vivo Applikation eine ausreichend hohe Plasmakonzentration in vivo erreichen, um konzentrationsabhängig die Targets sEH und PPAR zu modulieren. Mit dieser Modellverbindung wäre es möglich eine vergleichbare Studie zur sEH / PPAR-Kombinationstherapie von Imig et al. 72, durchzuführen. Letztendlich könnte mit dem Vergleich dieser zwei Studien gezeigt werden, ob die simultane Modulation dieser zwei Targets das Potenzial besitzt mehrere Risikofaktoren zu therapieren.
Die Applikation von therapeutischen Peptiden oder Proteinen kann im Patienten durch Mechanismen des Immunsystems zu unerwünschten Nebenwirkungen führen, die die biologische Wirksamkeit vermindern können. Dies geht mit einer erhöhten Wirkstoffgabe oder einer Therapieresistenz einher und stellt damit ein Sicherheitsrisiko für den Patienten dar. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel HIV-inhibitorischer Peptide eine Möglichkeit aufgezeigt, mit der die peptidspezifische humorale und zelluläre Immunogenität vermindert, die Wirksamkeit indes beibehalten werden kann. Als Ausgangspunkt wurden die bereits publizierten Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C34-EHO ausgewählt, welche äußerst effektiv den Eintritt von HIV in dessen Zielzellen verhindern. Alle fünf Peptide sind von der Aminosäuresequenz des transmembranen Hüllproteins gp41 des HIV-1 (T-20, C46, SC35EK), HIV-2 (C34-EHO) bzw. HIV-1/-2/SIV (T-1249) abgeleitet. In dieser Arbeit wurde das HIV-2 Peptid C34-EHO C-terminal um 12 Aminosäuren des HIV-1 verlängert (neue Bezeichnung: C46-EHO). Für die Initiierung einer zellulären Immunantwort muss unter anderem ein Peptidfragment (sog. MHC-I-Epitop) über Ankeraminosäuren an ein MHC-I-Molekül binden. Die in silico Analyse der Aminosäuresequenzen der Peptide ergab diesbezüglich für das Hybridpeptid C46-EHO die geringste potentielle zelluläre Immunogenität, wobei insgesamt fünf starke potentiell immunogene MHC-I-Epitope von den Vorhersageprogrammen BIMAS und SYFPEITHI identifiziert wurden. Die in vitro Analyse der humoralen Antigenität zeigte zudem, dass die überwiegende Mehrheit der HIV-1-infizierten Patienten Antikörper gegen die HIV-1-abgeleiteten Peptide C46 und T-20 im Serum aufwies, nicht jedoch gegen C46-EHO, T-1249 und SC35EK. Die Antikörper waren überwiegend gegen die am C-Terminus lokalisierte HIV-1 MPER (membrane-proximale external region) gerichtet. In den Seren von HIV-2-infizierten Patienten waren hingegen Antikörper gegen T-1249 und C46-EHO detektierbar. Die Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C46-EHO verhinderten spezifisch die Infektion von HIV-1 im nanomolaren Konzentrationsbereich. C46-EHO hemmte überdies den Eintritt von SIVmac251 als auch T-20- und C46-resistenter HI-Viren. T-Zelllinien wurden durch die membranständige Expression von C46-EHO effektiver vor einer HIV-1 Infektion geschützt im Vergleich zu membranständigen C46 Peptid. Aufgrund der geringen Immunogenität und der äußerst breiten und effektiven antiviralen Wirksamkeit wurde C46-EHO für die weitere Optimierung verwendet. Im C46-EHO wurden Aminosäuren an Hauptankerpositionen der MHC-I-Epitope gegen weniger stark bindende Aminosäuren bei fünf potentiellen 9mer MHC-I-Epitopen ausgetauscht. Dies resultierte in den Peptidvarianten V1, V2, V3 und V4, wobei V2 die aussichtsreichsten Eigenschaften aufwies: 1) niedrigste humorale Antigenität in HIV-1 Patientenseren; 2) potente antivirale Wirksamkeit; 3) verringerte potentielle zelluläre Immunogenität. Abschließend wurde basierend auf V2 die optimierte Peptidvariante V2o generiert. Die Glykosylierungsstelle im V2 Peptid wurde an die entsprechende C46 Position verschoben, wodurch die in silico vorhergesagte zelluläre Immunogenität weiter vermindert wurde. Zudem wurde das HIV-1-abgeleitete MPER-Motiv durch die Aminosäuresequenz des HIV-2 Stammes EHO ersetzt, so dass V2o nicht mehr von prä-existierenden Antikörpern in HIV-1 Patientenseren erkannt wurde. Im ELISpot Assay wiesen weder Patienten mit einer HIV-1 bzw. HIV-2 Infektion noch SIV-infizierte Rhesus Makaken eine zelluläre Immunantwort gegen C46-EHO, V2 oder V2o auf. V2o verhinderte den Eintritt von diversen HIV-1 Viren im pikomolaren Konzentrationsbereich und wies somit eine deutlich verbesserte antivirale Wirksamkeit auf. Somit konnte in dieser Arbeit durch Austausch von Aminosäuren die intrinsische Immunogenität des HIV-inhibitorischen Peptids C46-EHO vermindert und zugleich die biologische Wirksamkeit verstärkt werden. Das hieraus resultierende Peptid V2o steht nunmehr für die weitere klinische Entwicklung als Präventativ oder Therapeutikum für die subkutane oder gentherapeutische Applikation zur Verfügung.
Die größte Gruppe der Krebserkrankungen bei Kindern sind die Leukämien. Die größte Untergruppe stellen dabei die Leukämien unter Beteiligung des MLL-Gens auf Chromosom 11q23 dar. Die bei MLL-Translokationen gefundenen Partnergene sind äußerst vielfältig. Der häufigste Partner ist jedoch das AF4-Gen auf Chromosom 4. Die bei der t(4;11)-Translokation entstehenden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL sind die Auslöser der Leukämie, wobei in unterschiedlichen Forschungsarbeiten beiden Fusionsproteinen eine Transformatorische Wirkung bescheinigt werden konnte. Das Wildtyp MLL-Protein liegt in der Zelle in einem Multiproteinkomplex vor, der durch seine Histon-Methyltransferase-Aktivität an Lysin 4 des Histon H3, zu einer offenen Chromatinstruktur führt und dadurch für die Transkriptionsinitiierung essentiell ist. Eine besondere Rolle kommt den MLL-Protein bei der Aufrechterhaltung von epigenetischen Signaturen beispielsweise bei der Embryogenese oder dem Durchlaufen des Zellzyklus zu. Im Gegensatz dazu nimmt der F4-Multiproteinkomplex eine wichtige Stellung in der Transkriptionselongation ein und ermöglicht der RNA-Polymerase II zusammen mit seinen Komplexpartnern die Elongation der mRNA. Die Taspase1 wurde als das Protein entdeckt, dass für die Prozessierung des MLL-Proteins verantwortlich ist und es an den Schnittstellen CS1 bzw. CS2 proteolytisch spaltet. Die hierbei entstehenden Fragmente N320 und C180 können daraufhin dimerisieren und werden gegenüber einem proteasomalen Abbau stabilisiert. Diese Taspase1-Schnittstellen sind auch in dem Fusionsprotein AF4-MLL enthalten und ermöglichen die Stabilisierung des AF4-MLLs nach proteolytischer Spaltung gegenüber seinem proteasomalen Abbau. Die Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase aus der Familie der Typ-2 Asparaginasen zu deren weiteren Vertretern die L-Asparaginase sowie die Glycosylasparaginase zählen. Als einziger Vertreter dieser Gruppe ist die Taspase1 jedoch eine Protease. Gemein ist allen Vertretern der Familie, die autoproteolytische Aktivierung des exprimierten Proenzyms hin zu einer katalytisch aktiven Form. Im Falle der Taspase1 kommt es dabei zu einer Spaltung in die als Heterodimer vorliegenden α- und β-Untereinheiten. Das katalytische Nukleophil der aktiven Taspase1 ist dabei das N-terminale Thr234 der β-Untereinheit. Neben ihrer Rolle als Protease des AF4-MLLs und der damit verbundenen Stabilisierung des Onkogens, wird der Taspase1 auch bei den soliden Tumoren eine Rolle als für die Transformation wichtiges Protein zugewiesen, was sich in ihrer häufigen Überexpression in verschiedenen Tumorarten widerspiegelt. Die Taspase1 ist demnach ein interessantes Ziel für die Wirkstoffentwicklung. Hierfür ist die Generierung eines quantitativen Aktivitätstest besonders wichtig und war Ziel dieser Arbeit. Der entwickelte Aktivitätstest basiert auf einem Reporter bestehend aus den beiden Fluoreszenzproteinen TagBFP sowie TagGFP2, die über eine Taspase1 Schnittstelle verbunden wurden. Dieses FRET-Paar lässt dabei die kontinuierliche Beobachtung der Reaktion zu und ermöglicht eine Auswertung der kinetischen Parameter der Reaktion. Von den beiden FRET-Reportern mit den unterschiedlichen Schnittstellen CS1 und CS2,konnte nur der mit der CS2 Schnittstelle exprimiert werden. Dieser Reporter konnte dann für die Validierung des Aktivitätstests eingesetzt werden und ließ die Bestimmung der kinetischen Parameter der Taspase1 für diese Reaktion zu. Die erhaltenen Parameter bewegen sich in einer ähnlichen Größenordnung wie schon publizierte kinetische Parameter eines Peptid-basierten Aktivitätstests. Ausgehend hiervon wurden die dnTaspase, eine dominant negative Taspase1-Mutante, kinetisch untersucht und ihre Inhibition der Taspase1-Aktivität beschrieben. Der Aktivitätstest ließ die Bestätigung der Konzentrationsabhängigen Inhibition der Taspase1-Aktivität durch die dnTaspase zu. Diese Beobachtung konnte auch in einer Zell-basierten Variante des Aktivitätstests bestätigt werden und zeigte sich ferner auch in einer Wachstumsverlangsamenden Wirkung der dnTaspase in der t(4;11)-Zelllinie SEM, wobei dieser Effekt nicht auf einer Zunahme der Apoptose der Zellen zurückzuführen war. Desweiteren wurde der Aktivitätstest benutzt, um eine Reihe von gegen das aktive Zentrum der Taspase1 gerichtete Substanzen auf ihre inhibitorische Wirksamkeit zu untersuchen.Hierbei gelang es einen Kandidat als Leitsubstanz zu identifizieren, der eine konzentrationsabhängige Inhibition der Taspase1 zeigte. Eine Bindung dieser Substanz an die Taspase1 konnte jedoch durch einen Thermal Shift Assay nicht nachgewiesen werden und ein Einfluss auf die Viabilität von proB-ALL Zelllinien konnte nicht beobachtet werden.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden drei bakterielle Enzyme, die Metallo-β-Lactamasen NDM-1 (New Delhi Metallo-β-Lactamase 1), VIM-1 (Verona-Integron Encoded Metallo-β-Lactamase 1) und IMP-7 (Imipenemase 7), sowie ein humanes Enzym, die sEH-Phosphatase, behandelt.
Das Auftreten multiresistenter Bakterien ist eine alarmierende Entwicklung. Dabei ist das vermehrte Erscheinen von Metallo-β-Lactamasen (MBLs) in Gramnegativen Bakterien zu beobachten, die von Inhibitoren anderer β-Lactamasen unbeeinflusst bleiben. MBLs sind Enzyme, die β-Lactam-Antibiotika hydrolysieren und somit unwirksam machen. β-Lactam-Antibiotika hemmen die Zellwandsynthese von Bakterien und haben keinen Einfluss auf menschliche Zellen. Daher sind sie für den Menschen sehr gut verträglich und werden oft eingesetzt. Gerade diese häufige Verwendung und der Fehleinsatz führen vermehrt zur Resistenzbildung. Suche nach neuen Wirkstoffen zur Behandlung von Pathogenen mit Resistenz ist von äußerster Dringlichkeit, da die Resistenzen sich in kürzester Zeit über den kompletten Planeten verbreiten.
NDM-1, VIM-1 und IMP-5 wurden in E.coli überexprimiert und aufgereinigt, um die rekombinanten Enzyme zu erhalten. Damit wurde zunächst ein Fluoreszenz-Intensitäts-Assay entwickelt, um die Wirksamkeit möglicher Inhibitoren zu quantifizieren. Als Testsubstanzen wurden elf zugelassene Wirkstoffe gewählt, die eine Thiol-Gruppe enthalten, da bekannt ist, das Thiole Zink-abhängige Proteine inhibieren. Weiterhin wurden Thermal Shift Assays durchgeführt, um zwischen Liganden, die durch Bindung an die MBL inhibieren, und Liganden, die nur dadurch inhibieren, dass sie der Bindetasche das nötige Zink entziehen, unterscheiden zu können. Substanzen, die Inhibition im Assay zeigten und keine Zink-Chelatoren waren, wurden weiterhin auf Aktivität in bakteriellen Zellen untersucht. Dafür wurden pathogenene Stämme aus Patienten sowie mit den Resistenzplasmiden transfizierte Laborstämme einem Test auf Antibiotikaempfindlichkeit unterzogen. Die Wirksamkeit von Imipenem sollte in Kombination mit den Testsubstanzen wieder hergestellt werden. Insgesamt wurden vier Substanzen mit nicht-antiinfektiösen Indikationen gefunden, die MBLs im niedrig-mikromolaren Bereich inhibieren und die Wirksamkeit von Imipenem in Bakterien partiell wieder herstellen.
In einem zweiten Ansatz wurden Fragmente mittels Docking ausgewählt und ebenfalls im Fluoreszenz-basierten Assay getestet. Die Bestätigung der Bindung erfolgte in diesem Fall mit STD-NMR und die Bestimmung der Dissoziationskonstante des besten Fragments mittels Messung der Chemical Shift Perturbation im NMR. In diesem Projekt wurde leider kein pan-Inhibitor für alle MBLs gefunden, allerdings ein Fragment mit hoher Bindeeffizienz zur NDM-1.
Die lösliche Epoxid-Hydrolase (englisch: soluble Epoxid Hydolase, sEH) katalysiert die Umsetzung von Epoxyeicosatriensäuren (EETs), Lipidmediatoren mit entzündungshemmenden und kardiovaskulär-protektiven Eigenschaften, zu Dihydroxyeicosatriensäuren (DHETs). Diese Reaktion ist ein Bestandteil der Arachidonsäurekaskade. Das Enzym besteht aus zwei Domänen mit unterschiedlichen katalytischen Funktionen, einerseits der viel erforschten Cterminalen Epoxid-Hydrolase-Domäne, aber auch der N-terminalen Domäne, die eine Phosphatase-Eigenschaft zeigt. Die N-terminale Domäne katalysiert die Hydrolyse von Phosphat-Monoestern, Isoprenoid- sowie Lipid-Phosphaten. Die biologische Funktion dieser Domäne ist nicht aufgeklärt, und die Phosphatase Aktivität wird von typischen Phosphatase-Inhibitoren nicht beeinflusst. Daher ist es von Interesse, einen Inhibitor zu entwickeln.
Zunächst wurde ein Aktivitätsassay mit einem fluorogenen Substrat entwickelt und dieser in verschiedene Formate überführt, um in unterschiedlichen Größen testen zu können. Im 96well Format wurden mögliche Inhibitoren getestet, die mittels Docking ausgesucht wurden. Allerdings wurden nur Inhibitoren mit IC50s über 100 μM gefunden oder Inhibitoren, die Sulfonsäure-Strukturen aufweisen. Im 384well Format wurde, in Kollaboration mit dem European ScreeningPort Hamburg, ein High-Throughput Screening von ca. 17000 Substanzen durchgeführt. So wurde Oxaprozin gefunden, ein Inhibitor, der strukturelle Ähnlichkeit zu bereits bekannten Inhibitoren zeigt.
Leitstrukturoptimierung mit Hilfe von Matched Molecular Paris im Kontext der Rezeptorumgebung
(2015)
In der hier vorgestellten Arbeit wurde ein strukturbasierter Ansatz zur gezielten Leitstrukturoptimierung entwickelt. Die Grundlage dafür bildeten die sogenannten Matched Molecular Pairs (MMPs). Dabei handelt es sich um Paare von Molekülen, welche sich lediglich in einer wohldefinierten Modifikation (Transformation) unterscheiden und sich in einer Datenbank mit gemessenen Moleküleigenschaften befinden. Diese Transformationen wurden im Kontext ihrer Targetumgebung untersucht und eine mathematische Beziehung zwischen Transformation und dem Effekt auf die Bindungsaffinität (Transformationseffekt) hergestellt. Auf Basis der generierten Datengrundlage wurde anschließend ein Webserver zur gezielten Leitstrukturoptimierung implementiert und zur freien Nutzung zur Verfügung gestellt.
Die toxikologische Charakterisierung von Chemikalien und Arzneimitteln basiert auch heute noch hauptsächlich auf Toxizitätstests an Labortieren. Insbesondere die Prüfung auf Kanzerogenität fordert eine große Tieranzahl mit einer hohen Belastung der eingesetzten Tiere und ist sehr zeit- und kostenintensiv. Folglich stellt die Entwicklung von Methoden als Ergänzung und potenziellen Ersatz für Tierversuche ein Ziel der molekularen und zellulären Toxikologie dar. Diese Methoden umfassen verkürzte oder minimal invasive in vivo- sowie in vitro-Versuche, welche der toxikologischen Prüfung von Substanzen gemäß dem 3R-Prinzip dienen könnten.
Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz von Toxikoproteomics und -genomics im 28-Tage-Test (Toxizitätsstudie nach wiederholter oraler Gabe in Ratten), die in der Toxikologie routinemäßig durchgeführt werden müssen, zu untersuchen. Daneben wurden entsprechende Lebergewebeproben aus der in vivo-Prüfung mit den Daten aus einem hepatozytären Zellkultursystem als Ersatz- und Ergänzungsmethode verglichen. Identifizierte mechanistische Daten und putative Biomarker könnten für die Ableitung von chronisch-toxischen Potentialen von Substanzen genutzt werden und eine frühere Vorhersage zu kanzerogenen Potentialen von Stoffen erlauben.
Die in der Arbeit gewählten Modellsubstanzen stammten aus drei verschiedenen mechanistischen Kategorien: genotoxische Kanzerogene [Diethylnitrosamin (DEN), Aflatoxin B1 (AFB), Cupferron (CUP)], nicht-genotoxische Kanzerogene [Tetrachlorkohlenstoff (CCl4), Di(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP), Clofibrat (CF)] und hepatotoxische Nicht-Kanzerogene [Diallyl Phthalat (DAP), Benzaldehyd (BA), Ketokonazol (KC)].
Im ersten Teil der Arbeit wurden Rattenlebern aus den behandelten Tieren (ausgewählte Substanzen: AFB, CUP, CF, BA, KC) und den entsprechenden Kontrollen auf Veränderungen der globalen Genexpression nach 3, 7 und 28 Behandlungstagen untersucht. Das Ziel war es, nach kurzer Expositionsdauer charakteristische Wirkmechanismen auf Ebene der Genexpression zu erfassen, welche als frühes Indiz für zelluläre Transformation in Richtung Lebertoxizität bzw. Tumorentwicklung verwendet werden könnte. Dabei wurde gezeigt, dass eine Aktivierung verschiedener Prozesse, wie oxidativer Stress, Zellzyklus, Apoptose, Zellwachstum sowie spezifische Mechanismen infolge der verursachten Schädigung durch die eingesetzten Verbindungen bereits ab Tag 3 detektiert werden konnten. Mit der Genexpressionsanalyse wurden zudem auch einige putative Biomarker, welche kanzerogene Veränderungen beschreiben können, an Tag 28 identifiziert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Daten der toxikogenomischen Analyse mit den histopathologischen Beobachtungen für diese Substanzen gestützt werden.
Im darauf folgenden Teil der Arbeit sollte eine Proteommethode zur Identifizierung und Charakterisierung putativer Protein-Biomarker im Plasma eingesetzt werden, die eine verbesserte Vorhersage von Prozessen der chemisch induzierten Leberkanzerogenese innerhalb des geforderten 28-Tage-Tests erlauben. Der Vorteil der Nutzung von Plasma ist, dass die Tiere dafür nicht getötet werden müssen und man den Verlauf der Veränderungen in weniger Tieren über viele Zeitpunkte hinweg verfolgen kann. Hierfür wurde das Rattenplasma von Tag 3, 7 und 28 der mit genotoxischen und Nichtgenotoxischen Kanzerogenen behandelten Tiere mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und anschließender Identifizierung mit MALDI Massenspektrometrie untersucht. Die Ergebnisse zeigten bei den genotoxischen als auch Nichtgenotoxischen Kanzerogenen eine Vielzahl von Proteinen, die in akut toxischen Prozessen, wie z.B. dem Fettstoffwechsel, der Immunantwort und dem Proteinmetabolismus involviert sind. Als putativer Biomarker konnte zum Beispiel Alpha-1-Antitrypsin identifiziert werden, das auch im Serum bei Patienten mit Leberzellkarzinomen erhöht ist. Eine klare Unterscheidung zwischen den Mechanismen der genotoxischen und Nicht-genotoxischen Kanzerogene war allerdings auf Basis dieser begrenzten Daten nicht möglich.
Im dritten Teil der Arbeit wurden Rattenhepatozyten mit den gleichen fünf ausgewählten Ausgangssubstanzen wie im in vivo-Experiment behandelt. Das Ziel bestand darin, die Eignung von primären Rattenhepatozyten in Collagen-Sandwich-Kulturen als in vitro-Modell zur Prädiktion von hepatotoxischen Effekten zu überprüfen. Der Vergleich des in vitro-Systems zu den in vivo-Daten an den Behandlungstagen 3 und 7 zeigte, dass zwischen in vivo und in vitro eine gute Korrelation der mechanistischen Genexpressionsveränderungen nach Behandlung mit AFB und CF zu detektieren war. Des Weiteren lieferte die Behandlung der primären Rattenhepatozyten mit CUP detaillierte Hinweise auf den toxischen Mechanismus, wogegen in den Leberproben keine vergleichbaren Erkenntnisse gewonnen werden konnten. So konnte für CUP in vitro z.B. ein starker Einfluss auf das Netzwerk der nukleären Rezeptoren gezeigt werden. Der Vergleich des in vivo- und in vitro-Testsystems nach Behandlung mit den hepatotoxischen Substanzen KC und BA zeigte im Gegensatz zu AFB und CF nur eine sehr geringe Übereinstimmung der differentiell deregulierten Gene bzw. Signalwege. Ein möglicher Grund für die Unterschiede könnten die eingesetzten Dosierungen sein, welche möglicherweise nicht direkt miteinander verglichen werden können.
Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren, dass die eingesetzten molekulartoxikologischen Methoden frühe Hinweise liefern können, die sowohl eine Zuordnung zu toxischen Wirkmechanismen als auch eine Identifizierung von kanzerogenesespezifischer Biomarker-Kandidaten ermöglichen. Zudem zeigte der Vergleich der in vivo / in vitro-Testsysteme eine gute Übereinstimmung in den identifizierten Signalwegen nach Behandlung mit den Testkanzerogenen. In Zukunft könnten diese Methoden in den kürzeren in vivo-Prüfungen wie z.B. 28-Tage-Test eingesetzt werden, um die konventionellen toxikologischen Prüfsysteme zu unterstützen.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine klonale Erkrankung einer myeloischen Vorläuferzelle, welche nicht zur geregelten Selbsterneuerung und terminalen Differenzierung in der Lage ist. Es kommt zur Anhäufung von unreifen Zellen im Knochenmark und peripheren Blut. Häufig werden in AML-Patienten reziproke Chromosomentranslokationen wie t(6;9), t(8;21) und t(15;17) detektiert. Diese Translokationen führen zu Genfusionen und bilden die Fusionsproteine DEK/CAN, AML1/ETO und PML/RARα. In dieser Arbeit wurde DEK/CAN untersucht, das Fusionsprodukt der Translokation t(6;9).
Die t(6;9)-positive Leukämie zeichnet sich durch eine äußerst schlechte Prognose aus sowie einem Eintritt der Krankheit bereits im jungen Erwachsenenalter. Aus diesen Gründen wird die t(6;9)-positive Leukämie nach der neuen WHO-Klassifikation als eigene Entität geführt. Das leukämogene Potential des Fusionsproteins DEK/CAN wurde bereits nachgewiesen, der Mechanismus der Leukämieinduktion ist jedoch völlig ungeklärt.
Von den Leukämie-assoziierten Fusionsproteinen AML1/ETO und PML/RARα ist bekannt, dass sie mutierte Transkriptionsfaktoren sind und die lokale Zusammen-setzung chromatin-assoziierter Proteine beeinflussen. Durch die aberrante Rekrutierung von chromatin-modifizierenden Faktoren kommt es zur Deregulierung von differenzierungsrelevanten Genen. Ziel dieser Arbeit war es daher zu ermitteln, ob es sich bei DEK/CAN ebenso um einen aberranten Transkriptionsfaktor mit Einfluss auf das Chromatin handelt.
Dazu wurden zunächst folgende Grundeigenschaften eines Transkriptionsfaktors untersucht: nukleäre Lokalisation und Chromatinassoziation. Immunfluoreszenz-untersuchungen bestätigten eine nukleäre Lokalisation von DEK/CAN. Es zeigte sich dabei, dass die Fusion mit CAN eine Umverteilung von DEK zur Folge hat. Während DEK diffus im Zellkern verteilt ist, zeigt das Fusionsprotein ein punktiertes Muster. Anschließend wurde die Assoziation von DEK/CAN zum Chromatin mit Hilfe von Zellfraktionierungsexperimenten nachgewiesen. Dabei konnte DEK/CAN aus der gleichen nukleären Fraktion eluiert werden wie andere chromatin-assoziierte Proteine.
Es stellte sich daraufhin die Frage, ob DEK/CAN die epigenetische Maschinerie beeinflussen und möglicherweise Veränderungen von Chromatinmodifikationen verursachen kann. Hierfür wurde die globale Verteilung der Histonmethylierungen H3K9me3, H3K27me3, H3K4me2 und H4R3me2 in An- und Abwesenheit von DEK/CAN untersucht. Es stellte sich heraus, dass DEK/CAN die Verbreitung von H4R3me2 maßgeblich beeinflusst. Histonmethylierungen regulieren das Expressionsniveau der gebundenen DNA, weshalb DEK/CAN durch seine Wirkung auf H4R3me2 die Deregulierung tumorrelevanter Gene verursachen könnte.
AML-assoziierte Fusionsproteine verändern die lokale Zusammensetzung von chromatin-modifizierenden Faktoren, indem sie oligomerisieren und so mehr Inter-aktionsmöglichkeiten für chromatin-modifizierende Proteine schaffen. Eine Gemein-samkeit aller AML-assoziierten Fusionsproteine ist der Besitz einer Oligomeri-sierungsoberfläche. Die putative Coiled coil (CC)-Domäne von CAN wurde hinsichtlich ihres Einflusses auf das leukämogene Potential und der Fähigkeit zur Bildung von Oligomeren untersucht, denn auch beim APL-spezifischen Fusionsprotein PML/RARα ist eine CC-Domäne für die Akkumulation verantwortlich. Die Deletion einzelner Helices aus der putativen CC-Domäne von DEK/CAN führte im CFU-S12 Assay zur Reduktion der Kolonienbildung. Damit konnte gezeigt werden, dass die Integrität der putativen CC-Domäne für den proliferationsstimulierenden Effekt von DEK/CAN auf das Kompartiment der Stammzellen notwendig ist. Eine Funktion als Oligomerisierungsoberfläche wurde für die CC-Domäne jedoch ausgeschlossen.
DEK ist ein nukleäres Phosphoprotein mit vielfältigen Funktionen, die unter anderem durch seinen Phosphorylierungsstatus gesteuert werden. Um die Relevanz der Phosphorylierungsstellen für das leukämogene Potential von DEK/CAN zu ermitteln, wurden DEK- und DEK/CAN-Mutanten erstellt, die nur partiell phosphorylierbar sind. Tatsächlich zeigte ein CFU-S12 Assay, dass die Mutation dieser Phosphorylierungsstellen zur Reduktion der Milzkolonienzahl und damit zur Aufhebung des leukämogenen Potentials führt. Außerdem hebt die Mutation der Phosphorylierungsstellen den DEK-vermittelten Effekt der Apoptoseresistenz auf.
Mit dieser Arbeit wurde durch Chromatinuntersuchungen und Struktur-Funktions-analysen ein Beitrag zur Entschlüsselung des leukämogenen Mechanismus von DEK/CAN geleistet.
Mit einer immer weiter steigenden Lebenserwartung, steigt auch die Anzahl der an Alzheimer erkrankten Patienten stetig an. Die Kosten für die Versorgung dieser Patienten sind für das Gesundheitssystem weltweit immens.
Bislang führten alle Therapiebemühungen zu mangelhaften Erfolgen. Ein medikamentöses Eingreifen in den Krankheitsverlauf und die Beeinflussung der auslösenden Faktoren konnte, trotz eines hohen Forschungsaufwandes bislang nicht realisiert werden.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der quantitativen analytischen Charakterisierung zweier Substanzen, die sich auf drei relevante Bereiche auswirken, die für die Entwicklung und das Fortschreiten der Alzheimer Krankheit verantwortlich gemacht werden. Die γ-Sekretase, die an der Entstehung der toxischen Aβ-Peptide beteiligt ist, die dann durch Agglomerisierung zu den charakteristischen pathologischen Aβ-Plaques führen. Der nukleäre Rezeptor PPARγ, welcher an der Genexpression vor allem inflammatorischer Faktoren im Gehirn beteiligt ist und weitere AD relevante Vorgänge wie den Abbau der Aβ-Peptide beeinflusst. Und schließlich die mitochondriale Dysfunktion, die zur verringerten Energieversorgung und schließlich zum Untergang von Synapsen und ganzer Neuronen führen kann. Diese drei Bereiche konnten in vitro durch die zwei untersuchten Substanzen MH84, einem Pirinixinsäurederivat und MH163, einem Zimstsäurederivat, positiv beeinflusst werden.
Aus diesem Grund wurden in vivo Studien zu beiden Verbindungen an Mäusen geplant, die die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften der Substanzen untersuchen sollten.
Im Vorfeld dieser Studien wurden analytische Methoden entwickelt um die Substanzen aus den biologischen Proben bestimmen zu können. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf einer besonders hohen Empfindlichkeit um auch sehr kleine Konzentrationen, die sich bei den Studien im Hirngewebe der Tiere ergeben können, bestimmen zu können.
Die Validierung der Methoden sollte nach Guideline der FDA (Food and Drug Administration) für bioanalytische Methodenentwicklung erfolgen.
Die Validierung stellt die Grundlage dar, um die Gehalte der Verbindungen aus biologischen Matrices wie Plasma und Hirn einwandfrei quantifizieren zu können und somit auch die Bioverfügbarkeit im ZNS nachzuweisen.
Für MH84 konnte eine empfindliche LC/MS-Methode entwickelt und validiert werden. Dabei wurde eine MultoHigh 100 RP 18-5µ, 125 x 4 mm HPLC Säule und ein MicrOTOF-QII Massenspektrometer der Firma Bruker® mit einer APCI-Quelle für die Ionsierung verwendet.
Es konnten alle Forderungen der FDA Guideline zur analytischen Methode erfüllt werden und die Stabilität der Substanz zweifelsfrei bewiesen werden.
Die validierte Methode wurde anschließend für die Auswertung einer Pharmakokinetik-Studie an gesunden Mäusen verwendet. Der zeitliche Konzentrationsverlauf von MH84 im Plasma und Hirngewebe, sowie die ZNS-Bioverfügbarkeit der Substanz, konnten mit Hilfe der analytischen Methode bestimmt werden.
Zusätzlich wurden eine Akkumulationsstudie und zwei pharmakodynamische Studien durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass sich MH84 nach 21-tägiger, oraler Gabe von 12_mg/Kg nicht im Gehirn gesunder Mäuse anreichert.
Die Wirkung von MH84 auf transgene Tiere, die das Krankheitsmodell beschreiben, wurde ebenfalls nach 21 Tagen oraler Gabe untersucht. Die Tiere waren deutlich vitaler im Vergleich zu den transgenen Kontrolltieren.
Es konnten vor allem Verbesserungen der mitochondrialen Dysfunktion festgestellt werden, die zu einer vollständigen Wiederherstellung der Parameter im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrolltieren führten. Die Aβ-Spiegel konnten vermutlich aufgrund der kurzen Behandlungsdauer nur leicht gesenkt werden.
Für MH163 wurde ebenfalls eine empfindliche Analysenmethode entwickelt. Dabei konnte die gleiche HPLC-Säule wie bei MH84 verwendet werden. Die chromatographischen Bedingungen und die APCI-Parameter wurden für diese Verbindung neu optimiert.
Im Verlauf der Methodenentwicklung wurden jedoch verschiedene Instabilitäten der Substanz sichtbar. Dabei handelte es sich licht- und zeitabhängige Vorgänge.
Es kam infolge einer E/Z-Isomerisierung an der Doppelbindung der Zimtsäuregruppe zu einem zweiten analytischen Signal, welches bei der Anwendung der entwickelten LC/MS- Methode sichtbar wurde. Die Gesamtfläche beider Signale von MH163 zeigte zusätzlich eine ebenfalls zeitabhängige Abnahme. Durch eine Strukturaufklärung konnte ein Coumarin-Derivat als mögliches Umlagerungsprodukt identifiziert werden.
Da durch die Umlagerungsprozesse nicht sichergestellt ist, welche Verbindung die Aktivität in den in vitro Testsystemen ausgelöst hat und eine einwandfreie quantitative Bestimmung von MH163 in einem für die Analytik aus den Matrices benötigten Zeitraum nicht möglich ist, wurden die Tierstudien zu MH163 abgesagt.
Polypharmakologie hat in den letzten Jahren mehr und mehr an Bedeutung in der pharmazeutischen Forschung gewonnen und könnte in Zukunft zu einem Umdenken in der Entwicklung neuer Wirkstoffe führen. Das wachsende Verständnis für biologische Zusammenhänge, im speziellen für die starke Vernetzung zwischen verschiedenen Signalwegen oder Gewebearten, und die daran beteiligten Proteine, könnten zu gänzlich neuen Strategien führen. Beispiele aus dem Bereich der Onkologie und der Entwicklung von Neuroleptika haben bereits gezeigt, dass eine Intervention an mehreren Stellen eines solchen komplexen Netzwerkes zu wirksameren und gleichzeitig sichereren Wirkstoffen führen kann. Erkenntnisse aus der Systembiologie und die retrospektive Analyse bereits zugelassener Wirkstoffe machen deutlich, dass viele erfolgreiche Wirkstoffe nur aufgrund ihres polypharmakologischen Wirkprofils so effektiv sind – wenngleich dies bei Ihrer Entwicklung oftmals nicht beabsichtigt war.
Das rationale Design sogenannter „multitarget Wirkstoffe“ stellt bis heute eine große Herausforderung dar. Aus Sicht eines medizinischen Chemikers bedeutet es die Verknüpfung zweier, auf unterschiedliche Targets aktiver, Liganden zu einem neuen Wirkstoff, ohne einen signifikanten Aktivitätsverlust auf die einzelnen Targets herbeizuführen. Ein naheliegender Ansatz zur Verbindung zweier Liganden ist die Verknüpfung der Moleküle über einen flexiblen Linker. Dieser Ansatz kann zwar in vitro zu sehr potenten Wirkstoffen führen, birgt jedoch pharmakokinetische Nachteile, bedingt durch das hohe Molekulargewicht, die sich oft erst in vivo zeigen. Die Schwierigkeit besteht also zum einen in der Aufrechterhaltung der individuellen Aktivität auf das jeweilige Target und zum anderen im Erreichen einer guten Balance zwischen Aktivität und Komplexität des Liganden. Damit soll ausreichend Raum für spätere Optimierung von pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften gewährleistet werden. Bisher wurden nur wenige Computer-gestützte Ansätze entwickelt um diese und ähnliche Fragestellungen zu bearbeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer in silico Verfahren zur Identifzierung von multitarget Liganden ein Kernthema dieser Arbeit. Die Implementierung eines Fragment-basierten Ansatzes hält die Komplexität der Liganden möglichst gering und bietet genügend Raum für eine anschließende, multi-dimensionale Optimierung an zwei oder mehreren Targets.
In der ersten Studie wurde eine Pharmakophor-basierte Strategie verfolgt. Die Repräsentation eines Liganden durch ein Pharmakophormodell stellt eine abstrakte dreidimensionale Darstellung der für die biologische Aktivität relevanten Strukturmerkmale dar. Diese Abstraktion vereinfacht den Vergleich zweier Verbindungen und erlaubt gleichzeitig Spielraum für chemische Variabilität. Bei diesem Ansatz wurden Pharmakophormodelle, jeweils für eine Vielzahl aktiver Liganden zweier Targets, erzeugt und paarweise miteinander verglichen. Sobald zwei Pharmakophormodelle eine genügend große Anzahl an Pharmakophorpunkten in räumlich ähnlicher Orientierung teilen, stellt dieses gemeinsame Pharmakophor die Basis eines potentiellen multitarget Liganden dar. In der beschriebenen Studie wurde dieses Verfahren anhand von aktiven Liganden der löslichen Epoxid Hydrolase (sEH) und 5-Lipoxygenase (5-LO) evaluiert. Die auf dieser Grundlage identifizierten multitarget Pharmakophormodelle wurden zum anschließenden Screening einer Fragement-Datenbank verwendet und führten zu 9 aktiven Liganden für sEH und 5-LO. Diese Liganden besitzen chemische Grundgerüste (Scaffolds), die in der Literatur bisher noch nicht als aktive sEH- oder 5-LO-Liganden beschrieben wurden und somit eine ideale Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe darstellen. Für eine der gefundenen Verbindungen, basierend auf einem Benzimidazol-Gerüst, wurden Aktivitäten im niedrig mikromolaren Bereich für beide Targets bestimmt. Diese Verbindung und weitere Derivate werden zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert um eine erste Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufzustellen und die Eignung dieser Substanzklasse als potentielle Leitstruktur für neue, duale sEH/5-LO Liganden zu überprüfen.
Parallel dazu wurde eine Substruktur-basierte Strategie verfolgt um Rückschlüsse auf jene Strukturmerkmale zu ziehen, die für die Aktivität auf dem jeweiligen Target verantwortlich sein könnten. Dazu wurden in einem ersten Schritt alle aktiven Liganden zweier Targets auf ihre möglichst maximalen gemeinsamen Substrukturen reduziert. Für jedes Target wird damit ein Set von Substrukturen generiert, welches die für die Bindung an das jeweilige Target charakteristische Strukturmerkmale enthält. Diese Substrukturen, repräsentieren den chemischen Raum des jeweiligen Targets und stellten die Trainingsdaten für den entwickelten multiSOM Ansatz dar. Dieser Ansatz basiert auf dem automatisierten Vergleich von selbst-organisierenden Karten und hebt Gemeinsamkeiten zwischen diesen Substruktursets in einer leicht zu interpretierenden, visuellen Form hervor. Dies erlaubt die Identifizierung von gemeinsamen Substrukturen aus beiden verwendeten Substruktursets, welche potentielle duale Strukturelemente darstellen.
Die Validierung dieses Ansatzes erfolgte erneut auf Basis bekannter 5-LO- und sEH-Liganden. Unter 24 ausgewählten Verbindungen konnten neun Fragmente identifiziert werden, die auf einem der beiden Targets und 5 Fragmente, die auf beiden Targets im niedrig mikromolaren Bereich inhibierend wirken. Einer dieser dualen Fragmente wurden anschließend als Basis für eine Substruktursuche in einer Inhouse Datenbank verwendet. Die daraus resultierende Verbindung, die einen Teil des ursprünglichen Fragments beinhaltet, wirkt sowohl auf sEH als auch 5-LO in nanomolaren Konzentrationen inhibierend. Auch diese Verbindung wird zu diesem Zeitpunkt weiter charakterisiert und stellt eine vielversprechende Basis als Leitstruktur neuer dualer sEH/5-LO-Liganden dar.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellten Methoden neue Möglichkeiten bieten, das rationale Design von multitarget Liganden zu unterstützen. Die Pharmakophor-basierte Methode kann besonders dann von Vorteil sein, wenn bereits Strukturinformationen für beide Targets bzw. die bioaktiven Konformationen der Liganden vorliegen. Für einen ausschließlichen Liganden-basierten Ansatz stellt die Verwendung der MultiSOM, und damit die Identifizierung gemeinsamer Strukturelemente der Liganden, die bessere Methode dar.
Im zweiten Teil dieser Arbeit werden Studien zur Identifizierung neuer Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Partialagonisten beschrieben. Auch in diesem Fall wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Da FXR eine starke strukturelle Anpassung abhängig vom gebundenen Liganden aufweist („induced fit“), sind rein strukturbasierte virtuelle Screening-Methoden nur eingeschränkt einsetzbar. Aus diesem Grund sollte zunächst ein Liganden-basierter Drug Repurposing Ansatz verfolgt werden, bei dem bereits zugelassene Wirkstoffe mit potentiell FXR-modulierenden Eigenschaften identifiziert werden sollten. Der Vorteil des Drug Repurposing besteht darin, dass die betrachteten Wirkstoffe bereits intensiv hinsichtlich Sicherheit und Bioverfügbarkeit untersucht wurden. Somit kann man sich bei der Entwicklung verstärkt auf die biologische Aktivität auf das neue Target konzentrieren.
Erneut wurden selbstorganiserende Karten (SOMs) verwendet, um zugelassene Wirkstoffe mit FXR-Aktivität zu identifizieren. Trainiert wurde die SOM auf einem Datensatz bestehend aus bekannten FXR-Agonisten zum einen und der DrugBank Datenbank mit zugelassen Wirkstoffen zum anderen. Die Eigenschaft der SOM Verbindungen mit ähnlicher biologischer Aktivität in räumlicher Nähe auf der Karte zu clustern führte zu einer Anhäufung an bekannten FXR-Agonisten auf einigen wenigen Neuronen. Auf solchen sogenannten Aktivitätsinseln wurden zusätzlich auch zugelassene Wirkstoffe platziert, wenn ihre Ähnlichkeit zu den FXR-Agonisten ausreichend hoch war. Die auf den Aktivitätsinseln angesiedelten Wirkstoffe wurden anschließend bestellt und hinsichtlich ihrer FXR-Aktivität in einem Transaktivierungs-Assay untersucht. Unter den bestellten Verbindungen konnten sechs Liganden mit einer signifikanten relativen FXR-Aktivierung identifiziert werden. Weitere Hinweise auf eine mögliche FXR-Aktivierung der Verbindungen gaben in der Literatur beschriebene Nebeneffekte, die mit einer FXR-Aktivierung in Zusammenhang stehen könnten. Die potentenste Verbindung, der zugelassenen Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib, wurde zusätzlich in Bezug auf FXR-basierte SHP mRNS Induktion untersucht. In qPCR-Experimenten konnte dabei eine mit GW4064 vergleichbare Induktion in HepG2 Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse untermauern die aus der Literatur gewonnen Vermutung, dass Imatinib FXR-modulierende Eigenschaften besitzt und somit eine interessante Grundlage für die Entwicklung neuer FXR-Partialagonisten darstellt. Zu diesem Zeitpunkt werden weitere Imatinib-Derivate synthetisiert und diese Struktur als mögliche Leitstruktur charakterisiert.
In einer zweiten Studie wurde eine Kombination aus Liganden- und Struktur-basierten Ansatz verfolgt. Dabei wurden sämtliche Struktur-Informationen aus publizierten FXR-Kristallstrukturen und den darin kokristallisierten Liganden gebündelt, um die Auswirkungen des zu Beginn erwähnten induced-fit Effekts zu minimieren. Auf Basis der ko-kristallisierten Liganden wurden zunächst zwei Konsensus-Pharmakophormodelle erstellt. Diese Modelle wurden in einem anschließenden Schritt jeweils mit einem Konsensus-Pharmakophormodell, das mit Hilfe von Protein-Ligand-Interaktions-Fingerprints (PLIF) aus den korrespondieren Kristallstrukturen abgeleitet wurde, überlagert und kombiniert. Diese kombinierten Modelle vereinten sowohl Informationen der strukturellen Gemeinsamkeiten der Liganden als auch gemeinsame, relevante Interaktionspunkte zwischen Ligand und Rezeptor aus den Kristallstrukturen. Das Pharmakophor-Screening mit anschließender Docking Analyse führte zu 42 getesteten Verbindungen, von denen 12 Strukturen eine signifikante relative FXR-Aktivierung zeigten. Darunter konnte ein Partial-Agonist mit einem EC50 von 480 nM bei einer maximalen Aktivierung von ca. 14% im Vergleich zur Referenz GW4064 identifiziert werden. Auch diese Verbindung wird zum aktuellen Zeitpunkt weiter charakterisiert und könnte in Zukunft als Leitstruktur für neue FXR-Partialagonisten dienen.
In beiden Studien konnten neue FXR-Agonisten mit bisher noch nicht beschriebenen Scaffolds identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Verwendung bereits zugelassener Wirkstoffe für neue Indikationen eine attraktive Quelle für neue Leitstrukturen darstellen kann und im Zuge dessen bisher ungeklärte Nebeneffekte bekannter Wirkstoffe aufgeklärt werden können.
Abschließend lässt sich festhalten, dass selbstorganisierende Karten eine universelle Methode zur Erkennung und Analyse von polypharmakologischen Zusammenhängen darstellen. Des Weiteren lassen sich mit ihrer Hilfe chemische Räume repräsentieren und durch den in dieser Arbeit entwickelten MultiSOM-Ansatz direkt vergleichen. Dies ermöglicht auf intuitive und effiziente Weise die Identifizierung von überlappenden chemischen Räumen und somit möglicher polypharmakologischer Zusammenhänge.
Als zellulärer Sensor für Gallensäuren und als Regulator zahlreicher metabolischer und inflamma-torischer Gene stellt der nukleäre Farnesoid X Rezeptor (FXR) ein vielversprechendes neues Wirkstofftarget dar. Die Aktivierung von FXR mit natürlichen oder synthetischen Liganden führte in vitro und in vivo zu zahlreichen wünschenswerten Effekten wie gesteigerter Insulinfreisetzung, verringerter Insulinresistenz oder verbessertem Lipidprofil. Daneben stellt die Aktivierung von FXR ein Prinzip zur Behandlung von Lebererkrankungen wie nicht-alkoholischer Fettleber und primärer billiärer Zirrhose dar, das mit dem FXR-Agonisten Obeticholsäure bereits in klinischen Studien überprüft wird. Existierende synthetische FXR-Liganden sind Fettsäure- bzw. Gallensäuremimetika und imitieren die physiologischen FXR-Agonisten. Die meisten synthetischen FXR-Liganden sind jedoch aufgrund von Toxizität, geringer Selektivität oder schlechter Bioverfügbarkeit nicht zur wie-teren klinischen Entwicklung geeignet. Sie stellen außerdem vornehmlich vollagonistische FXR-Ligan-den dar, doch die klinischen Erfahrungen mit Liganden anderer nukleärer Rezeptoren wie den Peroxi-somen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) oder den Estrogenrezeptoren (ER) haben gezeigt, dass eine zu starke Aktivierung eines Ligand-aktivierten Transkriptionsfaktors Risiken erheblicher Nebenwirkungen bergen kann. Eine Möglichkeit, dieser Gefahr vorzubeugen, bietet die Entwicklung partialagonistischer FXR-Liganden, die den Rezeptor nur mit moderater Amplitude aktivieren.
In dieser Arbeit wurde ausgehend von der in einem virtuellen Screening identifizierten Leitstruktur 1, durch medizinisch chemische Optimierung und Studien zu den Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) ein potenter und selektiver FXR-Partialagonist entwickelt. Die drei Molekülteile der Leitstruktur 1 (azide Kopfgruppe, zentraler Anthranilamidkörper und Acylsubstituent) wurden einzeln hinsichtlich ihrer Potenz an FXR untersucht und optimiert. In der Untersuchung der SAR des Acylsubstituenten zeigten sich ein 2-Naphthoyl- und ein 4-tert-Butylbenzoylsubstituent der in 1 enthaltenen 4-Methylbenzoylgruppe überlegen. Unter Beibehaltung des 2-Naphthoylsubstituenten wurde hierauf durch selektive Methylierung bzw. Reduktion die Notwendigkeit beider Amidbindungen der Subs-tanzklasse für Aktivität an FXR nachgewiesen. Durch Erweiterung der aziden Kopfgruppe um einen zusätzlichen aromatischen Ring gelang eine weitere Potenzsteigerung, die sich durch eine Methyl-gruppe an 6-Position dieses neu eingeführten Ringes noch erhöhen ließe. Andere Substituenten am aromatischen Ring der Kopfgruppe führten dagegen an keiner Position zu einer Aktivitätsverbes-serung. Der Austausch der freien Carbonsäure durch metabolisch stabilere Bioisostere wie ein Methylketon oder ein Nitril stellte sich als ohne Aktivitätsverlust möglich heraus, wobei das Tetrazol als klassisches Carbonsäurebioisoster eine Ausnahme mit geringerer Potenz bildete. Die entscheiden-de Steigerung der Aktivität der Acylanthranilamide an FXR resultierte aus der Einführung eines zusätzlichen Substituenten in 4-Position des zentralen aromatischen Ringes, wobei eine Methoxy-gruppe zur größten Potenz führte. Das resultierende Anthranilamid 2 stellt einen hochpotenten FXR-Partialagonisten mit einem EC50-Wert von 8±3 nM in einem flFXR-Reportergenassay bei 18±1% Maximalaktivierung dar und ist der Leitstruktur somit um mehr als einen Faktor 1000 überlegen.
Die optimierte Verbindung 2 wurde aufgrund ihrer großen Potenz ausführlich in vitro pharma-kologisch charakterisiert. Dabei stellte sich die Substanz als metabolisch sehr stabil, moderat löslich in Wasser und gemessen an ihrer hohen Aktivität an FXR als wenig toxisch heraus. Darüber hinaus er-wies sich 2 als selektiv für FXR über den membranständigen G-Protein-gekoppelten Gallen-säurerezeptor TGR5 (Faktor >1000) sowie über die nukleären Rezeptoren PPARα (>1000), PPARγ (~375) und PPARδ (>1000). Bei der Quantifizierung seiner Effekte auf die FXR-Targetgene SHP, CYP7A1, BSEP, OSTα und IBABP durch qRT-PCR übte 2 im Bereich 0,1 µM bis 10 µM einen konzen-trationsunabhängigen partialagonistischen Effekt von etwa 40% des Effektes des physiologischen FXR-Agonisten Chenodeoxycholsäure (CDCA) aus. Mit der Verbindung 2 wurde somit ein hochpotenter, selektiver und metabolisch stabiler FXR-Partialagonist entwickelt und charakterisiert, der sich für künftige in vitro und in vivo Studien zu partieller FXR-Aktivierung empfehlen kann.
In Deutschland erhalten jährlich etwa 12.500 Patienten die Diagnose Leukämie. Unter ihnen befinden sich ca. 6 % Kinder, welche mit 33,8 % den größten Anteil der kindlichen Krebsneuerkrankungen repräsentieren. Die überwiegende Form im Kindesalter ist die akute lymphatische Leukämie (ALL), deren genetische Ursache meistens in einem hyperdiploiden Karyotyp oder einer chromosomalen Translokation zu finden ist. Bei 8 % der pädiatrischen ALLs ist ein Rearrangement des MLL-Gens involviert. Unter Beteiligung des häufigsten Translokationspartnergens (TPG) AF4 entsteht die t(4;11)(q21;q23)-Translokation mit den beiden Fusionsproteinen AF4•MLL sowie MLL•AF4. Die Therapie erfolgt in der Regel gemäß Hochrisikoprotokollen aufgrund der extrem schlechten Prognose und der mit hoher Therapieresistenz assoziierten Rezidivrate. Eine Studie zur Korrelation zwischen klinischen Merkmalen und molekularen Charakteristika belegte die Abhängigkeit des Outcomes von der Verteilung des Bruchpunkts im MLL-Gen. Bei älteren Patienten treten die Bruchpunkte überwiegend in MLL Intron 9 oder 10 auf und bedeuten eine signifikant bessere Prognose im Vergleich zu den besonders bei Säuglingen präsenten Bruchpunkten im MLL Intron 11. Die damit verbundene Verkürzung der Plant Homeodomain (PHD) 1 kann neben einer modifizierten Funktion des PHD1 auch in einer veränderten Konformation der gesamten PHD-Domäne resultieren. Besondere Bedeutung hat die PHD1-3-Domäne wegen der Fähigkeit des PHD3 einerseits H3K4me-Signaturen zu erkennen und auf der anderen Seite mit CYP33 zu interagieren. Die mit transkriptionell aktivem Chromatin assoziierten H3K4me-Signaturen sowie die CYP33-vermittelte repressive Aktivität bedingen einen ambivalenten Charakter des MLL-Proteins. Daneben ist der PHD3 allein interessant wegen des Vorkommens von 4 differenten Varianten mit keinen, 3, 11 oder 14 fehlenden Aminosäuren, welche durch alternatives Spleißen an der MLL Exon 15/16-Verknüpfung entstehen (PHD3-0, PHD3-3, PHD3 11 und PHD3-14). Semiquantitative Bestimmungen in verschiedenen Zelllinien verdeutlichen die nahezu ähnliche Transkription aller 4 Varianten. Weiterführende Untersuchungen mit dem Yeast Two-Hybrid (Y2H)-System sowie folgende Koimmunpräzipitations (CoIP)-Experimente zeigten, dass der PHD3-0 die beste Dimerisierungsfähigkeit aufweist. Dagegen ist der am schlechtesten dimerisierende PHD3-3 allein in der Lage, CYP33 bzw. dessen RRM-Domäne zu binden. Die Interaktion mit inhibitorischen Proteinen und die folgende Funktion als transkriptioneller Repressor sind allein mit der PHD3-3-Variante möglich. Bei Betrachtung der gesamten PHD1-3-Domäne sowie deren verkürzter Variante (ΔPHD1-3) fällt die reduzierte Bindungsfähigkeit der ΔPHD1-3-Domäne an die CYP33 RRM-Domäne sowie deren fehlende Dimerisierung auf. Über die resultierende geringere Bindung an inhibitorische Proteine kann die transkriptionell repressive Aktivität reduziert werden, während die transkriptionell aktive Funktion an Bedeutung gewinnt. Neben der Untersuchung der PHD-Domänen des MLL-Proteins wurde das Y2H-System zur weiteren Aufklärung der AF4- und AF4•MLL-Multiproteinkomplexe (MPC) verwendet. Ähnlich den Wildtypproteinen MLL und AF4 sind auch die beiden aus der t(4;11)(q21;q23)-Translokation resultierenden Fusionsproteine an der Assemblierung von MPCs beteiligt. Besonders das reziproke AF4•MLL scheint bezüglich des Therapieerfolgs für die Leukämogenese entscheidend zu sein. Die Identifizierung und Verifizierung sowohl bekannter als auch neuer Komponenten der AF4- und AF4•MLL-MPCs gelang in verschiedenen Experimenten. Allerdings wurde meist nur die Präsenz der Proteine im MPC nachgewiesen. Die Y2H-Untersuchungen konnten Interaktionen zwischen den verschiedenen Proteinen der Komplex identifizieren und damit die Kenntnis über die Zusammensetzung der MPCs wesentlich erweitern und vertiefen. Aufgrund der Beteiligung viraler Proteine an der Krebsentstehung sowie der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren der Wirtszelle für die virale Replikation erscheint auch die Nutzung der Superelongationskomplexe (SEC) durch virale Proteine plausibel. Die Funktion des AF4-Proteins als Kofaktor von viralen Proteinen, besonders der HCMV und EBV immediate early (IE)-Proteine, wurde bereits gezeigt. Außerdem konnte der Einfluss des HCMV IE1 auf AF4-abhängige Effekte sowie dessen Beteiligung am AF4-MPC nachgewiesen werden. Mithilfe der Y2H-Experimente konnten nicht nur Interaktionen des HCMV IE1 sondern auch Wechselwirkungen der Onkoproteine E6/E7 des HPV mit den Proteinen der AF4- und AF4•MLL-MPCs identifiziert werden.
Fettsäuren vermitteln ebenso wie Gallensäuren über ihre G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPR40 bzw. TGR5) und nukleären Rezeptoren Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPARs) bzw. Farnesoid-X-Rezeptor (FXR) Signale zur Regulation wichtiger Stoffwechselwege, wie dem Fettstoffwechsel, Cholesterolstoffwechsel und der Glukosehomöostase. Gerade die nukleären Rezeptoren stellen durch ihre Regulation einer Vielzahl an Targetgenen vielversprechende Wirkstofftargets dar. Die Aktivierung von PPARα und PPARγ wird seit Jahren therapeutisch genutzt zur Therapie der Dyslipidämie (Fibrate) und des Typ-2 Diabetes (Glitazone). Dennoch zeigte sich durch diese Vollaktivierung ein bedenkliches Profil unerwünschter Nebenwirkungen eng mit der therapeutischen Wirkung verknüpft. Im Falle des FXR befindet sich derzeit ein semisynthetisches Derivat, welches sich von den endogenen Liganden CDCA ableitet, in Phase III der klinischen Entwicklung zur Therapie von Lebererkrankungen, wie der nicht-alkoholischen Fettleber und der primären billiären Zirrhose. In vitro und in vivo-pharmakologische Untersuchungen weisen auf positive Effekte von FXR-Agonisten aber auch mit FXR-Antagonisten auf den Zucker- und Cholesterolstoffwechsel hin. Doch hier bleibt abzuwarten, ob agonistisch oder antagonistisch aktive Substanzen das größte therapeutische Potential besitzen, wobei die Erfahrung mit Liganden anderer nukleärer Rezeptoren, wie den PPARs und Estrogenrezeptoren (ER) zeigt, dass die partielle Aktivierung der Vollaktivierung zu bevorzugen ist. Diese Arbeit unterteilt sich in zwei Projekte, die sich von der an PPAR dual aktiven Pirinixinsäure (1) ableiten. Ausgangspunkt des ersten Projekts bildet die Substanz MD78 (2), die sich aus Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) vorangegangener Arbeiten entwickelt hat. Mit ihrem potenten dual PPARα/γ-agonistischen Profil hebt sie sich in ihrer Aktivität von den anderen Derivaten ab. Ziel war es die Ursache dieser Aktivität mit Hilfe einer konkretisierten SAR zu identifizieren. Die nähere Untersuchung der Verbrückung des lipophilen Substituenten zeigte einen deutlichen Einfluss des sekundären Amins auf die Aktivität, vor allem am PPARα-Subtyp. Eine Dockingstudie unterstützte die These, dass ein Wasserstoffbrückendonor an dieser Stelle für die Aktivität von Vorteil sei, da dadurch ein Wasserstoffbrückennetzwerk zu einem konserviert vorliegendem Wasserkluster ausgebildet werden konnte. Dieses Wasserkluster wird durch die Aminosäure Thr279 in der Ligandbindetasche fixiert, sodass eine Mutationsstudie durchgeführt wurde, die diese These belegen konnte. Ebenfalls aus vorangegangenen Arbeiten entwickelte sich ausgehend von der Pirinixinsäure Phenylthiohexansäuren, die in einem Screening als FXR-Liganden identifiziert wurden. Die Substanz HZ55 (3) bildete somit die Leitstruktur des zweiten Projekts dieser Arbeit, bei dem die Zielsetzung die Entwicklung selektiver FXR-Liganden war. Da die Leitstruktur 3 eine auf die Aktivität an PPAR und den Enzymen der Arachidonsäurekaskade mPGES-1 und 5-LO optimierte Substanz darstellte, wurde im ersten Schritt der SAR der substituierte Thioether deletiert, da dieser als potentes PPAR-Pharmakophor bekannt war. Anschließend erfolgte die weitere Optimierung durch Struktur-Wirkungs-Beziehung der sauren Kopfgruppe, des Linkers und des heteroaromatischen Substituenten. Erste agonistisch aktive Derivate wurden durch Austausch des Chinolin-Rings durch einen Pyridin-Ring erreicht, wobei die Position 2 des Stickstoffs bevorzugt war (4). Durch Variation der Substitutionsposition am Pyridin-Ring stellte sich die Position 3 als vorteilhaft heraus, um hier durch Vergrößerung des lipophilen Substituenten die Aktivität zu steigern. Bei dem Einsatz des Eduktes Pyridin-2-ol musste die Synthese optimiert werden, um das Tautomeren-Gleichgewicht zwischen Pyridin/Pyridon steuern zu können. Denn auch die Pyridon-Derivate zeigten vergleichbare partialagonistische Potenz zu ihren Isomeren. Hier führte jedoch die Vergrößerung des lipophilen Substituenten in 3-Position zu der Etablierung einer neuen FXR-antagonistischen Substanzklasse. Der hieraus potenteste Vertreter (5) wurde weitergehend charakterisiert und konnte seine antagonistische Wirkung auch auf die FXR-Targetgene SHP, BSEP, Ostα und IBABP nachweisen. Durch qRT-PCR quantifiziert zeigte sich, dass 5 die Aktivität des endogenen Liganden CDCA antagonisieren konnte. Weiterhin zeigte die Substanz eine gute Selektivität über die PPARs. Optimierungsbedarf besteht jedoch in der metabolischen Stabilität und Löslichkeit und der Selektivität gegenüber mPGES-1. Doch die Substanz 5 stellt einen interessanten Ausgangspunkt für eine neue Substanzklasse dar, da sie eine agonistische Aktivität an dem G-Protein gekoppelten Rezeptor der Gallensäuren, TGR5, zeigt. Somit stellt 5 die erste synthetische Substanz dar, die dieses duale Profil der Gallensäurerezeptoren besitzt. Dies stellt ein vielversprechendes neues Therapieprinzip dar, nachdem sowohl der FXR-Antagonistmus positive Wirkung auf die Insulinsensitivität in Mausmodellen des Diabetes gezeigt hat, als auch der TGR5-Agonismus durch die Sekretion von GLP-1 Auswirkungen auf den Glukosehomöostase hat.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) als neue potentielle antientzündliche Wirkstoffe. Beide Enzyme befinden sich innerhalb der Arachidonsäurekaskade und sind einerseits an der Prostaglandin E2 (PGE2) Biosynthese und andererseits an der Biosynthese der Leukotriene (LTs) beteiligt (siehe Abb. 1). Die mPGES-1 ist ein membranständiges
Enzym, das downstream lokalisiert ist, hauptsächlich unterhalb der induzierbaren COX-2, und katalysiert die Reaktion von PGH2 zu PGE2. PGE2 gilt innerhalb der Prostaglandine als prominentester Vertreter bezüglich Entzündungen, Schmerzen und Fieber. Die Leukotriene gehören ebenso wie die Prostaglandine zu den proinflammatorisch wirkenden Lipid-Mediatoren und sind unter anderem beteiligt an der Bronchokonstriktion oder erhöhen auch die vaskuläre Permeabilität. Während dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungsbeziehungen zweier verschiedener Substanzklassen untersucht. Leitstruktur I entstammt einem Pirinixinsäure-Derivat (siehe Abb. 2). Die Pirinixinsäure (Verbindung 1) selbst ist sowohl an der mPGES-1 als auch an der 5-LO inaktiv. Initiale Arbeiten haben gezeigt, dass eine Einführung eines n-Hexyl Restes in α-Position zu der Carbonsäure zu einer dualen Inhibition der 5-LO und mPGES-1 geführt hat (Verb. 2). Unter Beibehaltung dieses Restes sollte der lipophile Rückraum durch Austausch des 2,3-Xylidin-Gerüsts optimiert werden und hier hat sich insbesondere das 4-(4-Chlorphenyl)-1,3-thiazol-2-amin Gerüst als potent erwiesen (Verb. 3). Mit dieser Erkenntnis sollten verschiedene 2-Aminothiazolhaltige Pirinixinsäurederivate synthetisiert werden, und ihre Struktur-Wirkungsbeziehung als
duale 5-LO/ mPGES-1 Inhibitoren untersucht werden. Leitstruktur II entstammt einem virtuellen Screening Ansatz, in dem neue acidische mPGES-1 Inhibitoren identifiziert werden sollten. Das Benzensulfonamid Derivat FR4 (Verb. 4) stellt dabei eine neuartige Leitstruktur für mPGES-1 Inhibitoren dar, die nicht nur in der Lage sind die humane mPGES-1 zu hemmen, sondern ebenso die murine mPGES-1. Viele in der Literatur beschriebene mPGES-1 Inhibitoren sind zwar in der Lage, die humane mPGES-1 sehr potent zu inhibieren, haben allerdings keinen Effekt gezeigt in ersten präklinischen Versuchen, weil der Spezies Unterschied zwischen der murinen und humanen mPGES-1 zu groß ist. Dementsprechend liefern die Benzensulfonamide einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuartiger mPGES-1 Inhibitoren, um die Hürde der präklinischen Entwicklung zu überwinden.
Sphingolipide sind an zahlreichen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen im Körper beteiligt. Vor Allem das sowohl auto- als auch paracrinwirkende Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt dabei eine essentielle Rolle. Ein Großteil der S1P-vermittelten / regulatorischen Effekte beruht auf dessen Wechselwirkung mit den fünf G Protein-gekoppelten S1P-Rezeptoren (S1P1-5). S1P nimmt hierüber Einfluss auf das Schicksal der Zellen (Proliferation, Überleben, Migration), die Zellmobilität, die Angiogenese und das Immunsystem. Viele der über die S1P-Rezeptor-vermittelten Effekte sowie deren Rolle und Funktion in einzelnen Geweben oder Organen sind bis heute noch nicht komplett verstanden bzw. erklärbar. Pharmakologische Tools können einen wichtigen Beitrag zur weiteren Erforschung und zum Verständnis des komplexen Sphingolipidnetzwerks leisten. Ausgehend von einer substituierten Diaryl-1,2,4-oxadiazol-Leitstruktur, die in der Literatur als privilegierte Struktur für S1P1-Rezeptoragonisten gilt, und dem selektiven S1P1-Agonisten SEW2871 wurden verschiedene Liganden mit unterschiedlichen chemischen Gruppen synthetisiert. Nach der Etablierung eines Synthesewegs zu etherverknüpften Aminoethan-diphenyl-1,2,4-oxadiazolen wurden diese in die fluoreszierenden Dansyl-, Isoindolin-, Pyridinium-Dye- und Coumarin-gelabelten Derivate überführt. Außerdem wurde eine einfache und optimierte Syntheseroute zu dem kleinen, umgebungsempfindlichen Fluorophor 4-(Dimethyl-amino)phthalimid (4-DMAP) entwickelt, dass entlang eines linearen Synthesewegs in guten Aus-beuten auch mit den Trifluormethyl- und Methyl-substituierten Diphenyloxadiazol-Grundstrukturen zu fluoreszenzmarkierten Derivaten umgesetzt wurde. Neben den fluoreszenzmarkierten Liganden für den S1P1-Rezeptor wurden zudem drei substituierte Phenyloxadiazolaniline zu den entspre-chenden Acrylamiden umgesetzt, die als kovalente Labeling Tools eingesetzt werden können. Durch die Synthese von Trifluormethyl- und Cyano-substituierten 4-DMAP-markierten Diaryloxa-diazolen sowie von Arylpropansäurederivaten wurde die gewählte Leitstruktur auf Grundlage einer ersten Affinitätstestungen verfeinert. Dabei wurde die zuvor entwickelte Synthese-strategie optimiert. Der Aufbau der Arylpropansäuren erfolgte durch eine Heck-Reaktion mit Acroleindiethylacetal. Durch den Wechsel der Synthesestrategie von 1. Heck-Reaktion und 2. Oxadiazolringschluss zur umgekehrten Vorgehensweise konnte eine Reihe von synthetischen Problemen umgangen werden und die Gesamtausbeute gesteigert werden.
Zwei der fluoreszenzmarkierten S1P1-Liganden mit verfeinerter Grundstruktur zeigten eine durch die Bindung an den S1P1-Rezeptor verursachte Internalisierung des Rezeptors, die durch die GFP-Markierung unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wurde. Diese Internalisierung lieferte weitere Hinweise, dass die beiden Substanzen eine durch Bindung am S1P1-Rezeptor verursachte, agonistische Wirkung haben. Die weitere pharmakologische Charakterisierung aller synthetisierten, funktionellen Liganden im Bereich der Sphingolipide steht noch aus. Leukotriene (LT) sind wichtige Lipidmediatoren, die durch Oxygenierung von Arachidonsäure entstehen. Sie nehmen eine zentrale Rolle ein in der Entstehung und dem Voranschreiten von Entzündungen, allergischen Reaktionen, Asthma, kardiovaskulären Erkrankungen und auch bei Krebserkrankungen. Das Schlüsselenzym der LT-Biosynthese ist das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO). Zur Behandlung von LT-assoziierten Krankheiten sind bis heute nur zwei Wirkstoffe zugelassen, die in den LT-Stoffwechsel eingreifen: der Cys-LT-Rezeptorantagonist Montelukast (Singulair®) und der eisenchelatisierende 5-LO-Inhibitor Zileuton (Zyflo®, nur in den USA zugelassen). Es besteht daher ein großer Bedarf an neuen, selektiven Liganden. C06 ist einer der am besten charakterisierten Vertreter einer neue Klasse an potenten, direkten und selektiven 5-LO-Inhibitoren: den Aryliden-Aryl-Thiazolonen, die ein großes Potential für die Entwicklung neuer anti-Leukotrien Arzneistoffe aufweisen. In-vivo-Experimente haben jedoch gezeigt, dass C06 und seine Derivaten nicht optimale pharmakologische Profile besitzen und zudem nur in geringem Maße im Wässrigen löslich sind. Durch die Optimierung und Etablierung einer mikrowellenassistierte Drei-Komponenten-one-pot-Synthese sowie einer verwandten zweistufigen Synthese zum Aufbau der Aryliden-Aryl-Thiazolone, konnte die Reaktionszeit verringert werden und daher die Isolierung und Aufreinigung vereinfacht werden. Zur Steigerung der Löslichkeit der Aryliden-Aryl-Thiazolone in wässrigen Systemen und zur weiteren Erforschung der SAR wurde einige Derivate mit polaren Substituenten, unterschiedlichen Wasserstoffbrückenbindungs-Eigenschaften, Morpholinderivate und verschiedene heteroaromatische Aryliden-Aryl-Thiazolone hergestellt, wobei die Heteroarylderivate aufgrund ihrer niedrigeren, berechneten Lipophilie (clogP) und höheren berechneter Löslichkeit (clogS) ausgewählt wurden. Für alle synthetisierten Derivate wurde die Inhibition der 5-LO-Produktbildung unter zellfreien (S100) und unter zellulären Bedingungen (PMNL) bestimmt. Zudem wurden für einige Derivate die experimentellen Löslichkeiten in DMSO und in Puffer grob ermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass alle besser löslichen Derivate einen höheren IC50-Wert im zellbasierten Assay aufweisen bzw. die potentesten Substanzen nicht gut im Wässrigen löslich sind. Zur Charakterisierung der unbekannten, allosterischen Bindestelle der Aryliden-Aryl-Thiazolone wurde eine Reihe von zum kovalenten bzw. zum Photoaffinity-Labeling fähigen Aryliden-Aryl-Thiazolonderivaten synthetisiert. Alle Derivate wiesen gute bis sehr gute 5-LO Affinitäten auf und durch Vorversuche konnte die prinzipielle Eignung zum Photoaffinity-Labeling gezeigt werden. Da sowohl die polaren als auch die heteroarylbasierten Aryliden-Aryl-Thiazolone die bekannte kontinuierliche SAR wiederspiegelten und keine hohe Wasserlöslichkeit bei gleichzeitiger hoher 5-LO-Inhibition erreicht werden konnte, wurden die einzelnen Element des Aryliden-Aryl-Thiazolon-grundgerüstes durch individuelle Synthesen variiert. Diese Kernvariations- und die an der Aryliden-einheit variierten Derivate haben die SAR der Aryliden-Aryl-Thiazolone deutlich erweitert und konnten die für die 5-LO-Aktivität wichtigen Elemente identifizieren. Dadurch ist es gelungen, die 2-Aryl-5-aryl(methyl)thiazol-4-ole als 5-LO-Leitstruktur zu erschließen, die sowohl unter zellfreien Bedingungen (S100) als auch im zellbasierten Assay (PMNL) Aktivitäten im nanomolaren Bereich erreichen. Mit den 2-Aryl-5-arylmethylthiazol-4-olen konnte außerdem die Löslichkeit in DMSO und vor allem im Wässrigen, verglichen zu C06, deutlich erhöht werden. ST-1829 ist ein C06-Analogon, dass die Nachteile im pharmakologischen Profil von C06 eliminiert und zu einem neuen, effektiven Wirkstoff in der anti-Leukotrien Therapie weiter entwickelt werden kann.
Die Naturwissenschaften waren von den teilweise gewalttätigen Auseinandersetzungen der Studentenproteste Ende der 1960er Jahre nicht an erster Stelle betroffen. Insbesondere das Pharmaziestudium mit seinem zeitintensiven, streng geregelten und durch Laborpraktika dominierten Arbeitsalltag bot wenig Raum für politische Agitationen. Andererseits waren die Studierenden auch nicht mit den Herausforderungen einer sich entwickelnden Massenuniversität konfrontiert. Nichtsdestoweniger mussten sich auch die Hochschullehrer der naturwissenschaftlichen Fakultät mit den zeitgenössischen Reformvorschlägen auseinandersetzen. Der pharmazeutische Chemiker Herbert Oelschläger, eine der prägenden Persönlichkeiten der Frankfurter Pharmazie, scheute diese Auseinandersetzungen nicht und wurde deshalb zu einer beliebten Zielscheibe des AStA.
In Deutschland erkranken pro Jahr ~1800 Kinder neu an Krebs, wobei Leukämien mit 33,8 % die häufigste diagnostizierte Krebsform darstellen. Besonders Leukämien mit dem Phänotyp einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL) sind mit der Erkrankung im Kindesalter assoziiert. Die häufigsten genetischen Ursachen kindlicher ALLs sind ein hyperdiploider Karyotyp oder chromosomale Translokationen. Unter Säuglingen im Alter von nur wenigen Monaten mit einer ALL treten hier oft reziproke chromosomale Translokationen mit Beteiligung des MLL-Gens auf. Die t(4;11)-assoziierte Leukämie, mit dem AF4-Gen als Translokationspartner, stellt den häufigsten Krankheits-Phänotyp dieser Patientengruppe dar. Die Erkrankung zeichnet sich durch eine stark erhöhte Leukozytenzahl im peripheren Blut bei Diagnose aus. Aufgrund immunphänotyperischer und morphologischer Analysen werden die Leukozyten und auch die Erkrankung durch einen pro B-Zell Phänotyp charakterisiert. Ein weiteres klinisches Merkmal ist das schnell auftretende Rezidiv, welches schlecht auf eine folgende Therapie anspricht und zu sehr geringen Überlebensraten führt, wodurch die t(4;11)-assoziierte Leukämie als Hochrisiko-Leukämie klassifiziert wird. Als genetische Grundlage des Mechanismus der t(4;11)-Leukämogenese wird die Expression der resultierenden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL angenommen. Durch die Expression beider Fusionsproteine wird die Funktion des Wildtyp MLL-Proteins gehemmt, welches als epigenetischer Regulator für die Hämatopoese und die Ausbildung des Körperbauplans während der Embryogenese essenziell ist. Weiterhin wird auch die Funktion des Wildtyp AF4-Proteins gehemmt, welches einen bedeutenden Bestandteil der zellulären Transkriptionsinitiations- und Elongationsmaschinerie darstellt. Außerdem beeinflussen beide Fusionsproteine zelluläre Mechanismen wie die Proliferation, das Überleben und die Differenzierung, weshalb die Erforschung des Pathomechanismus der Fusionsproteine essenziell für die Rekapitulation und damit für die Therapie und Heilung der Erkrankung ist.
Aktuell rekapitulieren Studien der beiden Fusionsproteine die humane Erkrankung jedoch nur unzureichend. Das MLL•AF4-Protein zeigte bisher eine Blockierung der Apoptose nach unterschiedlichsten Induktionen in zellbasierten Systemen. Allerdings konnte dem Fusionsprotein kein onkogenes Potenzial in vitro nachgewiesen werden und auch in vivo führte die Expression von MLL•AF4 zur Bildung von hauptsächlich myeloischen Neoplasien nach langen Latenzzeiten. Die Expression des reziproken AF4•MLL-Proteins führte in zellbasierten Systemen zu einem verstärkten Metabolismus durch die Steigerung der zellulären Transkription und beeinflusste so die Proliferation. Parallel trat eine hohe Apoptoserate auf, sodass die Proliferation nahezu unverändert schien. Da in vitro jedoch die Kontaktinhibition und Wachstumstransformation von Zellen gezeigt werden konnte und im Mausmodell der humane Phänotyp einer pro B-ALL ausgelöst wurde, scheint das AF4•MLL-Protein das treibende Onkogen der t(4;11)-assoziierten Leukämie zu sein. Allerdings wird die Erkrankung auch in diesem Modell erst nach einer langen Latenzzeit beobachtet und auch die zellulären Mechanismen, in welchen das onkogene Potenzial des reziproken Fusionsproteins entscheidend ist, bleiben weiter zu untersuchen. Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit hauptsächlich die Auswirkungen der Expression des onkogenen AF4•MLL-Proteins unter verschiedenen Aspekten untersucht, und kooperierende Ereignisse analysiert werden.
Grundlegend sollte die Auswirkung des reziproken Fusionsproteins in humanen Zellen studiert, und auch Effekte des MLL•AF4-Proteins mit früheren Studien verglichen werden, um zellbiologisch relevante Mechanismen aufzudecken. Weiterhin sollte der Einfluss möglicher sekundärer Mutationen und die Wirkung von Koffein als Stimulans untersucht werden, um mögliche Ursachen der langen Latenzzeiten in t(4;11)-assoziierten Mausmodellen zu identifizieren. Da jedoch etwa 20 % aller t(4;11)-Patienten kein AF4•MLL-Protein bilden und als Reziprok oft der solitäre MLL C-Terminus exprimiert wird, sollte zudem der Effekt des MLL•C-Proteins im Mausmodell studiert werden. Insgesamt konnten alle erhobenen Daten mit Resultaten früherer Studien kombiniert werden, wodurch ein spezifisches Modell der t(4;11)-assoziierten Leukämogenese entstand. Das Modell diskutiert die onkogene Funktion des AF4•MLL-Proteins besonders während der hämatopoetischen Differenzierung. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit zum klonogenen Wachstum der humanen Zellen nach Expression von AF4•MLL und der Ergebnisse im MLL•C-Mausmodell konnte ein Einfluss des Reziproks auf die Differenzierung von Leukozyten gezeigt werden.
Weiterhin konnte nach AF4•MLL-Expression in humanen Zellen die Steigerung des Metabolismus aber auch die einhergehende vermehrte Apoptose bestätigt werden, welche die lange Latenzzeit im AF4•MLL-Mausmodell begründen könnte. Durch Kooperation mit dem MLL•AF4-Protein, welches anti-apoptotische Effekte zeigt, könnte es jedoch zum frühen Ausbruch der Erkrankung im Säuglingsalter kommen. Allerdings konnte in dieser Arbeit auch eine Steigerung der Proliferation von MLL•AF4-exprimierenden Zellen beobachtet werden, wenn anti-apoptotische Mechanismen des Fusionsproteins inaktiv sind, welche aus der Aktivierung des RAS/RAF/MEK/ERK-Signalwegs resultiert. Werden neben der Translokation zusätzliche RAS-Mutationen aquiriert, die bei 26 % der Kinder mit einer t(4;11)-Leukämie auftreten, wird der Signalweg und somit die Proliferation der leukämischen Blasten zusätzlich stabilisiert. Dadurch kommt es zu höheren Leukozytenzahlen und einem noch früheren Ausbruch der Erkrankung. Weiterhin deckte die Analyse von sekundären Mutationen auch die Beteiligung des FLT3-Signalwegs an der Therapieresistenz durch Quieszenz auf. Ein besonderer Einfluss von Koffein als Stimulans in t(4;11)-Zellen konnte hingegen ausgeschlossen werden. So wurde der Pathomechanismus der t(4;11)-assoziierten Leukämie in dieser Arbeit weiterführend aufgeklärt, wodurch Strategien zur Therapie und Heilung der Erkrankung in Zukunft intensiviert werden können.
In zahlreichen, in der Einleitung bereits näher beschriebenen Studien konnte anxiolytische Wirksamkeit des patentierten ätherischen Öls Silexan sowohl im Tiermodell, als auch am Menschen zur Therapie subsyndromaler und generalisierter Angsterkrankungen demonstriert werden.
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, den zugrunde liegenden pharmakologischen Wirkmechanismus zu untersuchen. Nach eingehender Analyse der Targets klassischer Anxiolytika, richtete sich der Fokus auf spannungsabhängige Calciumkanäle, die die Bindungsstelle des Gabapentinoids Pregabalin enthalten. Die mögliche Modulation der Kanäle wurde an PC-Zellen, einem Modell neuronaler Vorläuferzellen, murinen Synaptosomen, aber auch in primären Neuronen der für die Genese der Angsterkrankungen relevanten Hirnareale Hippocampus und Cortex untersucht. Die Kanalexpression, sowie - distribution in den unterschiedlichen Geweben wurde charakterisiert und die Frage erörtert, ob Silexan spezifische Modulation eines bestimmten Kanalsubtyps vermittelt oder unspezifisch alle Kanäle dieser Gattung inhibiert. Um dies näher zu beleuchten wurden elektrophysiologische Messungen an transfizierten Zellen durchgeführt, die jeweils nur einen Subtyp der Familie spannungsabhängiger Calciumkanäle exprimieren. Zur weiteren Aufklärung des Wirkmechanismus wurde auch die mögliche Involvierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren ermittelt.
Der zweite Teil der vorliegenden Untersuchung widmet sich der Klärung potentieller antidepressiver Wirkungen durch mögliche neurotrophe Effekte. Primäre hippocampale Neurone und PC12-Zellen wurden hierzu u.a. auf prä- und postsynaptische Marker, Ausdifferenzierungsmarker, sowie Neuritenwachstum hin analysiert.
Die Proteomforschung wurde die letzten beiden Dekaden maßgeblich durch die Massenspektrometrie geprägt und vorangetrieben. Ohne die Ionisationstechniken MALDI und ESI wäre die Analyse von Peptiden und Proteinen nicht in dem Maße möglich. Durch das Zusammenspiel zwischen Probenvorbereitung und effektiven Trennmethoden mit hochauflösenden Massenspektrometern und Auswertungssoftware können heute problemlos komplexe Proteinmischungen oder ganze Proteome untersucht werden.
Um Proteine in Peptide zu schneiden, wird in den allermeisten Fällen die Protease Trypsin verwendet, deren Eigenschaften in vielerlei Hinsicht die bestmögliche Lösung für die nachfolgende Analyse mit Massenspektrometern bieten. Allerdings stößt die Anwendbarkeit dieses Enzyms bei der Analyse von einigen Proteinen oder Proteinklassen wie Membranproteinen an ihre Grenzen, da nur sehr wenige potentielle Schnittstellen vorhanden sind. In solchen Fällen wurden eine Reihe von weniger spezifischen Enzymen wie Chymotrypsin, Proteinase K oder Elastase in den vergangenen Jahren genutzt, die Proteine auch in für Trypsin weniger gut zugänglichen Bereichen wie Transmembranhelices, in massenspektrometrisch analysierbare Peptide spalten können.
Allerdings stellen die wenig spezifischen Enzyme und die von ihnen generierten Peptide die Massenspektrometrie vor neue Herausforderungen. Für eine Identifizierung benötigen die Peptide eine sehr hohe Massengenauigkeit, daneben sind insbesondere bei der Verwendung von MALDI-Massenspektrometern neutrale und sehr saure Peptide schwerer ionisierbar und analysierbar als basische.
Genügte es bis vor einigen Jahren, nur die Identität einzelner Proteine in komplexen Proben zu bestimmen, hat sich die Fragestellung mittlerweile einem Wandel unterzogen. Heute ist man daran interessiert, wie viel eines bestimmten Proteins vorliegt, besonders im Vergleich mit anderen, unterschiedlich behandelten Proben ist die Regulation von Proteinen von Interesse. Zum Quantifizieren stehen viele unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Eine solche stellen die isobaren Derivatisierungsreagenzien TMT und iTRAQ dar, mit denen unterschiedliche Proben nach Peptidfragmentierung quantifiziert werden können.
Fast alle Arbeiten zur Quantifizierung in der Vergangenheit benutzten Trypsin als Protease.
Im Zuge dieser Arbeit sollten die Vorteile, die durch die Verwendung von Elastase bei der Identifizierung von Membranproteinen bereits gezeigt werden konnten, auf die Quantifizierung mit TMT erweitert werden.Wurde in der Vergangenheit noch in manchen Publikationen davon abgeraten, Elastase zu verwenden,weil die Nutzbarkeit der dabei gebildeten komplexen Peptidmischungen in Frage gestellt wurde, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Elastase wie auch Trypsin sich eignen, als Enzym für Quantifizierungsexperimente verwendet zu werden. Dies wurde an Modellproteinen evaluiert und dann auf komplexe Membranproben von Hefezellen erweitert.
Bei Vorexperimenten zur Derivatisierung mit TMT wurde desweiteren festgestellt, dass Peptidklassen, die zuvor nur mit ESI als Ionisationsmethode identifiziert werden konnten, durch die Derivatisierung nun auch mit MALDI zugänglich waren. Die dadurch analysierten kleinen, hydrophoben und sehr sauren Peptide lieferten bei der Kombination mit der underivatisierten Probe einen deutlichen Zugewinn in der Sequenzabdeckung der identifizierten Proteine.
Ein weiterer Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der nachträglichen Korrektur von gemessenen Peptidmassen über selbst geschriebene Softwarelösungen für verschiedene Massenspektrometer. Es wurde das Ziel verfolgt, eine möglichst hohe Massengenauigkeit und damit hohe Anzahl an Identifizierungen von Proteinen nach Verdau mit wenig spezifischen Proteasen zu erreichen. Weitere Computerprogramme wurden mit dem Ziel geschrieben, den Arbeitsablauf zu erleichtern und zu verbessern.
Für die früher schon beschriebene Kombination zweier Massenspektrometer mit hoher Massengenauigkeit und Auflösung auf der einen Seite und effizienter Peptidfragmentierung auf der anderen Seite konnte durch Veränderung der Instrumentierung und Software nun eine Automatisierbarkeit geschaffen werden, die es ermöglicht, die Methode standardmäßig bei Routineanalysen zu verwenden.
So ergeben sich viele neue Möglichkeiten neben den oft gewählten Standardprotokollen mit der Analyse tryptischer Verdauansätze mittels LC-ESI-MS/MS, die häufig nur der Einfachheit halber und ohne Anpassung an die eigene Zielsetzung gewählt werden.
Die Arbeit zeigt aber auch auf, dass die Verwendung weniger spezifischer Enzyme sowohl eine Optimierung des Arbeitsablaufs als auch eine Datenauswertung benötigt, die die Besonderheiten der Proteasen berücksichtigt. Wenn dies gewährleistet wird, kann vor allem mit dem Zugewinn durch die Derivatisierung mit TMT eine wertvolle Alternative zu Trypsin genutzt werden.
Pharmakologische Charakterisierung zentraler cholinerger Dysfunktionen in transgenen Mausmodellen
(2013)
Die cholinerge Dysfunktion steht in Zusammenhang mit der Ätiologie der Alzheimer-Krankheit (AD). Das Absterben cholinerger Neurone führt zu einer verminderten cholinergen Neurotransmission im Gehirn. Die Abnahme der Acetylcholinesterase-(AChE)-Aktivität und eine leichte Zunahme der Butyrylcholinesterase-(BChE)-Aktivität zählen zu den charakteristischen Merkmalen der AD. Acetylcholinesterase-Inhibitoren (AChEI) sollen Acetylcholin (ACh)-Konzentrationen im Gehirn steigern, um cholinerge Defizite auszugleichen. Allerdings zeigen AChEI in der Klinik nur einen mäßigen Erfolg. Zur Optimierung der Therapie mit Esterasehemmern, wurden im Rahmen dieser Arbeit drei transgene Mausmodelle mit cholinergen Veränderungen untersucht.
Zunächst wurde die AChE-heterozygote (AChE +/-) Maus analysiert. Die Maus weist bei einer 60-prozentigen AChE-Restaktivität (60,6 U/mg in AChE +/- versus 100,0 U/mg in WT-Mäusen) nur sehr leicht erhöhte ACh-Konzentrationen im Gehirn (9,0±5,1 fmol/5 µl in AChE+/- versus 5,0±3,6 fmol/5 µl in der WT-Maus) auf, die mithilfe der in vivo Mikrodialyse bestimmt wurden. PET-Studien haben gezeigt, dass die zerebrale AChE-Restaktivität in AD-Patienten, die mit Donepezil behandelt wurden, immer noch 70 bis 90% beträgt. Vom AChE +/- Modell kann abgeleitet werden, dass eine bis zu 50-prozentige AChE-Hemmung durch AChEI nicht genügt, um ACh-Konzentrationen im Gehirn von Patienten deutlich zu erhöhen. Leider ist eine Dosiserhöhung der AChEI durch das Auftreten von unerwünschten Wirkungen (Diarrhö, Übelkeit, Erbrechen) begrenzt.
Hippocampale ACh-Konzentrationen in der AChE +/- Maus steigen nach intrazerebraler und intraperitonealer Gabe von selektiven AChEI signifikant stärker an als in WT Mäusen. AChEI können ACh-Konzentrationen also auch noch bei einer verminderten AChE-Aktivität steigern. Die Cholinacetyltransferase-Aktivität ist in AChE +/- Mäusen unverändert, während der hochaffine Cholintransport signifikant um 58% erhöht ist. Veränderungen der kognitiven Leistungsfähigkeit der AChE +/- Maus sind in Verhaltenstests nicht zu erkennen. Es folgte die Untersuchung der PRiMA (Prolin-reicher Membrananker) defizienten Maus und der AChE del5 6-Maus. PRiMA ist ein transmembranäres Protein, das zur Prozessierung der AChE und ihrer Verankerung in der Membran verantwortlich ist. PRiMA kommt hauptsächlich im Gehirn vor, daher kann die PRiMA-KO-Maus dort keine AChE-Verankerung ausbilden. Die AChEdel5 6-Maus kann weder im Gehirn noch in der Peripherie AChE-Verankerungen formen, da eine Domäne fehlt, die essentiell für die Wechselwirkung mit Anker-Proteinen ist. Beide Mausmodelle weisen geringe AChE-Restaktivitäten (< 10 %) und drastisch erhöhte ACh-Konzentrationen im Gehirn auf. Die ACh-Konzentrationen im Striatum der PRiMA-KO-Maus sind circa 350 fach erhöht (4±3 fmol/5 µl in WT-Mäusen versus 1450±700 fmol/5 µl in PRiMA-KO-Mäusen). Allerdings zeigt die PRiMA-KO-Maus keinen Phänotyp, während die AChE del5 6 Maus krank aussieht (Tremor, geringes Körpergewicht, stumpfes Fell). Beide Modelle bestätigen, dass ACh-Spiegel im Gehirn nur dann stark ansteigen, wenn die AChE immens gehemmt ist. Ferner kann aus der PRIMA-KO-Maus gefolgert werden, dass die Interaktion zwischen AChE und PRiMA ein geeignetes Target für die Therapie der cholinergen Dysfunktion darstellen könnte.
Nach intrazerebraler Applikation eines selektiven AChE-Inhibitors (BW284c51 1 µM), steigen die ACh-Spiegel im Gehirn beider transgener Mäuse signifikant an. Eine Veränderung der ACh-Konzentrationen nach BChEI Gabe ist weder bei der AChE +/-, der PRiMA-KO, noch bei der AChE del5 6 Maus zu sehen. Die BChE trägt bei einer AChE-Restaktivität (10 bis 40 %) nicht zum hydrolytischen Abbau von ACh bei. Daraus lässt sich ableiten, dass bei stark verminderten AChE-Aktivitäten, der Einsatz von BChEI vermutlich keinen weiteren Nutzen erbringt. Um die Adaptionsmechanismen der PRiMA-KO-Maus aufzuklären, wurde die M2-Rezeptor Funktion (negativer Feedback-Mechanismus) getestet. Da die striatalen ACh-Konzentrationen in der PRiMA-KO-Maus nach Behandlung (lokal und i.p.) mit M2-Agonisten und -Antagonisten kaum verändert sind, lässt dies einen nicht-funktionalen M2 vermuten.
Aus den Ergebnissen können wichtige Erkenntnisse über die Therapie der Alzheimer-Krankheit gewonnen werden. Die Bestimmung der ACh-Konzentrationen, in Gegenwart unterschiedlicher AChE-Aktivitäten der verschiedenen Mausmodelle, zeigt den Zusammenhang zwischen ACh und AChE im Säugerhirn und erklärt die limitierte klinische Wirksamkeit der AChE-Inhibitoren. Die Hemmung der Interaktion zwischen PRiMA und der AChE stellt eine denkbare Interventionsmöglichkeit dar, um ACh-Konzentrationen im Gehirn zu steigern, ohne dabei periphere Nebenwirkungen auszulösen. Ziel der weiteren Forschung sollte sein, PRiMA bzw. die Interaktion zwischen PRiMA und AChE als Target für die Therapie der Alzheimer-Krankheit weiter zu erforschen.
Abdominale Aortenaneurysmen sind in Industrienationen eine häufige Erkrankung der Personengruppe über 65 Jahre. Diese Dilatationen der abdominalen Aorta zeichnen sich durch eine lokale Inflammation aus, die mit der Infiltration von Immunzellen, dem Verlust von glatten vaskulären Muskelzellen und der Degeneration der extrazellulären Matrix einhergeht. Ursprünglich als Symptom einer Atherosklerose angesehen, sind die Ursachen dieser progressiv verlaufenden Erkrankung nach wie vor nicht vollständig verstanden; obwohl steigendes Alter, männliches Geschlecht, genetische Prädisposition, Rauchen und ein zuvor erlittener Myocardinfarkt als Risikofaktoren identifiziert werden konnten. Der lange Zeit asymptomatische Krankheitsverlauf, die Gefahr einer Ruptur mit häufig letalen Folgen und der Mangel einer effizienten pharmakologischen Therapie machen eine weitere Untersuchung dieser Erkrankung unabdingbar.
Diltiazem ist ein Inhibitor spannungssensitiver L Typ-Calciumkanäle, der seit über 25 Jahren zur Behandlung von arterieller Hypertonie, verschiedener Arrhythmien und Angina pectoris verwendet wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob Diltiazem auch einen antianeurysmatischen Effekt besitzt. Eine vierwöchige subcutane Infusion des blutdrucksteigernden Hormons Angiotensin II führte nach vier Wochen zur Bildung abdominaler Aortenaneurysmen, sowie zu atherosklerotischen Gefäßveränderungen der thorakalen Aorta Apolipoprotein E (ApoE)-defizienter Mäuse. Eine parallele Therapie mit Diltiazem über das Trinkwasser konnte diese Entwicklung unabhängig vom arteriellen Blutdruck und damit unabhängig von der antihypertensiven Wirkung verhindern. Im Aortenbogen Diltiazem-behandelter Tiere konnte im Rahmen dieses in vivo-Modells nach sechs Tagen eine deutlich geringere lokale Expression proinflammatorischer Cytokine, wie Tumornekrosefaktor-a, Interleukin-1ß (IL1B) und Interleukin-6 (IL6), Chemokine, wie CCL2, und degenerativer Proteasen, wie der Matrix-Metalloprotease 9 (MMP9), festgestellt werden. Dies war die Folge einer reduzierten Anzahl von Macrophagen in der Gefäßwand. Zirkulierende proinflammatorische Cytokine, wie CCL12, konnten im Serum teilweise ebenfalls vermindert nachgewiesen werden.
Obwohl die antihypertensive Wirkung von Diltiazem in glatten vaskulären Muskelzellen vermittelt wird, war es nicht möglich, die Angiotensin II-induzierte Produktion von promigratorischem CCL2 und proinflammatorischem IL6 in isolierten Aortenringen ApoE-defizienter Mäuse oder in glatten vaskulären Muskelzellen der Ratte zu reduzieren. Diltiazem war zudem nicht in der Lage, die CCL2-induzierte Migration proinflammatorischer Ly6C+-Monocyten in vivo zu unterbinden. In isolierten peritonealen Macrophagen ApoE-defizienter Mäuse dagegen, konnte die IL6 induzierte Expression von IL1B- und CCL12-mRNA durch eine Inkubation mit Diltiazem verhindert werden. In der RAW264.7-Zelllinie, die morphologische und funktionelle Merkmale von Monocyten und Macrophagen aufweist, konnte die Dilitiazem-sensitive IL6-induzierte Expression von IL1B-mRNA in vitro ebenfalls nachgewiesen werden. Eine Stimulation mit IL6 war in diesen Zellen jedoch nicht ausreichend, um die Sekretion von IL1B-Protein auszulösen.
Thorakales Aortengewebe wies im Vergleich mit RAW264.7-Zellen eine veränderte Ausstattung spannungssensitiver Calciumkanäle auf. In letzteren fanden sich keine muskelzellspezifischen L-Typ-Calciumkanäle (CACNA1C), aber eine relevante Expression neuronaler P/Q-Typ-Calciumkanäle (CACNA1A). Mittels fluorimetrischer Bestimmung mit Fura-2AM konnte jedoch festgestellt werden, dass die intrazelluläre Calciumkonzentration Diltiazem-behandelter RAW264.7-Zellen unverändert war und der antiinflammatorische Effekt somit calciumunabhängig vermittelt wurde.
Diltiazem war nicht in der Lage, eine Lipopolysaccharid (LPS)-bedingte Inflammation in RAW264.7-Zellen zu unterbinden. Weder die LPS-induzierte Sekretion von IL1B Protein, noch die nucleäre Translokation des Transkriptionsfaktors NF-?B oder die Aktivierung des NF-?B-Promotors konnten durch eine Inkubation der Zellen mit Diltiazem verhindert werden. Diltiazem reduzierte jedoch, die IL6-induzierte Aktivierung des AP 1-Promotors unabhängig von der MAPK1-Phosphorylierung oder der Phosphorylierung und nucleären Translokation des Transkriptionsfaktors STAT3 zu unterbinden. Eine Unterdrückung von c-Jun N-terminale Kinase JNK- oder p38 Proteinkinase-vermittelten Signalwegen ist damit wahrscheinlich.
Das Pirinixinsäurederivat LP105 ist ein neuer Inhibitor der Arachidonat-5-Lipoxygenase (LOX5), der im Rahmen dieser Arbeit erstmals in vivo auf seine antianeurysmatischen Eigenschaften hin untersucht wurde. LOX5 katalysiert die Reaktion von Arachidonsäure zu Leukotrien A4 und kontrolliert damit einen wichtigen Schritt in der Synthese proinflammatorischer Leukotriene. LP105 war im Tiermodell nicht in der Lage die Angiotensin II-induzierte Bildung abdominaler Aortenaneurysmen in ApoE-defizienten Mäusen komplett zu unterbinden, führte aber über die Reduktion der vaskulären Inflammation zu einer deutlich verringerten Krankheitslast. LP105 selbst beeinflusste die mRNA-Expression verschiedener Enzyme des Arachidonsäuremetabolismus nicht, verstärkte jedoch durch die Blockade von LOX5 die Metabolisierung von Arachidonsäure über Arachidonat-15-Lipoxygenase und Cytochrom P450-Enzyme.
Die Transkription ist ein entscheidender Schritt in der Transition der genetischen Information, welche durch die DNA codiert und im Genom hinterlegt ist, zu dreidimensionalen Funktionseinheiten in der Zelle, den Proteinen. Während der Transkription wird die Information von der Ebene der DNA in RNA umgewandelt, welche in der Zelle zusätzlich zu dessen Rolle als Informationsmediator in Form der mRNA eine Vielzahl von Funktionen ausübt. Die Transkription benötigt in Hinblick auf ihre essentielle Rolle in der Errichtung des Proteoms und der notwendigen Adaption von Genexpressionsprogrammen an externe zelluläre Stimuli, den Zellzyklus etc. eine präzise und gleichzeitig flexible Regulation. Besonders für die Transkription von mRNA dient die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAP II) in diesem Prozess als eine zentrale Einheit, die einer Vielzahl regulativer Mechanismen wie post-translationaler Modifikationen und der Assemblierung dynamischer Proteinkomplexe unterliegt. Während Komponenten dieser Regulation wie die Zusammensetzung und Dynamik des Prä-Initiationskomplex bereits seit Jahrzehnten beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAP II-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAP II bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Initiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieser Blockade wird durch den positiven Transkriptions-elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAP II und assoziierter Faktoren die produktive Elongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch eine inaktivierende Assoziation mit Speicherkomplexen. P-TEFb wurde abseits dieser Komplexe in einer Vielzahl von Elongations-assoziierten Proteinkomplexen identifiziert, der Mechanismus der Transition aus dem inaktiven Speicherkomplex zur aktiven Form an der RNAP II war jedoch unbekannt.
Ein zentrales Element aller aktiven Komplexe ist die Anwesenheit von Proteinen der AF4/FMR2-Familie, darunter das AF4 Protein. Bemerkenswerterweise war die genaue Rolle dieses Proteins in den Komplexen bisher unbekannt oder wurde lediglich auf die strukturelle Integrität der Komplexe beschränkt. AF4 und speziell dessen N-Terminus ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die t(4;11)(q21;q23) chromosomalen Translokation bedingter, akuter lymphoblastischer Leukämie assoziiert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das AF4 Protein und im Speziellen sein N-Terminus in der Lage ist, die zelluläre Transkription durch die Aktivierung und Rekrutierung von P-TEFb zu aktivieren. In Anwesenheit von AF4 wird die Kinase-Untereinheit CDK9 des P-TEFb post-translational an Lysinresten modifiziert und damit aktiviert sowie die C-terminale Domäne der RNAP II im Kontext stärker phosphoryliert. Gleichzeitig wurde das P-TEFb inaktivierende Protein HEXIM1 stärker exprimiert. AF4 und AF4-MLL waren weiterhin in der Lage ein Elongations-kontrolliertes Reportergen zu aktivieren. Gleichzeitig führte die Überexpression des AF4 zu einer Erhöhung der zellulären RNA Menge. Zur genaueren Untersuchung der AF4-abhängigen Mechanismen wurden zwei Zelllinien erstellt, die zum Einen eine induzierbare und reproduzierbare Überexpression und Reinigung des AF4 erlaubten (TCZP-AF4ST) und zum Anderen durch lentiviralen knock-down eine an AF4-Mangelsituation nachstellten (AF4kd V100). Es konnte so gezeigt werden, dass AF4 über P-TEFb hinaus eine regulative Funktion gegenüber Transkription-assoziierten Faktoren wie CDK7, MENIN und NF?B besitzt und dass diese Faktoren vorrangig, analog zu P-TEFb, mit dem N-Terminus des AF4 interagieren. Die Überexpression von AF4 führte über die Bindung an die 7SK snRNA und deren Degradation zur Rekrutierung des P-TEFb aus den Speicherkomplexen in distinkte AF4-assoziierte Komplexe und zu einer Umverteilung des Faktors auf distinkte Loci im Zellkern, wobei der AF4 N-Terminus für sich alleine jedoch nicht in der Lage war, diese Funktion auszuüben. Im Falle eines Mangels an AF4 kam es zur Wachstumsretardierung der Zellen sowie zu einem völligen Aktivitätsverlust in Reportergenversuchen.
Die Tatsache, dass AF4 ein zentrales Element in der Elongationskontrolle darstellt führte zu der weitergehenden Vermutung, dass virale immediate early (IE) Proteine zur Kontrolle viraler Genexpression auf der Ebene der Elongation ebenfalls auf dieses Wirtsprotein zugreifen können. Es konnte vor diesem Hintergrund gezeigt werden, dass AF4 tatsächlich mit den IE-Proteinen IE1 (HCMV) und Zta (EBV) aus der Familie der Herpesviren interagiert und durch die Stabilisierung des AF4 Proteins eine kooperative, transaktivierende Funktion auf ein ALOX5 Reportergen ausgeübt wurde. Es wurde gezeigt, dass die viralen IE-Proteine dabei Komponenten der AF4 Komplexe sind und in der Zelle zur epigenetischen Regulation des ALOX5 Gens führen. Weiterhin konnte in diesen Experimenten dargestellt werden, dass AF4 über seine Rolle in der Elongationskontrolle hinaus auch distinkte Effekte in der Aktivierung von Promotoren und damit in der Initiation der Transkription zeigt. Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal die essentielle Rolle des AF4 Proteins in der Elongationskontrolle und der Initiation der Transkription als auch in der Infektion durch Herpesviren gezeigt werden.
Der ischämische Schlaganfall zählt zu den häufigsten Todesursachen in den Industrienationen und hinterlässt die meisten überlebenden Patienten in einer Pflegebedürftigkeit. Trotz der hohen Inzidenz und der gravierenden Folgen eines Schlaganfalls gibt es bislang keine ausreichende medikamentöse Therapie zum Schutz der Nervenzellen. Die akute Versorgung beschränkt sich auf die Lyse des Thrombus, welcher die betroffene Hirnarterie verschließt, und auf symptomatische Maßnahmen.
In der vorliegenden Dissertation wurden daher das neuroprotektiv wirkende Bilobalid, eine Substanz aus dem Ginkgo biloba Baum, und das anaplerotisch wirksame Triheptanoin auf ihre schützende Wirkung während eines ischämischen Schlaganfalls im Mausmodell untersucht. Zusätzlich wurden in der Bilobalid-Studie Tiere aus zwei verschiedenen Altersgruppen (6-8 Wochen gegen 18-24 Monate) verglichen. Der transiente Schlaganfall wurde in der Maus durch einstündigen Verschluss der mittleren Cerebralarterie (MCAO, middle cerebral artery occlusion) induziert.
Bilobalid wurde prophylaktisch eine Stunde vor Induktion des Schlaganfalls intraperitoneal (10 mg/kg) oder lokal in das betroffene Hirnareal (10 µM) verabreicht. Alle durchgeführten Experimente wiesen auf eine deutliche Neuroprotektion durch die Gabe von Bilobalid hin. Ein Tag nach MCAO war die Infarktfläche durch die Gabe von Bilobalid signifikant vermindert. In den durchgeführten motorischen Verhaltenstests schnitten die Bilobalid-behandelten Tiere wesentlich besser ab als unbehandelte Tiere. Der beobachtete Schutzeffekt von Bilobalid wurde auf mitochondriale Prozesse zurückgeführt: Die nach Ischämie beobachteten Defizite in Komplex I der mitochondrialen Atmungskette wurden durch die Gabe von Bilobalid deutlich vermindert. Bilobalid verringerte außerdem den enormen Anstieg von extrazellulärem Glutamat und das Ausmaß der mitochondrialen Schwellung während MCAO.
In der Altersstudie wurde deutlich, dass sowohl die motorische Aktivität der Tiere als auch einige zelluläre Prozesse wie die mitochondriale Atmung beeinträchtigt sind. Nichtsdestotrotz zeigte Bilobalid auch in gealterten Tieren einen deutlichen protektiven Effekt nach Ischämie.
Das anaplerotisch wirksame Triheptanoin wurde den Mäusen in einer 14-tätigen Fütterungsstudie verabreicht (33 % der Gesamt-Kalorien). Deutliche Schutzeffekte der Triheptanoin-Diät wurden nach Ischämie sowohl in TTC-gefärbten Hirnschnitten als auch in motorischen Verhaltenstests beobachtet. Durch den anaplerotischen Effekt sollte einerseits der Citratcyclus mit Acetyl-CoA und Succinyl-CoA gespeist werden, andererseits könnte Succinat in Komplex II der Atmungskette als direkter Energielieferant dienen. Dieser theoretische Ansatz wurde experimentell bestätigt: Die Fütterung mit Triheptanoin bewirkte eine signifikante Aktivitätssteigerung der mitochondrialen Komplexe II und IV nach MCAO. Die durch Ischämie gesenkten ATP-Spiegel und das Membranpotential wurden durch die anaplerotische Diät ebenfalls deutlich erhöht. Triheptanoin bewirkte zudem eine signifikante Reduktion des extrazellulären Glutamat-Anstiegs wŠhrend der MCAO.
Die Auswirkungen eines Schlaganfalls wurden demnach sowohl durch die prophylaktische Gabe von Bilobalid eine Stunde vor Ischämie als auch durch die 14-tägige Triheptanoin-Diät maßgeblich vermindert. Beide Substanzen zeigten im Mausmodell bemerkenswerte neuroprotektive Effekte und könnten daher auch beim Auftreten eines humanen Schlaganfalls entscheidende Vorteile bringen. Der präventive therapeutische Einsatz von Bilobalid oder Triheptanoin sollte daher in klinischen Studien weiter verfolgt werden.
Meeting Abstract : 10. Deutscher Kongress für Versorgungsforschung, 18. GAA-Jahrestagung. Deutsches Netzwerk Versorgungsforschung e. V. ; Gesellschaft für Arzneimittelanwendungsforschung und Arzneimittelepidemiologie e. V. 20.-22.10.2011, Köln
Hintergrund: Multimedikation als Folge von Multimorbidität ist ein zentrales Problem der Hausarztpraxis und erhöht das Risiko für unangemessene Arzneimittel-Verordnungen (VO). Um die Medikation bei älteren, multimorbiden Patienten zu optimieren und zu priorisieren, wurde eine computergestützte, durch Medizinische Fachangestellte (MFA) assistierte, komplexe Intervention (checklistengestütztes Vorbereitungsgespräch sowie Überprüfung eingenommener Medikamente durch MFA, Einsatz des web-basierten ArzneimittelinformationsDienstes AiD, spezifisches Arzt-Patienten-Gespräch) entwickelt und in einer 12-monatigen Pilotstudie auf Machbarkeit getestet. Ein auf 9 Items reduzierter MAI [1] wurde eingesetzt, um dessen Eignung als potentielles primäres Outcome der Hauptstudie zu prüfen.
Material und Methoden: In die Pilotstudie in 20 Hausarztpraxen mit Cluster-Randomisation auf Praxisebene in Kontrollgruppe (Regelversorgung b. empfohlenem Standard) vs. Interventionsgruppe (komplexe Intervention b. empfohlenem Standard) wurden 5 Pat./Praxis eingeschlossen (≥65 Jahre, ≥3 chron. Erkrankungen, ≥5 Dauermedikamente, MMSE ≥26, Lebenserwartung ≥6 Monate). Zur Bewertung des MAI wurden an Baseline (T0), 6 Wo. (T1) & 3 Mon. (T2) nach Intervention erhoben: VO, Diagnosen, Natrium, Kalium & Kreatinin i.S., Größe, Gewicht, Geschlecht, Cumulative Illness Rating Scale (CIRS) [2] durch die Hausarztpraxis; Symptome für unerwünschte Arzneimittelwirkungen im Patienten-Telefoninterview.
Für den MAI wurde die Angemessenheit jeder VO in den 9 Kategorien Indikation, Effektivität, Dosierung, korrekter & praktikabler Applikationsweg, Arzneimittelwechselwirkung, Drug-disease-Interaktion, Doppelverordnung, Anwendungsdauer 3-stufig bewertet (1 = korrekt - 3 = unkorrekt) und für die Auswertung auf Patientenebene summiert. Die Bewertung erfolgte ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit. Deskriptive Statistiken und Reliabilitätsanalysen, ungewichtete Auswertung und Gewichtung n. Bregnhoj [3].
Ergebnisse: Es wurden N=100 Patienten in die Studie eingeschlossen, im Mittel 76 Jahre (Standardabweichung, SD 6; Range, R: 64-93) , 52% Frauen, durchschnittlich 9 VO/Pat. (SD 2; R 4-16), mittlerer CIRS-Score 10 (SD 4; R 0-23). Basierend auf N=851 VO (100 Pat.) zu T0 betrug der Reliabilitätskoeffizient (RK, Cronbachs Alpha) der ungewichteten 9 Items 0,70. Items 1-5 wiesen akzeptable Trennschärfen auf (0,52-0,64), die der Items 6, 7 & 9 fielen mit 0,21-0,29 niedriger aus, die des Item 8 betrug 0,06. Auf der Basis der 9 gewichteten Items fiel die interne Konsistenz des MAI erwartet höher aus (0,75). Die Reliabilitätsanalysen auf VO-Ebene zeigten einen RK von 0,67 (ungewichtet) vs. 0,75 (gewichtet), die Trennschärfen waren vergleichbar. Zur Zwischenauswertung betrug der MAI (T1-T0) in der Interventionsgruppe (5 Praxen, 24 Pat.) -0,9 (SD 5,6), in der Kontrollgruppe (7 Praxen, 35 Pat.) -0,5 (SD 4,9); die Differenz zwischen beiden Gruppen Mi–Mk -0,4 [95% Konfidenzintervall: -3,4;2,6].
Schlussfolgerung: Der MAI ist als potentielles primäres Outcome in der Hauptstudie geeignet: wenige fehlende Werte, Darstellung von Unterschieden prä-post und zwischen den Gruppen, akzeptable interne Konsistenz. Der niedrige Trennschärfekoeffizient des Items 8 weist darauf hin, dass dieses Item nicht mit dem Gesamt-Skalenwert korreliert, auch die Items 6, 7 und 9 korrelieren wesentlich schwächer mit dem Gesamt-Skalenwert als die Items 1 bis 5. Eine Wichtung z.B. der Items 2, 5, 6 und 9 könnte erwogen werden, um den Fokus der Intervention in der Hauptzielgröße angemessen abzubilden.
Schädigungen des Zentralnervensystems führen häufig zu schweren irreversiblen Schäden, die die Betroffenen vor große körperlichen und psychischen Herausforderungen stellen. Auf zellulärer Ebene ist bekannt, dass das Gehirn über protektive Mechanismen verfügt, die zwar nach der Schädigung aktiviert werden deren Potential jedoch nicht ausreicht, um den Schaden einzudämmen. Das Endocannabinoidsystem wurde mehrfach als ein solches protektives System bei ZNS Läsionen beschrieben. Zu den klassischen und gut untersuchten Endocannabinoiden (eCBs) wie Anandamid oder 2-AG kommen im Gehirn mehrere eCBs vor, deren physiologische und pathologische Bedeutung schwer einzuordnen ist. Das N-Arachidonyl-Dopamin (NADA) gehört zu dieser Gruppe und wirkt über bereits bekannte Cannabinoid Rezeptoren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Wirkung von NADA auf das Überleben der Körnerzellen im Gyrus dentatus im Modell der organotypischen hippokampalen Schnittkulturen (OHSC) untersucht. Weiterhin wurden die beteiligten Rezeptoren und die intrazellulären Signalkaskaden an neuronalen und gliösen Primärkulturen sowie Zelllinien analysiert. Nach der NMDA Schädigung kam es zum massiven Absterben der Neurone und einer deutlichen Zunahme der Zahl von Mikrogliazellen. NADA (100 pM-10 μM) hemmte den Prozess der neuronalen Schädigung und führte bei 1 nM und 1 μM zum Rückgang der Mikrogliaanzahl in geschädigten OHSC. Weiterführende Analysen ergaben, dass NADA Effekte über den Cannabinoid (CB)1 Rezeptor mediiert. Sowohl die abnCBD, CB2, TRPV1 und TRPA1 Rezeptoren als auch -als struktureller Bestandteil des NADA waren an den Wirkungen nicht beteiligt. Es ist bekannt, dass der TRPV1 Rezeptor eine große Rolle bei NADA mediierten Effekten in der Peripherie spielt. Das Vorkommen bzw. die funktionelle Aktivität des TRPV1 im ZNS ist Gegenstand kontroverser Diskussionen. TRPV1 konnte auf mRNA Ebene in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen (OHSC), Astrozyten, hippokampalen Neuronen und DRG (Spinalganglien) nachgewiesen werden. Mittels Calcium Imaging und Elektrophysiologie konnte an HEK293-TRPV1 Zellen NADA als Agonist des TRPV1 bestätigt werden. In allen untersuchten Zellen war jedoch die Funktionstüchtigkeit des TRPV1 Rezeptors mittels Calcium Imaging Messungen nicht nachweibar.
Im nächsten Schritt wurde geprüft, welche der klassischen mit dem Endocannabinoidsystem assoziierten Signalkaskaden an der NADA vermittelten Protektion teilnehmen. Die Signalkaskaden p38 und p44/42 MAPK wurden in den stimulierten und nichtstimulierten Zellen durch NADA nicht beeinflusst.
NADA gehört somit zur Gruppe der neuroprotektiv wirkenden Endocannabinoide, welches seine Effekte über den CB1 Rezeptor vermittelt. Im Schädigungsmodell des OHSC spielt der TRPV1 Rezeptor keine Rolle. Weitere intrazelluläre Signalkaskaden, wie der PLC Weg, bedürfen einer weitergehenden Analyse bezüglich ihrer Involvierung in NADA-vermittelte Effekte.
Sojabohnen sind aufgrund ihres hohen Proteingehaltes ein wichtiges Nahrungsmittel und insbesondere bei Kindern ein häufig austretendes allergenes Lebensmittel. Der einizige zur Zeit mögliche Schutz vor einer allergischen Reaktion auf Soja ist die strikte Vermeidung der Aufnahme. Die allergenen Substanzen sind Proteine und Glykoproteine. Es gibt eine Reihe von Produkten aus Soja, die kein oder nur geringe Mengen Protein enthalten, aber in zahlreichen Lebensmitteln enthalten sind. Die Prüfung der potenziellen Allergenität von solchen Produkten, wie z.B. Vitamin E aus Soja, ist von grundlegendem Interesse für allergische Personen. Vitamin E aus Soja wird vielen Produkten z.B. als Antioxidanz zugesetzt und müsste nach den rechtlichen Kennzeichnungsvorschriften als Allergen auf der Verpackung angegeben werden. Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war daher die Entwicklung von sensitiven und spezifischen Detektionmethoden für den Nachweis von Sojaprotein in Tocopherol (VitaminE) aus der Sojabohne. Aber auch die Charakterisierung von Sojaallergenen für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Methoden ist wichtig. Das zweite Ziel der Arbeit war somit die genauere Charakterisierung von β-Conglycinin (Gly m 5) als Sojaallergen sowie die Identifizierung der IgE-bindenden Bereiche des untersuchten Proteins. Zum Nachweis, dass in dem hoch prozessierten Sojaprodukt Tocopherol kein Sojaprotein mehr vorhanden war, wurden mehrere proteinbiochemische und immunologische Methoden entwickelt und validiert. Der sojaspezifische ELISA zur Detektion von hydrophilen Sojaproteinen aus der Tocopherolmatrix mit einer realen Nachweisgrenze von 10 ppm zeigte eine gute Reproduzierbarkeit. Die Detektion von lipophilen, denaturierten und hydrophilen Sojaproteinen aus Tocopherol im Immunoblot mit einer Nachweisgrenze von 20 ppm war ebenfalls gut reproduzierbar. Der etablierte IgE Immunoblot mit Sojaallergikerseren wies eine vergleichbare Sensitivität auf. In keiner der 10 untersuchten Tocopherolproben wurde mit den etablierten sensitiven sojaspezifischen Methoden Sojaprotein detektiert. Bei in vivo Studien von klinischen Partnern wurde bei Sojaallergikern weder eine Reaktion auf Tocopherol im Hauttest noch in der oralen Provokation von 500 mg Tocopherol beobachtet. Dass Gly m 5 ein wichtiges Sojaallergen ist und als diagnostischer Marker für schwere allergische Reaktionen genutzt werden kann, wurde in einer früheren Publikation unserer Arbeitsgruppe beschrieben. Die genauere Charakterisierung von Gly m 5 in dieser Arbeit zeigte, dass es ein Hauptallergen bei sojaallergischen Kindern und bei Sojaallergikern mit anaphylaktischen Reaktionen darstellt. Dabei zeigten alle Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker spezifisches IgE gegen eine der drei Gly m 5 Untereinheiten, das Gly m 5.03. Diese Untereinheit kann somit als diagnostischer Marker für eine Gly m 5 Sensibilisierung eingesetzt werden. Es konnte ebenfalls in dieser Arbeit bestätigt werden, dass die meisten Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker moderate bis schwere allergische Reaktionen zeigten und Gly m 5 somit einen potenziellen Marker für die Schwere einer Sojaallergie darstellt. Zur Identifizierung von IgE-bindenden Bereichen des Gly m 5 und des homologen Erdnussallergens Ara h 1 wurde die hoch sensitive und spezifische CelluSpot Technik etabliert, welche im Vergleich zur häufig angewendeten SPOT Membran-Technik nicht nur Zeit und Serumvolumen spart, sondern auch die individuelle Testung der Seren unter ständiger Mitführung von Positiv-und Negativkontrollen ermöglichte. Diese Methode stellt damit eine geeignete Technik zur Untersuchung von IgE reaktiven linearen Bereichen der Gly m 5 Untereinheiten und des Ara h 1 dar. Die Mehrheit der Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker besaß spezifisches IgE gegen sequenzielle synthetische Peptide der Gly m 5 Untereinheiten, wobei jedes Allergikerserum ein individuelles IgE Bindungsmuster zeigte. Zusammengefasst wurden fünf sequenzielle Regionen auf allen drei Gly m 5 Untereinheiten identifiziert, welche die größte IgE Bindungshäufigkeit aufwiesen. Alle fünf Bereiche waren zwischen 12-17 Aminosäuren groß und auf der Moleküloberfläche lokalisiert. Sie bildeten gemeinsam zwei zusammenhängende Bereiche in der Kernregion der Gly m 5 Moleküle und lassen vermuten, dass sie Teile von Konformationsepitopen darstellen. Zur Untersuchung einer möglicherweise vorhandenen serologischen Kreuzreaktivität zwischen den zwei Leguminosen Soja und Erdnuss, wurden sowohl Sojaallergiker mit Erdnussallergie als auch Erdnussallergiker ohne Sojaallergie auf Reaktivitäten gegen Peptide des Erdnussallergens Ara h 1 untersucht. Dabei wurden drei sequenzielle Bereiche identifiziert, die von der Mehrheit der Sojaallergiker, jedoch nur selten von den Erdnussallergikern erkannt wurden. Diese drei Bereiche wiesen eine Sequenzähnlichkeit zu den reaktivsten Bereichen der Gly m 5 Untereinheiten auf. Die Untersuchung von Allergikerseren auf Aminosäuresequenzebene könnte als diagnostische Methode zur Unterscheidung der klinischen Ausprägung einer Sojaallergie im Vergleich zur Erdnussallergie dienen und somit die Anzahl der risikobehafteten Nahrungsmittelprovokationen zur Bestätigung einer Sojaallergie senken. Die Identifizierung von B-Zell Epitopen ist eine wichtige Grundlage für die Herstellung von Hypoallergenen mit verringerter B-Zell Aktivität, bei gleichbleibender T-Zell-Aktivierung. Solche hypoallergenen Mutanten sind eine hoffnungsvolle Perspektive für eine Immuntherapie von Sojaallergikern, da sie womöglich das Risiko einer allergischen Reaktion während der Behandlung verringern können.
Das Gleichgewicht zwischen den Sphingolipiden Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt eine entscheidende Rolle für das Schicksal einer Zelle. Es ist bekannt, dass Ceramid proapoptotisch wirkt, wohingegen S1P antiapoptotische und entzündungshemmende Signalwege induziert [6]. Eine Beeinflussung der Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme sowie eine daraus resultierende gestörte Balance zwischen Ceramid und S1P ist somit ein Merkmal diverser entzündlicher Krankheiten wie der Asthma bronchiale, der Colitis ulcerosa [148] oder auch verschiedenen Arten von Tumoren [199]. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Ceramid-abbauenden neutralen Ceramidase (NCDase) und der S1P-synthetisierenden Sphingosinkinase 1 (SK1) in verschiedenen Nierenzellen. Ein Fokus wurde dabei auf die Regulierung dieser Enzyme durch entzündungshemmende Corticosteroide in Ratten Mesangiumzellen gelegt, wobei diese Zellen entscheidend in der Entstehung entzündlicher Nierenerkrankungen wie einer Glomerulonephritis sind. Weiterhin wurde der Einfluss der Mutation putativer Phosphorylierungsstellen der NCDase auf die Regulierung dieses Enzyms in HEK293 Zellen untersucht und in einem dritten Teil der Arbeit schließlich die Expression und die Funktion der SK1 in der humanen Niere im Vergleich zum Nierenzellkarzinom analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide (GCs) Mesangiumzellen durch eine Steigerung der intrazellulären S1P-Konzentrationen vor durch Stress induzierter Apoptose schützen. Diese Beeinflussung des Sphingolipid-Rheostats beruhte auf einer gesteigerten mRNA- und Proteinexpression der Sphingosinkinase 1 (SK1) und der neutralen Ceramidase (NCDase). Außerdem wurde nachgewiesen, dass der Promotor der NCDase durch GCs aktivierbar ist und dass zwei Glucocorticoid-responsive-Elemente (GREs) innerhalb der Promotorsequenz durch die Bindung von Glucocorticoidrezeptoren (GRs) diese Aktivierung bewirken. In vivo Experimente mit isolierten Glomeruli, die aus mit Dexamethason behandelten Mäusen gewonnen wurden, zeigten ebenfalls eine Erhöhung der mRNA-Expression und Aktivität der SK1 sowie eine gesteigerte Proteinexpression der NCDase. Somit wurde erstmals ein direkter Einfluss von GCs auf den Sphingolipidmetabolismus in Mesangiumzellen beschrieben.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation zweier putativer Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen (T253A und T420/23A) in der Sequenz der murinen NCDase zu einem verlangsamten Reifungsprozess dieses Enzyms führt. Western Blot-Analysen ergaben, dass der überexprimierte NCDase-WT zwei unterschiedlich glykosylierte Isoformen mit einem Molekulargewicht von 120 und 130 kDa exprimiert, welche stetig durch einen aktiven Prozess sezerniert werden. Im Gegensatz dazu war in den Mutanten ausschließlich die 130 kDa-Form im Zellkulturüberstand und die 120 kDa-Form im Lysat zu finden. Im Gegensatz zum WT lokalisierten die Mutanten lediglich an intrazellulären Membranen und nicht zusätzlich an der Plasmamembran. In Lysaten von Zellen die die Mutanten exprimierten, konnte eine verringerte relative Aktivität gemessen werden, die der sezernierten mutierten Formen hingegen war erhöht. Daher wurde vermutet, dass die 130 kDa-Form die reife Plasmamembran-gebundene und anschließend sezernierte, aktivere Isoform der NCDase darstellt. Die Inkubation von Mesangiumzellen mit Zellkulturüberständen, die den sezernierten NCDase-WT enthielten, führte zum Schutz vor durch Stress induzierter Apoptose. Somit kann eine auto- bzw. parakrine Funktion der sezernierten NCDase angenommen werden.
Dem dritten Teil der Arbeit lag die erstmalige Beschreibung der SK1-Expression in der gesunden humanen Niere zugrunde. Es konnte gezeigt werden, dass diese im Zytoplasma sowie an Membranen von Zellen des proximalen Tubulus sowie in geringerem Maße in Podozyten und Mesangiumzellen des Glomerulus exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wurde die SK1 in Biopsien von Patienten mit Nierentumor im Nukleus gefunden. Die Untersuchung der SK1-Expression in 5 verschiedenen Nierentumorzelllinien im Vergleich zu Epithelzellen des proximalen Tubulus (Human Kidney 2 - HK2-Zellen) ergaben, dass sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expression der SK1 in Föhn-Zellen stark erhöht, in ACHN3-Zellen hingegen signifikant niedriger war. Zudem konnte auch in den Föhn-Zellen eine nukleäre Expression der SK1 nachgewiesen werden. Die Behandlung von HK2-, ACHN3- und Föhn-Zellen mit dem Transforming Growth Factor-ß2 (TGF-ß2) resultierte in einer transkriptionellen Steigerung der SK1-Expression. Die Herunterregulierung der SK1 in diesen Zellen führte zu einem Arrest der Zellen in der S Phase, wohingegen die Überexpression der SK1 in den ACHN3-Zellen zu einem signifikanten Schutz vor Apoptose führte.
Zusammenfassend sind die Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme NCDase und SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit pathologischen Prozessen wie Entzündung, Apoptose und Proliferation einhergehen, wie es bei Glomerulonephritiden und bei Nierentumoren der Fall ist.
Einleitung: Glioblastome, die aggressivsten malignen Gehirntumore, gehören zu den menschlichen Karzinomen mit der schlechtesten Prognose. Ihre Therapie stellt eine große Herausforderung dar. Eine komplette chirurgische Entfernung des Tumors ist auf Grund des infiltrativen Wachstums in gesundes Hirngewebe meist nicht möglich, und trotz der Standardtherapie, die Operation, Chemo- und Radiotherapie umfasst, sind die Behandlungserfolge nicht zufriedenstellend. Erschwerend kommt hinzu, dass das Gehirn vom übrigen Organismus durch die hochselektive Blut-Hirn-Schranke abgegrenzt ist, welche für viele potentiell wirksame therapeutische Substanzen eine Permeabilitätsbarriere darstellt. Somit stehen viele Zytostatika für die systemische Glioblastomtherapie nicht zur Verfügung und eine relative Therapieresistenz ist zu verzeichnen.
Nicht nur die Neuentwicklung von Arzneistoffen für die Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie den Gehirntumoren, sondern auch die Etablierung neuer Arzneiformen zur kontrollierten, gewebsspezifischen Arzneistoffapplikation gewinnt immer mehr an Bedeutung.
Ein Ansatz, der in der Vergangenheit vielversprechende Erfolge erzielte, ist die Einbettung von Arzneistoffen in kolloidale Trägersysteme wie polymere Nanopartikel oder Liposome. Diese Carrier sind in der Lage verschiedene Arzneistoffe über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren, damit diese im zentralen Nervensystem ihre Wirkung ausüben können. Der Grund für diesen Erfolg ist offensichtlich begründet in der nanopartikulären Größe und der besonderen Oberflächenstruktur dieser Träger. Zusätzlich geht mit der vermehrten Anreicherung der Wirkstoffe im Zentralnervensystem eine Verminderung der unerwünschten Arzneimittelwirkungen in peripheren Organen einher, was die Therapie positiv beeinflusst.
In der vorliegenden Arbeit wird die antitumorale Effizienz nanopartikulärer Formulierungen, die den Wirkstoff Doxorubicin enthalten, eingehend untersucht. Hierbei liegt der Schwerpunkt auf der histologischen und immunhistochemischen Analyse der Gehirntumore, die eine genaue
Differenzierung zwischen den Zubereitungen und eine aussagekräftige Effizienzbeurteilung erlaubt. Weiterhin wird der Fokus dieser Arbeit auf die Quantifizierung der Doxorubicinmenge gerichtet, die nach Applikation der nanopartikulären Formulierungen im Gehirn vorliegt.
Enthält u.a. die Publikationen:
Publikation 1:
Transport of drugs across the blood-brain barrier by nanoparticles – A review
Journal of Controlled Release – Special Issue: Drug delivery research in Europe
Status: accepted, geplantes Erscheinungsdatum: 01.2012
Publikation 2:
Increased numbers of injections of doxorubicin bound to nanoparticles lead to enhanced efficacy against rat glioblastoma 101/8
Wohlfart et al. 2009, Journal of Nanoneuroscience, Volume 1, Number 2, December 2009, pp. 144-151 (8)
Publikation 3:
Treatment of glioblastoma with poly (isohexyl cyanoacrylate) nanoparticles
Wohlfart et al. 2011, International Journal of Pharmaceutics 415 (2011) 244-251
Publikation 4:
Drug delivery to the brain using surfactant-coated poly (lactide-co-glycolide)
nanoparticles: Influence of the formulation parameters
Gelperina et al. 2010, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 74 (2010) 157–163
Publikation 5:
Efficient chemotherapy of rat glioblastoma using doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles with different stabilizers
Wohlfart et al. 2011, PloS One May 2011, Volume 6, Issue 5, e 19121
Publikation 6:
Kinetics of transport of doxorubicin bound to nanoaprticles across the blood-brain barrier
Wohlfart et al. 2011, Journal of Controlled Release (2011),
doi:10.1016/j.jconrel.2011.05.010, in press
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie
(2010)
Bei chronischen Erkrankungen ist eine regelmäßige Arzneimitteleinnahme eine der Vo-raussetzungen für den Therapieerfolg. Trotzdem nehmen viele Patienten ihre Arzneimit-tel nicht wie vorgeschrieben ein. Dies kann im Rahmen von kardiovaskulären Erkrankun-gen (z. B. Hypertonie) schwerwiegende Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall haben. Es ist bekannt, dass die Therapietreue (Adhärenz bzw. Compliance und Persistenz) bei Hypertonikern nur bei 30 – 55 % liegt. Daher ist es von größter Wichtigkeit, die Therapie-treue und die Gründe für mangelnde Adhärenz zu erfassen, um danach gezielte Interven-tionen zur Verbesserung dieser entwickeln zu können. Allerdings liegen aus Deutschland zu dieser Thematik nur wenige Untersuchungen aus Feldstudien in Apotheken oder Ana-lysen aus Verordnungsdatenbanken vor.
Um die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Ermittlung der Therapietreue großflä-chig abzudecken, wurden unterschiedliche Erfassungswege genutzt. Zum einen wurde eine Patientenbefragung in öffentlichen Apotheken zur Erfassung der Adhärenz und Ein-nahmegewohnheiten unter medikamentöser Therapie mit Antihypertensiva durchge-führt. Zum anderen diente die Analyse von Verordnungsdaten der DAPI-Datenbank dazu, die Persistenz und Compliance von Patienten unter antihypertensiver Therapie zu be-stimmen. Als Spezialfall wurde weiterhin betrachtet, ob die Umstellung von einem Origi-nal- auf ein generisches Ramipril-Präparat nach dessen Patentauslauf mit einer vermin-derten Compliance einhergeht.
Die Patientenbefragung wurde sowohl von Patienten wie auch von den 24 teilnehmenden Apotheken gut angenommen. Dies zeigen die Rücklaufquoten der ausgegebenen Frage-bögen (46,8 % für die Befragung per zugesandtem Fragebogen (KF; kurze Form des Frage-bogens) und 32,8 % für das Interview in der Apotheke (LF; lange Form des Fragebogens)) Gemessen anhand des eingesetzten Adhärenz-Scores beschrieben sich 71,9 % der Patien-ten im LF und 58,2 % im KF selbst als adhärent. Der Bedarf für strukturierte, einfach durchführbare Adhärenz-Erfassungsinstrumente für die öffentliche Apotheke wurde sehr deutlich, wie u. a. der Abschlussbericht, welcher von den Apotheken nach Abschluss der Befragung ausgefüllt wurde, zeigte. Demnach hielten die Apotheken die Befragung von Umfang und Verständlichkeit für angemessen. Die Patienten waren bereit, detaillierte
Kapitel V Zusammenfassung V
Dissertation Miriam Ude
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie 160
Auskünfte über ihre Erkrankung zu geben. Dies zeigten auch die vielen in den Bogen ein-getragenen Anmerkungen seitens der Patienten und Apothekern, in denen individuelle Probleme dokumentiert wurden.
Bei der Analyse von Persistenz und Compliance im Substanzklassenvergleich wurde ein-drücklich gezeigt, dass die Therapietreue unter den First-line-Antihypertensiva (AHT) sub-optimal ist. Patienten unter der Therapie mit β-Blockern (77,3 %) weisen den geringsten non-persistenten Anteil auf, gefolgt von Patienten mit Verordnungen über ACE-Hemmer (78,7 %), AT1-Antagonisten (79,0 %), Calcium-Kanal-Blocker (81,4 %) und Diuretika (83,0 %). Hinsichtlich der Compliance findet sich in der Gruppe der mit AT1-Antagonisten be-handelten Patienten der niedrigste Anteil mit Non-Compliance (52,1 %), gefolgt von ACE-Hemmern (54,1 %), β-Blockern (54,7 %), Calcium-Kanal-Blockern (58,5 %) und Diuretika (63,6 %).
Die primäre Hypothese, dass die Compliance nach Umstellung von einem Ramipril-Original-Präparat nach dessen Patentauslauf auf ein Generikum signifikant abnimmt, konnte nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden für Patienten ermittelt, welche mit Ramipril-Monopräparaten, nur mit Fixkombinationen aus Ramipril mit einem Diuretikum, oder mit beidem (duale Therapie) behandelt wurden.
Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Projekte zeigen, dass die medikamentöse Therapietreue bei Patienten unter antihypertensiver Therapie in Deutschland verbesserungswürdig ist, und dass die Ermittlung der Adhärenz, Compliance und Persistenz von immenser Wichtigkeit ist. Trotz der unterschiedlichen gewählten An-sätze kongruieren die Ergebnisse sehr gut. Patienten benötigen Unterstützung in der Durchführung ihrer medikamentösen Therapie mit AHT, um gesteckte Therapieziele zu erreichen, welche dazu beitragen können, Morbidität und Mortalität zu verringern bzw. die Lebensqualität zu verbessern. Ein erster Schritt dazu ist das zielgerichtete Erkennen therapiebezogener Probleme. Da es hierfür in Deutschland bisher keine strukturierten Instrumente gibt, welche flächendeckend in den Apothekenalltag implementiert wurden, könnte das neu entwickelte und auf Machbarkeit getestete Befragungsinstrument ein Ansatz sein, die Patienten gezielt und zeitsparend nach ihren Problemen mit der Arznei-mitteleinnahme zu befragen und frühestmöglich intervenieren zu können.
In dieser Arbeit sollten auf Grundlage eines in vitro Transkriptions-/Translations-Assays (TTA) neue Substanzen als Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese gefunden werden. Um dieses Ziel verfolgen zu können, wurde zuerst ein zellfreies Testsystem aus kommerziellen Komponenten entwickelt und als Screening-Tool für Inhibitoren der bakteriellen Proteinbiosynthese evaluiert. Anhand des allgemein akzeptierten Bewertungskriteriums Z‘-Faktor konnte die Performance des etablierten Assays als exzellent eingeordnet werden. Mit diesem System war es nun möglich, Substanzen aus unterschiedlichen Quellen bei der Wirkstoffsuche als potentielle Antibiotika einzuordnen, welche die Proteinbiosynthese hemmen.
In zwei nachfolgenden Projekten wurde die Praktikabilität dieses neuen Assays bei der Auffindung möglicher Antibiotika-Kandidaten bewiesen. In dem ersten Ansatz wurde ein virtuelles Screening der Substanzdatenbanken Specs und Asinex anhand eines Pseudorezeptormodells für Aminoglykoside durchgeführt. In Kombination mit dem TTA sowie einem Ganzzell-Assay gegen den gram-positiven Keim Bacillus subtilis 168 konnte eine Struktur mit Ähnlichkeit zu Vanilloiden als interessanter Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen identifiziert werden. Die Entdeckung korreliert mit den antimikrobiellen Eigenschaften eines anderen Vanilloid, dem Capsaicin, für welches bisher aber keine Hemmung der Proteinbiosynthese in der Literatur beschrieben ist. Somit konnte gezeigt werden, dass anhand eines virtuellen Screenings sowie weiterer Assays neue Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese effizient und effektiv gefunden werden können. In einem zweiten Screening-Projekt dienten pflanzliche Naturstoffe als Substanzquelle. Hierfür wurden auf der Grundlage der diterpenoiden Fusidinsäure, einem Proteinbiosynthesehemmer (PBS-Hemmer), tetra-und pentazyklische Isoprenoide ausgewählt.
Aus einem Ensemble von terpenoiden Strukturen gingen nach TTA und einem zellbasierten Assay gegen Bacillus subtilis 168 in absteigender Aktivität die 18β-Glycyrrhetinsäure, 11-Keto-β-boswelliaäsure und Carnosolsäure als nennenswerte antimikrobiell wirksame Vertreter und PBS-Hemmer hervor. Auch zeigten sich diese Substanzen den Stoffen aus dem virtuellen Screening sowohl im TTA als auch in der Wirksamkeit gegen Bacillus subtilis 168 deutlich überlegen. Im nächsten Schritt erfolgte deshalb nur für diese drei Terpenoide eine Charakterisierung ihrer Auswirkungen auf das Proteom des gram-positiven Bakteriums Bacillus subtilis 168.
Dafür wurde eine komplette zweidimensionale gelelektrophoretische Methodik basierend auf der Differentiellen Gelelektrophorese (DIGE) etabliert. Sie umfasst eine Strategie zur schnellen Evaluierung der optimalen Anzucht des Testkeims Bacillus subtilis 168 unter Einfluss einer antimikrobiell wirksamen Substanz und ein einfaches Aufschlussverfahren, um einen kompatiblen Proteinextrakt für DIGE zu erhalten. Außerdem wurde ein preisgünstiges Markierungsverfahren mit dem 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimid-Ester als Alternative zu den teuren DIGE-Cyan-Farbstoffen entwickelt, um die Fluoreszenzbildqualität eines neuen unbekannten Extraktes vor dem eigentlichen kostspieligen DIGE-Versuch zu überprüfen. Eine Quantifizierung regulierter Spots im Gel ist mit diesem billigen Verfahren ebenfalls möglich, stellt aber keinen Ersatz für den DIGE-Versuch dar.
Die Ergebnisse der quantitativ vergleichenden Proteomanalyse vom behandelten und unbehandelten Bacillus subtilis 168 mittels DIGE bieten erstmals einen Einblick in die Einflussnahme der drei Terpenoide 18β-Glycyrrhetinsäure, 11-Keto-ß-boswelliaäsure und Carnosolsäure auf die Stressregulation und die Stoffwechseländerungen dieses Bakteriums.
Außerdem beinhaltet die Arbeit einen Abgleich, inwieweit andere antimikrobiell wirksame Substanzen die regulierten Proteine der drei untersuchten Naturstoffe bei Bacillus subtilis 168 beeinflussen können. Aus den erhobenen Daten konnte dann ein Wirkmechanismus für 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure postuliert werden. 18β-Glycyrrhetinsäure greift wahrscheinlich am membranständigen Lipid-II-System der bakteriellen Zellwand an, da wie bei den Antibiotika Vancomycin, Nisin, Daptomycin, Ramoplanin und Bacitracin das Zellwandstress-Regulationsnetzwerk (LiaRS-System) als Warnsystem aktiviert wird. Außerdem konnte für 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure eine Theorie für Ihre PBS-Hemmung entwickelt werden. Beide beeinflussen gegebenenfalls die GTPase-Aktivität des Translationsfaktors EF-G durch Interaktion mit dem ribosomalen Bindezentrum für Translationsfaktoren. Dieses Bindungszentrum ist neben der dekodierenden Region auf der ribosomalen 30S-Untereinheit und dem Peptidyltransferase-Zentrum auf der ribosomalen 50S-Untereinheit eine extrem wichtige Region für die Funktionalität eines Ribosoms. Fusidinsäure greift auch an dieser Stelle an, indem es den EF-G-GDP-Ribosomkomplex stabilisiert. Natürlich wären weitere Studien nötig, z. B. eine Röntgenstrukturanalyse der Ribosomen von 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure behandelten Bakterien, um die Bindestelle für die PBS-Hemmung zweifelsfrei zu bestätigen.
Bei Entzündung oder Verletzung peripherer Gewebe und Nerven kommt es zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im schmerzleitenden System. Welche ROS-generierenden Systeme hierbei beteiligt sind, ist jedoch nur ansatzweise verstanden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die ROS-produzierende NADPH Oxidase 4 (Nox4) einen wichtigen ROS-Generator im nozizeptiven System darstellt. Nox4 wird in unmyelinisierten nicht-peptidergen sowie in myelinisierten primär afferenten Neuronen exprimiert. In Modellen für akute und inflammatorische Schmerzen zeigten Nox4-/--Mäuse ein ähnliches Verhalten wie ihre wildtypischen Wurfgeschwister, jedoch war ihr Schmerzverhalten in Modellen für neuropathische Schmerzen reduziert. Eine Microarray-Analyse des lumbalen Rückenmarks nach peripherer Nervenverletzung zeigte eine Hochregulation der Expression Myelin-spezifischer Gene in Wildtyp-, nicht aber in Nox4-/- Mäusen. Darüber hinaus wurden in Wildtyp-Mäusen Myelin-spezifische Proteine im N. ischiadicus nach peripherer Nervenverletzung herab reguliert, während in Nox4-/--Mäusen keine Regulation dieser Proteine beobachtet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nox4 eine essentielle Rolle bei Myelinisierungsprozessen spielt und so die Verarbeitung neuropathischer Schmerzsignale beeinflusst.
Neben dem ROS-produzierenden System Nox4 wurde auch die Rolle des Peroxid-abbauenden Proteins Sestrin 2 (Sesn2) im nozizeptiven System untersucht. Nach peripherer Nervenverletzung wurde Sesn2-mRNA in den Spinalganglien und Sesn2-Protein im peripheren Nerv hochreguliert. Sesn2-/--Mäuse zeigten ein normales Verhalten in Modellen für akute und inflammatorische Schmerzen. Ihr Schmerzverhalten war jedoch im Formalin-Test und nach peripherer Nervenverletzung verstärkt.
Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass sowohl Nox4 als auch Sesn2 bei der Verarbeitung neuropathischer Schmerzsignale wichtige Funktionen einnehmen. Während Nox4 pronozizeptiv wirkt, weist Sesn2 antinozizeptive Effekte auf. Die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies scheint daher ein wichtiger endogener Faktor der Sensibilisierung im Rahmen von neuropathischen Schmerzen zu sein.
Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Teilaspekte des S1P-Signalsystems näher untersucht. Der erste Teil der Arbeit geht der Frage nach, welche Störungen das Ausschalten der S1P-Lyase in der Ca2+-Homöostase verursacht. Die Messung der zellulären Lipidkonzentrationen ergab in Sgpl1-/--MEFs einen sechsfach höherer Wert für S1P und einen doppelt so hohen Wert für Sphingosin als in den Sgpl1+/+-MEFs. [Ca2+]i wurde an Einzelzellen mit Hilfe des Proteinfarbstoffs Cameleon untersucht, wobei [Ca2+]i-Anstiege durch den SERCA-Inhibitor Thapsigargin induziert wurden. So konnte gezeigt werden, dass sowohl in Sgpl1+/+-MEFs als auch in Sgpl1-/--MEFs zwei verschiedene Subtypen existieren, die sich hinsichtlich Geschwindigkeit und Ausmaß des [Ca2+]i-Anstiegs unterscheiden. Die basale [Ca2+]i war im Subtyp der Sgpl1-/--MEFs mit einem schnellen und kurzen [Ca2+]i-Anstieg signifikant erhöht, während das Maximum des Thapsigargin-induzierten [Ca2+]i-Anstiegs im Subtyp der Sgpl1-/--MEFs mit einem langsamen und langen [Ca2+]i-Anstieg signifikant erhöht war. Die AUC des Zeitverlaufs nach der Stimulation mit Thapsigargin war in beiden Subtypen der Sgpl1-/--MEFs signifikant erhöht, was bedeutet, dass der Ca2+-Gehalt der Thapsigargin-sensitiven Speicher in Sgpl1-/--MEFs höher als in Wildtyp-MEFs war.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Aspekte der Modulation des S1P-Signalsystems durch das Sphingosin-Analogon cis-4-Methylsphingosin näher untersucht. Die Messung der Lipidkonzentrationen von cis-4-Methylsphingosin und dem Phosphorylierungsprodukt cis-4-Methyl-S1P erfolgte dabei in HEK-293-Zellen und deren Überständen mittels LC-MS/MS. Hierbei wurde erstmals cis-4-Methyl-S1P im Zellkulturüberstand nachgewiesen, was bedeutet, dass cis-4-Methylsphingosin nach der intrazellulären Phosphorylierung sezerniert werden kann. Dieser Mechanismus bildet die Grundlage dafür, dass cis-4-Methylsphingosin nicht nur intrazellulär wirken, sondern ebenso wie FTY720 als S1P-Rezeptor-Modulator fungieren kann. Der dritte und umfangreichste Teil der Arbeit befasst sich mit der Regulation der SK1 durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Um die Rolle von Gαq/11-Proteinen bei der Ansteuerung der SK1 durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren weiter zu analysieren, wurde zunächst die Rezeptor-induzierte Translokation der SK1 in MEFs untersucht, die sowohl in Gαq als auch in seinem Homolog Gα11 doppelt defizient waren (Gαq/11 -/--MEFs). Die SK1-Translokation war nur nach Transfektion mit Gαq möglich. Um Hinweise auf die strukturellen Erfordernisse für die SK1-Ansteuerung durch Gαq zu erhalten, wurde der Einfluss verschiedener Gαq-Mutanten auf die Translokationshalbwertszeit der SK1 untersucht. So waren alle untersuchten Mutanten in der Lage, die SK1-Translokation in Gαq/11-/--MEFs zu vermitteln. Die Expression der Gαq-W263D-Mutante führte dabei zu einer signifikant verlangsamten SK1-Translokation. Die durch Gαq-T257E-vermittelte Translokation war erst nach mehreren Minuten feststellbar. Die Abhängigkeit der SK1-Translokation von Gαq wurde auf zellulärer Ebene durch Coexpression einer katalytisch inaktiven Mutante der G-Protein gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2) als Gαq-scavenger in HEK3-Zellen nachgewiesen. Dies führte zu einer vollständigen Inhibierung der Carbachol-induzierten SK1-Translokation. Hingegen führte die Überexpression der SK1 in den M3-Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen zu einer reduzierten Carbachol-induzierten Aktivierung der PLCβ. Dieser Effekt war unabhängig von der katalytischen Aktivität der SK1. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die SK1 mit den Effektoren GRK2 und PLCβ um gemeinsame Bindungsstellen der aktivierten G-Protein Untereinheit Gαq konkurriert. Zusätzlich wurde die direkte Interaktion zwischen Gαq und SK1 auf Proteinebene mittels optischer Thermophorese nachgewiesen. Dazu wurde die humane SK1 als N-terminal getaggtes His6-MBP-Fusionsprotein exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. So konnte gezeigt werden, dass die mit dem Fluoreszenzfarbstoff NT647-markierte hSK1 (hSK1*) mit dem TNF Rezeptor-assoziiertem Faktor 2 (TRAF2), nicht jedoch mit dem N-terminalen Fragment des TRAF family member-associated NF-kappa-B activator (TANK) interagierte. Sowohl inaktives Gαq als auch [AlF4]--aktiviertes Gαq interagierten mit der hSK1* mit einem vergleichbaren kD-Wert. Auch mit NT-647-markiertes Gαq interagierte mit der hSK1 sowohl in der inaktiven als auch in der [AlF4]--aktivierten Form, wohingegen es nicht mit TANK oder TRAF2 interagierte.
Insgesamt zeigen die erhaltenen Daten, dass die SK1 ein direktes Target von Gαq ist und sie an genau dieselben Gαq-Reste bindet, an die auch die klassischen Effektoren PLCβ, p63RhoGEF und GRK2 binden.
Im Rahmen der in dieser Arbeit vorgestellten Daten konnten zwei Erkenntnisse gewonnen
werden:
1. Der Einsatz volatiler Anästhetika bei der Narkose erhöht die extrazellulären Laktatspiegel im
Gehirn der Maus.
2. Die Applikation von Laktat entfaltet neuroprotektive Wirkung im fokalen Schlaganfallmodell
der Maus und zwar in Abhängigkeit von dem für das Modell verwendete Anästhetikum.
Im 1. Teil der Arbeit wurde in ersten Voruntersuchungen mit Hilfe der Mikrodialysetechnik
ein starker Anstieg extrazellulärer Laktatspiegel im Gehirn von Mäusen unter einer Narkose mit
Isofluran detektiert. Ein Kernthema dieser Arbeit war die Untersuchung der neuroprotektiven
Wirkung von Laktat im Schlaganfallmodell der Maus. Da dieses Modell zwingend eine Narkose
erforderte und Isofluran eine deutliche Wirkung auf den zerebralen Laktatstoffwechsel aufwies,
wurden die metabolischen Wirkungen weiterer, in der tierexperimentellen Forschung gebräuchlichen,
Anästhetika untersucht.
In mehreren Mikrodialyseexperimenten wurden die metabolischen Wirkungen inhalativer
(Sevofluran, Isofluran und Halothan) und injizierbarer Anästhetika (Ketamin/Xylazin, Chloralhydrat,
Propofol und Pentobarbital) auf die extrazellulären Glukose- und Laktatspiegel im
Gehirn von Mäusen untersucht. In separaten Versuchen wurde für das jeweilige Anästhetikum
zusätzlich die Glukose- und Laktatwerte im Blut und CSF der Tiere bestimmt. Begleitet wurden
diese Versuche mit der Untersuchung physiologischer Parameter (Blutgase und zerebraler Blutfluss)
innerhalb der Narkose mit verschiedenen Anästhetika. Abschließend wurde in einem in
vitro-Experiment mit inkubierten Hirnschnitten die lokale, metabolische Wirkung von Isofluran
untersucht.
Die Experimente zeigten, dass volatile Anästhetika spezifisch die extrazellulären Laktatwerte
im Gehirn von Mäusen erhöhen (um das 3-4 fache) und so eine metabolische Wirkung auf den
zerebralen Laktatstoffwechsel besitzen, welcher bisher in der Literatur nicht beschrieben worden
ist. Mit dem Vergleich der Laktatdaten aus den CSF/Blut-proben, aus den in vitro-Versuchen,
sowie aus der Analyse der physiologischen Parameter konnte zusammenfassend folgendes festgestellt
werden: die durch inhalative Anästhetika induzierte Laktaterhöhung ist dosisabhängig, tritt
unabhängig von peripheren Einflüssen lokal im Gehirn auf und wird weder durch eine Hypoxie
noch durch eine Hypotension verursacht. Injizierbare Anästhetika (Ketamin/Xylazin, Chloralhydrat
und Propofol) besaßen diese Wirkung auf die Laktatwerte nicht und fielen vielmehr durch
eine moderate Erhöhung der Glukosekonzentrationen (um das 1,5-2 fache) im Blut und Extrazellularraum
des Gehirns auf, die wiederum bei den volatilen Anästhetika nicht zu beobachten war.
Nur Pentobarbital zeigte als einziges Anästhetikum keine Veränderungen in den extrazellulären
Glukose- und Laktatwerten im Gehirn der Tiere und verminderte sogar die Laktatspiegel im
Blut.
Ausgehend von den durchgeführten Untersuchungen wird für inhalative Anästhetika die
Stimulation von „Two-pore“-Kaliumkanälen als Ursache für die Erhöhung der extrazellulären
Laktatwerte vermutet. Dieser stellt für die Gruppe der volatilen Anästhetika einen spezifischen
Wirkmechanismus dar. Andere Wirkmechanismen von Anästhetika wie der NMDA-Rezeptor-
Antagonismus und der GABA-Rezeptor-Agonismus konnten ausgeschloßen werden, da eine Erhöhung
der extrazellulären Laktatspiegel im Gehirn der Tiere unter Ketamin/Xylazin- und
Pentobarbitalnarkose nicht auftrat. Der genaue Wirkmechanismus muss aber in weiteren Versuchen
näher geklärt werden.
Die aus den Mikrodialysedaten gewonnenen Erkenntnisse bildeten eine wichtige Grundlage
für ein besseres Verständnis der Schlaganfallexperimente und deren Zusammenhang zwischen
Laktat, Neuroprotektion beim Schlaganfall und der zerebralen, metabolischen Wirkung einzelner
Anästhetika.
Im 2. Teil der Arbeit wurde, als eine der ersten Arbeiten, die neuroprotektive Wirkung von
Laktat im permanenten und transienten Schlaganfallmodell der Maus getestet. Dies bot sich vor
dem Hintergrund der derzeit stattfindenden Neuinterpretation des Laktats als wichtigem Energiemetabolit
an.
Für den Schlaganfall in der Maus wurde ein silikonbeschichteter Nylonfaden verwendet, mit
welchem die mittlere Zerebralarterie der Tiere verschlossen wurde. Im permanenten Schlaganfallmodell
verblieb der implantierte Faden die gesamte Zeit über im Gehirn der Maus, während
beim transienten Modell der Faden nach einer gewissen Okklusionszeit (30-60 min) wieder
entfernt und der zerebrale Blutfluss wieder hergestellt wurde. Laktat (250 mg/kg) wurde im
permanenten Modell zu unterschiedlichen Zeitpunkten (45, 30, 15 min vor und 15 min nach
der Okklusion) intraperitoneal verabreicht. Als Anästhetika kamen Isofluran und Pentobarbital
zum Einsatz. Die Applikation im transienten Modell erfolgte direkt nach der wiederhergestellten
Reperfusion ebenfalls intraperitoneal. Hierbei kamen Isofluran und Ketamin/Xylazin als Anästhetika
zum Einsatz. Einen Tag später wurde für jedes Tier das allgemeine Verhalten, die
motorische Koordination im Cornertest sowie der Gewichtsverlust dokumentiert. Anschließend
wurde das Gehirn entnommen, eine TTC-Färbung durchgeführt und das Infarktvolumen und
der Schweregrad des Infarkts anhand der Graustufendifferenz bestimmt.
Eine neuroprotektive Wirkung des Laktats konnte sowohl im permanenten und als auch
im transienten Schlaganfallmodell der Maus nachgewiesen werden. Im permanenten Modell war
unter Isoflurannarkose eine neuroprotektive Wirkung erkennbar, die sich durch Reduktion des
Infarkvolumens, Verminderung der Graustufendifferenz sowie eine Reduktion des Gewichtsverlusts
bei Gabe von Laktat (30 und 15 min vor der Okklusion) nachwiesen ließ. In der allgemeinen
Verhaltensanalyse und im Cornertest war kein signifikanter Unterschied zu erkennen. Unter
Pentobarbitalnarkose trat diese Form der Neuroprotektion nicht auf. Im transienten Schlaganfallmodell
war eine Neuroprotektion des Laktats (bei Gabe direkt nach der Reperfusion) sowohl
unter Isofluran- als auch unter Ketamin/Xylazin-Narkose nachzuweisen. Diese äußerte sich in der
Reduktion des Infarktvolumens und der Graustufendifferenz. Eine Veränderung in der Reduktion
des Gewichtverlustes, in der allgemeinen Verhaltensanalyse und im Cornertest war jedoch nicht
zu sehen. Unter Bezugnahme der Mikrodialysedaten verschiedener Anästhetika, ist festzustellen,
dass die neuroprotektive Wirkung des Laktats davon abhängt, welches Anästhetikum zum
Einsatz kommt und wie dieses den Laktatstoffwechsel moduliert. So war eine Neuroprotektion
durch Laktat unter Verwendung von Anästhetika feststellbar, die die peripheren Laktatspiegel im
Blut erhöhen (Isofluran) oder nicht beeinflussen (Ketamin/Xylazin). Bei Pentobarbital, welches
die peripheren Laktatwerte im Blut der Tiere verminderte, zeigte die exogene Laktatgabe keine
Wirkung.
Die Experimente konnten also nachweisen, dass Laktat neuroprotektive Wirkungen im Schlaganfallmodell
von Mäusen besitzt.Weiterführende Versuche bieten sich hier an, um Aussagen über
die optimale Dosierung und den geeignetsten Therapiezeitpunkt zu ermöglichen, bevor eine Untersuchung des klinischen Nutzens beim Menschen sinnvoll erscheint.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Epoxyeicosatriensäuren (EETs) hinsichtlich ihrer Beteiligung an der Verarbeitung nozizeptiver Information untersucht. Im ersten Teil der Arbeit lag der Fokus auf der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) und der drei von ihr metabolisierten EETs, 8,9-, 11,12-, und 14,15-EET. Dabei stellte sich heraus, dass sEH-defiziente Mäuse eine verlängerte mechanische Hyperalgesie bei zymosan-induziertem pathophysiologischen Nozizeptorschmerz aufwiesen. Anhand von Lipidmessungen mittels LC-MS/MS konnte gezeigt werden, dass zum Zeitpunkt des stärksten Schmerzempfindens (48 Stunden nach Zymosan-Injektion) vorwiegend 8,9-EET in den Dorsalwurzelganglien der sEH-defizienten Mäuse akkumuliert. Zudem wurde anhand von Calcium-Imaging-Versuchen gezeigt, dass 8,9-EET Calcium-Einströme in primär afferenten Neuronen von Wildtyp-Mäusen hervorruft, und eine Stimulation von Ischiasnerven mit 8,9-EET zu erhöhter Freisetzung des pronozizeptiven Peptids CGRP führt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass Wildtyp-Mäuse nach intraplantarer 8,9-EET-Injektion eine geringere mechanische Schmerzschwelle aufweisen. Die Resultate dieses Teils der Arbeit weisen darauf hin, dass die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) eine wichtige Rolle in der späten Phase des pathophy-siologischen Nozizeptorschmerzes spielt, indem sie 8,9-EET zu seinem bioinaktiven Metaboliten 8,9-DHET umsetzt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde 5,6-EET gesondert untersucht, da es nicht durch sEH metabolisiert wird. Dabei wurde beobachtet, dass 5,6-EET bei akutem Schmerz in DRGs freigesetzt wird. In Calcium-Imaging-Versuchen mit DRG-Neuronen aus Wildtyp- TRPV4- und TRPA1-defizienten Mäusen sowie transfizierten Zelllinien zeigte sich, dass schon geringe Konzentrationen an 5,6-EET den TRPA1- (transient receptor potetntial ankyrin 1-) Kanal aktivieren (EC50 193 nM) und den TRPV1-Kanal sensibilisieren können. Auch die CGRP-Freisetzung am Ischiasnerv ist nach 5,6-EET-Stimulation signifikant erhöht. Zudem konnte beobachtet werden dass eine periphere Injektion von 5,6-EET zu akuter mechanischer Hyperalgesie in Wildtyp-, aber nicht in TRPA1-defizienten Mäusen führt. Die Resultate dieses Teils der Arbeit weisen 5,6-EET als bisher potentesten endogenen TRPA1-Aktivator aus, und implizieren eine wichtige Rolle dieses Lipids beim Übergang von physiologischem zu pathophysiologischem Nozizeptorschmerz und zu neruogener Inflammation. Darüber hinaus leisten die Resultate einen Beitrag zum grundlegenden Verständnis endogener TRP-Kanal-Aktivatoren bei der Schmerzwahrnehmung.
Mit einer Prävalenz von rund 5% bildet das Hereditäre Nonpolypöse Kolorektalkarzinom (HNPCC), auch Lynch Syndrom genannt, die häufigste genetische Disposition unter allen Kolorektalkarzinomen in Deutschland. Das Lynch Syndrom wird autosomal-dominant vererbt und tritt im Schnitt bereits ab dem 44. Lebensalter auf, während die Mehrheit der Kolorektalkarzinome erst mit 63 Jahren diagnostiziert wird. Ein wichtiges Merkmal sind sogenannte HNPCC-assoziierte Malignome, welche sich außerhalb des Dickdarms befinden. Die Diagnose gestaltet sich allerdings relativ schwierig, da bei Lynch Syndrom-Patienten kein eindeutiger klinisch auffälliger Phänotyp vorliegt und die Diagnosestellung nur in Zusammenhang mit einer Familienanamnese des Patienten möglich ist.
Mittlerweile ist bekannt, dass für das charakteristische Auftreten von hochgradigen Mikrosatelliteninstabilitäten im Tumorgewebe ein defektes DNA-Mismatch-Reparatursystem verantwortlich ist. Diese Defekte treten vor allem in den Genen MLH1, MSH2, MSH6 oder PMS2 auf und können über die Keimbahn vererbt werden.
Das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 wurde im Jahr 2009 publiziert, nachdem es bei einer Familie aus Französisch-Guyana gehäuft identifiziert wurde. Mehrere Familienmitglieder waren an unterschiedlichen Krebsarten erkrankt, und die Tatsache, dass neben Dickdarmtumoren auch synchrones und metachrones extrakolonisches Tumorwachstum auftrat, ließen den Schluss einer positiven Familienanamnese für das Lynch Syndrom zu. Auffällig war jedoch, dass das Spektrum dieser extrakolonischen Tumoren nicht im Einklang mit den typischen HNPCC-assoziierten Malignomen stand. Daher lag die Vermutung nahe, dass das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 für diesen Phänotyp verantwortlich ist.
Das dem zugrundeliegende Fusionsgen MLH1•ITGA9 ist das Resultat einer interstitiellen Deletion auf Chromosom 3p21.3. Es kodiert für den N-Terminus des Mismatch-Reparaturgens MLH1 sowie den C-Terminus des rund 400 kb downstream gelegenen Integrin α9. Aufgrund der fehlenden nukleären Lokalisationssequenz und weiterer wichtiger im C-Terminus gelegenen Domänen des MLH1-Proteins ist davon auszugehen, dass es außer Stande ist, Basenfehlpaarungen zu reparieren; ebenso sollte das Fusionsprotein theoretisch keine Funktionen des Wildtyp Integrin α9 mehr ausüben können.
Diese Annahmen konnten durch diverse Versuche wie Zelladhäsions- und Zellmigrationsassays bestätigt werden; das Fusionsprotein hatte dabei keinerlei Einfluß auf das Adhäsions- oder Migrationsverhalten unterschiedlicher Zelllinien.
Bezüglich der Lokalisation von MLH1•ITGA9 wurde über Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der fehlenden nuklären Lokalisationssequenz im MLH1-Proteinteil der Nachweis erbracht, dass sowohl das Fusionsprotein als auch seine Variante MLH1∆ (bestehend aus dem MLH1-Teil) lediglich im Zytoplasma, und nicht wie der Wildtyp auch im Zellkern, zu finden ist.
Desweiteren zeigten Co-Immunopräzipitationsexperimente eine Interaktion zwischen dem Fusionsprotein und MLH1∆ mit dem Tumorsuppressor BRCA1. Die Folgen dieser Interaktion wurden auf translationeller und Proteinebene mit dem Ergebnis untersucht, dass Zellen, welche das Fusionsprotein oder seine trunkierte Variante MLH1∆ exprimieren, nach Etoposidstimulierung teilweise in gravierendem Ausmaß einen negativen Einfluss auf die p53-abhängige DNA-Reparaturmaschinerie aufweisen. Dies zeigte sich besonders deutlich auf transkriptioneller Ebene in einer bis zu 96%igen Herunterregulierung wichtiger Zellzyklus- sowie proapoptotischer Gene. Die durchflusszytometrische Analyse dieser Zellen zeigte außerdem eine höhere Apoptoseresistenz nach Etoposidstimulierung im Vergleich zu Wildtyp-MLH1 exprimierenden Zellen.
Morbus Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung, die weltweit die häufigste Ursache einer Demenz darstellt. Da neben genetischer Prädisposition vor allem ein hohes Lebensalter einen Hauptrisikofaktor für die Erkrankung darstellt, erwartet man für die Industrieländer in den nächsten Jahrzehnten eine enorm ansteigende Patientenzahl. Trotz der großen Fortschritte in der Aufklärung der pathologischen Zusammenhänge ist es bisher noch nicht gelungen, eine Therapie zu entwickeln, mit der das Voranschreiten der Krankheit deutlich verlangsamt oder sogar gestoppt werden kann. Die vorliegende Arbeit verfolgt einen medizinisch-chemischen Ansatz, in der die Entwicklung von dualen Gamma-Sekretase- und PPARgamma (Peroxisomen Proliferator-aktivierter Rezeptor Gamma)-Modulatoren als potentielle Arzneistoffe gegen Morbus Alzheimer im Fokus steht. Bei der Gamma-Sekretase handelt es sich um eine Aspartylprotease, die im Rahmen der Amyloid-Kaskade an der carboxyterminalen Spaltung von Amyloid Precursor Protein und damit unmittelbar an der Bildung der pathogenen Amyloid-Gamma42-Fragmente beteiligt ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diverse Punktmutationen in ihrer katalytischen Untereinheit Presenilin eine genetisch bedingte early-onset Alzheimer-Demenz auslösen können. Das therapeutische Potential von Gamma-Sekretase-Inhibitoren und -Modulatoren konnte in der Folge in zahlreichen präklinischen Studien bestätigt werden. ...
Die N- und O-Glykosylierung von Proteinen ist gekennzeichnet durch eine hohe strukturelle und funktionelle Komplexität. Da verschiedene Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen selbst innerhalb eines Proteins unterschiedliche Aufgaben erfüllen können, ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Pharma-Industrie eine stellenspezifische Analytik zur Aufklärung der biologischen Bedeutung und bei therapeutischen Proteinen zur Gewährleistung von Sicherheit und gleichbleibenden pharmakologischen Eigenschaften essentiell. Die niedrige Abundanz sowie die hohe Komplexität durch die variablen Glykanzusammensetzungen und Verzweigungsmöglichkeiten sowie der daraus resultierende Mikroheterogenität an jeder einzelnen Stelle stellt jedoch eine besondere Herausforderung an die Analytik dar. In dieser Arbeit wurden deshalb auf verschiedenen Ebenen der Probenvorbereitung, der chromatographischen Separation sowie der MS-Analyse- Methoden und Techniken entwickelt und charakterisiert, um die stellenspezifische Analytik der Proteinglykosylierung zu vereinfachen.
In einem ersten Schritt wurde die hohe Komplexität eines Glykoproteinverdaus reduziert. Es wurden verschiedene Methoden zur Glykopeptidanreicherung miteinander verglichen, wobei sich die HILIC-Festphasenextraktion unter optimierten Bedingungen durch eine sehr hohe Selektivität und Effizienz auszeichnete. Zur Methodenoptimierung wurden verschiedene HILIC-Materialien (Silika, Amino, Mikrokristalline Cellulose, TSKgel Amide-80 und ZIC®-HILIC) eingesetzt und durch eine Variation der Anreicherungsbedingungen die Hauptretentionsmechanismen für jedes Material beschrieben. TSKgel Amide-80 sowie ZIC®-HILIC sind am besten geeignet, da unter optimierten Bedingungen sekundäre Retentionsmechanismen wie elektrostatische Wechselwirkungen deutlich reduziert werden und die hydrophile Verteilung den Hauptretentionsmechanismus darstellt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Parameter wie die Pufferzusammensetzung, Inkubationszeiten und die Volumenverhältnisse zwischen HILIC-Suspension, Binde-, Wasch- und Elutionspuffer entscheidend die Reproduzierbarkeit, Ausbeute und Selektivität beeinflussen. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen wurde ein Protokoll entwickelt, mit welchem Glykopeptide selektiv und quantitativ, d.h. ohne Präferenz für bestimmte Glykanstrukturen, aus komplexen Proben angereichert werden können. In Kombination mit Titandioxid zur selektiven Anreicherung sialylierter Glykopeptide bei bestimmten Fragestellungen ermöglichten in dieser Arbeit beide Methoden eine detaillierte Charakterisierung sowohl von N- als auch von O-Glykopeptiden. Die Hydrazinchemie erwies sich aufgrund eines zu komplexen Arbeitsschemas und einer unzureichenden Wiederfindung als nicht geeignet.
Da je nach Aminosäuresequenz oft mit einer einzigen Protease (z.B. Trypsin) nicht alle Glykosylierungsstellen aufgrund ihrer Eigenschaften (z.B. Größe, Hydrophobizität) für die Anreicherung und LC-MS-Analyse zugänglich sind, kamen in dieser Arbeit weitere Proteasen zum Einsatz. Durch eine sequentielle Kombination von Trypsin mit Endoproteinase Glu-C bzw. Trypsin mit Chymotrypsin konnten in allen Proteinen sämtliche N-Glykosylierungsstellen nach einer Anreicherung identifiziert werden. Bei der Analyse von O-Glykopeptiden verbesserte zusätzlich die N-Deglykosylierung des intakten Proteins und die Abtrennung der freien N-Glykane mittels Ultrafiltration vor der Anreicherung die Analytik. Neben den bereits für die N-Glykopeptide beschriebenen Enzymkombinationen wurde außerdem Proteinase K eingesetzt, um die O-Glykopeptide z.B. von Fetuin effizient anzureichern und mittels LC-ESI-MS2/MS3 zu charakterisieren. Dies war mit einem Trypsinverdau alleine nicht möglich.
Die Komplexität nach einer Glykopeptidanreicherung ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen immer noch so hoch, dass bei 1-dimensionalen HPLC-Läufen Koelution von Glykopeptiden zu einer unzureichenden Detektion niedrig-abundanter Formen führen kann. Aus diesem Grund wurden die komplementäre HPLC-Phasen RP18 und ZIC®-HILIC eingesetzt, um sich chromatographisch die differenzierenden Eigenschaften von Peptidgerüst und Glykanrest zunutze zu machen. ZIC®-HILIC ermöglicht die Auftrennung überwiegend nach der Glykanstruktur und RP18e nach Peptidsequenz und Anzahl an Sialinsäuren. Durch die Kombination beider Phasen in 1- und 2-dimensionalen HPLC-Konfigurationen konnten deutlich mehr unterschiedliche Glykoformen nachgewiesen und die Detektion niedrig-abundanter Glykopeptide ermöglicht werden, die bei der Verwendung von nur einer stationären Phase nicht identifiziert werden konnten.
Zusammen mit einer komplementären MS-Analytik, die sowohl ESI als auch MALDI sowie unterschiedliche Fragmentierungstechniken wie CID, ETD, PSD oder CID-MS2/MS3 umfasste, konnten N- und O-Glykopeptide stellenspezifisch und vollständig sowohl mit ihrem Peptid- als auch mit ihrem Glykananteil charakterisiert werden.
Für bestimmte quantitative Fragestellungen wurden außerdem die beschriebenen Anreicherungsmethoden mit dem zur Quantifizierung eingesetzten N-Glycan Mapping kombiniert und ein Arbeitschema entwickelt, mit welchem bei einem mehrfach glykosylierten Protein die Verhältnisse der unterschiedlichen Glykanstrukturen an den einzelnen Glykosylierungsstellen getrennt voneinander quantifiziert werden können.
Mit jeder einzelnen, in dieser Arbeit beschriebenen Methode wird ein beträchtlicher Informationsgewinn erzielt, doch erst durch die Kombination einer effizienten Probenvorbereitung, einer komplementären HPLC-Separation, verschiedener MS/MS-Techniken und Methoden zur Quantifizierung kann die Glykosylierung eines komplexen Proteins stellenspezifisch und detailliert beschrieben werden.
Krebs stellt die zweithäufigste Todesursache in Europa dar. Obwohl sich Diagnose und Heilungschancen über die letzten Jahre verbessert haben, besteht bei bestimmten neoplastischen Erkrankungen eine unverändert schlechte Prognose. Grundlage für eine langfristige Verbesserung des Behandlungserfolges ist ein molekulares Verständnis der Mechanismen, welche zur Krankheitsentstehung, Progression und Therapieresistenz beitragen. Nur so ist es möglich, nach neuen pharmakologischen und oder/genetischen Inhibitoren zu suchen, welche spezifische Eigenschaften dieser Faktoren blockieren und somit die Entwicklung neuer Therapiestrategien erlauben („from bench to bedside“). In diesem Zusammenhang spielen Proteasen nicht nur eine wichtige Rolle in pathobiologischen Prozessen, sondern stellen auch klinisch anerkannte Zielstrukturen derzeitiger Behandlungsstrategien dar. So wurde auch die Threonin-Protease Taspase1 als potenzielles Therapieziel der von Mixed Lineage Leukemia (MLL)-Translokationen verursachten Leukämien postuliert. Die Taspase1-induzierte Spaltung des MLL Proteins spielt eine wichtige physiologische Rolle in Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen. Darüber hinaus scheint Taspase1 durch die Prozessierung von MLL-Translokationsprodukten, im speziellen des Produkts der t(4;11), maßgeblich zur Leukämieentstehung beizutragen. Zusätzlich gibt es, wie auch in dieser Arbeit gezeigt, erste Hinweise, dass Taspase1 auch für solide Tumore bedeutsam sein könnte. Jedoch sind unsere Kenntnisse über die molekularen Mechanismen, welche für die (patho)biologischen Funktionen von Taspase1 verantwortlich sind, bislang noch lückenhaft. Obwohl neben MLL-Proteinen einige wenige Taspase1-Zielproteine postuliert wurden, fehlt derzeit eine Übersicht über das „Taspase1-Degradom“. Die Kenntnis aller humanen Taspase1-Zielproteine stellt eine wichtige Voraussetzung dar, um die biologischen Funktionen dieser Typ2-Asparaginase gezielter erforschen und verstehen zu können. Zudem stehen im Gegensatz zu anderen Proteasen für Taspase1 bislang keine wirksamen Inhibitoren zur Verfügung, welche nicht nur als potenzielle Wirkstoffe, sondern vor allem als „chemische Werkzeuge“ der Funktionsaufklärung dienen könnten. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das erste effiziente zellbasierte Taspase1- Testsystem entwickelt. Das Translokations-Testsystem basiert auf einem autofluoreszierenden Indikatorprotein, welches eine Taspase1-Spaltstelle enthält und durch die Wahl geeigneter Transportsignale zwischen Kern und Zytoplasma wandert. Nach Koexpression aktiver Taspase1, nicht aber inaktiver Taspase1-Mutanten bzw. anderer Proteasen, wird dieser Biosensor gezielt gespalten und dessen Akkumulation im Zellkern induziert. Die Spezifität des Testsystems mit seinem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erlaubte dessen Anpassung an eine Mikroskopie-basierte Hochdurchsatz-Plattform (Knauer et al., PloS ONE eingereicht). Durch gerichtete Mutagenese der Taspase1-Spaltstelle im Biosensor-Kontext konnte eine optimierte Konsensus-Erkennungssequenz für Taspase1 (Aminosäuren Q3[F,I,L,V]2D1¯G1’X2’D3’D4’) definiert werden, welche erstmalig eine zuverlässige bioinformatische Vorhersage des humanen Taspase1-Degradoms erlaubte. Die biologische Relevanz dieser Analyse wurde durch Validierung einzelner Zielproteine unterstrichen, wobei bisher noch nicht beschriebene Taspase1-Zielproteine wie beispielsweise Myosin1F und der Upstream Stimulating Factor 2 identifiziert wurden. Obwohl für beide Proteine bereits eine tumor-assoziierte Funktion beschrieben ist, bleibt die kausale Rolle von Taspase1 für deren (patho)physiologische Funktionen noch zu klären (Bier et al., JBC). Die Tatsache, dass Taspase1 als nukleäres/nukleoläres Protein identifiziert werden konnte, es sich bei den vorhergesagten Zielproteinen jedoch nicht ausschließlich um Kernproteine handelt, belegte die Notwendigkeit, die Regulation der intrazellulären Lokalisation von Taspase1 zu entschlüsseln. Experimentelle und bioinformatische Analysen zeigten erstmalig, dass Taspase1 über ein zweigeteiltes Importsignal über Importin-a aktiv in den Kern transportiert wird, jedoch kein nukleäres Exportsignal besitzt. Interessanterweise ist sowohl die cis- als auch die trans-Aktivität von diesem Kerntransport abhängig. Die nukleoläre Akkumulation wird hingegen durch die Wechselwirkung mit Nukleophosmin vermittelt. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Taspase1 am Nukleolus aktiviert wird und möglicherweise durch die Kernexportfunktion von Nukleophosmin transient Zugang zum Zytoplasma erhält, um so auch zytoplasmatische Proteine zu prozessieren (Bier et al., Traffic eingereicht). Zusätzlich konnten erstmalig multiple post-translationale Modifikationen von Taspase1 nachgewiesen werden (Bier et al., Manuskript in Vorbereitung). So kann Taspase1 über die Interaktion mit den Peptidasen Senp1-3 sowohl durch Sumo1 als auch durch Sumo2 sumoyliert werden. Diese so vermittelten dynamischen (De)Sumoylierungszyklen könnten eine Feinregulation der Enzym-Substrat-Interaktion darstellen. Zusätzlich wird Taspase1 durch verschiedene Histon-Acetyltransferasen (HAT) acetyliert und dadurch möglicherweise in seiner enzymatischen Aktivität beeinflusst. Interessanterweise acetylieren die HATs p300 und GCN5 hauptsächlich die Proform von Taspase1, was mit einer verstärkten cis-Aktivität einhergeht, während CBP und pCAF eher die prozessierte Form acetylieren. Andererseits interagieren die Histon-Deacetylasen HDAC-3 und -6 mit Taspase1, was nur die cis-Aktivität zu beeinflussen scheint. HDAC1 hingegen verhindert die Prozessierung der zweiten MLL-Schnittstelle, was auf eine zyklische Regulation im Wechsel mit der Acetylierung schließen lässt. WeitereUntersuchungen müssen klären, ob und wie diese post-translationale Feinregulation die (patho)biologische Aktivität von Taspase1 beeinflussen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit entscheidende neue Einblicke in die biologische Funktion und Regulation von Taspase1 gewonnen werden.
Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase, die das MLL-Protein an zwei konservierten Erkennungssequenzen (CS1 und CS2) hydrolysiert. Die daraus entstehenden Spaltprodukte, p320N und p180C bilden ein stabiles Heterodimer und fügen sich mit zahlreichen Proteinen zu einem Multiproteinkomplex zusammen, der die epigenetischen Prozesse während der Embryogenese, Zellzyklus und Stammzell-Wachstum steuert. Der MLL-Komplex weist eine spezifische Histon-Methyltransferase-Aktivität für Lysin-4 des Histon 3 Proteins auf (H3K4me3). Diese spezifische Aktivität hält ein Muster der aktiven Gene während der Entwicklung und Zelldifferenzierung aufrecht. Das AF4-MLL Fusionsprotein, welches durch die chromosomale Translokation t(4;11) gebildet wird, ist ebenfalls ein Substrat von Taspase1. Die Hydrolyse dieses Fusionsproteins führt ebenfalls zu Spaltprodukten, die zunächst miteinander ein Heterodimer bilden, um anschliessend einen onkogenen Multiproteinkomplex auszubilden. Dieser Komplex scheint hämatopoietische Stammzellen zu "reprogrammieren" und den Ausbruch einer lymphoblastischen Leukämie auszulösen.
Die Aktivität der Taspase1 selbst wird durch Eigen-Proteolyse reguliert. Es wird zunächst als Proenzym (p50) hergestellt, das anschliessend durch Autoproteolyse in die enzymatisch aktive Form konvertiert wird. Taspase1 ist ein enzymatisch strikt kontrolliertes Enzym mit geringer Substratanzahl. Neben MLL gibt es nur wenige, bekannte Substrate; allerdings scheint Taspase1 in den Zellen solider Tumoren überexprimiert zu sein. Daraus kann postuliert werden, dass Taspase1/MLL-Aktivität für diese Tumorarten von bedeutung ist. Taspase1 ist die einzige bislang bekannte Protease in Säugerzellen, die dazu befähigt ist, das Leukämie-spezifische AF4-MLL proteolytisch zu spalten und damit seine onkogenen Eigenschaften zu aktivieren. Eine spezifische Inhibierung der Taspase1 könnte deshalb eine mögliche Methode zur Therapie von t(4;11)-Leukämie darstellen. Aus diesem Grund war Taspase1 als ein potentielles Wirkstoffziel interessant und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer untersucht.
Um die Funktionsweise von Taspase1 zu untersuchen, wurde die 2005 veröffentlichte Kristallstruktur der Taspase1 als Grundlage für alle weiteren Arbeiten verwendet. Da die Struktur allerdings nur unvollständig aufgelöst war, wurden die unaufgelösten Bereiche mittels bioinformatischer Tools in Kooperation mit Tim Geppert (Arbeitskreis von Prof. Dr. Gisbert Schneider) modelliert. Die Modellierung führte zu einem detaillierteren Modell des Taspase1-Proenzyms, also dem Zustand vor der autokatalytischen Aktivierung.
Taspase1 weist interessanterweise nur Homologien zu L-Asparaginasen-2 (Familie der Hydrolasen), darunter Glycosylasparaginase, auf. Glycosylasparaginase durchläuft ebenfalls einen Autokatalyse-Prozess, allerdings nach einem N-O-Acyl-shift-Mechanismus. Daher wurde Taspase1 zunächst anhand geeigneter Experimente daraufhin überprüft, ob hier ebenso ein solcher Mechanismus für die Autokatalyse in Betracht kommt. Allerdings widerlegten die durchgeführten Experimente diese Vermutung.
Um die molekulare Funktionsweise der Taspase1 zu eruieren, wurde nun das modellierte Taspase1-Proenzym verwendet. Dies erlaubte die Identifizierung von kritischen Aminosäuren. Durch Mutationsanalysen konnte so die Funktion von Taspase1 aufgeklärt werden. So wurde ein intrinsischer Serin-Protease-Mechanismus für den Prozess der Autokatalyse entdeckt. Dabei spielt Serin-291 - unmittelbar in der Nähe des katalytischen Zentrums - eine wesentliche Rolle.
Anhand weiterer Mutationsanalysen konnte dann schrittweise der Aktivierungsmechanismus von Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei scheint die Homodimerisierung zweier Taspase1- Proenzyme der wesentliche Schlüssel für die vollständige Aktivierung der Taspase1 zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Aminosäuren Tryptophan-173, Arginin-262, und Glutaminsäure-295 als kritische Aminosäuren identifiziert.
Weiterhin konnte anhand der funktionellen Analyse aller Mutanten zuletzt eine trans-dominant-negative Taspase1-Variante (C163E-S291A; tdn-TASP1) hergestellt werden. Das proenzymatische Monomer dieser Mutante ist dabei befähigt, mit einem Wildtyp-Taspase1-Monomer zu heterodimerisieren und seine Aktivität vollständig zu inhibieren. Die Funktion dieser trans-dominant-negativen Mutante validierte den in dieser Arbeit postulierten Aktivierungsmechanismus der Taspase1, der nun zukünftig für ein rationales Wirkstoff-Design verwendet werden kann.
Zwei flavonoidhaltige Pflanzenextrakte, der neuartige Extrakt WS1261, sowie der standardisierte Ginkgo biloba L.-Extrakt EGb761 wurden auf antidepressive Wirkungsmechanismen untersucht, zusätzlich als chemisch definierte Einzelsubstanz das in beiden enthaltene Flavonoid Isorhamnetin. Methodisch wurden hierzu Effekte auf Transporter und Enzyme des Monoaminstoffwechsels, depressionsrelevante Stresshormone neurotrophe Eigenschaften untersucht.
WS1261 hemmte in höheren Konzentrationen in vitro die (Wieder-) Aufnahmetransportmechanismen von NA und 5-HT. Ex vivo war ein Effekt auf die Aufnahme von NA und 5-HT weder nach 1 h, noch 4 h nach Akutbehandlungen zu sehen, sondern erst nach (14-taegiger) subchronischer Behandlung, und dann auch nur Ufer 5-HT zu messen. Nach subchronischer Behandlung konnte eine ebenfalls in vitro festgestellte Hemmung der MAO-A durch WS1261 ebenfalls ex vivo gezeigt werden.
EGb761 hemmte in vitro die Wiederaufnahme von NA, 5-HT und DA. Ex vivo war dieser Effekt weder 1 h, noch 4 h nach einer Akutgabe, allerdings nach 14-taegiger Dauerbehandlung im Bezug auf eine Hemmung der NA-Aufnahme messbar, ohne dass MAO-A oder MAO-B-Aktivitaet beeinflusst wurden.
WS1261 erhoehte nach 14-taegiger Behandlung konzentrationsabhaengig die Plasma-Corticosteronspiegel. WS1261 war in der Lage, die Ausdifferenzierung von PC12-Zellen konzentrationsabhaengig zu fördern, wodurch auf eine Wirkung ähnlich dem neurotrophen Wachstumsfaktor NGF geschlossen werden kann. Die Konzentration des Wachstumsfaktor BDNF wurde in zwei relevanten Hirnregionen durch WS1261 nicht, in einer jedoch durch Isorhamnetin allein erhoeht.
Zusammengefasst ergaben sich Hinweise darauf, dass eine mögliche antidepressive Wirkung von WS1261 durch eine Wirkung auf eine Beeinflussung des Monoaminstoffwechsels, oder die Erhöhung depressionsrelevanter Stresshormonlevel erklärbar sein koennte, insbesondere nach subchronischer Behandlung. Es ergaben sich ausserdem Hinweise auf wachstumsfaktoraehnliche Wirkungsweisen. Eine Wirkung ueber eine Erhšhung zentraler BDNF-Konzentrationen konnte durch die vorliegende Untersuchung im Beobachtungszeitrum nicht festgestellt werden.
Die literaturbekannte kognitionsverbessernde Wirkung des Ginkgo biloba-Extraktes EGb761 koennte erklärbar sein durch eine nach subchronischer Behandlung feststellbare Hemmung des Noradrenalintransporters NET, da im frontalen Cortex vor allem ueber diesen die synaptische Elimination des hier mit Aufmerksamkeit und Lernprozessen im Zusammenhang stehenden Neurotransmitters Dopamin erfolgt.
Das in beiden Extrakten enthaltene Flavonoid Isorhamnetin kann hšchstens mit einem Teil dieser festgestellten Effekte in Verbindung stehen, da die Extrakte sich in ihrer Wirkungsweise unterschieden, und Isorhamnetin alleine teilweise andere Effekte zeigte, als die isorhamnetinhaltigen Extrakte WS1261 und EGb761. Dies koennte jedoch auch durch die unterschiedlichen in den Extrakten enthaltenen Mengen erklärbar sein.