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Clean water is fundamental to human health and ecosystem integrity. However, water quality deteriorates due to novel anthropogenic pollutants present at microgram per liter concentrations in urban water cycles (termed micropollutants). Wastewater treatment plants (WWTP) have been identified as major point sources for aquatic (micro-)pollutants. Chemical and ecotoxicological analyses have shown that conventional biological WWTPs do not fully remove micropollutants and associated toxicities, which is often because of mobile, polar and/or recalcitrant compounds and transformation products (TPs). To minimize possible environmental risks, advanced wastewater treatment (AWWT) technologies could be a promising mitigation measure. Multiple processes are therefore being developed and evaluated such as ozonation and ozonation followed by granulated activated carbon (GAC) or biological filtration. Assessing the performance of these combined AWWTs was the focus the TransRisk project. Within this project, this thesis accomplished four major goals.
Firstly, the preparation of (waste)water samples was optimised for in vitro bioassays. Acidification, filtration and solid phase extraction (SPE) were tested for their impact on environmentally relevant in vitro endocrine activities, mutagenicity, genotoxicity and cytotoxicity. Significantly different outcomes of these assays were detected comparing neutral and acidified samples. Sample filtration had a lesser impact, but in some cases retention of particle-bound compounds could have caused significant toxicity losses. Out of three SPE sorbents the Telos C18/ENV at sample pH 2.5 extracted highest toxicity, some undetected in aqueous samples. These results indicate that sample preparation needs to be optimised for specific sample matrices and bioassays to avoid false-positive or -negative detects in effect-based analyses.
Secondly, the above listed in vitro toxicities were monitored in a protected region for drinking water production in South-West Germany (2012-2015). Out of 30 sampling sites surface water and groundwater were the least polluted. Nonetheless, a few groundwater samples induced high anti-estrogenic activity that prompted further monitoring. The latter included a waterworks in which no toxicity was detected. Hospital wastewater also had elevated in vitro toxicities and hospitals are, thus, relevant intervention points for source control. The biological WWTPs were effective in removing most of the detected toxicity, and the selected bioassays proved to be pertinent tools for water quality assessment and prioritisation of pollution hotspots.
Thirdly, the in vivo bioassay ISO10872 based on Caenorhabditis elegans (C. elegans) was adapted for this thesis. Using this model, a median effect concentration (EC50) for reproductive toxicity of the polycyclic aromatic hydrocarbon β-naphthoflavone (β- NF) of 114 µg/L was computed which is slightly lower than reported in the scientific literature. β-NF induced cyp-35A3::GFP (a biomarker in transgenic animals) in a time and concentration dependent manner (≤ 21.3–24 fold above controls). β-NF spiked wastewater samples supported earlier hypotheses on particle-bound pollutants. Reproductive toxicity (96 h) and cyp-35A3 induction (24 h) of biologically treated and/or ozonated wastewater extracts and growth promoting effects of GAC/biologically filtered ozonated wastewater extracts were observed. This suggested the presence of residual bioactive/toxic chemicals not included in the targeted chemical analysis. It also highlighted the importance of integrating multiple (apical and molecular) endpoints in wastewater assessments.
Fourthly, five in vitro and the adapted C. elegans bioassay were integrated into a wastewater quality evaluation (developed within TransRisk). Out of the five AWWT options, ozonation (at 1 g O3,applied/g DOC, HRT ~ 18 min) combined with nonaerated GAC filtration was rated most effective for toxicity removal. All five AWWTs largely removed estrogenic and (anti-)androgenic activities, but not anti-estrogenic activity and mutagenicity, which even increased during ozonation. This has been observed in related studies and points towards toxic TPs. These results also emphasized the need for implementing an effective post-treatment for ozonation. The results from a parallel in vivo study with Lumbriculus variegatus and Potamopyrgus antipodarum conducted on site at the WWTP (using flow through systems) were in accordance with the C. elegans results. In this context, it is suggested to further implement C. elegans as sensitive, feasible and ecologically relevant model.
In conclusion, this thesis shows how optimised sample preparation, long-term (in vitro) environmental monitoring, sensitive and ecologically relevant (in vivo) bioassays as well as innovative evaluation concepts, are pivotal in improving the removal of micropollutants and their toxicities with AWWTs. Future research should further develop and evaluate measures at sewer systems, conventional biological, tertiary and other advanced treatment technologies, as well as sociopolitical strategies (e.g., source control or natural conservation) and restoration projects. The effect-based tools optimised in this thesis will support assessing their success.
Einleitung: Das Arbeiten in einer Notfallsituation ist stark von einer strukturierten Herangehensweise im Patientenmanagement abhängig. Junge Assistenzärzte sind in ihrem Alltag häufig die ersten vor Ort und sollten daher bereits mit Abschluss des Studiums in der Lage sein, häufige Notfallsituationen zu meistern. In den letzten Jahren hat sich die Simulation als hauptsächlich genutzte Methode für die Ausbildung im Fach Notfallmedizin herauskristallisiert, sodass immer mehr Universitäten realitätsnahe Szenarien für die Ausbildung nutzen. Jedoch ist unklar welches Ausmaß an Realitätsnähe in Hinblick auf Kosten/Aufwand-Nutzen-Bilanz sinnvoll ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Effekt von zwei unterschiedlich realitätsnahen Lernumgebungen (Seminarraum vs. realistische Simulationsumgebung) auf die erlernten notfallmedizinischen Kompetenzen zu analysieren. Dazu wurden Krankheitsbilder gewählt, die jedem Arzt in Präklinik, auf Station und im ambulanten Bereich begegnen können und die zügig erkannt und behandelt werden müssen: Asthma, Sepsis und Apoplex.
Material und Methoden: Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine vergleichende Effektivitätsanalyse im crossover-Design. Teilnehmende waren Studierende des 4. Studienjahres der Goethe-Universität Frankfurt am Main, die den 3-TagesNotfallmedizinkurs im Rahmen ihrer curricularen Ausbildung im Querschnittsbereich Notfallmedizin absolvierten. Am ersten Tag durchliefen alle Studierenden ein standardisiertes Skillstraining notfallmedizinischer Basiskompetenzen. An den Folgetagen wurden verschiedene leitsymptombasierte Module vermittelt, die neben der interaktiven Erarbeitung der theoretischen Lerninhalte eine direkte Anwendung in themenspezifischen Szenarien fokussierten. Für die vorliegende Studie wurden die Teilnehmenden in vier Gruppen randomisiert, wobei Gruppen eins und zwei das Training in der Seminarraumumgebung durchliefen, während drei und vier die Szenarien in der realitätsnahen Simulationsumgebung absolvierten. Am dritten Tag fand eine formative Überprüfung der erlernten Fähigkeiten in Form eines OSCEs statt. Bei dieser Überprüfung absolvierten die Gruppen eins und drei in der Seminarraumumgebung und Gruppen zwei und vier im realitätsnahen Umfeld der Simulation das Assessment. Die Datenauswertung erfolgte mit MS Excel und bias.
Ergebnisse und Fazit: Die vorliegende Studie fand zwischen Juli und Oktober 2018 an der Goethe-Universität in Frankfurt am Main statt. 134 Teilnehmer absolvierten die Studie vollständig. Die Ergebnisse zeigen deutliche Unterschiede in der Performance der vier Gruppen, sowohl insgesamt als auch nach Geschlechtern und mit dem van-Elteren-Test. Prozentual betrachtet zeigten die Teilnehmenden der Gruppe 4 (Training und Prüfung im realitätsnahen Umfeld) die höchsten Ergebnisse. Die Realitätsnähe hat einen positiven Einfluss auf die Performance der Studierenden.
This dissertation investigates several aspects of nominal modification in Ògè, an understudied language of Benue-congo spoken in Àkókó Northwest in Nigeria. The study focuses on two areas of nominal modification namely, Nominal Attributive Modifiers (NAMs) and the strategies of number marking.
The discussion and analysis of NAMs in the language reveal that Ògè belongs to the group of languages which lacks adjectives as a lexical category. NAMs are nominal and they
are derived from an existing lexical category namely, verbs. Predicative modifiers and NAMs have forms that are similar to the long and short forms (LF & SF) of adjectives in languages in which adjectives form an open class, for example, Russian, SerBoCroatian (BCS) and German.
Based on the Minimalist program, the dissertation reveals that unlike Russian, BCS, and German in which the discrepancies between the two forms of adjectives are related to definiteness (as in the case of BCS) and Agree, the discrepancies in the two forms of modifiers in Ògè are related to the fact that Ògè lacks adjectives and resorts into the nominalization of stative verbs in order to derive attributive forms. Using the analyses of adjuncts according to Truswell (2004) and Zeijlstra (2020), the dissertation proposes that NAMs are adjuncts in a modification structure while they are heads in possessive and genitive constructions. In addition, I propose that NAMs are attributive-only modifiers which modify the NP rather than
the DP.
The dissertation also investigates the strategies of number marking in Ògè. Unlike languages in which number marking is obligatory in the nominal domain (Hebrew, German, English),
nouns in Ògè are not always marked for number. This means that nouns in Ògè have general number. The general number nature of nouns in Ògè is like that of the nouns in modifying plural marking languages namely, Halkomelem, Korean, Yucatec Maya and Yorùbá. However, I argue that unlike the modifying plural marking languages in which the Number Phrase (NumP) is not projected, NumP is projected in the nominal spine of Ògè, claiming that NumP bears an
interpretable number feature which values the uninterpretable number feature in D. Argument in support of this comes from the interpretation of the noun in the presence of òtúro (an element which translates to the plural definite interpretation of the noun). I analyze òtúro as a plural determiner which occupies the D-head in the syntax of Ògè. The dissertation argues following Alexiadou (2019) that the locus of the occurrence of the marker of plurality in the nominal spine does not depend on its interpretation as a plural morpheme, rather, the locus of the occurrence of the element that is sensitive to the plural interpretation of the noun depends on other parameters which are definiteness, specificity and animacy.
Das Projekt anan ist ein Werkzeug zur Fehlersuche in verteilten Hochleistungsrechnern. Die Neuheit des Beitrags besteht darin, dass die bekannten Methoden, die bereits erfolgreich zum Debuggen von Soft- und Hardware eingesetzt werden, auf Hochleistungs-Rechnen übertragen worden sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Werkzeug namens anan implementiert, das bei der Fehlersuche hilft. Außerdem kann es als dynamischeres Monitoring eingesetzt werden. Beide Einsatzzwecke sind
getestet worden.
Das Werkzeug besteht aus zwei Teilen:
1. aus einem Teil namens anan, der interaktiv vom Nutzer bedient wird
2. und aus einem Teil namens anand, der automatisiert die verlangten Messwerte erhebt und nötigenfalls Befehle ausführt.
Der Teil anan führt Sensoren aus — kleine mustergesteuerte Algorithmen —, deren Ergebnisse per anan zusammengeführt werden. In erster Näherung lässt anan sich als Monitoring beschreiben, welches (1) schnell umkonfiguriert werden (2) komplexere Werte messen kann, die über Korrelationen einfacher Zeitreihen hinausgehen.
Fallzahlaufkommen und Qualitätsindikatoren bei der Versorgung des abdominellen Bauchaortenaneurysmas
(2021)
Hintergrund: Der MTL30 ist ein Surrogatparameter, der bisher in visceralchirurgischen Registern verwendet wird, um eine Prognose über die Qualität verschiedener komplikationsträchtiger Eingriffe abzugeben. Der Marker wird als positiv gewertet, wenn ein Patient am 30. postoperativen Tag verstorben (mortality) ist, in ein anderes Akutkrankenhaus verlegt (transfer) werden musste oder weiterhin im Krankenhaus verweilen muss (length of stay >30 days).
Zielsetzung: In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob der MTL30 eine Aussage über die Qualität der operativen Versorgung des Bauchaortenaneurysmas (AAA) abgeben kann. Dazu sollten Kliniken mit unterschiedlichem Fallaufkommen hinsichtlich Letalität und MTL30 miteinander verglichen werden. Zusätzlich sollten Literaturempfehlungen zu Mindestmengen des Fallaufkommens überprüft werden.
Methodik: Insgesamt wurden 18.205 elektive Eingriffe aus dem AAA- Register des Deutschen Instituts für Gefäßmedizinische Gesundheitsforschung (DIGG) der Deutschen Gesellschaft für Gefäßchirurgie und Gefäßmedizin (DGG) analysiert. 14.282 Patienten wurden mittels endovaskulärer Aortenaneurysmaversorgung (EVAR) und 3.923 Patienten mittels offener Versorgung (OAR) behandelt. Die Ergebnisse wurden zum Fallaufkommen der Kliniken in Beziehung gesetzt.
Ergebnisse: Weder für die Letalität noch für den MTL30-Wert konnten Volumen- Ergebnisbeziehungen gefunden werden. Bei EVAR lag die Sterblichkeit im Quintil 1 des Fallaufkommens bei 1,0% und im Quintil 5 bei 1,3%. Auch beim MTL30 ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen Quintil 1 und 5, der MTL30 belief sich jeweils auf 5,3%. Bei OAR war die Klinikletalität in dem Quintil mit dem geringsten Fallaufkommen (Quintil 1) mit 5,8% verglichen mit Quintil 5 (höchstes Fallaufkommen, Klinikletalität 3,5%) im Trend höher, aber nicht signifikant unterschiedlich (p= 0,505). Auch bei OAR korrelierte der MTL30 nicht mit dem Fallaufkommen (Quintil 1: 16,4% vs. Quintil 5:12,2%, p=0,110). Jedoch korrelierte die Liegedauer bei EVAR und OAR sowohl mit der Letalität (EVAR: Quintil 1 der Liegezeit 1,69% vs. Quintil 5 1,02%, p= 0,042; OAR: Quintil 1: 6,78% vs. Quintil 5: 2,16%, p= 0,000) als auch mit dem MTL30 (EVAR: Quintil 1 der Liegezeit 7,35% vs. Quintil 5 2,85%, p=0,000; OAR: Quintil 1 26,28% vs. Quintil 5 5,19%, p= 0,000).
Folgerung: Es konnte weder bei EVAR noch bei OAR ein Zusammenhang zwischen dem jährlichen Fallaufkommen und der Letalität bzw. dem MTL30 gefunden werden. Ob der MTL30 gegenüber der alleinigen Erfassung der Klinikletalität als Qualitätsparameter einen Zusatznutzen bietet, muss offenbleiben. Ein vielversprechenderer Marker scheint die stationäre Liegedauer zu sein, die zusätzlich zur Letalität als Qualitätsparameter verwendet werden könnte.
Diese Dissertation befasst sich mit Validierungsstrategien von Tests zur Erfassung studentischer Kompetenzen. Kompetenzen von Studierenden werden zu verschiedenen Zwecken erhoben. Dies beginnt beim Eintritt in das Studium durch Zulassungstests und wird im Studium fortgesetzt z.B. durch Tests zur Zertifizierung von Kompetenz (Benotung von Leistung) oder zur Zuteilung auf bestimmte Kurse (Einteilung in Sprachniveaus). Neben diesen internen Tests zur Erfassung studentischer Kompetenzen werden auch externe Tests genutzt um etwa die Lehre zu verbessern (Evaluation von Veranstaltungen). Die mit dem Einsatz von Tests verbundenen Konsequenzen können sowohl für Studierende als auch Lehrpersonen und Entscheidungsträger*innen schwerwiegend sein. Daher sollten Tests wissenschaftlichen Gütekriterien genügen.
Das wichtigste Kriterium für die Beurteilung von wissenschaftlichen Tests ist Validität. In dieser Dissertation wird ein argumentationsbasiertes Validierungsansatz verfolgt. In diesem wird nicht die Validität eines Tests untersucht, sondern die Plausibilität der Interpretation beurteilt, die mit den Testwerten verbunden ist. Bislang fehlt jedoch für viele der wissenschaftlichen Tests für den deutschen Hochschulbereich ein auf die Testwertinterpretation abgestimmtes Validitätskonzept.
In dieser Arbeit wird ein Validierungsschema vorgestellt, in das übliche Testnutzen der Erfassung studentischer Kompetenzen an deutschen Hochschulen eingeordnet werden können. Die Einordnung von Testnutzen in das Schema erlaubt die Ableitung von passenden Validitätsevidenzen. Im Fokus stehen das Verhältnis von Test zu 1) Konstrukt, 2) Lehre und 3) beruflichen Anforderungen.
Das Validierungsschema wird angewandt, um Testwertinterpretationen eines empirischen Forschungsprojektes zur Erfassung von Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement bei Studierenden zu validieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Validierung der Interpretation, dass die Testwerte von drei nachhaltigkeitsbezogenen Tests Indikatoren für hochschulisch vermittelte Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement sind. Die Analysen zur Gewinnung von Validitätsevidenzen konzentrieren sich auf die Grundannahme, dass Lernfortschritte in den nachhaltigkeitsbezogenen Tests vorwiegend hochschulisch vermittelt werden. Dafür wurde ein Messwiederholungsdesign mit zwei Gruppen von Studierenden realisiert. Studierende in der Schwerpunktgruppe besuchten ein Semester lang eine reguläre Lehrveranstaltungen mit Bezug zu Nachhaltigkeitsthemen und Nachhaltigkeitsmanagement, Studierende der Kontrollgruppe besuchten keine solchen Lehrveranstaltung. Die Einteilung in Schwerpunkgruppe und Kontrollgruppe erfolgte über Analyse von Modulhandbüchern und verwendeten Lehrmaterialien. Die Ergebnisse zeigen, dass Studierende aus der Schwerpunktgruppe in zwei der drei Tests höhere Lernfortschritte zeigen als Studierende der Kontrollgruppe. Selbstberichte der Studierenden zu hochschulischen und außerhochschulischen Lerngelegenheiten lassen darauf schließen, dass Studierende der Schwerpunkgruppe auch außerhochschulisch ein höheres Interesse an Nachhaltigkeitsthemen zeigen, dies schlägt sich jedoch nicht in höherem Vorwissen in den verwendeten Tests nieder. Insgesamt wird daher für die zwei Tests mit höheren Lernfortschritten in der Schwerpunktgruppe die Interpretation als plausibel bewertet, dass die Testwerte hochschulisch vermittelte Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement abbilden.
Next-generation DIRC detectors, like the PANDA Barrel DIRC, with improved optical designs and better spatial and timing resolution, require correspondingly advanced reconstruction and PID methods. The investigation of the PID performance of two DIRC counters and the evaluation of the reconstruction and PID algorithms form the core of this thesis. Several reconstruction and PID approaches were developed, optimized, and tested using hadronic beam particles, experimental physics events, and Geant simulations. The near-final design of the PANDA Barrel DIRC was evaluated with a prototype in the T9 beamline at CERN in 2018. The analysis finds excellent agreement between the experimental data and the Geant simulations for all reconstruction algorithms. The best PID performance of up to $5.2 \pm 0.2$ s.d. $\pi$/K separation at 3.5 GeV/c, was obtained with a time imaging PID method. The PANDA Barrel DIRC simulation, as well as the reconstruction and PID algorithms, were evaluated using experimental data from the GlueX DIRC as part of the FAIR Phase-0 program. The performance validation was carried out using physics events of the GlueX experiment and simulations. The initial analysis results of the commissioning dataset show a $\pi$/K separation power of up to 3 s.d. at a momentum of 3.0-3.5 GeV/c, obtained using a geometric reconstruction algorithm.
One of the most important events in human history occurred during the Early Pleistocene: the dispersal of early hominins out of Africa and into Europe and Asia. In Western Europe, the earliest evidences of the genus Homo have been found in the Baza Basin, at the sites of Orce in the SE of the Iberian Peninsula. These sites contain fossils and lithic industry dated approximately as 1.4–1.3 Ma.While hominin remains and artifacts at Orce, as well as the accompanying fauna, have been extensively studied, the properties and evolution of the Early Pleistocene vegetation in the basin remain unknown. The general effect of climate change on the expansion of early hominins from Africa into Eurasia still remains unclear. It is not known if the Early Pleistocene climate changes and the development of glacials periods led to the extirpation of European communities, or if those communities were able to endure and persist through such adverse climatic periods. This open question highlights the need for climate and environmental analyses for the time before, during and after the first presence of Homo in Europe. This PhD thesis contributes to that need by the presentation of the first long pollen record of the Baza Basin, where the oldest hominin sites in Western Europe are found.
Chronische Herzinsuffizienz ist eine der führenden Todesursachen im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen und ist mit einer hohen Anzahl an Komorbiditäten assoziiert. Unter anderem führt Herzinsuffizienz zu Veränderungen des Immunsystems, welche denen der Immunoseneszenz ähneln. Als einflussreiche Modulatoren ganzer molekularbiologischer Regelkreise sind microRNAs in den letzten Jahren zunehmend in den Fokus gerückt. Diese nicht-kodierenden, kurzen RNA-Einzelstränge können die Genexpression von vielen Zielgenen durch spezifisches Binden der jeweiligen mRNA Transkripte kontrollieren. Aufgrund zum Teil gewebe-, zelltyp- und prozess-spezifischer Expression können microRNAs auch als mögliche Biomarker für spezifische klinische Fragestellungen dienen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von immunmodulatorischen microRNAs im peripheren Blut (PB) von jungen und gealterten gesunden Probanden (y/h bzw. o/h) sowie Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (CHF) untersucht. Dabei wurde ein Bezug auf Immunoseneszenz bzw. die Auswirkung von CHF auf das Immunsystem hergestellt. Im Rahmen dessen wurden Leukozyten-, insbesondere Lymphozyten-Subpopulationen analysiert.
Hierzu wurden Probanden in die drei folgenden Gruppen eingeschlossen: Patienten mit CHF (n=18, durchschnittliches Alter 64 Jahre), alters-korrelierte gesunde Probanden (n=13, durchschnittliches Alter 64 Jahre) sowie junge gesunde Probanden (n=30, durchschnittliches Alter 25 Jahre). Neben der Erhebung der klinischen Daten wurde peripheres Blut zur Bestimmung der microRNA-Expressionslevels sowie für durchflusszytometrische Analysen der Leukozytenpopulationen gewonnen.
In den Expressionsanalysen konnte eine alters- und herzinsuffizienz-abhängige Dysregulation einzelner microRNAs beobachtet werden. Insbesondere Mitglieder der miR-181-Familie, spezifisch miR-181a und miR-181c, waren im Alter niedriger exprimiert, zudem war die Expression von miR-181c bei Vorliegen einer CHF deutlicher reduziert. Des Weiteren zeigte sich eine altersabhängige erhöhte Expression von miR-34a, wobei das Vorliegen von CHF keine Auswirkung auf die Expression zeigte. Bei den microRNAs miR-146a und miR-223 konnte keine signifikante alters- oder CHF-abhängige Regulation nachgewiesen werden. Lediglich zeigte bei der miR-155 zeigte sich eine signifikante Reduktion bei Vorliegen einer CHF im Vergleich o/h Probanden.
In Hinblick auf die Leukozytenpopulationen im peripheren Blut wiesen Patienten mit CHF höhere Zahlen an Leukozyten auf, alle miR-181 Mitglieder zeigten hierbei eine inverse Korrelation. Dagegen stellte sich in Hinblick auf die Zusammensetzung der Leukozyten-Subpopulationen eine Reduktion der Lymphozytenfraktion im Alter dar, besonders bei Patienten mit CHF. Insbesondere zeigte sich eine altersabhängige Abnahme der B-Lymphozytenpopulation, wobei auch hier das Vorliegen einer CHF diesen Effekt verstärkte. Die Expression miR-181a und miR-181c sowie miR-146a und miR-223 korrelierte positiv mit dem Anteil der B-Lymphozyten. Innerhalb der B-Zellen zeigte sich eine alters- und CHF-abhängige Reduktion der naïven B-Zellen, welche positiv mit der Expression von miR-181c, miR-146a und miR-223 korrelierte. Die beobachteten Veränderungen der B-Zell-Subpopulationen zeigten sich insbesondere bei CHF Patienten mit ischämischer Ursache im Vergleich zur dilatativen Kardiomyopathie.
Bei den untersuchten T-Lymphozyten-Subpopulationen zeigte sich eine altersabhängiger Abfall bei den zytotoxischen T-Zellen. Das Vorliegen einer CHF verstärkte diesen Effekt. Die beobachteten Veränderungen der T-Zell-Subpopulation korrelierten nicht mit der Expression der untersuchten microRNAs.
Im Gegensatz zu den lymphoiden Subpopulationen zeigte sich ein Anstieg der neutrophilen Granulozyten und der Monozyten im Alter, es stellte sich jeweils eine negative Korrelation mit der Expression von miR-181 Transkripten sowie miR-155, miR-146a und miR-223 dar.
Zusammenfassend zeigten sich signifikant erniedrigte Expressionslevels von miR-181c im Alter, was mit Immunoseneszenz-bedingten Veränderungen des peripheren Bluts einherging. Diese Veränderungen zeigten sich zusätzlich verstärkt bei Patienten mit CHF. Zukünftig könnten miR-181c Expressionslevel in peripherem Blut als Biomarker für die Immunfunktionen bei CHF Patienten dienen und in Hinblick auf eine mögliche prospektive Information evaluiert werden.
Das Feld der Hochenergie-Schwerionenforschung hat sich der Untersuchung des Quark-Gluon-Plasmas (QGP) gewidmet. Ein QGP ist ein sehr heißer und dichter Materiezustand, der kurz nach dem Urknall für einige Mikrosekunden das Universum füllte. Unter diesen extremen Bedingungen sind die fundamentalen Bausteine der Materie, die Quarks und Gluonen, quasi frei, also nicht in Hadronen eingeschlossen, wie es unter normalen Bedingungen der Fall ist. Hadronen sind Teilchen, die aus Quarks und Gluonen bestehen. Die bekanntesten Hadronen sind Protonen und Neutronen, die Bestandteile von Atomkernen, aus denen, zusammen mit Elektronen, die gesamte bekannte Materie aufgebaut ist.
Um ein QGP im Labor zu erzeugen, lässt man ultrarelativistische schwere Ionen, wie zum Beispiel Pb-208-Kerne, aufeinander prallen. Dies geschieht am CERN, dem größten Kernforschungszentrum der Welt. Der Teilchenbeschleuniger, welcher Protonen und Pb-Kerne beschleunigt und zur Kollision bringt, heißt Large Hadron Collider (LHC) und ist mit 27 km Umfang der größte der Welt. Bei einer einzigen Pb-Pb Kollision am LHC werden mehrere Tausend Teilchen und Antiteilchen erzeugt. Das dedizierte Experiment zur Untersuchung von Schwerionenkollisionen am LHC ist ALICE. ALICE ist mit mehreren Teilchendetektoren ausgerüstet, die es ermöglichen, tausende Teilchen gleichzeitig zu messen und zu identifizieren.
Unter den produzierten Teilchen befinden sich auch leichte Atomkerne, wenngleich diese nur sehr selten erzeugt werden. Die Anzahl der produzierten Teilchen pro Teilchensorte hängt nämlich von deren Masse ab. In Pb-Pb Kollisionen am LHC sinkt die Anzahl der produzierten (Anti)kerne exponentiell um einen Faktor 1/330 bei Hinzufügen jedes weiteren Nukleons. Die Menge an produzierten Teilchen pro Spezies stellt Informationen über den Produktionsmechanismus beim Übergang vom QGP zum Hadrongas zur Verfügung. Hierbei sind leichte (Anti)kerne von besonderem Interesse, da sie vergleichsweise groß sind und ihre Bindungsenergie bis zu zwei Größenordnungen kleiner ist als die Temperaturen, die bei der Erzeugung der Hadronen vorherrschen. Es ist bis heute noch nicht verstanden, wie leichte (Anti)kerne bei diesen Bedingungen erzeugt werden und überleben können.
Für diese Arbeit wurden ca. 270 Millionen Pb-Pb Kollisionen bei einer Schwerpunktsenergie von 5,02 TeV, die von ALICE im November 2018 aufgezeichnet wurden, analysiert. Es wurde die Produktion von (Anti)triton und (Anti)alpha untersucht. Wegen ihrer großen Masse werden beide Kerne sehr selten produziert, bei weitem nicht bei jeder Kollision. Antialpha ist der schwerste Antikern, der jemals gemessen wurde. Aufgrund dieser Seltenheit ist die Größe des zur Verfügung stehenden Datensatzes entscheidend. Es war möglich, das erste jemals gemessene Antialpha-Transversalimpulsspektrum zu extrahieren. Auch für (Anti)triton und Alpha wurden Transversalimpulsspektren bestimmt.
Die Ergebnisse wurden mit theoretischen Modellen und anderen ALICE Messungen verglichen.
Am Ende wird in einem Ausblick auf das kürzlich durchgeführte Upgrade der ALICE Spurendriftkammer (TPC) eingegangen. In der nächsten, bald startenden Datennahmeperiode wird der LHC seine Kollisionsrate erheblich erhöhen, was es ermöglichen wird, mehr als 100 mal so viele Daten wie bisher aufzuzeichnen. Hiervon werden die in dieser Arbeit beschriebenen (Anti)triton- und (Anti)alpha-Analysen beachtlich profitieren. Um mit den erheblich höheren Kollisionsraten zurecht zu kommen, mussten einige Detektoren, unter anderem die TPC, maßgeblich erneuert werden. In den ersten beiden Datennahmeperioden wurde die TPC mit Vieldrahtproportionalkammern betrieben. Diese sind allerdings viel zu langsam für die geplanten Kollisionsraten. Deshalb wurden sie im Jahr 2019, während einer langen Betriebspause des LHC, durch Quadrupel-GEM (Gas Electron Multiplier) Folien basierte Auslesekammern ersetzt, welche eine kontinuierliche Auslese der TPC ermöglichen. Da es sich um die erste jemals gebaute GEM TPC im Großformat handelt, war ein umfangreiches Forschungs- und Entwicklungs- (F&E) Programm notwendig, um die GEM Auslesekammern zu charakterisieren und zu testen. Im Rahmen dieses F&E Programms wurden am Anfang dieser Promotion systematische Messungen an einer kleinen Test TPC mit Quadrupel-GEM Auslese, die extra zu diesem Zweck gebaut worden war, durchgeführt. Hierbei wurde der Rückfluss der bei der Gasverstärkung erzeugten Ionen in das Driftvolumen der TPC und die Energieauflösung mit verschiedenen GEM Folien Typen und unterschiedlicher Anordnung gemessen. Das Ziel war, möglichst kleine Ionenrückflüsse bei möglichst guter Energieauflösung zu erreichen. Hierbei musste ein Kompromiss gefunden werden, da die beiden Größen sich gegenläufig verhalten. Es war jedoch möglich, mit mehreren GEM Konfigurationen Spannungseinstellungen zu identifizieren, bei denen beide Größen den gewünschten Anforderungen entsprachen.
Der Einfluss von Chemotherapie bei malignen pädiatrischen Erkrankungen auf kindliche Impftiter
(2021)
Hintergrund: Chemotherapie hat nicht nur einen Einfluss auf die Krebszellen, sondern auch auf das Immunsystem der Behandelten. In unserer Studie untersuchten wir den Impftiterverlust impfpräventablen Erkrankungen (Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster) bei Kindern und Jugendlichen, welche eine chemotherapeutische Behandlung wegen einer malignen Erkrankung erhielten.
Methoden: Eingeschlossen in die retrospektive Studie wurden Kinder, Jugendliche und junge Erwachsene im Alter bis zum 21. Lebensjahr, welche zwischen 2001 und 2010 an der Kinderklinik für Hämatologie und Onkologie der Universitätsklinik Frankfurt am Main therapiert wurden. Es erfolgte die Analyse von Antikörper-Titer für Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster zum Diagnosezeitpunkt und erneut bis zu 12 Monate nach Therapieende.
Ergebnis: Insgesamt konnten 195 Kinder und Jugendliche in die Studie eingeschlossen werden. 122 Probanden waren männlich, 73 weiblich. Die größte Patientengruppe war an ALL erkrankt (80 Patienten). Die übrigen Patienten verteilten sich auf 15 Patienten mit AML, 18 Patienten mit NHL, 22 Patienten mit Hodgkin Lymphom. 60 Patienten waren an soliden Tumoren erkrankt. Insgesamt haben 27%, 47%, 19% und 17% der Kinder und Jugendlichen ihren Impfschutz gegen Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster verloren. Hierbei zeigte sich eine Altersabhängigkeit. In der Auswertung zeigte sich bei jüngeren Kindern unter 7 Jahren häufiger ein Titerverlust als bei den älteren Kindern und Jugendlichen. Auch an ALL-erkrankte und behandelte Kinder und Jugendliche verloren häufiger ihren Impfschutz als die Patienten mit anderen untersuchten Krebserkrankungen (AML, NHL, M. Hodgkin, solide Tumore).
Fazit: Die Daten unserer retrospektiven Studie zeigen, dass eine signifikante Anzahl von Kindern und Jugendlichen durch eine chemotherapeutischen Behandlung ihre vorbestehenden Impftiter gegen impfpräventable Erkrankungen wie Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster verlieren. Dieser Verlust zeigt sich häufiger bei jüngeren Patienten und ALL-Patienten. Unsere Daten unterstreichen daher, wie wichtig es ist, Kinder und Jugendliche nach Beendigung der Chemotherapie erneut zu impfen, um einen neuen ausreichenden Impfschutz gegen Masern, Mumps, Röteln und Varizella zoster zu erhalten.
Octanoic acid (C8 FA) is a medium-chain fatty acid which, in nature, mainly occurs in palm kernel oil and coconuts. It is used in various products including cleaning agents, cosmetics, pesticides and herbicides as well as in foods for preservation or flavoring. Furthermore, it is investigated for medical treatments, for instance, of high cholesterol levels. The cultivation of palm oil plants has surged in the last years to satisfy an increasing market demand. However, concerns about extensive monocultures, which often come along with deforestation of rainforest, have driven the search for more environmentally friendly production methods. A biotechnological production with microbial organisms presents an attractive, more sustainable alternative.
Traditionally, the yeast Saccharomyces cerevisiae has been utilized by mankind in bread, wine, and beer making. Based on comprehensive knowledge about its metabolism and genetics, it can nowadays be metabolically engineered to produce a plethora of compounds of industrial interest. To produce octanoic acid, the cytosolic fatty acid synthase (FAS) of S. cerevisiae was utilized and engineered. Naturally, the yeast produces mostly long-chain fatty acids with chain lengths of C16 and C18, and only trace amounts of medium-chain fatty acids, i.e. C8-C14 fatty acids. To generate an S. cerevisiae strain that produces primarily octanoic acid, a mutated version of the FAS was generated (Gajewski et al., 2017) and the resulting S. cerevisiae FASR1834K strain was utilized in this work as a starting strain.
The goal of this thesis was to develop and implement strategies to improve the production level of this strain. The current mode of quantification of octanoic acid includes labor-intensive, low-throughput sample preparation and measurement – a main obstacle in generating and screening for improved strain variants. To this end, a main objective of this thesis was the development of a biosensor. The biosensor was based on the pPDR12 promotor, which is regulated by the transcription factor War1. Coupling pPDR12 to GFP as the reporter gene on a multicopy plasmid allowed in vivo detection via fluorescence intensity. The developed biosensor enabled rapid and facile quantification of the short- and medium-chain fatty acids C6, C7 and C8 fatty acids (Baumann et al., 2018). This is the first biosensor that can quantify externally supplied octanoic acid as well as octanoic acid present in the culture supernatant of producer strains with a high linear and dynamic range. Its reliability was validated by correlation of the biosensor signal to the octanoic acid concentrations extracted from culture supernatants as determined by gas chromatography. The biosensor’s ability to detect octanoic acid in a linear range of 0.01-0.75 mM (≈1-110 mg/L), which is within the production range of the starting strain, and a response of up to 10-fold increase in fluorescence after activation was demonstrated.
A high-throughput FACS (fluorescence-activated cell sorting) screening of an octanoic acid producer strain library was performed with the biosensor to detect improved strain variants (Baumann et al., 2020a). For this purpose, the biosensor was genomically integrated into an octanoic acid producer strain, resulting in drastically reduced single cell noise. The additional knockout of FAA2 successfully prevented medium-chain fatty acid degradation. A high-throughput screening protocol was designed to include iterative enrichment rounds which decreased false positives. The functionality of the biosensor on single cell level was validated by adding octanoic acid in the range of 0-80 mg/L and subsequent flow cytometric analysis. The biosensor-assisted FACS screening of a plasmid overexpression library of the yeast genome led to the detection of two genetic targets, FSH2 and KCS1, that in combined overexpression enhanced octanoic acid titers by 55 % compared to the parental strain. This was the first report of an effect of FSH2 and KCS1 on fatty acid titers. The presented method can also be utilized to screen other genetic libraries and is a means to facilitate future engineering efforts.
In growth tests, the previously reported toxicity of octanoic acid on S. cerevisiae was confirmed. Different strategies were harnessed to create more robust strains. An adaptive laboratory evolution (ALE) experiment was conducted and several rational targets including transporter- (PDR12, TPO1) and transcription factor-encoding genes (PDR1, PDR3, WAR1) as well as the mutated acetyl-CoA carboxylase encoding gene ACC1S1157A were overexpressed or knocked out in producer or non-producer strains, respectively. Despite contrary previous reports for other strain backgrounds, an enhanced robustness was not observable. Suspecting that the utilized laboratory strains have a natively low tolerance level, four industrial S. cerevisiae strains were evaluated in growth assays with octanoic acid and inherently more robust strains were detected, which are suitable future production hosts.
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Der Übergang von der Schule in die Ausbildung oder in das Studium ist ein entscheidender und wegweisender Schritt in der Bildungsbiografie von jungen Menschen. Der dabei vollzogene Übergangsprozess hat sich im Laufe der vergangenen Jahrzehnte deutlich verändert und zunehmend individualisiert. In diesem Zeitraum haben sich auch die Anforderungen und Verhältnisse auf dem Ausbildungs- und Arbeitsmarkt vor allem durch die Expansion des Dienstleistungsbereichs verändert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Entwicklung des Übergangsprozesses in Form der Dauer und der absolvierten Stationen vom Verlassen der Schule bis zum Beginn der beruflichen oder akademischen Erstausbildung vor dem Hintergrund der Zunahme an Arbeitskräften im Dienstleistungssektor bei westdeutschen Jugendlichen im Zeitraum zwischen 1971 und 2012 zu untersuchen. Dies wurde auch getrennt nach Schulabschlussgruppen überprüft. Im Rahmen der Ergebnisse zeigte sich, dass ein gestiegener Anteil an dienstleistungstätigen Arbeitskräften auf dem Arbeitsmarkt in der Zeit zwischen 1971 und 2012 keinen signifikanten Einfluss auf die Dauer und die absolvierten Stationen des Übergangs hatte. Dies galt unabhängig vom erreichten Schulabschluss. Die vorliegenden Erkenntnisse dienen als Anstoß dafür, den Übergangsprozess von der Schule in die Ausbildung genauer zu betrachten und hierbei gegebenenfalls weitere potenzielle Einflussfaktoren einzubeziehen.
Taxa under scrutiny in this thesis are Halophytophthora-like oomycetes. The genus Halophytophthora, proposed in 1990, is an assemblage of unrelated species grouped together on the basis habitat preference, i.e. the mangrove or saltmarsh biome, and morphological similarity to Phytophthora. The premise “Phytophthora-like species from the mangrove environment” became the genus concept for Halophytophthora and lasted for almost 2 decades which resulted to the addition of several species (i.e. H. elongata, H. exoprolifera, H. porrigovesica, H. kandeliae, H. masteri, and H. tartarea). At the onset of molecular phylogenetics, Halophytophthora was inferred as a highly polyphyletic taxon and the genus concept was found to be unsuitable. This thesis adds to this, since six Phytophthora spp. were isolated from the mangrove environment, two of which were found in the Philippines (Phytophthora elongata and Phytophthora insolita). After a thorough assessment of the morphologic and phylogenetic data of taxa included in this thesis, several taxonomic novelties were introduced – a new family (Salispinaceae), a new genus (Calycofera), new species (Calycofera cryptica, Phytopythium dogmae, Phytopythium leanoi, Salisapilia coffeyi, and Salispina hoi), and new combinations (Calycofera operculata, Salisapilia bahamensis, S. elongata, S. epistomia, S. masteri, S. mycoparasitica). In addition, Salisapiliaceae and Salisapilia were emended.
Aufbau: Acoustic Radiation Force Impulse (ARFI)- Bildgebung ist eine auf der konventionellen Ultraschall- Bildgebung basierende Elastographie- Methode, die die quantitative Messung der Festigkeit und Elastizität von Gewebe ermöglicht. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, ARFI- Bildgebung für die Differenzierung von Schilddrüsenknoten zu evaluieren und mit der bereits gut erprobten qualitativen Messmethode der Real-Time Elastographie (RTE) zu vergleichen.
Material und Methoden: ARFI- Bildgebung basiert auf der Aussendung von akustischen Impulsen in Gewebe, wodurch lokale Gewebeverschiebungen hervorgerufen werden. Die dabei entstehenden Transversalwellen wiederum werden über auf Korrelation basierende Methoden mittels Ultraschallwellen detektiert und in m/s angegeben. Einschlusskriterien der Studie waren: Knoten ≥ 5 mm sowie eine zytologische/histologische Aufarbeitung. Alle Patienten erhielten eine konventionelle Ultraschall- Untersuchung, eine Real-Time Elastographie sowie eine ARFI- Bildgebung.
Ergebnisse: Es standen 158 Knoten aus 138 Patienten zur Analyse zur Verfügung. 137 Knoten erbrachten bei der zytologischen/histologischen Aufarbeitung ein benignes Ergebnis, 21 Knoten hingegen wurden als maligne eingestuft. Die mittlere Geschwindigkeit der Messungen der ARFI- Bildgebung in gesundem Schilddrüsengewebe betrug 1,76 m/s, in benignen Knoten 1,90 m/s und in malignen Knoten 2,69 m/s. Es konnte kein signifikanter Unterschied der mittleren Geschwindigkeit zwischen gesundem Schilddrüsengewebe und benignen Knoten ermitteltet werden, wohingegen ein signifikanter Unterschied zwischen malignen Knoten und gesundem Schilddrüsengewebe (p= 0,0019) einerseits und benignen Schilddrüsenknoten (p=0,0039) andererseits bestand. Für die diagnostische Genauigkeit bei der Diagnose von malignen Schilddrüsenknoten konnte kein signifikanter Unterschied zwischen RTE und ARFI- Bildgebung festgestellt werden (0,74 vs. 0,69, p=0,54). Die Kombination von RTE und ARFI- Bildgebung erhöhte die Spezifität bei der Diagnose von malignen Schilddrüsenknoten von 72% (nur RTE) auf 92% (kombiniert).
Schlussfolgerungen: ARFI- Bildgebung kann als zusätzliche Methode bei der diagnostischen Aufarbeitung von Schilddrüsenknoten genutzt werden und liefert dabei einen hohen negativen prädiktiven Wert sowie vergleichbare Ergebnisse wie die RTE.
Get3 in Arabidopsis
(2021)
Der guided entry of tail-anchored proteins (GET) Biogenese-Weg vermittelt den Transport und die Insertion von tail-anchor (TA) Proteinen in die Doppellipidschicht des Endoplasmatischen Retikulums (ER). TA Proteine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Transmembran Domäne (TMD) in den letzten 50 Aminosäuren ihrer Sequenz beherbergen. Diese TMD enthält die notwendigen Informationen, mit denen die Proteine an ihren jeweiligen subzellulären Zielort transportiert werden können. TA Proteine erfüllen eine Vielzahl von essentiellen biologischen Prozessen, sie fungieren zum Beispiel als Rezeptoren, sind maßgeblich an der Fusion von Vesikeln beteiligt sowie an der Initiation von Apoptose. Durch ihren modularen Aufbau können TA Proteine nicht mit dem Signalerkennungspartikel interagieren und müssen deshalb posttranslational zum ER geleitet werden. Im Modellorganismus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) ist der GET Biogenese-Weg am besten beschrieben und läuft wie folgt ab: Nach der Termination der Translation bindet das Protein SgtA das TA Protein und händigt es über den Adapter-Komplex, bestehend aus Get4 und Get5, an die zytosolische ATPase Get3 aus. Get3 ist der zentrale Zielsteuerungsfaktor des GET Biogenese-Weges. Sobald sich ein Komplex aus Zeilsteuerungsfaktor und TA Protein gebildet hat, wird dieses zur Membran des ERs überführt. Dort wird das TA Protein an den Rezeptorkomplex bestehend aus Get1 und Get2 übergeben, welcher anschließend die Insertion des TA Proteins in die Doppellipidschicht des ERs initiiert.
Get3 hat im zellulären Kontext noch eine weitere Funktion. Unter oxidativem Stress oder Energie depletierenden Bedingungen wird Get3 zu spezifischen Foci rekrutiert, an denen sich noch weitere durch Stress -induzierbare Proteine, wie z.B. die der Familie der Hitze Stress Proteine (HSPs) versammeln. Analysen haben gezeigt, dass Get3 unter den oben genannten Bedingungen, Konformationsänderungen durchläuft und dann als ATP unabhängige Holdase fungiert. Diese kann die exponierten, hydrophoben Anteile von Proteinen binden, um dadurch die Proteostasis aufrechtzuhalten.
Durch die Bedeutsamkeit der TA Proteinen ist die zentrale ATPase Get3 in allen Domänen des Lebens hochgradig konserviert. Phylogenetische Analysen ergaben, dass sich Get3 im Allgemeinen in eine „A“ Gruppe sowie eine „BC“ Gruppe aufspaltet. Im Modellorganismus Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) wurden drei Orthologe zu Get3 identifiziert. Eins davon gehört zu der „A“ Gruppe und befindet sich im Zytoplasma. Die anderen zwei Orthologe befinden sich in den Organellen endo-symbiotischen Ursprungs und gehören der „BC“ Gruppe an. Untersuchungen an verschiedenen Deletionsmutanten in A. thaliana haben gezeigt, dass die Mutationen einzelner GET Komponenten zu einer signifikanten Verkürzung der Haarwurzeln führen, obwohl der restliche Habitus der Pflanze unverändert bleibt. Diesbezüglich wurde SYP123 als einziges TA Proteine identifiziert, dessen Abundanz durch die Deletion von GET Komponenten beeinflusst werden kann. Von den anderen beiden Orthologen organellären Ursprungs ist, abgesehen von ihrer Lokalisation nichts weiter bekannt
Vier Orthologe Gruppen in Pflanzen
Da bislang nicht mehr als zehn Pflanzenarten für phylogenetische Analysen herangezogen wurden, wurden in dieser Arbeit die taxonomischen Beziehungen von Get3 zu einander in 50 Spezies der Viridiplantae auf Basis der Orthologie sowie Homologie untersucht. Dies führte zur Identifizierung einer zytolischen (AtGet3a), einer plastidären (AtGet3b), einer mitochondriellen (AtGet3c) sowie einer Monokotyledone spezifischen Gruppe (SBGet3). Die Lokalisation der ersten drei Gruppen wurde in selektierten Pflanzen, sowohl homolog als auch heterolog, der unterschiedlichen Spezies mittels saGFP untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass mehrere Get3 Orthologe mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen eine unter Pflanze häufig auftretende Eigenschaft ist. Das Weitern konnte gezeigt werden, dass manche Komponenten des Präzielsteuerungskomplexes (SgtA und Get4) sowie des Rezeptorkomplexes (Get1) in fast allen der 50 untersuchten Pflanzenarten vorhanden sind. Dies weist auf eine Konservierung des gesamten GET Biogenese-Weges in Pflanzen hin.
Get3a in Arabidopsis thaliana
Da die molekulare Zusammensetzung des Präzielsteuerungskomplexes für AtGet3a in A. thaliana nicht bekannt ist, habe ich Co-Immunpräzipitationen mit Zellextrakten aus weißer Zellkultur und einen von mir selbst aufgereinigten Antikörper gegen AtGet3a durchgeführt. Nach anschließender Gelelektrophorese und einer Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue ließ sich ein reproduzierbares Muster aus Proteinbanden erkennen, welche ausgeschnitten und mittels LC-MS/MS analysiert wurden. Dadurch wurde ein putativer Kandidat für Get5 identifiziert sowie eine Assoziation mit Chaperonen und proteasomalen Untereinheiten.
Um die Zielsteuerungseffizienz und Topologie von ER-Membranproteinen zu analysieren habe ich (i) die rekombinante Synthese eines Modell-TA Proteins mit glykosylierbarem opsin bovine glycosylation Tag (OPG) etabliert sowie (ii) eine Methode etabliert um in isolierten Protoplasten die Richtigkeit der Insertion zu überprüfen. Mit Hilfe dieser Methoden können nun verschiedene Mutanten auf ihre Insertions-Wirksamkeit untersucht werden. Desweitern können durch Mutationsanalysen die notwendigen physikochemischen Eigenschaften für die Erkennung des Substrates ermittelt werden.
Eine weit verbreitete Methode im GET Feld ist die tail-anchor translocation (TAT). Bei dieser Methode werden isolierte mikrosomale Fraktionen des rauen ERs mit rekombinanten Komplexen bestehend aus Zielsteuerungsfaktor und TA Protein inkubiert. Durch einen rekombinanten OPG, der im Lumen des ERs post-translational modifiziert werden kann, ist die Beobachtung einer zeitabhängigen Kinetik der Glykosylierung möglich. Dieses System wurde bislang nur für Komponenten aus Säugern oder Hefen benutzt, aber noch nie mit einem System auf pflanzlicher Basis. Um dies zu verwirklichen, habe ich die rekombinante Proteinexpression soweit optimiert, dass der Großteil des synthetisierten Proteins sich im löslichen Anteil des Lysats statt in den Inclusion Bodies befand. Mittels dieser Optimierung konnte ich die Ko-Expression von Zielsteuerungsfaktor mit TA Protein als löslichen Komplex etablieren. Ergänzend zu den löslichen Komplexen habe ich eine geeignete Methode etabliert um mittels Saccharosegradienten mikrosomale Fraktionen aufzutrennen in denen AtGet3a angereichert ist. Leider müssen noch die Parameter der Reaktion optimiert werden, aber die Akquirierung alle nötigen Bestandteile ist etabliert.
In den letzten 20 Jahren haben sich zunehmend Schülerlabore an Universitäten und Forschungszentren etabliert, um naturwissenschaftliche Kompetenzen von Schülern/innen aufzubauen und zu fördern. Das wachsende Feld der Schülerlaborforschung zeigt allerdings auf, dass die Eingangsvoraussetzungen, mit denen die Schüler/innen an der naturwissenschaftlichen Lernumgebung teilnehmen, einen starken Einfluss auf die Annahme sowie die Entwicklung von interessens-, selbstkonzept- und motivationsbezogenen Persönlichkeitsmerkmalen haben können. Diese Erkenntnisse lenken den Blick auf die Entwicklungsumwelt der Familien, in der die Eltern von Geburt an auf die kindliche Persönlichkeitsentwicklung und Lernprozesse einwirken. Die Integration des vielversprechenden familiären Kontexts in eine naturwissenschaftliche Lernumgebung wird seit 2008 anhand des Eltern-Kind-Projekts KEMIE® an der Ruhr-Universität Bochum umgesetzt, indem Eltern-Kind-Paare gemeinsam an alltagsnahen naturwissenschaftlichen Phänomenen experimentieren. Seit 2016 wird KEMIE® zudem an der Goethe-Universität Frankfurt am Main im Goethe-Schülerlabor Chemie durchgeführt.
Am Beispiel des Frankfurter KEMIE®-Projekts will die vorliegende Arbeit das Potential von Eltern-Kind-Interaktionen für naturwissenschaftliche Lernprozesse untersuchen. Mithilfe der Grounded-Theory-Methodologie wurde das zentrale Forschungsdesiderat der Eltern-Kind-Interaktion über die Projektjahre 2016/17 und 2017/18 herausgestellt sowie mögliche Erhebungsmethoden pilotiert. Im Projektjahr 2018/19 konnte dieses schließlich in einer Mixed-Methods-Studie multiperspektivisch beforscht werden. Dafür wurden Interviews, Beobachtungen und Pre-Posttest-Daten von 46 teilnehmenden Eltern-Kind-Paaren sowie weitere Kontrollgruppendaten von 202 Frankfurter Familien erhoben.
Um zunächst die naturwissenschaftliche Lernumgebung zu beschreiben, wurden die vorherrschenden Einflussfaktoren identifiziert, die zugehörigen Phänomene beschrieben sowie die prozess- und personenbezogenen Verhaltensmuster herausgestellt. Über letztere können die Eltern-Kind-Interaktionen in das SELE-Modell elterlicher Unterstützungsmaßnahmen eingeordnet werden, wobei sich das Ermöglichen von Selbsttätigkeit als herausragendes Merkmal für die naturwissenschaftliche Lernumgebung manifestiert. Zudem zeigt sich, dass das Projekt positive Effekte auf naturwissenschaftsbezogene Werteorientierungen der Kinder sowie deren Interesse an den Naturwissenschaften hat.
Anhand der Entwicklung eines induktiven Beobachtungsschemas, konnten die Familien schließlich über die Verhaltensmerkmale der Eltern-Kind-Interaktion gruppiert und Zusammenhänge zu sowohl den Vorbedingungen als auch den Konsequenzen für die psychischen Dispositionen der Kinder aufgedeckt werden. Erste Erkenntnisse dieser explorativen Erhebung zeigen, dass das akademische Selbstkonzept und die naturwissenschaftsbezogenen Werteorientierungen der Eltern und Kinder die Verhaltensmuster in der naturwissenschaftlichen Umgebung determinieren. Auf der anderen Seite können die Kinder gerade hinsichtlich dieser beiden Faktoren am meisten profitieren. Dabei können diese positiven Effekte auf eine Regulation seitens der Eltern, das gemeinsame Ausführen von Tätigkeiten sowie den Einbezug in die Gestaltung der Lernumgebung zurückgeführt werden.
Analysing survival or fixation probabilities for a beneficial allele is a prominent task in the field of theoretical population genetics. Haldane's asymptotics is an approximation for the fixation probability in the case of a single beneficial mutant with small selective advantage in a large population.
In this thesis we analyse the interplay between genetic drift and directional selection and prove Haldane's asymptotics in different settings: For the fixation probability in Cannings models with moderate selection and for the survival probability of a slightly supercritical branching processes in a random environment.
In Chapter 3 we introduce a class of Cannings models with selection that allow for a forward and backward construction. In particular, a Cannings ancestral selection process can be defined for this class of models, which counts the number of potential parents and is in sampling duality to the forward frequency process. By means of this duality the probability of fixation can be expressed through the expectation of the Cannings ancestral selection process in stationarity. A control of this expectation yields that the fixation probability fulfils Haldane's asymptotics in a regime of moderately weak selection (Thm. 8).
In Chapter 4 we study the fixation probability of Cannings models in a regime of moderately strong selection. Here couplings of the frequency process of beneficial individuals with slightly supercritical Galton-Watson processes imply that the fixation probability is given by Haldane's asymptotics (Thm. 9).
Lastly, in Chapter 5 we consider slightly supercritical branching processes in an independent and identically distributed random environment and study the probability of survival as the number of expected offspring tends from above to one. We show that only if variance and expectation of the random offspring mean are of the same order the random environment has a non-trivial influence on the probability of survival, which results in a modification of Haldane's asymptotics. Out of the critical parameter regime the population goes extinct or survives with a probability that fulfils Haldane's asymptotics (Thm. 10).
The proof establishes an expression for the survival probability in terms of the shape function of the random offspring generating functions. This expression exhibits similarities to perpetuities known from a financial context. Consequently, we prove a limiting theorem for perpetuities with vanishing interest rates (Thm. 11).
My PhD work employed genetic and pharmacological manipulations, coupled with highresolution live imaging, to understand intercellular communications during zebrafish cardiovascular development. The heart is the first organ to form, and it is composed of several tissues, among which interactions are crucial. I identified two important interactions between muscular and non-muscular tissues in poorly characterized contexts, and the molecules required for the signalling. First, I discovered an important cellular and molecular crosstalk orchestrating the development of the cardiac outflow tract (i.e., the aortic root in mammals).
Endothelial-derived TGF-beta signalling controls the generation of the local extracellular matrix (ECM). The ECM in turn affects endothelial proliferation as well as smooth muscle cell organization (Boezio et al, 2020; Bensimon-Brito*, Boezio* et al, 2020). In my second project, I investigated the crosstalk between the epicardial layer and the myocardial wall. By generating epicardial-impairment models, I identified a novel role for the epicardium in regulating cardiomyocyte volume during heart development (Boezio et al, 2021). Ultimately, this research contributed to our understanding of how paracrine signalling controls the multicellular interactions integral to organogenesis.
Bohmian mechanics as formulated originally in 1952, has been useful in the implementation of numerical methods applied to quantum mechanics. The scientific community though has had ever since a critical thought about it. Therefore, there are still points to be clarified and rectified. The two main problems are basically: Bohmian mechanics gives a privilege role to the position representation. Secondly, the current interpretation of Bohmian trajectories has been recently proven wrong.
In this context, in Chapter 2, new complex Bohmian quantities are defined; so that they allow the capacity to formulate Bohmian mechanics in any arbitrary continuous representation, for instance, the momentum representation. This Chapter is fully based on two articles, regarding the proposed complex Bohmian formulation and its extension into momentum space.
Chapter 3 deals with a redefinition and reinterpretation of the Bohmian trajectories from the handling of the continuity equation, this is done without any need of additional postulates or interpretations. Also, it is proved that Bohmian mechanics is actually more than a projective aspect of the Wigner function.
As a third point, Chapter 4 presents a sytematic treatment of the hydrodynamic scheme of Bohmian mechanics. Then, a brief summary of the transport equations in Bohmian mechanics is done. Next, a unified hydrodynamic treatment is found for the Bohmian mechanics. This treatment is useful to sketch, a Bohmian treatment to efficiently find the steady value of the transmission integral.
In Chapter 5 conclusions of this thesis are drawn.
In dieser Dissertation wird der Frage nachgegangen, inwiefern sich unangemessene Behandlung in der praktischen Ausbildung zwischen Medizinstudierenden und Studierenden anderer Studienfächer unterscheidet. Zudem wird untersucht, welcher Einfluss der Hierarchie im angestrebten Beruf von den Probanden diesbezüglich zugemessen wird. Auch wird untersucht, wie sich Persönlichkeitsmerkmale auf die Wahrscheinlichkeit, unangemessene Behandlung zu erleben, auswirken.
The main topic of the present thesis is scene flow estimation in a monocular camera system. Scene flow describes the joint representation of 3D positions and motions of the scene. A special focus is placed on approaches that combine two kinds of information, deep-learning-based single-view depth estimation and model-based multi-view geometry.
The first part addresses single-view depth estimation focussing on a method that provides single-view depth information in an advantageous form for monocular scene flow estimation methods. A convolutional neural network, called ProbDepthNet, is proposed, which provides pixel-wise well-calibrated depth distributions. The experiments show that different strategies for quantifying the measurement uncertainty provide overconfident estimates due to overfitting effects. Therefore, a novel recalibration technique is integrated as part of the ProbDepthNet, which is validated to improve the calibration of the uncertainty measures. The monocular scene flow methods presented in the subsequent parts confirm that the integration of single-view depth information results in the best performance if the neural network provides depth distributions instead of single depth values and contains a recalibration.
Three methods for monocular scene flow estimation are presented, each one designed to combine multi-view geometry-based optimization with deep learning-based single-view depth estimation such as ProbDepthNet. While the first method, SVD-MSfM, performs the motion and depth estimation as two subsequent steps, the second method, Mono-SF, jointly optimizes the motion estimates and the depth structure. Both methods are tailored to address scenes, where the objects and motions can be represented by a set of rigid bodies. Dynamic traffic scenes are one kind of scenes that essentially fulfill this characteristic. The method, Mono-Stixel, uses an even more specialized scene model for traffic scenes, called stixel world, as underlying scene representation.
The proposed methods provide new state of the art for monocular scene flow estimation with Mono-SF being the first and leading monocular method on the KITTI scene flow benchmark at the time of submission of the present thesis. The experiments validate that both kind of information, the multi-view geometric optimization and the single-view depth estimates, contribute to the monocular scene flow estimates and are necessary to achieve the new state of the art accuracy.
Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved cytosolic isobutanol biosynthesis
(2021)
The finite nature of fossil resources and the environmental problems caused by their excessive usage requires alternative approaches. The transformation from a fossil based economy to one based on renewable biomass is called a “bioeconomy”. To substitute fossil resources, various microorganisms have already been modified for the biosynthesis of valuable chemicals from biomass. However, the development of such efficient microorganisms at an industrial scale, remains a major challenge. The most prominent and robust microorganism for industrial production is the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is known to produce ethanol that is used as renewable biofuel. However, S. cerevisiae is also naturally able to produce isobutanol in small amounts. Isobutanol is favoured as a biofuel compared to ethanol due to its higher octane number and lower hygroscopicity, which makes it more suitable for application in conventional combustion engines. In S. cerevisiae, the biosynthesis of isobutanol is permitted by the combination of mitochondrial valine synthesis (catalysed by Ilv2, Ilv5 and Ilv3) and its cytosolic degradation (catalysed by Aro10 and Adh2). The different compartmentalisation of the two pathways limit isobutanol biosynthesis. Thus, Brat et al. (2012) were able to increase the isobutanol yield up to 15 mg/gGlc by cytosolic re localisation of the enzymes Ilv2Δ54, Ilv5Δ48 and Ilv3Δ19 (cyt-ILV), with simultaneous deletion of ilv2. This corresponds to approximately 3.7% of the theoretical yield of 410 mg/gGlc, implying existing limitations in isobutanol biosynthesis, which have been investigated in this work.
For yet unknown reasons, isobutanol was only produced by S. cerevisiae in a valine free medium, according to Brat et al. (2012). This work shows that this can be attributed to the catalytic activity of Ilv2Δ54, which acted as growth inhibitor to S. cerevisiae. By this logic, a negative selection on the ILV2∆54 gene was exerted, which made the ilv2 deletion and simultaneous valine exclusion necessary to maintain the functional expression of toxic ILV2∆54. Furthermore, it was shown that valine exclusion is not mandatory due to the feedback regulation of Ilv2, permitted by Ilv6. Rather, increased isobutanol yield was observed when cytosolic Ilv6∆61 was expressed in the valine free medium, which is explained by the enhanced regulation of Ilv2Δ54 by Ilv6∆61 when BCAA are absent. Isobutanol biosynthesis is neither redox nor NAD(P)H co factor balanced. It was seen that co factor imbalance could be mitigated by the expression of an NADH oxidase (NOX), but not by expression of the NADH dependent ilvC6E6, since the latter showed low in vivo activity. Furthermore, it was seen that NAD(H) imbalance did already limit isobutanol biosynthesis, but the NADP(H) imbalance did not. Another limitation of cytosolic isobutanol biosynthesis is the secretion of the intermediate 2‑dihydroxyisovalerate, which then no longer is taken up by S. cerevisiae, causing a reduced isobutanol yield. This is attributed to insufficient Ilv3∆19 activity, due to poor iron sulphur cluster apo protein maturation. Therefore, it was aimed to replace Ilv3∆19 by heterologous dihydroxyacid dehydratases. Even though some of the enzymes were functionally expressed, none showed better in vivo activity than Ilv3∆19. Therefore, the Ilv3∆19 apo protein maturation was improved. This was achieved by the genomic deletion of fra2 or pim1 as well as by the cytosolic expression of Grx5∆29.
In addition to the isobutanol pathway, S. cerevisiae was optimised for isobutanol biosynthesis by rational and evolutionary engineering. For this purpose, the genes which are necessary for isobutanol production were integrated into the ilv2 locus, and the resulting strain was evolved in a medium containing the toxic amino acid analogue norvaline. Evolved single colonies were isolated, which presented improved growth and increased isobutanol yields (0.59 mg/gGlc) in a valine free medium, as compared to the initial strain. This is explained by a gene dosage effect which occurred during the evolutionary engineering experiment. In collaboration with Dr. Wess, the genes ilv2, bdh1/2, leu4/9, ecm31, ilv1, adh1, gpd1/2 and ald6 were cumulatively deleted in CEN.PK113 7D to block competing metabolic pathways. The resulting strain JWY23 achieved isobutanol yields up to 67.3 mg/gGlc, when expressing the cyt ILV enzymes from a multi copy vector. The most promising approaches of this work, namely the deletion of fra2 and the expression of Grx5∆29, Ilv6∆61, and NOX, were confirmed in this JWY23 strain. The highest isobutanol yield from this work was observed at 72 mg/gGlc for Ilv6∆61 and cyt ILV enzymes expressing JWY23, which corresponds to 17.6% of the theoretical isobutanol yield.
Isobutyric acid (IBA) is a by product of isobutanol biosynthesis, but it is also considered a valuable platform chemical. Therefore, the approaches that improved isobutanol biosynthesis were applied to the biosynthesis of IBA in S. cerevisiae. The highest IBA yield of 9.8 mg/gGlc was observed in a valine free medium by expression of cyt ILV enzymes, NOX and Ald6 in JWY04 (CEN.PK113 7D Δilv2; Δbdh1; Δbdh2; Δleu4; Δleu9; Δecm31; Δilv1). This corresponded to an 8.9 fold increase compared with the control and is, to our best knowledge, the highest IBA yield reported to date for S. cerevisiae.
Most cellular processes are regulated by RNA-binding proteins (RBPs). These RBPs usually use defined binding sites to recognize and directly interact with their target RNA molecule. Individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) experiments are an important tool to de- scribe such interactions in cell cultures in-vivo. This experimental protocol yields millions of individual sequencing reads from which the binding spec- trum of the RBP under study can be deduced. In this PhD thesis I studied how RNA processing is driven from RBP binding by analyzing iCLIP-derived sequencing datasets.
First, I described a complete data analysis pipeline to detect RBP binding sites from iCLIP sequencing reads. This workflow covers all essential process- ing steps, from the first quality control to the final annotation of binding sites. I described the accurate integration of biological iCLIP replicates to boost the initial peak calling step while ensuring high specificity through replicate re- producibility analysis. Further I proposed a routine to level binding site width to streamline downstream analysis processes. This was exemplified in the re- analysis of the binding spectrum of the U2 small nuclear RNA auxiliary factor 2 (U2AF2, U2AF65). I recaptured the known dominance of U2AF65 to bind to intronic sequences of protein-coding genes, where it likely recognizes the polypyrimidine tract as part of the core spliceosome machinery.
In the second part of my thesis, I analyzed the binding spectrum of the serine and arginine rich splicing factor 6 (SRSF6) in the context of diabetes. In pancreatic beta-cells, the expression of SRSF6 is regulated by the transcription factor GLIS3, which encodes for a diabetes susceptibility gene. It is known that SRSF6 promotes beta-cell death through the splicing dysregulation of genes essential to beta-cell function and survival. However, the exact mechanism of how these RNAs are targeted by SRSF6 remains poorly understood. Here, I applied the defined iCLIP processing pipeline to describe the binding landscape of the splicing factor SRSF6 in the human pancreatic beta-cell line EndoC-H1. The initial binding sites definition revealed a predominant binding to coding sequences (CDS) of protein-coding genes. This was followed up by extensive motif analysis which revealed a so far, in human, unknown purine-rich binding motif. SRSF6 seemed to specifically recognize repetitions of the triplet GAA. I also showed that the number of contiguous triplets correlated with increasing binding site strength. I further integrated RNA-sequencing data from the same cell type, with SRSF6 in KD and in basal conditions, to analyze SRSF6- related splicing changes. I showed that the exact positioning of SRSF6 on alternatively spliced exons regulates the produced transcript isoforms. This mechanism seemed to control exons in several known susceptibility genes for diabetes.
In summary, in my PhD thesis, I presented a comprehensive workflow for the processing of iCLIP-derived sequencing data. I applied this pipeline on a dataset from pancreatic beta-cells to unveil the impact of SRSF6-mediated splicing changes. Thus, my analysis provides novel insights into the regulation of diabetes susceptibility genes.
Fatty acids in oomycetes
(2021)
The vascular endothelium is a monolayer of endothelial cells that builds the inner lining of the blood vessels and constitutes a regulatory organ within the physiological system to sustain homeostasis. Endothelial cells participate in physiological processes including inflammation and angiogenesis. Dysregulation of these processes, however, can evoke or maintain pathological disorders, including cardiovascular and chronic inflammatory diseases or cancer. Although pathological inflammation and angiogenesis represent treatable conditions, current pharmacotherapeutic approaches are frequently not satisfying since their long-term application can evoke therapy resistance and thus reduced clinical efficacy. Consequently, there is an ongoing demand for the discovery of new therapeutic targets and drug leads. Considering that endothelial cells play a critical role in both angiogenesis and inflammation, the vascular endothelium represents a promising target for the treatment of diseases.
Vioprolide A is a secondary metabolite isolated from the myxobacterium Cystobacter violaceus Cb. vi35. Recently, vioprolide A was identified to interact with NOP14, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis. Ribosome biogenesis is an indispensable cellular event that ensures adequate homeostasis. Abnormal alterations in the ribosome biogenesis, referred to as ribosomopathies, however, can lead to an overall increase in the risk of developing cancer. Accordingly, several studies have outlined the involvement of NOP14 in cancer progression and metastasis, and vioprolide A has been demonstrated to exert anti-cancer effects in vitro. However, the impact of vioprolide A and NOP14 on the endothelium has been neglected so far, although endothelial cells are crucially involved in inflammation and angiogenesis under both physiological and pathological conditions.
In the present study, the effect of vioprolide A on inflammatory and angiogenic actions was analysed. In vivo, the laser-induced choroidal neovascularization (CNV) assay outlined a strong inhibitory effect of vioprolide A on both inflammation and angiogenesis. Furthermore, intravital microscopy of the cremaster muscle in mice revealed that vioprolide A strongly impaired the TNF-induced leukocyte-endothelial cell interaction in vivo.
In further experiments, the specific effect of vioprolide A on activation processes of primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was examined. According to the in vivo results, vioprolide A decreased the leukocyte-endothelial cell interaction in vitro through downregulating the cell surface expression and total protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin. Vioprolide A evoked its anti-inflammatory actions via a dual mechanism: On the one hand, the expression of pro-inflammatory proteins, including TNFR1 and cell adhesion molecules, was lowered through a general downregulation of de novo protein synthesis. The inhibition of de novo protein synthesis is most likely linked to the interaction with and inhibition of NOP14 by vioprolide A in HUVECs. On the other hand, the natural product prevented the nuclear translocation and promotor activity of the pro-inflammatory transcription factor NF-ĸB. Interestingly, most anti-inflammatory compounds that interfere with the NF-ĸB signaling pathway prevent NF-ĸB nuclear translocation through recovering or stabilizing the inhibitory IĸB proteins. Vioprolide A, however, decreased rather than stabilized the IĸB proteins and prevented NF-ĸB nuclear translocation through interfering with its importin-dependent nuclear import. By performing siRNA-mediated knockdown experiments, we evaluated the role of NOP14 in inflammatory processes in HUVECs and could establish a causal link between the anti-inflammatory actions of vioprolide A and the deletion of NOP14.
Besides exerting anti-inflammatory actions, we found that vioprolide A potently decreased the angiogenic key features proliferation, migration and sprouting of endothelial cells. Mechanistically, the natural product interfered with pro-angiogenic signaling pathways. Vioprolide A reduced the protein level of growth factor receptors, including VEGFR2, which is the most prominent receptor responsible for angiogenic signaling in endothelial cells. This effect was based on the general inhibition of de novo protein synthesis by the natural product. Downregulation of growth factor receptors impaired the activation of downstream signaling intermediates, including the MAPKs ERK, JNK and p38. To our surprise, however, activation of Akt, another downstream effector of VEGFR2, was increased rather than decreased. Furthermore, vioprolide A lowered the nuclear translocation of the transcriptional coactivator TAZ, which is regulated by the evolutionary conserved Hippo signaling pathway. Interestingly, however, and in contrast to NF-ĸB, TAZ nuclear translocation in mammalian cells seems to be independent of importins. In this context, we found that vioprolide A reduced both the protein level and nuclear localization of MAML1, which is needed to retain TAZ in the nucleus after its successful translocation.
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In dem vergangenen Jahrzehnt sah sich der Kindergarten vor neuen Herausforderungen gestellt, welche die Gesellschaft an ihn heranträgt: Das ist einerseits der gestiegene Anspruch an die Bildungsarbeit bereits im Kindergarten und andererseits der Anspruch an die bessere Vereinbarkeit von Familie und Beruf. Vor diesem Hintergrund werden in der vorliegenden Arbeit die Strukturen der pädagogischen Praxis im Kindergartenalltag analysiert und beschrieben.
Datengrundlage sind Videografien von Kindergartenalltagen in 61 Kindergartengruppen, davon 41 Aufnahmen in Deutschland und 20 in der Deutschschweiz. Zusätzlich wurden die strukturellen Rahmenbedingungen mit einem Fragebogen erhoben. Diese Daten entstanden im Rahmen der Studie „Professionalisierung im Elementarbereich“ (PRIMEL) (Kucharz et al., 2014), welche in der Linie „Ausweitung der Weiterbildungsinitiative Frühpädagogische Fachkräfte“ (AWiFF) vom BMBF gefördert wurde.
Zur Beantwortung der Fragestellung wurden in Anlehnung an Andrist und Chanson (2003) die Videografien inhaltsanalytisch (deskriptiv und induktiv ergänzt) hinsichtlich der gezeigten Strukturelemente kodiert, welche die Gestaltung eines Kindergartenalltags ausmachen: geführte Sequenz, freie Sequenz, angeleitete Sequenz und verbindende Sequenz. Mit Hilfe einer Clusteranalyse (Ward-Methode) wurden die unterschiedliche Verteilung der Sequenzen eines gezeigten Alltages gruppiert und somit einem Strukturierungsmuster (Cluster) zugeordnet. Die Clusteranalyse ergab, dass die Strukturen der pädagogischen Praxis drei Strukturierungsmuster bilden: „Kind-initiiert“, „Fachperson-initiiert“ und „Alltags-orientiert“. In allen Strukturierungsmuster kommen alle Strukturelemente vor. Kennzeichnend für das Strukturierungsmuster „Kind-initiiert“ ist das häufige Vorkommen der freien Sequenz und für das Strukturierungsmuster „Fachpersonen-initiiert“ die vielen geführten Sequenzen. Im Strukturierungsmuster „Alltags-orientiert“ machen verbindenden Sequenzen (Rituale, Routine, Essen und Übergänge), welche alltägliche Handlungen und Rituale umfassen, den größten Teil der Zeit aus.
Die Gestaltung des Mittagessens wurde in drei Videografien inhaltsanalytisch hinsichtlich der Arrangements analysiert. Hier ließen sich induktiv vier Kategorien – Instruktion/ Anweisung, Autonomie/Eigenständigkeit, Akzeptanz von Vorlieben und Abneigungen, Klima/Kultur/Rituale – herausarbeiten und drei Gestaltungstypen – „Familienähnlich“, „Mensaähnlich“ und „pädagogisches Familien-Restaurant“ – unterscheiden.
Die Ergebnisse zeigen auf, dass neben der Altersspanne der Kinder in der Gruppe, das Makrosystem (Länderebene) die Tagesgestaltung des Kindergartens stark beeinflusst. Die Sichtbarmachung der Strukturen auf der Mesoebene ermöglicht es, diese vergleichend zu diskutieren und Implikationen für die pädagogische Praxis abzuleiten.
Hintergrund: Die Atheroskleroseexpression unterscheidet sich nicht nur in unterschiedlichen Gefässbetten (koronar, zerebrovaskulär, peripher), sondern auch innerhalb des peripheren Gefässbettes. Der zugrundeliegende Mechanismus für unterschiedliche Atherosklerose-Phänotypen mit proximalem (iliakale Arterien) oder distalem (infragenikuläre Arterien) Atheroskleroseverteilungsmuster ist bis jetzt noch nicht abschliessend geklärt.
Zielsetzung: Das Ziel dieser monozentrischen retrospektiven Kohortenstudie ist es, den Zusammenhang zwischen kardiovaskulären Risikofaktoren und dem Atheroskleroseverteilungs-muster bei Patienten mit PAVK zu untersuchen. Dafür werden symptomatische Patienten mit extremen Atherosklerosephänotypen (proximale vs. distale Atherosklerose) genauer untersucht.
Methodik: Für diese Querschnittsstudie wurden Daten von 15’000 Patienten, welche sich im Zeitraum von 2000-2018 aufgrund einer symptomatischen PAVK einer primären endovaskulären Rekanalisation an den unteren Extremitäten unterziehen liessen, ausgewertet. Dabei wurden die Patienten herausgefiltert, welche angiographisch ein proximales (iliakal) oder distales (krural) Atheroskleroseexpressionsmuster aufwiesen. Von diesen Personen wurden in der Datenbank personen- und gesundheitsbezogene klinischen Angaben extrahiert. In einer multiplen logistischen Regressionsanalyse mit Rückwärtselimination der unabhängigen Variablen wurde der Einfluss verschiedener kardiovaskulärer Risikofaktoren mit proximaler oder distaler Atherosklerosexpression ermittelt.
Resultate: Von insgesamt 637 indentifizierten Patienten (29% Frauen) mit einer primären endovaskulären Rekanalisation hatten 351 (55%) ein proximales und 286 (45%) ein distales Atheroskleroseverteilungsmuster. Weibliches Geschlecht (OR 0.33, (95%CI 0.20-0.54), p=0.011), aktiver Nikotinkonsum (OR 0.16, (95%CI 0.09-0.28), p<0.001), vormaliger Nikotinkonsum (OR 0.33, (95%CI 0.20-0.57), p<0.001), Hypertriglyzeridämie (OR 0.76, (95%CI 0.60-0.96), p=0.021) waren assoziiert mit einem proximalen Befall. Diabetes mellitus (OR 3.25, (95%CI 1.93-5.46), p<0.001), chronische Niereninsuffizienz (OR 1.18, (95%CI 1.08-1.28), p<0.001) und höheres Alter (OR 1.31, (95%CI 1.06-1.61), p=0.011) waren hin-gegen mit einem distalen Befall assoziiert. Andere Faktoren wie Body Mass Index, arterielle Hypertonie, HDL-, LDL-Cholesterin zeigten keine Assoziation mit den untersuchten atherosklerotischen Prädilektionsstellen. Die Resultate der primären Analysen konnten mit den Subgruppenanalysen (Geschlecht, Nikotinkonsum, Diabetes) bestätigt werden.
Schlussfolgerung: Für distale (krurale) Atherosklerose wurden als Hauptrisikofaktoren Diabetes mellitus und chronische Niereninsuffizienz ermittelt. Obwohl kardiovaskuläre Risikofaktoren auf das gesamte Gefässbett wirken, lassen sich aus den Daten in Bezug auf das Atheroskleroseverteilungsmuster eine geschlechtspezifische und eine individuelle Suszeptibilität für kardiovaskuläre Risikofaktoren vermuten. Ausserdem deuten die Daten darauf hin, dass die PAVK mindestens zwei verschiedene atherosklerotische Phänotypen aufweist.
Untersuchungen zum HIV-assoziierten Immun-Rekonstitutions-Inflammationssyndrom bei Tuberkulose
(2021)
HIV- und Tuberkulose (TB)-koinfizierte Patienten können nach Beginn einer antiretroviralen Therapie (ART) als Komplikation ein Immunrekonstitutionssyndrom (IRIS) entwickeln. Dabei kommt es zu einem Neuauftreten oder einer Verschlechterung von klinischen Symptomen oder radiologischen Befunden im Zusammenhang mit der TB. Präsentieren kann sich ein IRIS entweder als eine plötzliche Verschlechterung der Infektion nach ART-Beginn („paradoxical/paradoxes IRIS“) oder durch ein Demaskieren einer vorher klinisch inapparenten und unbehandelten Infektion („unmasking/demaskierendes IRIS“). Aufgrund nicht einheitlich definierter Diagnosekritierien kann die Diagnosestellung im klinischen Alltag eine Herausforderung darstellen.
Ziel dieser Dissertation war es deshalb, klinische Charakteristika, Risikofaktoren und ggf. protektive Faktoren für die Entwicklung eines IRIS bei TB zu identifizieren. Diese Ergebnisse sollten zu besseren Verständnis und Vorhersagen von IRIS im Zusammenhang mit TB beitragen.
Dazu wurden retrospektiv Daten von 52 Patienten, die im Zeitraum 01.01.2010 - 30.06.2016 mit einer HIV-Infektion und zur Behandlung einer aktiven Tuberkulose stationär in der Infektiologie des Uniklinikums Frankfurts aufgenommen wurden, pseudonymisiert erfasst. Es wurden u. a. Arztbriefe, Laborbefunde, Fieberkurven und Visitenberichte aus dem Patientenmanagementprogramm „ORBIS“, der Datenbank „epidem“ und des Laborinformationsprogramms „Nexus swisslab“ des Uniklinikums Frankfurt genutzt. Zu den Parametern gehörten neben patientenspezifischen Daten wie Alter und Geschlecht unter anderem auch Routinelaborparameter, Serologien, Art der TB, genaue ART und TB-Therapien und Laborparameter, die zur Beurteilung einer Entwicklung der Immunrekonstitution und der virologischen Suppression hinweisend sind. Dazu zählen insbesondere HI-Viruslastwerte, CD4- und CD8-Zellzahlen für einen Zeitraum von 48 Wochen ab ART-Beginn.
Zur Untersuchung der unterschiedlichen IRIS-Arten wurden die Patienten in zwei Gruppen aufgeteilt: bereits mit einer ART vorbehandelte Patienten, bei denen somit die Entwicklung eines demaskierendem IRIS möglich war, und ART-naive Patienten, die theoretisch ein paradoxes IRIS entwickeln konnten. Durch Beurteilung des Krankheitsverlaufes und unter spezieller Berücksichtigung der HI-Viruslast im Verlaufe der ART wurde nach der IRIS-Definition von French et al. (2004) festgelegt, ob ein IRIS vorlag. Bei unklaren Fällen erfolgte eine gemeinsame Besprechung und definitive Einteilung im kliniksinternen Kolloquium. Schließlich wurde die statistische Auswertung mithilfe des Statistikprogramms „bias“ durchgeführt und dabei jeweils die „IRIS“ mit der „Nicht-IRIS“-Gruppe verglichen. Angewandt wurden der Exakte Fisher-Test für kategorische und der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test für numerische Variablen.
Die paradoxe IRIS-Inzidenz betrug 29,7 %, die demaskierende IRIS-Inzidenz 46,7 %. Am häufigsten präsentierte sich das IRIS in der Frankfurter Kohorte mit Fieber, am zweithäufigsten als Lymphadenopathie oder mit respiratorischen Beschwerden. Für sowohl Patienten mit paradoxem als auch demaskierendem IRIS zeigte sich ein signifikant längerer Krankenhausaufenthalt als für Patienten, die kein IRIS entwickelten. Sonst wurden für das demaskierende IRIS keine weiteren statistisch signifikanten Parameter gefunden, u. a. aufgrund Limitationen wie der sehr kleinen Studienpopulation (15 Patienten).
Patienten mit paradoxem IRIS hatten zudem eine signifikant höhere Rehospitalisierungsrate (63,3 % vs. 15,4 %; p= 0,006), was die klinische Relevanz aufzeigt. Außerdem korrelierten extrathorakale TB-Manifestationen (p= 0,025), niedrige CD4+-Lymphozyten-Zellzahl (p= 0,006) und hohe Viruslast (p= 0,017) vor ART-Beginn mit einer paradoxen TB-IRIS-Entwicklung. Diese Patienten sollten folglich nach ART-Beginn besonders engmaschig klinisch kontrolliert werden, da bei ihnen ein IRIS wahrscheinlicher ist. Ebenfalls statistisch signifikant zeigte sich erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH) und erniedrigtes Albumin im Serum. In Kombination mit den davorgenannten Parametern könnten die Werte dabei behilflich sein, das individuelle paradoxe IRIS-Risiko bei Tuberkulose einzuschätzen. ART-Bestandteile oder Zeit zwischen dem Beginn der TB-Therapie und ART hatten in der Studie keinen Einfluss.
Stereotaktische Methoden bieten in der Neurochirurgie die Möglichkeit, minimalinvasiv selbst tiefgelegene Strukturen zielgenau anzusteuern. Rahmensysteme wie der Leksell®-Rahmen der Firma Elekta gelten als Goldstandard zur Führung von Biopsienadeln oder Tiefenelektroden im Gehirn. Hierzu erfolgt eine dreidimensionale Planung des Eingriffes anhand einer präoperativen Magnetresonanz- oder Computertomographie. Die Einstellung der Trajektorie erfolgt am stereotaktischen Rahmen händisch über die Einstellung der Winkel- und Längenmaße. Bei den neueren, roboterassistierten Verfahren, bspw. mit dem ROSA®-Roboter der Firma Zimmer Biomet Robotics, erfolgt nach der schichtbildgebungsbasierten dreidimensionalen Planung eine automatisierte Einstellung der Trajektorie, welche prozedurale und zeitliche Vorteile verspricht.
Das Ziel dieser Arbeit ist es gewesen, die beiden Systeme in einem phantombasierten Setting einem direkten Vergleich zu unterziehen. Hierfür ist experimentell die Genauigkeit des Leksell®-Rahmens bestimmt und Daten zur Genauigkeit des ROSA®-Roboters aus einer vorangegangenen Studie von T. R. Wöbbecke herangezogen worden.
Die Genauigkeitsmessungen des Leksell®-Rahmens sind an einem Phantom in der Abteilung für Stereotaxie des Universitätsklinikums Köln durchgeführt worden. Vom Phantom sind fünf unabhängige Dünnschicht-CTs (Schichtdicke 0,67 mm, Pixelgröße 0,63 mm, Matrix 512×512) durchgeführt worden, an jedem CT sind 10 Trajektorien auf die insgesamt fünf Zielpunkte des Phantoms mit der Planungssoftware iPS geplant worden. Das Phantom ist im Strahlengang einer stereotaktischen Röntgenanlage fixiert und die berechneten Koordinaten für die Trajektorien an der Zielvorrichtung des Leksell®-Rahmens eingestellt worden. Die entsprechende Trajektorie wurde mittels einer Kanüle ausgeführt.
Zur Objektivierung der Genauigkeit wurden die Abstände zwischen Zielpunkt und Kanülenspitze mit einer zweidimensionalen stereotaktischen Röntgenanlage ermittelt.
Die Röntgenaufnahmen wurden in die ROSA®-Software eingespielt und der euklidische Abstand von Kanülenspitze zu Zielpunkt unter Erfassung der Abweichung in x-, y- und z-Achse ermittelt. Im Anschluss wurde die Genauigkeit des Leksell®-Stereotaxiesystems mit der im Vorfeld unter identischen Messbedingungen und mit den gleichen Geräten ermittelten ROSA®-Robotergenauigkeit8 verglichen.
Die mittlere euklidische Abweichung des Leksell®-Stereotaxiesystems betrug 0,72 mm, die mittlere Tiefenabweichung -0,2 mm, die mittlere seitliche Abweichung 0,65 mm.
Verglichen mit den unter identischen Bedingungen erhobenen Ergebnissen der ROSA®-Versuchsreihe hat sich ein signifikanter Unterschied zugunsten des Roboters in der euklidischen (0,53 mm) und seitlichen (0,43 mm), nicht aber in der Tiefenabweichung (-0,22 mm) gezeigt.
In dieser Studie ist gezeigt worden, dass die Genauigkeit des bisherigen Goldstandards, des stereotaktischen Rahmens, gegenüber dem ROSA®-Roboter geringer ist. Der Unterschied
befindet sich zwar im Submillimeterbereich, ist jedoch signifikant. In der klinischen Situation nehmen noch weitere Faktoren Einfluss auf die Genauigkeit, welche in einer Phantomstudie nicht erfasst werden können. Zudem ergeben sich in der klinischen Situation noch weitere Vorteile des Roboters, beispielsweise zeitliche und prozedurale Faktoren, die den Roboter gegenüber dem Rahmen überlegen machen. Perspektivisch ist zu erwarten, dass der Einsatz roboterassistierter Verfahren in den industrialisierten Nationen weiter ausgebaut wird.
Einleitung: Der Typ 1 Diabetes (T1D) ist eine Autoimmunendokrinopathie, die mit zahlreichen Langzeitkomplikationen assoziiert ist. Kardiovaskuläre Erkrankungen (CVD) stellen hierbei den zentralen Grund für Morbidität und Mortalität dar. Ihre Pathogenese wird zunehmend im Kontext autoimmunologischer Prozesse diskutiert. Wir konnten bereits zeigen, dass Vitamin D (VD) sowohl immunmodulatorische als auch gefäßprotektive Effekte vermittelt. Daher untersuchten wir, ob durch VD die inflammatorische Aktivität CD8+ zytotoxischer T-Zellen (CTL) von Patienten mit T1D ohne und mit kardiovaskulärer Komplikation beeinflusst werden kann.
Methoden: Primär isolierte CTLs von sowohl Patienten mit T1D ohne (T1D Ø CVD, n = 20) und mit CVD (T1D + CVD, n = 20) als auch von gesunden Kontrollprobanden (HCs , n = 20) wurden über 72 h in An- bzw. Abwesenheit (+/-VD) von VD (1,25(OH)2D3) kultiviert. Die relative mRNA-Transkriptmenge der Zytokine IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-6 und IL-10 sowie der Zelloberflächen- und Seneszenzmarker CD28, CD57 und CD95 wurde mittels RTqPCR analysiert. Zudem wurde die Proteinkonzentration der sezernierten Zytokine mittels CBA quantifiziert.
Ergebnisse: Die VD-Behandlung in vitro reduzierte die relative mRNA-Transkriptmenge von IL-2 (p = 0.01 und p = 0.02 resp.) und IFN-γ (p = 2x10-6 resp.) in CTLs von Patienten und HCs während die Genexpression von IL-4 (p = 2x10-6 und p = 2x10-3 resp.) und IL-6 (p = 2x10-6 und p = 4x10-6 resp.) erhöht wurde. Überdies war der VD-Effekt (ΔVDbehandelt-unbehandelt) auf die IL-4 Genexpression bei T1D + CVD stärker ausgeprägt als in der Kontrollgruppe (1.7 vs. 1.1; p = 0.03). Subgruppenanalysen zeigten zudem eine reduzierte IL-2 Genexpression durch die Behandlung mit VD in vitro bei T1D + CVD bei manifester diabetischer Nephropathie (142 vs. 97; p = 0.04) wohingegen dies bei erhaltener Nierenfunktion nicht beobachtet werden konnte (62 vs. 56; p = 0.31).
Schlussfolgerung: Die breite Modifikation der Genexpressionslevel untersuchter Zytokine bestätigt den immunmodulatorischen Effekt von VD bei Patienten mit T1D und kardiovaskulärer Komplikation. Die stark reduzierte Genexpression des pro-inflammatorischen IFN-γ legt hierbei einen potenziellen Effekt von VD in der Prävention chronisch-inflammatorischer Prozesse nahe. Die gruppenübergreifend unterschiedlich ausgeprägten VD-Effekte auf die Genexpression von IL-4 sowie die Subgruppenanalysen deuten jedoch auf eine relevante Heterogenität der immunmodulatorischen VD-Effekte hin: sowohl der individuelle klinische Zustand unter Einbeziehung assoziierter Komorbiditäten wie der diabetischen Nephropathie als auch die genetischen Variationen des VD-Systems müssen in groß angelegten Follow-up-Studien weiter untersucht werden, um optimale VD-Dosis-Effekte für klinisch relevante Subgruppen zu identifizieren.
Fragestellung und Ziele
Die vorliegende Dissertation untersucht, auf welche Weisen der Roman Lodore von Mary Shelley die Erziehung von Mädchen inhaltlich und stilistisch gestaltet. Daran anknüpfend erforscht die Arbeit, welche Implikationen die Art der Darstellung für die Interpretation des gesamten Romans birgt. Die Analyse der Inszenierung der Mädchenerziehung dient somit als Basis und Fokuspunkt, durch welchen sich die weitere Erforschung der Sprache und Mechanismen des Romans sowie von Shelleys schriftstellerischer Handwerkskunst entwickelt.
Die Zielsetzung ist darauf ausgerichtet, zur Wiederentdeckung von Lodore beizutragen und eine holistische Neubewertung der Autorin Mary Shelley sowie ihres Spätwerks anzuregen. In Abgrenzung zum Gros der wissenschaftlichen Abhandlungen zu Mary Shelleys Spätwerk konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf den Text als solchen in seiner Gestalt, seinem Inhalt und seinen Aussagen. Shelleys Biographie und ihre weiteren Veröffentlichungen wie etwa Frankenstein werden derweil bewusst ausgeblendet. Untersucht werden somit ausschließlich der Roman Lodore und das darin manifestierte Handwerk der Autorin, nicht jedoch ihr restliches Werk, ihre Person oder ihr Lebensumfeld.
Methodik
Da Lodore das Thema Mädchenerziehung nicht explizit thematisiert, entwickelt und erprobt die vorliegende Abhandlung eine Methodik, die es ermöglicht, einen Text auf Aspekte hin zu erforschen, welche er nur peripher zu tangieren scheint. Um jene für den Untersuchungsschwerpunkt relevanten Details identifizieren zu können, die in den Text beiläufig, untergründig oder selbstverständlich verwoben sind und die Erziehung von Mädchen charakterisieren, stützt sich die Arbeit auf eine diskursanalytische und kulturwissenschaftliche Betrachtung dessen, was der Begriff „Mädchenerziehung“ im Kontext des 18. und 19. Jahrhunderts umfasst.
Fundament dieser Sensibilisierung für die zeitgenössische, historische Perspektive auf die Erziehung von Mädchen sind, erstens, Abhandlungen der historischen Bildungsforschung zu Mädchenerziehung im 18. und 19. Jahrhundert in Europa und speziell in England. Zweitens werden aktuelle, wissenschaftliche Abhandlungen über den historischen Diskurs von Erziehungstheoretikern /-theoretikerinnen über Mädchenerziehung dazu genutzt, ein grundlegendes Verständnis aus moderner Perspektive auf die damaligen Denkmuster und Fragestellungen zu gewinnen. Drittens wird die Sensibilisierung für die zeitgenössischen Überlegungen und Ausdrucksweisen zum Thema Mädchenerziehung abgerundet durch das eigenständige Studium originaler Publikationen von Erziehungstheoretikern /-theoretikerinnen. Feinabgestimmt auf die Problemfelder und die historischen, erziehungsphilosophischen Grundpositionen untersucht die Arbeit in intensivem close reading die Darstellung der Mädchenerziehung und deren resultierenden Einfluss auf das Leben und Verhalten der weiblichen Figuren in Lodore.
Ergebnisse
Die Abhandlung erkennt unter der zunächst konventionell und unanstößig anmutenden Textoberfläche einen systematisch konstruierten, konsistenten Subtext. Die Dissertation charakterisiert die wiederkehrenden Techniken und sprachlichen Muster, mit denen der Subtext implementiert ist. Dadurch macht sie nachvollziehbar, inwiefern die emotionale Reaktion des Lesers auf den Roman im Sinne von Unverständnis, Irritation oder Amüsement nicht zufällig auftritt, sondern durch Mary Shelleys schriftstellerisches Handwerk bewusst provoziert wird.
Im Subtext verborgen identifiziert die Dissertation, erstens, eine Einladung zur kritischen Betrachtung systemkonformer Wertvorstellungen zum Leben von Frauen in der Familie und in der Gesellschaft. Dabei demonstriert die Interpretation, wie der Roman traditionelle und literarische Idealisierungen von „Weiblichkeit“ entzaubert, während er gleichzeitig alternative, geschlechtsneutrale Lebensentwürfe für Frauen anerkennend präsentiert.
Zweitens beobachtet die Arbeit im Subtext vielfältige Hinweise auf Missstände im Lebensalltag von Frauen und weist nach, dass der Roman insbesondere Momente der geschlechtsdiskriminierenden Vorverurteilung durchgängig inszeniert. Diese Problematisierung versteht die Dissertation als eine Aufforderung an den Leser / die Leserin, den eigenen Leseprozess des Romans in Bezug auf Informationsdistribution, Disposition und Verteilung der Sympathien selbstkritisch zu reflektieren.
Drittens entdeckt die Abhandlung im Subtext des Romans, dass Lodore unterschiedliche Ansätze der Mädchenerziehung in Bezug auf die Ausbildung von „Weiblichkeit“ polyperspektivisch erkundet. Die Untersuchung zeigt auf, dass der Roman drei verschiedene Modelle der Mädchenerziehung einander gegenüberstellt, die sich ideologisch mitunter diametral gegenüberstehen. Die Analyse beschreibt, inwiefern sich die drei Modelle mit den gleichen Herausforderungen innerhalb der Mädchenerziehung beschäftigen. Hierbei wird ausgeführt, auf welche Weise der Roman die unterschiedlichen Lösungsansätze auslotet, die von den drei Modellen auf diese konkreten Problemstellungen angeboten werden und sie abwägend, jedoch ohne kategorische Abwertung nebeneinander positioniert. Die Arbeit resümiert, dass der Roman einerseits die Bedeutung, Ausbildung und Konsequenz von „Weiblichkeit“ durch Erziehung, und andererseits das Leben, die Ziele und das Verhalten einer Frau innerhalb der Gesellschaft als Resultat solcher Erziehung kritisch prüft. Im Zuge dessen veranschaulicht die Dissertation, welche Aussagen und Suggestionen der Subtext dabei in Bezug auf die Themenkomplexe „Weiblichkeit“ und „Erziehung“ transportiert.
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Increased intraindividual variability of reaction time is a main cognitive feature of Attention Deficit Hyperactivity Disorder. It is associated with deficits in sustained attention. While traditionally, mean and variance were used to characterize reaction time distributions, the ex-gaussian distributional model allows a more sophisticated analysis of reaction time series. Reaction time distributions are separated in a normal and an exponential component.
The present study investigates the impact of incentives on reaction time variability in a sample of adult ADHD patients. ADHD is associated with increased Tau, the output parameter of the ex-gaussian model characterizing the exponential part of the distribution. Tau is linked to “lapses of attention”, which are more frequent in ADHD patients. It is known that tau can be modulated in ADHD Patients. It was therefore postulated that tau would be higher in ADHD Patients in a paradigm where quick answers were required but could be modulated by monetary incentives. In addition, the effect of “delay discounting”, which is more distinct in ADHD patients, on reaction time variability was investigated. Eventually, the association of variability measures with strength of ADHD symptoms was tested.
To this end, reaction time distributions of 62 adult ADHD patients and 45 healthy controls from two different reaction time paradigms were analyzed. The monetary incentive delay task, by comprehending a control – and a win condition, allows an investigation of the effect of incentives on reaction times. Subjects had to react as fast as possible by keypress to a stimulus, after a cue signaled a possible monetary reward. During the Delay-Discounting-Task, subjects had to choose between sooner, but smaller, and higher delayed monetary rewards, during which they could use as much time for consideration as desired.
Results show that an increased Tau in the control condition of the monetary- incentive-delay-task could be replicated, while a distinct influence of the win condition emerged. Subjects with ADHD showed an improvement of Tau in the win condition even below the level of healthy controls. However, they showed increased variability of the “regular” responses around the mean of the normal component of the distribution, represented by sigma. Moreover, it was indicated by trend a higher reaction time variability in ADHD patients during choices of delayed rewards. Tau was associated the current symptom strength as well as with the strength of ADHD-Symptoms during childhood, assessed by questionnaire.
While the present results could have implications for etiological models of the disease, they may also contribute to the development of novel diagnostic methods. In advanced studies, neural correlates of sophisticated measures of reaction time variability should be investigated. Furthermore, they should be associated with genetic risk factors with regard to possible endophenotypes. Possible implications for clinical handling of patients should be explored.
The Southern Ocean (SO) is one of the most pristine regions of our Planet, characterised by high levels of biodiversity (5% of the global diversity) (David and Saucède 2015) and hosting a unique fauna (up to 90% of SO species are endemic) (De Broyer and Danis 2011; Chown et al. 2015). Yet, the knowledge on SO biodiversity is still far from being completed. In addition, the knowledge on the impact that changing environments have on SO species-richness is very little and for some groups, it is still totally unknown. For instance, most of studies generally focus on one single species such as Antarctic krill (Kawaguchi et al. 2011), Clio pyramidata Linnaeus, 1767 (Orr et al. 2005), Globigerina bulloides d'Orbigny, 1826 (Moy et al. 2009), or only on a high taxonomic level (e.g. phylum, class): Echinodermata, Crustacea, Mollusca, Porifera, Bryozoa, Brachiopoda, Hydrozoa, Ascidiacea, Holoturoidea
(Barnes 1999; Rowden et al. 2015; Post et al. 2017; Gutt et al. 2019; Vause et al. 2019; Pineda-Metz et al. 2020). Ultimately, the influence of sea-ice coverage on benthic species diversity was totally unknown prior to this study. In light of this, the objectives of the thesis are:
1. To expand the knowledge on shelf and deep-sea peracarid assemblage structure and abundance on a small regional (Weddell Sea) and on a large regional (Atlantic sector of the SO and South Atlantic Ocean) geographic scale.
2. To assess the environmental variables driving peracarid assemblage structure and abundance from the above mentioned areas.
3. To investigate SO benthic isopod species diversity from the Atlantic sector of the SO and assess the influence of environmental variables on their species-richness and composition.
4. To describe new possible peracarid species by means of integrative taxonomy, using morphological descriptions and whole genome sequencing analyses to support the species identification.
Objective outcomes: The present thesis provides new information on the abundance and assemblage structure based on 64766 peracarid crustaceans from different 28 locations within the Atlantic sector of the SO continental shelf and deep sea (Chapters I-II). These locations are characterised by different environmental conditions, for instance different sea-ice concentrations. Results from Chapters I-II confirmed the dominance of peracarid assemblages in the benthos, with amphipods being the most abundant group, followed by isopods. Sea ice was identified as the main driver shaping benthic peracarid assemblage structure (Chapter I). On a larger geographic scale and wider bathymetric range (e.g. including sampling locations from previous studies performed in the South Atlantic Ocean
and at a depth range from 160 to ~6000 m), depth was the main physical variable driving peracarid assemblage structure (Chapter III). In addition, 16157 isopod specimens from the Atlantic sector of the SO were identified to species level at a smaller scale (Chapter IV). In this case, sea ice was identified as the main physical driver affecting isopod diversity and composition among sampling locations (Chapter IV). Reduced concentration of sea ice
causes a decrease in isopod biodiversity, thus climate change was identified as a huge threat for this taxon and for SO benthos in general. During the identification process, two new isopod species were discovered (Chapter V). The two new species (Notopais sp.1 n. sp. and Notopais sp.2 n. sp.) were accurately described and identified by means of integrative taxonomy. This provided the first whole genome sequencing of benthic isopods from the SO and the first complete mitochondrial genome of the genus Notopais (Chapter V). Thanks to the collaboration with the University of Genoa (Dipartimento di Scienze della Terra dell'Ambiente e della Vita, DISTAV, Italy) and the National Antarctic Museum (MNA) in Genoa, two new SO species of the suborder Valvifera G. O. Sars, 1883 were described by means of classical taxonomy. In this case, a molecular approach could not be used because both new species were represented by a single specimen, therefore it was important to preserve the integrity of the holotypes (Chapters VI-VII).
This research project investigated how motor activity, such as cycling, influences the acquisition of foreign language vocabulary under two distinct conditions of auditory-motor-synchronisation. In a mixed subject design, 48 participants had to learn 40 Polish-German vocabulary pairs by auditory presentation over headphones in two different conditions, in which they performed motor activity cycling on a bicycle ergometer: in experiment 1, vocabulary was presented in a fixed rhythm while in experiment 2, participants self-initiated the presentation of vocabulary through pedalling. After having listened to the word pairs, they had to perform online vocabulary tests, one directly after the learning session and a second one 24 hours later from home. Additionally, the individual pitch perception preference (i.e. fundamental vs. spectral pitch perception) of the participants was determined.
The results showed that fundamental listeners forgot significantly more vocabulary than spectral listeners during the fixed than during the self-initiated condition. There was no difference within the groups for the self-initiated condition. The analysis of the motor data revealed a significantly more accurate synchronisation for fundamental listeners during the fixed condition. Therefore, this study provides first evidence for the benefit of self-initiated auditory-motor synchronisation in the process of learning a foreign language in adults. It also reveals that pitch preference has an effect on auditory-motor synchronisation.
Komplexe biologische Phänotypen resultieren aus einem koordinierten Zusammenspiel von einer Vielzahl von Genen. Um zu verstehen, wie Krankheiten durch genetische Dysfunktionen
entstehen können, ist es unabdingbar die genetischen Interaktionsnetzwerke in menschlichen Zellen zu entschlüsseln. Eine Identifizierung von Kontext-abhängigen genetischen Interaktionen kann bedeutende Erkenntnisse über die Beziehung von Phänotyp und Genotyp liefern und erklären, wie synergistische Gen-Funktionen die Entstehung von komplexen Krankheiten bedingen.
Gepoolte, kombinatorische CRISPR (kurz für: clustered regularly interspaced short palindromic repeats) Screens stellen eine wirkungsvolle Methode zur simultanen Untersuchung potentieller Interaktionen von einer großen Anzahl von Genen dar. Mit sogenannten multiplex CRISPR
gRNA Bibliotheken werden im Rahmen großangelegter Screens vielzählige kombinatorische Gen-Knockouts in Zellen generiert. Diese multiplex CRISPR gRNA Bibliotheken können aus bis zu hunderttausenden Plasmiden bestehen, die jeweils für eine andere gRNA-Kombination kodieren und auf ein spezifisches Gen-Paar abzielen. Im Gegensatz zu CRISPR Screens für Einzel-Knockouts gehen multiplex CRISPR Screens zur Identifizierung von genetischen Interaktionen mit zusätzlichen Herausforderungen einher: Zum einen wächst der verbundene Arbeitsaufwand für die Konstruktion der multiplex CRISPR gRNA Bibliotheken proportional mit der Anzahl der gewünschten Ziel-Gene, welche die Diversität der Bibliothek bestimmt. In einer idealen gRNA-Bibliothek wären alle gRNA-Sequenzen gleich häufig vorhanden. Jedoch weisen
gRNA-Bibliotheken aufgrund von technischen Beschränkungen gRNA-Sequenzen mit höherer, beziehungsweise niedriger Abundanz auf. Konventionelle Methoden zur Herstellung von
gRNA-Bibliotheken basieren beispielsweise auf iterativen, gepoolten Klonierungsschritten mit PCR-amplifizierten Oligonucleotiden, welche zu einer Ungleichverteilung oder zum Verlust von gRNA-Sequenzen führen können. Daher bieten Methoden zur gRNA-Bibliotheken-Generierung Optimierungspotenzial. Da die Reproduzierbarkeit der Screen-Ergebnisse durch die sogenannte Screening Coverage sichergestellt werden muss, erfordert eine Erhöhung der
Bibliotheks-Diversität gleichzeitig auch eine Vergrößerung des Versuchsmaßstabs und ist mit umfangreichem Zellkultur-Arbeitsaufwand verbunden. Die Screening Coverage gibt die
durchschnittliche Abundanz der einzelnen gRNA-Sequenzen in der Zellpopulation während des Screens an. Aktuelle Richtlinien empfehlen eine Screening Coverage, die zwischen dem 200- bis 1000-fachen Wert der Bibliotheks-Diversität liegt, allerdings fehlen bisher genaue Angaben die auf die verwendete gRNA Bibliothek abgestimmt sind. Deshalb stellt die benötigte Screening Coverage bisher einen limitierenden Faktor dar, der die Anzahl der möglichen Ziel-Gene-Kombinationen in einem Screen beschränkt.
In der vorliegenden Arbeit stellen wir eine neue Methode zur Generierung von multiplex gRNA Bibliotheken mit hohen Diversitäten vor. Die Methode, genannt 3Cs (covalently-closed circular-synthesized) Multiplexing, umgeht iterative, gepoolte Klonierugsschritte mit Restriktionsenzymen und PCR-Amplifikation von gRNA-kodierenden Oligonucleotiden. Wir
zeigen, dass 3Cs Multiplexing auf robuste Weise zur Herstellung von gleichmäßig verteilten multiplex gRNA Bibliotheken verwendet werden kann. Der Verteilungs-Skew, auch Skew-Ratio oder Bibliotheksbreite genannt, ist ein Maß zur Ermittlung der Gleichverteilung der gRNA-Sequenzen in der Bibliothek. Wir zeigen, dass 3Cs multiplex Bibliotheken typischerweise einen Verteilungs-Skew von 2.5 aufweisen, was unter den üblichen Werten von Einzel-gRNA Bibliotheken liegt.
Wir nahmen an, dass die gRNA-Bibliotheksverteilung die Robustheit von gepoolten CRISPR Screens beeinflussen könne und deshalb bei der Auswahl einer geeigneten Screening
Coverage berücksichtigt werden müsse. Um den Einfluss der gRNA-Bibliotheksverteilung auf die Screen-Qualität in Abhängigkeit von der verwendeten Screening Coverage zu untersuchen, generierten wir zwei künstlich fehlverteilte multiplex gRNA-Bibliotheken. Diese wurden, zusätzlich zu einer nahezu gleichverteilten multiplex gRNA-Bibliothek, jeweils mit einer 20- und 200-fachen Screening Coverage in einem kombinatorischen Proliferationsscreen angewandt.
Dadurch konnten wir die gRNA-Bibliotheksverteilung als den bestimmenden Parameter für die benötigte Screening Coverage identifizieren. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass 3Cs multiplex gRNA-Bibliotheken auf Grund ihrer gleichmäßigen Verteilung mit minimierter Screening Coverage eingesetzt werden können, was zu einer 10-fachen Reduktion des assoziierten Arbeitsaufwands führt. Während bisherige Richtlinien für gepoolte CRISPR Screens die initiale
gRNA-Bibliotheksverteilung nicht berücksichtigen, empfehlen wir die Screening Coverage an dieser auszurichten.
Autophagie ist ein streng regulierter zellulärer Prozess, der den Lysosomen Abbau von intrazellulärem Material steuert und im Zusammenhang mit zahlreichen menschlichen Erkrankungen steht. Da Autophagie in eine Vielzahl von Signalwegen integriert ist, bietet es außerdem therapeutische Ansatzpunkte zur Behandlung von Krankheiten. Die Identifizierung von synergistischen Funktionen zwischen Autophagie-Genen könnte unser Verständnis über die molekularen Mechanismen, die der Regulation der Autophagie zu Grunde liegen, erweitern und dadurch neuartige Behandlungen ermöglichen.
Um genetische Interaktionen von Autophagie-Genen zu untersuchen haben wir eine 3Cs multiplex gRNA Bibliothek generiert, die auf menschliche Autophagie-Genkombinationen
abzielt. In dieser Arbeit demonstrieren wir die Funktionalität der 3Cs Autophagie multiplex gRNA Bibliothek unter Anwendung minimierter Screening Coverage in zwei verschiedenen Screen-Ausführungen: In einem Proliferationsscreen konnten wir Geninteraktionen
identifizieren, deren Verlust zu einer gesteigerten oder verringerten Zellproliferation führt. Unter diesen resultierte der Knockout von WDR45B-PIK3R4 zur stärksten Suppression der Proliferation, während die Depletion von ATG7-KEAP1 zu extrem verstärkter Proliferation beitrug. Unter Einsatz eines Autophagie-Reporters konnten wir in einem Autophagie Screen genetische Interaktionen aufdecken, die essentiell für Autophagie sind, darunter die
Interaktionen zwischen ATG2A-ATG2B , GABARAPL2-WIPI2 und ULK4-SQSTM1.
Wir glauben, dass 3Cs Multiplexing in Zukunft breite Anwendung in verschiedenen biologisch relevanten Feldern finden kann und die Entschlüsselung von kontext-abhängigen genetischen Interaktionen voranbringen und so das Verständnis für die Entstehung von komplexen pathologischen Phänotypen erweitern wird.
Hintergrund: Das genaue Wissen um die Umstände eines jeden tödlichen Arbeitsunfalls ist Voraussetzung für die Identifizierung von Unfallschwerpunkten und ermöglicht eine effektive Präventionsarbeit. Mit dieser rechtsmedizinischen Studie zum Arbeitsunfallgeschehen soll ein Beitrag dazu geleistet werden, die Zahl tödlicher Arbeitsunfälle in Deutschland zu senken.
Material und Methode: Zur Untersuchung kamen die tödlichen Arbeitsunfälle, die sich im Einzugsbereich des rechtsmedizinischen Instituts Frankfurt am Main in den Jahren von 2005 bis 2016 ereigneten. Ausgewertet wurden Obduktionsprotokolle sowie die dem Institut zur Verfügung gestellten Staatsanwaltschaftlichen Ermittlungsakten.
Ergebnisse. Es fanden sich 87 tödliche Arbeitsunfälle in dem genannten Zwölfjahreszeitraum. Die Altersstruktur reichte vom jugendlichen Alter bis in das Rentenalter. Betroffen waren zum größten Teil männliche Arbeiter (96,6%, p< 0,0001), verhältnismäßig häufig ausländischer Nationalit.t (34,5%). Die meisten Unfälle ereigneten sich in der 2. Jahreshälfte (58,6%), an Montagen (26,4%), kurz vor und nach der Mittagspause. In 3 Fällen lag die Blutalkoholkonzentration über 0,5‰. Die Baubranche (55,2%) war der unfallträchtigste Wirtschaftszweig. Der Absturz (28,7%) war der häufigste
Unfallmechanismus und das Polytrauma (39,1%) gemeinsam mit dem Schädel-Hirn-Trauma (24,1%) gemäß dem ISS die häufigste Todesursache.
Diskussion: Nach den Ergebnissen dieser Studie sollten Alter der Arbeiter sowie die Tages-, Wochen- und Jahreszeit bei der Ausführung risikoreicher Arbeiten im Baugewerbe berücksichtigt werden. Besonderes Augenmerk sollten Arbeitgeber auf die Kontrolle von Sicherheitsvorkehrungen bei Arbeiten in der Höhe sowie auf die Durchsetzung der Helmpflicht gerade auch bei ausländischen Arbeitnehmern legen.
Clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP) is caused by recurrent somatic mutations leading to clonal blood cell expansion. However, direct evidence of the fitness of CHIP-mutated human hematopoietic stem cells (HSCs) in blood reconstitution is lacking. Because myeloablative treatment and transplantation enforce stress on HSCs, we followed 81 patients with solid tumors or lymphoid diseases undergoing autologous stem cell transplantation (ASCT) for the development of CHIP. We found a high incidence of CHIP (22%) after ASCT with a high mean variant allele frequency (VAF) of 10.7%. Most mutations were already present in the graft, albeit at lower VAFs, demonstrating a selective reconstitution advantage of mutated HSCs after ASCT. Thus, CHIP-mutated stem and progenitor cells largely gain on clone size upon ASCT-related blood reconstitution, leading to an increased future risk of CHIP-associated complications. CHIP increase with age and is also associated with atherosclerosis and inflammation. Age and inflammation are the major risk factors for heart failure, yet the association of CHIP with chronic ischemic heart failure (CHF) in humans is unknown. Therefore, we analyzed bone marrow-derived mononuclear cells from 200 patients with CHF by NGS to detect the presence of CHIP and associated such with long-term prognosis in patients with CHF. Forty-seven mutations with a VAF of at least 2% were found in 18.5% of 200 patients with CHF. The mutations most commonly occurred in the genes DNMT3A and TET2. During a median follow-up of 4.4 years, a significantly worse clinical outcome for patients with either DNMT3A or TET2 mutations compared with non-CHIP carriers was notable. Importantly, there was a significant dose-response association between VAF and clinical outcome. Our data suggest that somatic mutations in hematopoietic cells, may be significantly associated with the progression and poor prognosis of CHF.
Terpenes are one of the largest and most diverse class of natural products, produced by organisms from all kingdoms of life and with important applications in the pharma, flavor and fragrance industries. Well-known examples of terpenes are the pharmaceuticals artemisinin and taxol, the flavor and fragrance compounds menthol, santalol and sclareol, the structural material polyisoprene and the biofuel precursor farnesene. The methods and results presented in this work offer a variety of ways to modify terpene precursors for the creation of new terpene molecules. The application of these methodologies in well-established production systems could lead to the production of new substances, with applications in the industrial fields of pharmaceuticals, flavors and fragrances, and biofuels.
Cancer therapies have experienced significant advances in recent years. While conventional cytotoxic chemotherapy has long been the cornerstone for the treatment of many tumor entities, uprising immunotherapies have revolutionized the therapeutic landscape. Among them, immune checkpoint inhibitors (ICIs) with their demonstrated increased overall survival rates and response rates in cancer patients are now FDA-approved for metastatic melanoma and multiple other malignancies. Despite their clinical benefit in cancer therapies, ICIs can induce unique autoimmune-like toxicities known as immune-related adverse events (irAEs), which can involve any organ system including the nervous system. Although neurotoxicities are rare complications of ICI therapy they are often severe and can lead to long-term disability or even death if left untreated.
Neurological irAEs exhibit a broad spectrum of clinical presentations affecting the entire nervous system. Diagnosing neurological irAEs is often challenging as symptoms and laboratory findings can be uncharacteristic for common neurological disorders and clinical experience with ICI-mediated toxicities is still limited. In light of expanding clinical indications for ICIs, physicians will encounter ICI-mediated neurotoxicities more frequently. Thus, thorough characterizations of the diverse set of neurological irAEs are essential for optimal patient care, the prevention of severe ICI-mediated complications, and the development of diagnostic and therapeutic algorithms. This work portrays the clinical presentation, management and outcome of neurological irAEs following ICI therapies.
Patients with neurotoxicities related to ICIs who presented at the Yale New Haven Hospital between January 2014 and June 2018 were retrospectively identified from the quality control database. A comprehensive chart review was performed and data regarding patient demographics, medical history, ICI regimen and neurotoxicity were recorded. In total, 18 patients with neurological irAEs following ICI therapy for melanoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, and Merkel-cell carcinoma were identified. Neurotoxicities included central nervous system disorders comprising central demyelinating disorder,autoimmune encephalitis predominantly affecting the grey matter, and aseptic meningitis. Peripheral nervous system toxicities included sensorimotor polyneuropathy and myasthenia gravis. Cases of hypophysitis were also recorded. Time to onset of neurological irAEs ranged from 1 to72 weeks with a median of five weeks. In all patients ICIs were held and steroids initiated. Additional immunomodulatory therapies were required in nine patients. Sixteen of 18 patients showed neurological improvement. Fourteen patients had highgrade neurotoxicity (grade 3-4), six of whom deceased due to cancer progression, while none of the low-grade neurotoxicity patients (grade 1-2) died. High-grade neurotoxicity was identified as a negative prognostic marker for overall survival (p = 0.046).
This work shows that neurotoxicities present early-onset, rapidly progressive complications of ICIs with a broad spectrum of clinical phenotypes affecting the central nervous system, peripheral nervous system, and neuroendocrine system. A high index of caution for neurological irAEs is warranted throughout ICI therapy as timely diagnosis and management can reduce morbidity and mortality. Randomized clinical trials are needed to develop standardized diagnostic and therapeutic algorithms of ICI-induced neurotoxicities.
Für jeden Betroffenen ist die Diagnose Krebs ein schwerwiegender Einschnitt in der Lebensqualität und -führung, da die Behandlung oftmals mit langen Chemotherapien einhergeht. Moderne Durchbrüche in der Krebsbehandlung stammen aus dem Forschungsbereich der zielgerichteten Molekulartherapie oder aus dem Gebiet der Immuntherapien, die zu beachtlichen Erfolgen bei der Behandlung von Krebspatienten führten. Trotzdem bleiben auf dem Gebiet der Onkologie weiterhin Fragen zu den grundlegenden biologischen Prozessen unbeantwortet.
Zu den Onkoproteinen, die das Tumorwachstum in Leukemiezellen stark beeinflussen, gehören die Proteine der Klasse der mixed lineage leukemia (MLL) Histonmethyltransferasen. Genetische Fusionen des mll Gens, sogenannte Rearragments, führen zu MLL-fusion Produkten, die erheblich zum Verlauf der aggressiven akuten myeloischen Leukämie (AML) beitragen. Ein weiteres Onkoprotein, das für den Krankheitsverlauf vieler Krebsarten relevant ist, ist die Transkriptionsfaktorfamilie MYC. Überexprimierung von MYC wurde in einem Drittel aller humanen Tumore beobachtet. Zahlreiche Studien belegen, dass hohe MYC Level die Expression von Genen regulieren, die essentiell für den Transformationsprozess und somit das Tumorwachstum sind. Da der Transkriptionsfaktor weder eine sabile tertiäre Proteinstruktur noch eine für Inhibitoren adressierbare Bindetasche aufweist, gilt MYC bis heute als undruggable.
Sowohl die Histonmethyltransferase MLL1, als auch der Transkriptionsfaktor MYC interagieren mit einem ca. 37 kDa Protein namens WD40-repeat containing Protein 5 (WDR5), das durch seine propellerförmige Struktur eine Oberfläche mit insgesamt zwei Bindestellen aufweist. Mehrere Studien zeigten, dass WDR5 die Stabilität und somit die Funktion epigenetischer Proteinkomplexe wie SET/ MLL und NSL gewährleistet. In diesem Kontext wurde WDR5 als relevantes Target für die MLL-rearragend akute lymphatische Leukämie (ALL) postuliert. Weitere Studien zeigten zusätzliche Rollen von WDR5, wie die Interaktion zwischen WDR5 und dem Onkoprotein MYC sowie dessen Rekrutierung zum Chromatin. Seit 2015 wurden erfolgreich mehrere niedermolekulare Wirkstoffe für die Inhibierung von WDR5 entwickelt. Dabei zielten die meisten der literaturbekannten Inhibitoren auf die Argininmotiv-erkennende WDR5-interacting (Win) Bindestelle, eine große, hydrophobe Bindetasche im Zentrum des WDR5-Propellers. Die Resultate der besser erforschten Win Inhibitoren zeigten, dass WDR5 ein erfolgsversprechendes Target zur Inhibierung von leukämischen (MLL-r-abhängigen) und neuroblastomatischen (MYC-abhängigen) Zellwachstum ist.
Da beide Bindestellen des WDR5 Proteins Interaktionen mit onkologisch bedeutsamen Faktoren eingehen, würde eine einseitige Inhibierung nur die Effekte der jeweiligen Bindestelle aufzeigen. Diese Limitierung könnte jedoch durch die Entwicklung von WDR5 PROTACs (Proteolysis targeting chimeras) aufgehoben werden, da alle Gerüstfunktionen des Proteins und Protein-Protein-Interaktionen durch die Degradierung von WDR5 entfernt werden würden. Dabei induzieren die heterobifunktionellen Moleküle den Abbau des Zielproteins über das zelleigene Ubiquitin-Proteasom-System, statt die Enzymfunktion zu inhibieren. Nach dem zelleigenen Abbau des Zielproteins wird der PROTAC freigesetzt und kann einen neuen Zyklus der Proteindegradation einleiten, was die erforderliche Menge an Wirkstoff verringert.
Diese Dissertation beschäftigte sich mit dem Design, der Synthese sowie der biophysikalischen und biologischen Evaluierung von WDR5 PROTACs. Ausgehend von literaturbekannten WDR5 Liganden wurden zwei verschiedene PROTAC Typen entworfen. Diese beiden Molekültypen besitzen einen unterschiedlichen geometrischen Austrittswinkel, wodurch die Chance auf eine erfolgreiche Komplexbildung zwischen WDR5, PROTAC und E3 Ligase erhöht wird. Als Leitstruktur fungierten die Verbindungen OICR-9429 sowie DDO-2117 und ausgehend von Ligand (6d) wurden heterobifunktionelle Moleküle mit verschiedenen Linkersystemen ([PEG]- und alkyl-basiert, sowie aromatisch verbrückt) und verschiedenen E3 Ligase Liganden (Cereblon, VHL und MDM2) synthetisiert. Die anschließenden biochemischen und biophysikalischen Evaluierungen der verschiedenen PROTACs durch Thermofluor (DSF) und ITC zeigten eine hohe in vitro Affinität einiger Moleküle. Die zelluläre Permeabilität der großen Moleküle wurde in einem hier etablierten BRET Assay untersucht. Zur Assay-Etablierung wurden drei Tracer (21a-c), basierend auf BODIPY Konjugaten, synthetisiert und getestet, bevor die PROTACs in intakten und lysierten Zellen vermessen wurden. Während die zellulären Affinitäten von Cereblon- und VHL-adressierenden PROTACs sich im niedrigen μM Bereich bewegten, wurden die nicht zellgängigen MDM2 PROTACs von weiteren Experimenten ausgeschlossen.
Die Degradierungeffizienz der WDR5 PROTACs (7a-e) und (8a-j) wurden in der Leukämie Zellinie MV4-11 untersucht, da diese die am meisten auftretende MLL fusion Mutation AF4 birgt. Dabei wurde der Proteinabbau von WDR5 über den HiBiT Assay sowie Western Blots nachgewiesen. ...
Viele Gruppen der Lebewesen, insbesondere Insekten breiten sich durch steigende Temperaturen zunehmend in Gebieten aus, in denen sie ursprünglich nicht vorkommen(Novikov und Vaulin 2014; Bebber 2015). Hierbei ist die steigende Temperatur in
verschiedenen Gebieten der Hauptfaktor für Expansionen dieser Arten in Richtung des nördlichen Polarkreises. Einige dieser Arten sind sehr tolerant für verschiedene Variablen und können damit ihr Verbreitungsgebiet deutlich nach Norden hin ausdehnen. Aufgrund steigender Temperaturen werden jedoch andere Arten in ihrem Verbreitungsgebiet eingeschränkt oder ihre Verbreitung verschiebt sich in nördliche Richtung (Ogden und Lindsay 2016; Lawler et al. 2009). Auch für die Verbreitung von Krankheiten spielen Temperaturen, Ausbreitungen oder Verbreitungsverschiebungen eine wichtige Rolle (Mordecai et al. 2019).
So können, durch die Etablierung der passenden Vektoren, bisher nur in wärmeren Gebieten auftretende Krankheiten zukünftig auch in unseren Breitengraden eingeschleppt und
verbreitet werden. Bremsen, invasive Stechmücken aber auch einheimische Mücken tragen alle ein Potential,verschiedenste Krankheitserreger zu verbreiten, auch wenn die Eignung als
Vektor für jede Art unterschiedlich groß ausfällt und manche Arten daher kaum beobachtet und untersucht werden. Mit dem Augenmerk auf sich ändernde Verbreitungsgebiete hinsichtlich zukünftigen klimatischen Veränderungen und sich wandelnden anthropogenen Einflüssen sollten jedoch auch Arten mit bisher geringem Vektorpotential mit in Beobachtungsprogramme aufgenommen werden.
Wir untersuchten in Projekt I auf kontinentaler Skala die Verbreitung von sechs verschiedenen Bremsenarten und konnten sowohl Rückschlüsse auf eine mangelhafte Beobachtung der
Arten ziehen als auch Artpräferenzen hinsichtlich der Landschaftsnutzung, Auswirkungen des Klimas auf die Verbreitung der Art und bisher unbekannte Toleranzen hinsichtlich tiefen Temperaturen und äußerst verkürzten Wärmeperioden aufdecken. Eine Größenordnung niedriger wurde in Projekt II, basierend auf aktuellen und Vergangenen Klimadaten, die zukünftige und aktuelle Verbreitung einer invasiven, sich zukünftig ausbreitenden Stechmückenart innerhalb Deutschlands modelliert. Durch bisherig im Untersuchungsgebiet nur begrenztes Auftreten konnten noch keine Rückschlüsse auf die unterschiedlichen Präferenzen für das Habitat gezogen werden, es können jedoch für zukünftige Berechnungen Habitatpräferenzen aus anderen Gebieten hinzugezogen werden um die Art und ihre fortschreitende Ausbreitung genauer zu beobachten. Auf der kleinsten untersuchten Ebene konnten in Projekt III innerhalb eines Mikrohabitates verschiedenste Rückschlüsse auf limitierende oder förderliche abiotische Faktoren, die teilweise bisherig nicht oder nur geringfügig beobachtet wurden, gezogen werden. Ebenfalls konnten Auswirkungen der umgebenden Landschaft auf die Abundanzen der Tiere beobachtet werden. Mithilfe von verschiedenen Modellen und in Abhängigkeit von Klimakarten, Landbedeckungsdaten und Landnutzung sowie Eigenschaften und Toleranzen der untersuchten Arten lassen sich in verschiedenen Größenordnungen geeignete Habitate von einheimischen sowie invasiven Arten identifizieren und zukünftige Verbreitungen effizient vorhersagen.
Insgesamt können, basierend auf all diesen Daten, dadurch für alle untersuchten Faktoren Modelle auf andere Gebiete übertragen werden um somit potentielle Verbreitungen dort
vorherzusagen. Auf unseren Daten basierend können so zum Beispiel Modellierungen für die potentielle Ausbreitung der untersuchten Tabaniden innerhalb anderer Kontinente berechnet werden und Monitoringprogramme können die Ergebnisse unserer Studie als Startpunkt aufgreifen, um durch Beprobung an modellierten Standorten die Korrektheit unserer Modelle zu überprüfen und sowohl Landschaftstypen als auch Artzusammensetzung aufzunehmen um das Modell zu bestätigen oder zu verbessern. Die Modellierung der invasiven Art Aedes albopictus bietet die Möglichkeit, diese Art in Zukunft innerhalb der möglichen Ausbreitungskorridore genauer zu beobachten um ihre fortschreitende Verbreitung zu
verifizieren oder eventuelle Änderungen des klimatischen Verlaufes mit einzubinden und das Modell anzupassen. Die Untersuchung des Mikrohabitats von Culex pipiens pipiens und Culex torrentium bietet, auch hinsichtlich anderer Arten in diesem Habitat, eine potente Methode, Vorhersagen für Artvorkommen innerhalb anderer Unterirdischen Objekte zu berechnen. Hier können, bei ausreichend großer Datenlage, eine Vielzahl von Faktoren in die Auswertung mit einfließen.
Die durchgeführten Studien bestätigen die Notwendigkeit für verbesserte Monitoringkonzepte für alle vektorkompetenten Tiergruppen hinsichtlich der sich ändernden klimatischen Bedingungen, des globalen Handels und die sich wandelnde Nutzung der Landschaften durch den Menschen und darin begründete Veränderungen der Artenzusammensetzung eines Habitates, zeigen Möglichkeiten, diese Konzepte mit bisher
ungenutzten Daten aufzubauen und zu verbessern und können gleichzeitig zu deren Verbesserung herangezogen werden.
Es ist bekannt, dass die Aktivierung von S1P-Rezeptoren die Expression von profibrotischen Mediatoren, wie dem Bindegewebswachstumsfaktor CTGF, induzieren und deshalb auch eine Rolle bei der Entstehung der Nierenfibrose spielen kann. In diesem Kontext konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung von S1P5 zur TGF-β2-induzierten CTGF-Expression in humanen glomerulären Mesangiumzellen beiträgt (Wünsche et al. 2015). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb die Rolle von S1P5 in einem in vivo-Modell zur Nierenfibrose untersucht. Männliche S1P5-/--Mäuse und Wildtypmäuse mit C57BL/6J-Hintergrund wurden mit einer adeninreichen Diät für jeweils 7 und 14 Tage gefüttert, um eine tubulointerstitielle Fibrose hervorzurufen. Die Nieren von unbehandelten Mäusen des jeweiligen Genotyps dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass S1P5-/--Mäuse geringere Kreatininplasmaspiegel und weniger Schäden im Nierengewebe gegenüber Wildtypen zeigten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von mehreren Fibrosemarkern und proinflammatorischen Zytokinen in den S1P5-/--Mäusen schwächer war als in den Wildtypen. Die Auswertung von histochemischen Färbungen und Western Blots bestätigte diese Beobachtung. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass S1P5 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Adenin-induzierter Entzündung in der Niere und nachfolgender Pathogenese wie Gewebeschäden und Fibrose spielt.
Ceramide sind ein Bestandteil der Lipiddoppelschicht, in allen eukaryotischen Zellen vorhanden und zentrale Moleküle des Sphingolipidstoffwechsels. Die Synthese und der Abbau der Ceramide werden von vielen verschiedenen Enzymen reguliert. Neben ihrer Aufgabe als strukturelle Elemente der Zellmembranen wurde herausgefunden, dass Ceramide auch in verschiedenen Signalwegen involviert sind, die auch bei Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. In Bezug auf die Kettenlänge der angehängten Fettsäure können so genannte kurz- und langkettige Ceramide Apoptose induzieren, wohingegen sehr langkettige Ceramide Zellproliferation fördern. In mehreren Studien wurden bereits Konzentrationsänderungen von kettenlängenspezifischen Ceramiden im Plasma und Serum von Patienten gemessen, die zu diesem Zeitpunkt an einer Nierenerkrankung litten. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob solche Konzentrationsänderungen auch im Nierengewebe von Patienten und Mäusen mit einer Nierenfibrose, dem Kennzeichen nahezu aller chronischen Nierenerkrankungen, zu sehen sind. Zu diesem Zwecke wurden Biopsien der Nierenrinde und des Nierenmarks von fibrotischen Nieren aus Patienten, die an Hydronephrose und/oder Pyelonephritis litten, und von gesunden Gewebeproben untersucht. Letztere wurden durch Nephrektomien zur Behandlung von Nierenkarzinomen gewonnen und dienten als nichtfibrotische Kontrolle. Zum Vergleich mit fibrotischen Nieren aus Mäusen wurden männliche Mäuse der Linie C57BL/6J mit einer adeninreichen Diät für 14 Tage gefüttert. Die Konzentrationen der Sphingolipide wurden mittels Massenspektrometrie gemessen und die Level der fibrotischen Marker wurden mit Hilfe von RT-qPCR und histologischen Färbungen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die sehr langkettigen Ceramide Cer d18:1/24:0 und Cer d18:1/24:1 sowohl in fibrotischen Nierenrindenproben der Patienten als auch in fibrotischen Nieren der Mäuse im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollproben signifikant geringer konzentriert waren. Diese Effekte korrelieren mit der Hochregulation der Fibrosemarker COL1α1, COL3α1 und αSMA in den fibrotischen Nieren. Es konnte gezeigt werden, dass nur bestimmte Ceramide in fibrotischem Nierengewebe in ihrer Konzentration verändert sind, was interessante Fragen hinsichtlich der Ursache dieser Veränderungen, ihrer funktionellen Aufgabe und zu möglichen Effekten einer Manipulation des Ceramidstoffwechsels mit dem Ziel der Behandlung der Nierenfibrose oder der Entdeckung neuer Biomarker aufwirft. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen zudem die Eignung von in vivo-Mausmodellen als translationalen Ansatz für das Verständnis der Beteiligung von Ceramiden in menschlichen Nierenerkrankungen.
Die in vitro-Untersuchungen zu der Rolle des S1P-Transporters Spns2 haben gezeigt, dass Spns2 die Expression von CTGF nach Stimulation von Mausmesangiumzellen mit TFG-β2 verstärkt. 24 Stunden nach Stimulation war im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC im Gegensatz zu Spns2+/+-mMC keine Akkumulation des pro-fibrotischen Zytokins CTGF gegenüber der unstimulierten Kontrolle detektierbar. Nach 48 Stunden Stimulation mit TFG-β2 war die Menge an CTGF im Zelllysat als auch im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC genauso hoch wie in der unstimulierten Kontrolle. Im Zelllysat und im Überstand der Spns2-/--mMC war die Expression von CTGF weiterhin deutlich höher im Vergleich zu den Proben der unstimulierten Zellen. Die basale und TFG-β2-induzierte Genexpression von S1P-synthetisierenden und S1P-degradierenden Enzymen, sowie die Konzentrationen an S1P und Sphingosin in den Zellen unterschieden sich zwischen Spns2-/--mMC und Spns2+/+-mMC nicht.
Hintergrund und Fragestellung: Für Menschen mit Depression gestaltet sich der Zugang zu adäquater Versorgung oft schwierig. Sie müssen sich in einer äußerst komplexen Versorgungslandschaft mit vielen Behandlungsoptionen und verschiedenen Anlaufstellen orientieren, sind aber aufgrund der Depressionssymptome teilweise nicht in der Lage, sich selbst aktiv um ihre Behandlung zu kümmern. Für Frauen der ersten Einwanderergeneration konnte gezeigt werden, dass diese zwar mindestens ebenso häufig an Depression erkranken wie Menschen ohne Migrationshintergrund, aber nicht im gleichen Maße an Versorgungsangeboten teilhaben wie die restliche Bevölkerung. Ziel ist es daher, mehr darüber zu erfahren, wie Migrantinnen den Zugang zu Versorgung bei Depression erleben und welche Schwierigkeiten und Verbesserungswünsche sie haben. Es sollen konkrete Ansatzpunkte zur Verbesserung der Versorgung aufgezeigt werden.
Methodisches Vorgehen: Es wurden zwölf teilstrukturierte qualitative Einzelinterviews mit Migrantinnen der ersten Einwanderergeneration geführt, die aufgrund von Depression in Deutschland behandelt wurden. Die Auswertung der Interviews erfolgte mittels qualitativer Inhaltsanalyse.
Ergebnisse: Die Teilnehmerinnen beschreiben zahlreiche Unsicherheiten und Ängste beim Versorgungszugang, den sie als zu schwierig, kompliziert und langwierig erleben. Konkrete Schwierigkeiten sind fehlendes Wissen zu Depressionssymptomen und Behandlungsoptionen, der Umgang mit Stigmatisierung und Vorurteilen, mangelnde Behandlungskoordination und Beratung insbesondere beim Zugang zu ambulanter Psychotherapie, lange Wartezeiten sowie Verständigungsschwierigkeiten. Die Teilnehmerinnen wünschen sich bessere Beratung und Informationsmöglichkeiten zu geeigneten Behandlungsoptionen, niedrigschwelligere Behandlungsangebote, sprachliche Unterstützung insbesondere zu Beginn der Behandlung sowie Aufklärungskampagnen zum Thema Depression für die breite Öffentlichkeit.
Diskussion: Beim Versorgungszugang von Migrantinnen mit Depression besteht Verbesserungsbedarf. Die beschriebenen Schwierigkeiten und Wünsche sollten bei der Planung von Versorgungsangeboten und bei der Behandlung stärker berücksichtigt werden. Konkrete Ansatzpunkte für eine bessere Versorgung sind entstigmatisierende, öffentlichkeitswirksame Informationskampagnen zu den Symptomen und der Behandlung von Depression sowie muttersprachliche Informationsmaterialien für Patientinnen und Patienten zu Depression, den Versorgungsangeboten und den relevanten Grundlagen des Gesundheits- und Sozialsystems. Auch sprachliche Unterstützung im Einzelfall, etwa durch professionelle Sprachmittlerdienste, sollte bei Bedarf ermöglicht werden. Darüberhinaus sind individuelle Unterstützungsangebote bei der Behandlungskoordination und beim Zugang zu ambulanter Psychotherapie nötig sowie mehr Aufmerksamkeit und Einfühlungsvermögen der Behandlerinnen und Behandler für individuell bestehende Vorbehalte und Ängste von Personen mit Migrationshintergrund.
Sympathetic influences on articular cartilage regeneration capacity and osteoarthritis manifestation
(2021)
The pathogenesis of osteoarthritis (OA) involves articular cartilage, synovial tissue and subchondral bone and is therefore a disease of the whole joint. OA is characterized by progressive degradation of cartilage, synovial inflammation, osteophyte formation and subchondral bone sclerosis. Cartilage-surrounding tissues are innervated by tyrosine hydroxylase (TH)-positive sympathetic nerve fibers with the most important sympathetic neurotransmitter norepinephrine (NE) detected in the synovial fluid of OA patients. Furthermore, adrenergic receptors are expressed in different knee joint tissues. Most in vitro studies indicate a potential role of the β2-adrenergic receptor, which has been not investigated during OA pathogenesis in vivo. The role of the sympathetic nervous system (SNS) in OA progression has not yet been studied. Therefore, the objective of this study was to analyze how the SNS and NE influence the MSC dependent cartilage regeneration in vitro and the OA pathogenesis and manifestation in vivo.
In the first part of this study, the effect of NE on the chondrogenesis of sASC, which are known to play an important role in cartilage regeneration was analyzed in vitro. In the second part of this study, the role of the SNS was studied in vivo in mice that were sympathectomized chemically followed by surgically induced OA. The specific focus was on the β2-adrenergic receptor effects on OA pathogenesis, which were analyzed in β2-adrenergic receptor-deficient mice.
The in vitro experiments have shown that NE reduced the chondrogenic potential of sASCs by decreasing the expression of type II collagen and sGAG. NE mediated these effects mainly by the α2-AR signalling. Furthermore, NE treatment led to activation of the ERK1/2 signal pathway. These findings suggested that the sympathetic neurotransmitter NE might suppress the chondrogenic capacity of MSC and their dependent cartilage regeneration and may also play a role in OA progression and manifestation.
The in vivo study has shown that sympathectomy reduced synovial TH-positive nerve fibers in the synovium and the NE concentration in the spleen significantly. In WT mice, DMM leads to increased NE concentrations in the spleen compared to sham mice indicating an increased SNS activity after mechanical stress or inflammation due to DMM. Sympathectomy leads to less pronounced cartilage degeneration (OARSI score) after DMM compared to DMM in WT mice. Furthermore, the release of the type II collagen degradation fragment CTX-II was abolished in Syx DMM mice compared to WT DMM mice, suggesting that less SNS activity due to sympathectomy reduced the cartilage degeneration during OA pathogenesis. Similarly, sympathectomy decreased the synovitis score significantly after DMM compared to DMM in
WT mice. Synovitis in WT mice was accompanied by increased MMP-13 expression in the synovium after DMM, compared to Syx mice. Cartilage degeneration seemed to be driven mainly by the increased synovial inflammation accompanied by an increased MMP13 expression in synoviocytes and not in chondrocytes. The pathological changes in synovium and cartilage might also be linked to each other, as indicated by the moderate correlation between the synovial inflammation (synovitis score) and cartilage degeneration (OARSI score). Subchondral bone volume as well the thickness of the subchondral bone plate (SCBP) and calcified cartilage (CC) were increased in Syx mice compared to WT after DMM. The data on DMM induction in β2-AR deficient mice revealed that the β2-AR signaling is involved in cartilage degeneration and the aggravated subchondral bone changes as these mice had less pronounced cartilage degeneration compared to WT mice. While the cartilage degeneration was similar, the subchondral bone changes were more pronounced in β2-AR deficient mice compared to the Syx mice.
Overall, the SNS had differential effects in cartilage, synovium and subchondral bone. A reduced SNS activity by sympathectomy attenuated cartilage degeneration and synovitis but aggravated the OA specific subchondral bone changes. These findings provide new insights into the development of novel therapeutic strategies for OA by targeting the SNS in a tissue- specific manner.
Die Auswirkungen der syrischen Flüchtlingskrise auf den zivilgesellschaftlichen Sektor im Libanon
(2021)
Die vorliegende Dissertation analysiert die Auswirkungen der syrischen Flüchtlingskrise auf den zivilgesellschaftlichen Sektor im Libanon, in Anbetracht einer historisch engverwurzelten Beziehung zwischen dem Libanon und Syrien. Die Dissertation wird von dem Interesse geleitet, die Rolle der lokalen zivilgesellschaftlichen NROs zu erforschen, die sich mit syrischen Flüchtlingen im Libanon befassen, und versuchen, die Leere des schwachen bzw. minimalistischen libaneischen Staatensystems zu füllen.Es wird untersucht, welche Effekte der syrische Konflikt auf die zivilgesellschaftliche Landschaft im Libanon gehabt hat und wie sich der Zufluss von internationaler Gelder auf die Aktivitäten dieser lokalen NROs sowie auf ihrer Beziehungen zu den libanesischen Staatsbehörden auf nationaler und lokaler Ebene ausgewirkt hat.
Der Verzehr von radioaktiv belasteten Pilzfruchtkörpern stellt ein Gesundheitsrisiko für den Menschen dar und auch fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 sind Pilze aus Waldökosystemen zum Teil noch stark durch das ausgetretene radioaktive 137Cs belastet. Die Einschätzung der Belastung und somit des Gesundheitsrisikos ist aufgrund einer Vielzahl von Einflussfaktoren, wie z. B. der Pilzart, der Tiefe des Myzels, der Bodenkontamination und der Feuchtigkeit des Bodens, schwierig. Ziel dieser Arbeit war es die Variabilität, den Einfluss verschiedener Faktoren sowie die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Pilzfruchtkörpern zu ermitteln. Des Weiteren wurde überprüft, ob die Bodenkontamination für eine Abschätzung der 137Cs-Aktivität von Pilzfruchtkörpern herangezogen werden kann. Für die Untersuchungen wurden über mehrere Jahre Proben von Maronenröhrlingen (Imleria badia) und Steinpilzen (Boletus edulis) aus vier Waldgebieten in Mittel- und Süddeutschland mit unterschiedlichem Aktivitätseintrag nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 analysiert. Die Gebiete waren Eichenzell, Wülfersreuth, Oberschönenfeld und der Nationalpark Bayerischer Wald. Als Ergänzung dienten zugesendete Proben derselben Pilzarten von Mitgliedern aus Pilzvereinen aus ganz Deutschland. Zusätzlich zu den Pilzproben wurden Bodenproben gemessen, um zum einen die aktuelle Bodenkontamination zu bestimmen und zum anderen zu überprüfen, ob der Großteil des 137Cs weiterhin im Bereich des Pilzmyzels zu finden ist.
Für die Untersuchung der örtlichen Variabilität der 137Cs-Aktivität wurden Maronenröhrlinge (Imleria badia) aus dem Waldgebiet Eichenzell in den Jahren 2017 bis 2019 analysiert. Innerhalb eines Sammeltages variierten die Messwerte verschiedener Proben innerhalb des Waldgebietes teilweise um den Faktor sechs. Dabei ist die Variabilität innerhalb eines Teilgebietes größer als zwischen beiden Teilgebieten des Waldgebietes Eichenzell. Für ein repräsentatives Ergebnis eines Gebietes ist es aufgrund der Variabilität erforderlich, eine ausreichende Menge an Fruchtkörpern zu analysieren.
Um die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Maronenröhrlingen (Imleria badia) zu ermitteln, wurden Proben aus drei Waldgebieten über fünf bis neun Jahre analysiert. Die Wahl der drei Waldgebiete erfolgte anhand des 137Cs-Aktivitätseintrags nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986. Die Bodenkontaminationswerte variieren von 3.000 Bq/m² in Eichenzell über 12.500 Bq/m² in Wülfersreuth bis 35.000 Bq/m² in Oberschönenfeld. Die effektiven Halbwerts-zeiten liegen in einem engen Bereich von 5,2 bis 5,8 Jahre mit einem Mittelwert von 5,4 ± 0,3 Jahren. Damit reduziert sich die radioaktive Belastung der Pilzfruchtkörper in etwa fünfmal schneller als durch die rein physikalische Halbwertszeit des 137Cs von 30,08 Jahren. Durch die Hinzunahme von bereits im Jahr 1990 veröffentlichten Daten ergab sich eine längere effektive Halbwertszeit von 7,7 ± 0,6 Jahren.
Für die Untersuchung der zwei Einflussfaktoren Exposition des Sammelgebiets (Hangausrichtung nach Ost oder West) und Höhenlage wurden sowohl Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch Steinpilze (Boletus edulis) hinsichtlich der 137Cs-Aktivität gemessen, um die Auswirkung auf Pilzarten mit unterschiedlichem Akkumulationsvermögen zu analysieren. Als Untersuchungsgebiet diente der Nationalpark Bayerischer Wald, da dieser ein großes Gebiet umfasst und verschiedene Ausprägungen der beiden Faktoren abbildet. Zudem wurde das Gebiet in Folge der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl stark kontaminiert und der Park ist ein beliebtes Pilzsammelgebiet. Anhand der 137Cs-Aktivität von Bodenproben konnte das Gebiet in zwei Regionen (Cluster) eingeteilt werden: eine Region mit hohem und eine mit niedrigem Aktivitätseintrag. Im Vergleich wiesen Maronenröhrlinge (Imleria badia) durchschnittlich eine um den Faktor fünf höhere 137Cs-Aktivität als Steinpilze (Boletus edulis) auf. Der Faktor Höhenlage zeigte im Gegensatz zur Exposition einen Einfluss auf die Kontamination der Pilzfruchtkörper. In Bezug auf die Höhenlage war der Einfluss nur im Falle eines hohen Aktivitätseintrags signifikant, wobei die Pilzproben aus der niedrigsten Höhenlage am höchsten belastet waren.
Zur Ermittlung der vertikalen Verteilung des 137Cs im Boden wurden in den Waldgebieten Eichenzell und Nationalpark Bayerischer Wald Proben bis zu einer Tiefe von 24 cm entnommen und anschließend in 2 cm Schichten analysiert. Alle Verteilungen konnten mit einem Gauß-Fit oder einem multiplen Gauß-Fit mit 2 bis 3 Maxima abgebildet werden. Das erste Maximum lag in allen Fällen in den organischen Horizonten oder im Übergangsbereich zum Ah-Horizont. Folglich befindet sich der Großteil des 137Cs fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl immer noch im Bereich des Pilzmyzels und kann somit von den Pilzen aufgenommen und in den Fruchtkörpern angereichert werden.
Der Vergleich der 137Cs-Aktivität der Pilz- und Bodenproben aus dem Nationalpark Bayerischer Wald ergab sowohl für Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch für Steinpilze (Boletus edulis) eine positive Korrelation. Nach Unterteilung der Proben anhand der Höhenlage zeigte sich eine noch stärkere Korrelation. Dies zeigt, dass neben der Bodenkontamination auch die Höhenlage einen Einfluss auf die 137Cs-Aktivität der Fruchtkörper hat.
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Measuring teaching cross-culturally - the issue of measurement invariance and sources of bias
(2021)
Im Kontext der Globalisierung nimmt das Interesse daran, Unterricht vergleichend zwischen Bildungssystemen der ganzen Welt zu untersuchen, kontinuierlich zu (Paine et al., 2016). Unterricht ist einer der stärksten Prädiktoren für Lernergebnisse von Schülerinnen und Schülern (Hattie, 2009). Folglich bieten internationale Vergleiche die einmalige Möglichkeit von besonders erfolgreichen Bildungssystemen zu lernen und geben Auskunft über die Generalisierbarkeit beziehungsweise über die kulturellen Variationen von Unterricht und dessen Wirksamkeit. Gleichzeitig sind sie richtungsweisend für bildungspolitische Entscheidungen (Klieme, 2020). Zur Erfassung von Unterrichtsmerkmalen aus der Perspektive der beteiligten Lehrkräfte und Schülerinnen und Schüler werden häufig Fragebögen in internationalen Schulleistungsstudien eingesetzt. Erste empirische Befunde weisen jedoch daraufhin, dass die Fragebogenskalen oftmals nicht messinvariant sind (z.B. Desa, 2014; He & Kubacka, 2015; Nilsen & Gustafsson, 2016). Das bedeutet, dass Unterschiede in den Messwerten zwischen Bildungssystemen nicht automatisch genuine Unterschiede im gemessenen Konstrukt, wie beispielsweise Unterschiede in der Klassenführung, reflektieren. Stattdessen entstehen diese teilweise durch nicht intendierte kulturelle Variationen im Antwortprozess (Bias), beispielsweise durch kulturelle Unterschiede in der Bedeutung der Items zur Messung von Klassenführung oder durch kulturspezifische Antworttendenzen (van de Vijver & Leung, 1997). Eine fehlende Messinvarianz hat folgenreiche Konsequenzen, da valide (Mittelwerts-)Vergleiche von Unterrichtsmerkmalen zwischen Bildungssystemen nicht möglich sind und somit die umfangreichen Datensätze internationaler Studien nicht ausgeschöpft werden können (Davidov et al., 2018a). Dennoch mangelt es in der international vergleichenden Bildungsforschung bisher an empirischen Studien, die mit fortgeschrittenen Analysemethoden die Messinvarianz von Unterrichtsmerkmalen prüfen, sowie an empirisch-fundierten Erkenntnissen zu den Ursachen der oftmals fehlenden Invarianz. Mit einer Kombination aus quantitativen und qualitativen Methoden widmet sich die vorliegende Dissertation in drei Beiträgen der Aufarbeitung dieser Forschungslücke. Sie konzentriert sich auf Fragebogenskalen zur Messung von zwei generischen Unterrichtsmerkmalen aus der Perspektive von Schülerinnen und Schülern, der Unterrichtsqualität mit den Dimensionen Klassenführung, konstruktive Unterstützung und kognitive Aktivierung und den Unterrichtsmethoden mit den Dimensionen lehrerzentrierte und schülerzentrierte Methoden und Methoden des Assessments.
Beitrag I prüft die Messinvarianz von PISA Skalen zur Erfassung der drei Basisdimensionen der Unterrichtsqualität zwischen 15 Bildungssystemen. Zusätzlich wird untersucht, ob die kulturelle Ähnlichkeit (operationalisiert als ähnliche oder identische Sprache) der Bildungssysteme einen Einfluss auf das Ausmaß der Messinvarianz besitzt. Da die Modellannahmen der häufig eingesetzten konfirmatorischen Faktorenanalyse zunehmend als zu strikt für Messinvarianzprüfungen im interkulturellen Kontext kritisiert werden (Rutkowski & Svetina, 2014), wird mit Alignment (Asparouhov & Muthén, 2014) eine flexiblere und angemessenere Methode verwendet. Dennoch erreichen die drei Basisdimensionen nur metrische (identische Faktorenladungen) und nicht skalare Invarianz (identische Intercepts) zwischen den 15 Bildungssystemen. Folglich sind valide Vergleiche von Mittelwertsunterschieden in der Unterrichtsqualität zwischen den 15 Bildungssystemen nicht möglich. Innerhalb der fünf Cluster, bestehend aus jeweils drei Bildungssystemen mit ähnlicher oder identischer Sprache, wird im Gegensatz dazu skalare Invarianz bestätigt. Die Ergebnisse aus Beitrag I legen nahe, dass die untersuchten Fragebogenskalen zur Messung von Unterrichtsqualität unterschiedlich zwischen Bildungssystemen funktionieren. Eine höhere Vergleichbarkeit scheint jedoch mit einer kulturellen und sprachlichen Ähnlichkeit der Befragten einherzugehen. Wird diese Ähnlichkeit bei der Analyse berücksichtigt, sind valide Vergleiche von Mittelwertsunterschieden für eine Teilmenge an Bildungssystemen mit invarianter Messung möglich.
Beitrag II knüpft an Ergebnisse aus Beitrag I an und untersucht potenzielle Ursachen der fehlenden Invarianz. Der Fokus liegt auf kulturellen Variationen im Antwortprozess, die zu einer eingeschränkten Datenvergleichbarkeit führen können (z.B. Schwarz et al., 2010). Beitrag II konzentriert sich auf die erste und zweite Stufe des Antwortprozesses, der Item-Interpretation und der Assoziation des Item-Inhaltes mit persönlichen Erfahrungen (Tourangeau, 1984). Mit Hilfe von kognitiven Interviews wird untersucht, wie Schülerinnen und Schüler aus China (Shanghai) und Deutschland PISA Items zur Messung konstruktiver Unterstützung interpretieren und welche Unterrichtserfahrungen sie mit den Items assoziieren. Die Ergebnisse der strukturierenden qualitativen Inhaltanalyse nach Kuckartz (2018) zeigen zwar, dass sowohl chinesische als auch deutsche Schülerinnen und Schüler die Items mehrheitlich mit Unterrichtsmethoden assoziieren, die zur Kompetenzunterstützung beitragen (beispielsweise Methoden zur Beseitigung von Verständnisproblemen). Es zeigen sich jedoch auch deutliche interpretative Variationen, sowohl für statistisch nicht messinvariante (nicht vergleichbare) Items als auch für messinvariante (vergleichbare) Items. Diese können zum einen auf Eigenschaften der Messung zurückgeführt werden. Hierzu zählt eine unterschiedliche Übersetzung des Terms Lernen (in Deutschland Lernfortschritt in China Lernstand). Zudem finden sich Hinweise, dass komplexe und uneindeutige Itemformulierungen mehr Spielraum für kulturspezifische Interpretationen zulassen. Die zweite Ursache der interpretativen Variationen ist ein unterschiedliches Verständnis von konstruktiver Unterstützung, das durch kulturelle Unterschiede in der Unterrichtsgestaltung und -zielsetzung erklärt werden kann (Leung, 2001). Neben der Kompetenzunterstützung assoziieren die deutschen Schülerinnen und Schüler die Items mehrheitlich mit Methoden zur Unterstützung ihrer Autonomie und ihres sozial-emotionalen Erlebens im Unterricht, wohingegen die chinesischen Schülerinnen und Schüler die Items mehrheitlich mit Methoden zur Unterstützung ihrer akademischen Produktivität (z.B. ihrer Aufmerksamkeit) assoziieren. Die Ergebnisse aus Beitrag II legen nahe, dass die Interpretation von Fragebogenitems variieren kann, je nach dem in welchem kulturellen Kontext die Frage gestellt wird. Sie betonen zudem, dass quantitative und qualitative Methoden miteinander kombiniert werden sollten, um verlässliche Information über die interkulturelle Vergleichbarkeit von Fragebogenitems zu erhalten ...
Diese Arbeit ist ein detaillierter Bericht über die Forschungsaktivitäten, die ich während meiner Promotion am Max-Planck-Institut für Biophysik durchgeführt habe. Mit dem Aufkommen der direkten Elektronendetektoren erlebte die Transmissionselektronenmikroskopie von gefrorenen hydratisierten Proben (Kryo-EM) einen epochalen Wandel, die sogenannte “Auflösungsrevolution”. Ab den 2010er Jahren ermöglichte die Kommerzialisierung der ersten direkten Detektoren die Erforschung biologischer Phänomene in beispiellosem Detail und machte Kryo-EM zu einer der leistungsstärksten (und gefragtesten) Forschungsmethoden in den Biowissenschaften. Meine Forschung konzentrierte sich auf die Verwendung der Elektronen-Kryotomographie, um zwei herausfordernde Ziele zu erreichen. Das erste bestand darin, die Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu untersuchen, und das zweite die molekulare Landschaft eines lichtempfindlichen Chloroplastenvorläufers, des Etioplasten, zu beschreiben. Um die Relevanz, Herausforderungen und Auswirkungen meiner Arbeit zu vermitteln, habe ich diese Arbeit in drei Kapitel unterteilt.
Kapitel eins enthält eine Einführung in die Transmission-Elektronenmikroskopie.
Nach einer kurzen Zusammenfassung der historischen Meilensteine in der Disziplin beschreibe ich die wesentlichen Komponenten des TEM und deren Funktionsweise. Hier lege ich besonderen Wert auf die Struktur elektromagnetischer Linsensysteme, wie sie den Weg der Elektronen beim Durchlaufen der Säule beeinflussen und wie Bilder entstehen. Der hardwarebezogene Teil der Einführung wird durch eine vereinfachte Beschreibung der Elektronendetektoren abgeschlossen, in der ich die revolutionären Aspekte der direkten Elektronendetektoren, mit der Struktur und Funktion von CCD-Detektoren (Charge Coupled Device detector) vergleiche. Als nächstes konzentriere ich mich auf die theoretischen Prinzipien der Bilderzeugung. Um die Hauptphänomene im Zusammenhang mit der Bildqualität in TEM hervorzuheben, stelle ich grundlegende Konzepte wie den Einfluss von Elektronenenergie und optischen Aberrationen vor, gefolgt von einer ausführlicheren Beschreibung des Ursprungs von Kontrast und Rauschen. Der Unterabschnitt schließt mit einigen Überlegungen darüber, wie - und vor allem wie effizient - Detektoren kontinuierliche Elektronenwellen in diskrete Bereiche (Pixel) abtasten. Der folgende Unterabschnitt ist der Erfassung und Verarbeitung tomografischer Daten gewidmet. Hier gebe ich eine vereinfachte Beschreibung, wie Kippserien mit dem Mikroskop erfasst werden und wie die Rohdaten zu einer dreidimensionalen Darstellung der Probe verarbeitet werden. Der Einfluss der Neigungsgeometrie und der Dosisverteilung auf die Rekonstruktionsqualität wird ebenfalls diskutiert. Der zweite Teil des Unterabschnitts befasst sich mit der Strukturbestimmung durch Subtomogramm-Mittelung und der Errechnung der Auflösung von Kryo-EM-Rekonstruktion. Zuletzt schließe ich das Kapitel mit einer Beschreibung der Vorbereitung biologischer Proben für die Kryo-EM-Bildgebung mit einigen abschließenden Bemerkungen zur Dynamik und den Grenzen der Vitrifizierung ab.
Kapitel zwei folgt dem Thema der Kryo-Präparation biologischer Proben mit der Untersuchung der Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche.
Im Einführungsabschnitt skizziere ich die wichtigsten Aspekte dieses Phänomens. Frühe Experimente zum Verhalten von Proteinen in Lösung zeigten ihre Neigung, aus der Lösung zu ihrer Grenzfläche mit der Atmosphäre zu diffundieren. Hier bilden sie meist unlösliche Schichten denaturierter Fibrillen Es wurde vorgeschlagen, dass die Korrelation zwischen Proteindenaturierung und Kontakt mit der Grenzfläche auf einen allmählichen Entfaltungsprozess zurückzuführen ist, bei dem Tausende von Wechselwirkungen pro Sekunde zu einer immer größeren strukturellen Schädigung führen würden. Ein direkter Beweis für diesen Mechanismus wurde jedoch nie dokumentiert. Um einen tieferen Einblick in die Dynamik an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu erhalten, sammelte ich Kryotomogramme vitrifizierter Präparate der Fettsäuresynthase (FAS, Fatty Acid Synthase) aus Hefe. Im ersten Unterabschnitt der Ergebnisse beschreibe ich, wie die biochemische und Negativkontrastierung-TEM-Analyse von FAS-Fraktionen zeigte, dass der Komplex während des gesamten Reinigungsverfahrens intakt und katalytisch aktiv blieb. Nach der Vitrifizierung ergab die Einzelpartikelanalyse jedoch, dass 90% aller Komplexe stark beschädigt waren. Die tomographische Rekonstruktion derselben Proben zeigte, dass alle FAS-Komplexe an die Luft-Wasser-Grenzfläche gebunden waren. Die Seite des Moleküls, die der Grenzfläche ausgesetzt war, schien abgeflacht zu sein, während die Seite, in der wässrigen Phase, ihre native Struktur beibehielt. Die Mittelung der Subtomogramme bestätigte, dass eine Seite von fast 90% der Partikel stark beschädigt war. Durch den Vergleich der Ausrichtung dieser beschädigten Seite mit der Position eines Rechenmodells der Luft-Wasser-Grenzfläche konnte ich nachweisen, dass sie perfekt übereinstimmen, was den ersten direkten Beweis dafür liefert, dass die Wechselwirkung mit der Luft-Wasser-Grenzfläche die lokale Denaturierung großer Proteinkomplexe herbeiführt.
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The present research in high energy physics as well as in the nuclear physics requires the use of more powerful and complex particle accelerators to provide high luminosity, high intensity, and high brightness beams to experiments. With the increased technological complexity of accelerators, meeting the demand of experimenters necessitates a blend of accelerator physics with technology. The problem becomes severe when optimization of beam quality has to be provided in accelerator systems with thousands of free parameters including strengths of quadrupoles, sextupoles, RF voltages, etc. Machine learning methods and concepts of artificial intelligence are considered in various industry and scientific branches, and recently, these methods are used in high energy physics mainly for experiments data analysis.
In Accelerator Physics the machine learning approach has not found a wide application yet, and in general the use of these methods is carried out without a deep understanding on their effectiveness with respect to more traditional schemes or other alternative approaches. The purpose of this PhD research is to investigate the methods of machine learning applied to accelerator optimization, accelerator control and in particular on optics measurements and corrections. Optics correction, maximization of acceptance, and simultaneous control of various accelerator components such as focusing magnets is a typical accelerator scenario. The effectiven- ess of machine learning methods in a complex system such as the Large Hadron Collider, which beam dynamics exhibits nonlinear response to machine settings is the core of the study. This work presents successful application of several machine learning techniques such as clustering, decision trees, linear multivariate models and neural networks to beam optics measurements and corrections at the LHC, providing the guidelines for incorporation of machine learning techniques into accelerator operation and discussing future opportunities and potential work in this field.
Acinetobacter baumannii is a worldwide opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections. One of the main factors contributing to multidrug resistance in A. baumannii is the upregulation of various chromosomally encoded or acquired efflux pumps, which expel toxic compounds out of the cells with high efficiency.
The resistance-nodulation-cell division (RND)-type efflux pump gene deletion strains ∆adeAB, ∆adeFG or ∆adeIJ and the major facilitator superfamily (MFS) chloramphenicol efflux pump gene deletion strain ∆craA of A. baumannii ATCC 19606 were created and a differential gene expression study was conducted via RT-qPCR. The expression of efflux pump genes adeB, adeG, adeJ, craA, and the outer membrane protein ompA were examined in the absence and presence of chloramphenicol. No significant up- or downregulation of these genes for any of these deletion strains in comparision to the wild-type strain in absence of the drug chloramphenicol.
In contrast, craA was significantly up-regulated in A. baumannii exposed to chloramphenicol, emphasizing the importance of CraA in chloramphenicol resistance. CraA is widely present in clinical isolates of A. baumannii. It is homologous to the well-studied multiple-drug efflux transporter MdfA from Escherichia coli (61% similarity), but surprisingly reported to be acting as a specific chloramphenicol transporter of A. baumannii (Roca et al., 2009).
The drug susceptibility assay done with A. baumannii ATCC 19606 ΔcraA showed that CraA could confer resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), which was in line with the previous report. CraA was heterologously overproduced in E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA and its substrate specificity was determined by drug susceptibility assays and whole cell fluorescent dye uptake experiments. We observed that the substrate specificity of craA overexpressed in E. coli was more diverse and resembling that of the E. coli MdfA homolog. Apart from resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), CraA also confer resistance towards monovalent cationic drugs (benzalkonium, TPP+, and ethidium), long dicationic drugs (dequalinium and chlorhexidine), fluoroquinolones (norfloxacin and ciprofoxacin) and anticancer drugs (mitomycin C). We showed that CraA is a drug/H+ antiporter by ACMA quenching in inverted CraA or CraA variant containing membrane vesicles.
To address the molecular determinants for multidrug binding and transport, 45 mostly single Ala-substitution variants of CraA were created. These include substitution variants for membrane-embedded proton-titratable residues (E38, D46, and E338) and residues predicted to be important for binding and transport of drug, as inferred from docking experiments on basis of a MdfA-derived CraA model. The combined results indicated a high degree of functional similarities between MdfA and CraA. The conserved titratable residues E26 and D34 (E38 and D46 in CraA) are important for transport in both these homologs. The CraA variant E38A is inactive against all tested drugs, but D46A is only inactive for some drugs, suggesting that only E38 is involved in H+-transport.
Another focus of this thesis is the three tetracycline transporters of A. baumannii strain AYE, TetA, TetG and TetA(A). Susceptibility assays involving tetracycline, minocycline, doxycycline and the last-resort antibiotic tigecycline were conducted on E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA overexpressing these transporters. TetA(A) was excluded from further study due to toxicity of the cells caused by protein overexpression. Both TetA and TetG confer resistance against tetracycline, minocycline and doxycycline. Although tigecycline was reported not to be recognized by tetracycline efflux pumps, we surprisingly found that TetA is able to transport tigecycline. The role of TetA in tigecycline efflux in A. baumannii was confirmed by conducting tigecycline susceptibility assays on A. baumannii.
We speculate that TetA embedded in the inner membrane acts in cooperation with RND-type tripartite systems that span the inner and outer membrane to extrude tigecycline from the periplasm across the outer membrane. A. baumannii ATCC 19606 ∆adeAB were indeed sensitive to tigecycline in comparison to wild-type strain. Deletion of adeIJ also leads to sensitivity to tigecycline, but less so compared to the DadeAB phenotype, while A. baumannii ATCC 19606 ∆adeFG did not show any difference compared to wild-type strain in tigecycline susceptibility. Differential gene expression analysis of the RND efflux pumps (adeB, adeG and adeJ) and tetA of A. baumannii strain AYE showed that the expression of tetA expression is significantly upregulated when tigecycline is present in the growth medium.
We conclude that craA encodes a broad-spectrum efflux pump rather than a specific chloramphenicol transporter. In A. baumannii, the synergistic effects with the outer membrane and/or the presence of other transporters could result in the discrepancy observed. Thus, the possibility of CraA in conferring multidrug resistance should not be overlooked, especially when it is up-regulated under antibiotic stress conditions.
Eines der übergeordneten Ziele neurowissenschaftlicher Grundlagenforschung ist es, die Pathomechanismen neuropsychiatrischer Erkrankungsbilder besser zu verstehen. Als Erklärungsmodell für einige dieser Erkrankungen dient unter anderem ein gestörtes Verhältnis zwischen Exzitation und Inhibition im Gehirn. Synaptische Strukturproteine sind wichtige Modulatoren dieses Verhältnisses. Für eine unbeeinträchtigte inhibitorische synaptische Transmission spielt das postsynaptische Zelladhäsionsprotein Neuroligin 2 eine maßgebliche Rolle, um das Gleichgewicht zwischen Exzitation und Inhibition aufrechtzuerhalten. Neuroligin 2 ist an der inhibitorischen Synapse lokalisiert und beeinflusst die Entwicklung, Reifung und Funktion dieser Synapse. Die klinische Relevanz von Neuroligin 2 wurde bereits bei zahlreichen Erkrankungsbildern wie Schizophrenie, Depression oder Epilepsie im Rahmen von Studien nachgewiesen. Um das Verhältnis zwischen Exzitation und Inhibition in vivo sowie Mechanismen der synaptischen Übertragung und Plastizität zu untersuchen, hat sich die Ableitung von Feldpotentialen im Gyrus Dentatus des Hippocampus etabliert. Im Neuroligin 2 Knockout Mausmodell konnte bereits gezeigt werden, dass eine pränatale Deletion dieses Proteins eine stark erhöhte Erregbarkeit der Körnerzellen und eine verminderte GABAerge Netzwerkinhibition im Gyrus Dentatus in vivo zur Folge hat.
Unklar blieb bisher, ob diese durch den konventionellen Neuroligin 2 Knockout (pränatal) hervorgerufenen Netzwerkveränderungen alleine auf das Fehlen dieses Proteins zurückzuführen sind oder durch eine zusätzliche Beeinträchtigung der Hirnentwicklung hervorgerufen werden. Ziel dieser Dissertation ist es deshalb, die Rolle von Neuroligin 2 im Gyrus Dentatus durch einen induzierten Knockout in adulten Mäusen (postnatal) unabhängig von einem möglichen Entwicklungseffekt zu klären.
Dazu wurde im ersten methodischen Schritt dieser Dissertation durch orale Tamoxifen-Gabe eine zeitspezifische konditionale Eliminierung von Neuroligin 2 in genetisch modifizierten, adulten Mäusen erzielt. Im Anschluss an diese konditionale Eliminierung wurde die synaptische Transmission, Plastizität sowie neuronale Erregbarkeit von Körnerzellen im Gyrus Dentatus mittels elektrophysiologischer Experimente untersucht. Hierzu wurde zunächst der Tractus Perforans und die Körnerzellschicht durch stereotaktische Chirurgie in anästhesierten Mäusen lokalisiert. Anschließend wurde eine Stimulation des Tractus Perforans sowie eine Ableitung von Feldpotentialen im Gyrus Dentatus durchgeführt. Um die Erregbarkeit der Körnerzellen, die synaptische Transmission, Kurz- und Langzeitplastizität sowie Netzwerkinhibition im Gyrus Dentatus zu analysieren, wurden unterschiedliche Stimulationsprotokolle verwendet. Im Anschluss an die elektrophysiologischen Experimente wurden die Hippocampi beidseitig entnommen, konserviert und später einer Proteinquantifizierung von Neuroligin 2 mittels Western-Blotting unterzogen.
Die Ergebnisse zeigten ein signifikant verringertes Proteinlevel von Neuroligin 2 auf 41,07% im Hippocampus von konditionalen Neuroligin 2 Knockout Mäusen. Unter dieser Reduktion von Neuroligin 2 in adulten Mäusen war die in vivo Erregbarkeit der Körnerzellen des Gyrus Dentatus sowie GABAerge Netzwerkinhibition weitgehend unbeeinträchtigt und die signifikanten Beobachtungen des konventionellen Knockout Modells ließen sich nicht reproduzieren. Aufgrund der unvollständigen Proteinreduktion lässt sich jedoch nicht abschließend beurteilen, ob die Restmenge den elektrophysiologischen Effekt kompensiert oder ob die im konventionellen Neuroligin 2 Knockout Modell beobachteten Effekte auf eine ausschließliche Rolle von Neuroligin 2 in der Hirnentwicklungsperiode zurückzuführen sind. Kürzlich veröffentlichte Daten zeigten allerdings, dass die postnatale Deletion von Neuroligin 2 in anderen Hirnregionen zu einer verminderten Netzwerkinhibition führt.
Neben der hier verwendeten in vivo Methodik ist eine Ergänzung von Untersuchungen in nicht-anästhesierten Tieren sowie Messungen einzelner Zellen durch whole-cell patch-clamp Untersuchungen in vitro oder in vivo zu erwägen. Es sollte dabei auf eine konditionale Proteineliminierung geachtet werden, damit mögliche Kompensationsmechanismen weitgehend ausgeschlossen werden können. Eine weiterführende immunhistochemische Bildgebung der Hippocampuspräparate, wie sie im konventionellen Knockout durchgeführt wurde, könnte sich hierbei ebenso als aufschlussreich für die Funktion von Neuroligin 2 im Hippocampus des adulten Tieres erweisen.
Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) steht weltweit an dritter Stelle tumorbedingter Todesursachen. Eine kurative Therapie durch Leberresektion oder Transplantation ist nur dann Erfolg versprechend, wenn der Patient in einem frühen Stadium diagnostiziert wird, in dem noch keine Fernmetastasen oder Gefäßinvasionen vorliegen. Die Ausbildung von Mikrometastasen sind mittels Bildgebung nicht detektierbar.
Mit Hilfe der „liquid biopsy“, einem Blutanalyseverfahren, das sich auf die Detektion zirkulierender Tumorzellen (CTCs) im Patientenblut fokussiert, ist es m glich, diese Tumorzellen im Anschluss an ihre Isolation auf ihre molekularen Eigenschaften hin zu untersuchen. Im Laufe des Metastasierungsprozesses kommt es zur De- und Repolarisierung der CTCs.
In der vorliegenden Promotionsarbeit wurde ein immunologisches Verfahren zur Detektion polarisierter Tumorzellen (p-CTCs) im Blut von Patienten mit HCC entwickelt. Dazu erfolgte zunächst die Isolation der CTCs mittels Dichtegradientverfahren (Oncoquick@, Fa. Greiner
bio-one) und die anschließende Immunfluoreszenzfärbung der CTCs mittels Anti-Ezrin-Alexa- Fluor 488 zum strukturellen Nachweis des zytoskelletalen Membranproteins Ezrin.
Anhand der Lokalisation des Ezrin innerhalb der CTCs war es m glich, die CTCs in polarisierte(p-CTC) und nicht-polarisierte Zellen (non-polarized CTC) zu unterteilen. Mit diesem Verfahren konnten in einem Zeitraum von Juni 2018 bis Januar 2019 Blutproben (5 ml/Patient) von 15 Patienten mit HCC und von 10 Patienten mit einer nicht malignen Lebererkrankung (NMLD) untersucht werden.
Die häufigste Grunderkrankung war mit 30,43% (n=7) C2 Abusus, gefolgt von der NASH mit 26% (n=6) und DM Typ 2 mit Leberzirrhose mit 13,04% (n=2). 10 (66,6%) HCC-Patienten hatten eine Leberzirrhose. Bei einem Patienten war die Tumorgröße <2 cm, bei 7 Patienten zwischen 2-5 cm, und 7 Patienten hatten eine Tumorgröße von > 5 cm. Die meisten Patienten hatten ein BCLC-Stadium C (n=7), gefolgt von BCLC-Stadium B (n=4), und BCLC-Stadium D (n=3) und nur ein Patient hatte ein BCLC-Stadium 0.
In 14 (93,3%) HCC-Patienten konnten CTCs 1,2 CTCs/ml (0,4-3 CTCs/ml) nachgewiesen werden. Die Falsch-Positiv-Rate lag bei 0,2 isolierte Zelle/ml (p=0,0006). P-CTC konnten in 10/14(71%) HCC-Patienten identifiziert werden. Die HCC-Gruppe wies mit 0,42 p-CTCs/ml signifikant mehr p-CTCs als die NMLD-Patienten(0 p-CTCs/ml, p=0,002).
Eine negative Korrelation fand sich zwischen der Tumorgröße, BCLC-Stadium und der Anzahl polarisierter CTCs (r=-0,029, p=ns).
Die hier vorgestellten Daten zum Nachweis der Polarisierung von CTCs in Zusammenhang mit HCC könnten zukünftig eine Rolle in der molekularen Charakterisierung von CTCs und der
Diagnose des HCC darstellen.
In this thesis, molecular dynamics (MD) simulations are used to study the interaction of different proteins with lipid bilayers. MD simulations can be used as a “computational microscope” to gain atomistic insights into the interactions between proteins and lipids that can barely be accessed in such detail by experimental methods. The different chapters of this thesis address the lipid sensing functionality of amphipathic helices (AHs) when bound to membranes, the folding of AHs at lipid-water interfaces as well as the conformational dynamics of the HIV-1 Env glycoproteins in viral-like and experimental bilayers. In the last chapter the possibilities to enhance the performance of MD simulations are explored, leading to a more efficient usage of computational resources.
Endolysosomal effectors and their relevance for antiviral activity against the Hepatitis E virus
(2021)
Mit über 20 Millionen registrierter Fälle pro Jahr, repräsentiert das Hepatitis-E-Virus (HEV) eine Hauptursache einer viralen Hepatitis weltweit und stellt ein erhebliches Risiko insbesondere für Schwangere und Immunsupprimierte dar. Jedoch sind Behandlungsoptionen stark limitiert und mit teils schweren Nebenwirkungen verbunden. Neue Erkenntnisse des Wechselspiels zwischen Wirtszelle und HEV werden deshalb benötigt, um neue antivirale Wirkstoffe zu entwickeln. Der Fokus der Arbeit wurde hierbei auf Effektoren des endosomalen Systems gesetzt, welches von HEV zur Freisetzung von Virionen genutzt wird.
Eine virale Infektion führt in der Zelle zur Produktion von Interferonen (IFNs) und weiters zu einer IFN-Antwort. Ein essenzielles Effektormolekül, welches HEV nachweislich effizient repressiert, ist die GTPase guanylate binding protein 1 (GBP1). In dieser Studie wurde beleuchtet, dass Letztere durch eine HEV-Infektion induziert wird. Zusätzlich reduziert die ektopische Expression von GBP1 sowohl die intrazelluläre Menge des HEV Kapsidproteins als auch die Menge freigesetzter Virionen. Mechanistisch liegt diesem Sachverhalt die GBP1-induzierte Inkorporation von Virionen in Lysosomen zugrunde, was schlussendlich deren Abbau nach sich zieht. Erkenntnisse über die Rolle verschiedener GBP1 Proteindomänen innerhalb des Mechanismus wurden unter Verwendung ektopischer Expression von GBP1-Mutanten erlangt. Inkorporation der Mutation R48A führt zum Verlust der GTPase-Aktivität. Andererseits führt eine Inkorporation der Mutation S73A zum Verlust der Homodimerisierung, was die nachfolgende Farnesylierung und gekoppelte Membranassoziation reduziert. Hierbei behält GBP1-R48A Fähigkeiten zur Induktion lysosomalen Abbaus von HEV bei, GBP1-S73A jedoch nicht. Dies wiederum bedeutet, dass eine GBP1 Homodimerisierung notwendig für den antiviralen Mechanismus ist, was eine Adapterfunktion des Moleküls für lysosomale Inkorporation nahelegt. Die Relevanz von GBP1 während einer IFNγ-Antwort wurde deshalb mittels siRNA-basiertem Silencing untersucht. Ähnlich der ektopischen Expression von GBP1 induziert IFNγ die lysosomale Degradation von HEV. In Abwesenheit von GBP1 jedoch, ist dieser Effekt signifikant geringer ausgeprägt, was zu einem Effizienzverlust von IFNy in Bezug auf dessen antiviralen Effekt bedeutet. Dies führte schlussendlich zur Identifizierung von GBP1 als essenziellen Restriktionsfaktor gegen HEV, was seine Rolle in Abhängigkeit seiner Homodimerisierung via Induktion lysosomalen Abbaus erfüllt.
Nebst der Induktion von GBP1, konnte eine Akkumulation von Cholesterin in Lysosomen durch IFNy nachgewiesen werden. Da dieses Lipid einen essenziellen Faktor für endosomale Reifung, Transport und Funktionalität darstellt, wurden Cholesterinspiegel und verbundene transkriptionelle Fußabdrücke im Kontext einer HEV Infektion untersucht. Letztere führt zu einer Dysregulation Cholesterin-assoziierter Genexpression, was eine Reduktion intrazellulären Cholesterins nach sich zieht. Auch in HEV infizierten Patienten liegt eine Abnahme des Serumcholesterins vor. Unter Modulation intrazellulären Cholesterins, wurde deutlich, dass die Inhibition der Cholesterinsynthese durch Simvastatin eine verstärkte Freisetzung von Virionen nach sich zieht, was ebenso in HEV infizierten Patienten nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu zieht eine Erhöhung intrazellulären Cholesterins via Supplementierung von Lipoproteinpartikeln niedriger Dichte (LDL) oder 25-Hydroxycholesterin eine signifikante Reduktion des viralen Kapsidproteins und freigesetzter Virionen nach sich. Dem liegt eine verstärkte Inkorporation von HEV in Lysosomen mit anschließender Degradation zugrunde. Ob dieser Mechanismus pharmakologisch nutzbar ist, wurde mittels eines Screenings Lipid modulatorischer Medikamente untersucht. Der p-Glykoprotein Inhibitor PSC833 und besonders der PPARα-Agonist Fenofibrat stellten sich als äußerst effiziente Inhibitoren des HEV heraus. Beide führen zu einer Erhöhung und Akkumulation zellulären Cholesterins in vesikulären Strukturen. Dies zieht eine dramatische Erhöhung lysosomaler Lokalisation von HEV nach sich und führt letzten Endes zu einer signifikanten Reduktion freigesetzter Virionen.
Zusammenfassend konnten in dieser Studie essenzielle Funktionen von GBP1 in Bezug auf dessen restriktiven Effekt gegen HEV identifiziert werden. Weiters wurde dieses als entscheidender Wirtsfaktor für die IFNγ-Antwort gegen das Virus identifiziert. Andererseits legt diese Studie nahe, dass HEV niedrige Cholesterinspiegel innerhalb infizierter Zellen für die Freisetzung von Virionen benötigt. Andererseits sind erhöhte intrazelluläre Cholesterinspiegel schädlich für die virale Freisetzung, da der lysosomale Abbau von Virionen induziert wird. Dies führte zur erfolgreichen Entdeckung eines neuartigen antiviralen Wirkstoffes, welcher diesen cholesterinabhängigen Effekt effizient induziert: Fenofibrat.
In this thesis we investigate the thermodynamic and dynamic properties of the D-dimensional quantum Heisenberg ferromagnet within the spin functional renormalization group (FRG); a
formalism describing the evolution of the system’s observables as the magnetic exchange inter-action is artificially deformed. Following an introduction providing a self contained summary of the conceptual and mathematical background, we present the spin FRG as developed by Krieg and Kopietz in references [1] and [2] in chapter two. Thereto, the generating functional of the imaginary time-spin correlation functions and its exact flow equation describing the deformation process of the exchange interaction are introduced. In addition, it is highlighted that - in contrast to conventional field-theoretic FRG approaches - the related Legendre trans-formed functional cannot be defined if the exchange interaction is initially switched off. Next, we show that this limitation can be circumvented within an alternativ hybrid approach, which treats transverse and longitudinal spin fluctuations differently. The relevant functionals are introduced and the relations of the corresponding functional Taylor coefficients with the spin correlation functions are discussed. Lastly, the associated flow equations are derived and the possibility of explicit or spontaneous symmetry breaking is taken into account.
In chapter three, we benchmark the hybrid formalism against a calculation of the thermo-dynamic properties of the one and two-dimensional Heisenberg model at low temperatures T and finite magnetic field H. For this purpose, we devise an anisotropic deformation scheme of the exchange interaction which allows for a controlled truncation of the infinite hierarchy of FRG flow equations. Thereby, contact with mean-field and spin-wave theory is made and the violation of the Mermin-Wagner theorem is discussed. To fulfill the latter, the truncation scheme is then complemented by a Ward identity relating the transverse self-energy and the magnetization. The resulting magnetization M (H, T ) and isothermal susceptibility χ(H, T ) are in quantitative agreement with the literature and the established behavior of the transverse correlation length and the zero-field susceptibility close to the critical point is qualitatively reproduced in the limit H → 0.
Finally, we investigate the longitudinal dynamics at low temperatures. To this end, the hierarchy of flow equations is solved within the same anisotropic deformation scheme complemented by an expansion in the inverse interaction range, and the resulting longitudinal dynamic structure factor is calculated within a low-momentum expansion. In D = 3, the large phase space accessible for the decay into transverse magnons yields only a broad hump centered at zero frequency whose width scales linearly in momentum. In contrast, at low temperatures and in a certain range of magnetic fields, a well-defined quasiparticle peak with linear dispersion emerges in D ≤ 2, which we identify as zero-magnon sound. Sound velocity and damping are discussed as a function of temperature and magnetic field, and the relevant momentum-frequency window is estimated and compared to the hydrodynamic
second-magnon regime.
Mit 71 Millionen chronisch erkrankten Patienten im Jahr 2015 stellt die chronische Hepatitis C-Virusinfektion eine wichtige Ursache für Zirrhose, Leberdekompensation und Leberkrebs dar.
Eine grundlegende Eigenschaft des Hepatitis C-Virus (HCV) ist die Biogenese modifizierter intrazellulärer Membranen. Das dabei aus dem endoplasmatischen Reticulum (ER) gebildete, sogenannte membranöse Netz (MW, membranous web) dient im Rahmen des HCV-Lebenszyklus als Gerüst für die Assemblierung eines Multi-Protein-Replikase-Komplexes. Das MW wird durch virale nicht-strukturelle Proteine wie NS5A induziert.
Das Multidomänen-Metalloprotein NS5A ist über seine verschiedenen Domänen sowohl bei der Replikation am MW als auch bei der viralen Assemblierung und Freisetzung in der Nähe von Lipidtropfen (LD, lipid droplet) maßgeblich beteiligt. Seine N-terminale amphipathische Helix (AH) spielt dabei über die vermittelte Assoziation von NS5A mit Membranen eine wichtige Rolle. Damit verbundene spezifische Lipidinteraktionen von NS5A unterliegen molekularen Umstrukturierungen, die benötigt werden, um NS5A für seine
verschiedenen Aufgaben im viralen Lebenszyklus anzupassen. Es liegen zwar Röntgen-strukturmodelle von Domäne 1-Dimeren und NMR-Strukturen zur AH vor, allerdings keine experimentellen Strukturen des NS5A-Proteins vollständiger Länge (NS5A fl) in seinem natürlichen Lipidmilieu. Trotz der essentiellen Bedeutung von NS5A für den HCV-Lebens-zyklus und langjähriger Forschung ist bisher nur wenig zur molekularen Funktionsweise von NS5A bekannt.
Dennoch konnten durch Screening hochpotente NS5A-Inhibitoren entdeckt und weiterentwickelt werden. NS5A-Inhibitoren tragen als direkt wirkende antivirale Arzneimittel(DAA, direct-acting antiviral) entscheidend zum Therapieerfolg bei der Behandlung der Hepatitis C bei. Trotz ihrer Bedeutung in der Therapie und intensiver Forschung ist der Wirk-mechanismus von NS5A-Inhibitoren bisher ungeklärt. Eine durch NS5A-Inhibitoren
induzierte intrazelluläre Umverteilung von NS5A und das ausschließliche Auftreten von Resistenz-assoziierten Mutationen (RAM) nahe der NS5A-Lipid-Interaktionsbereiche weisen jedoch auf einen Effekt der Inhibitoren auf die Lipid-NS5A-Interaktion hin.
Als grundlegende Hypothese dieser Arbeit wurde somit vermutet, dass abhängig vom NS5A umgebenden Lipidmilieu (MW oder LD) spezifische Lipid-Protein-Interaktionen Einfluss auf die Struktur und Funktion von NS5A nehmen und NS5A-Inhibitoren über eine Inhibition dieser Interaktionen wirken. Polyphosphoinositide (PPI) könnten dabei als Lipidinteraktionspartner eine besondere Rolle spielen, da sie bedeutend für die Membran-Kennzeichnung verschiedener Zellkompartimente sind und auch die Funktion von Membranproteinen regulieren können. Eine Interaktion von NS5A mit PtdIns(4,5)P2 wurde bereits publiziert.
Um basierend auf der postulierten Hypothese die mechanistischen Details im Wechselspiel von NS5A und intrazellulären Membranen sowie den dabei möglichen Effekt von
NS5A-Inhibitoren zu untersuchen, musste zunächst NS5A in ausreichender Menge, Reinheit und Qualität rekombinant hergestellt werden. Hierfür wurde ein entsprechendes Protokoll zur Proteinexpression durch Baculovirus-vermittelte Expression in Sf9-Insektenzellen und Strep-Tactin-Reinigung für das full length Protein und trunkierte Varianten etabliert.
In Kooperation mit einem Partner konnte unter Verwendung von giant unilamellar vesicles (GUVs) und konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass unser full length Protein die Struktur von Membranen verändert (Membran-Remodellierung).
Die Stabilität des gereinigten Proteins und damit Effekte auf die Proteinfaltung wurden mittels Thermal shift assay (TSA) untersucht und dabei auch Effekte des NS5A-Inhibitors
Daclatasvir (DCV) und des Metall-Chelators EDTA überprüft. Die Bindung des Inhibitors hatte einen stabilisierenden Effekt auf die Proteinstruktur zur Folge.
Potentielle Interaktionsmuster mit Membranlipiden wurden mit Hilfe eines Protein lipid overlay assays (PLOA) detektiert. Zusätzlich zum in der Literatur bereits beschriebenen
Interaktionspartner PtdIns(4,5)P2 konnten weitere Lipid-Bindungspartner für NS5A identifiziert werden. Dabei legen die gewonnenen Daten nahe, dass die Interaktion über die Domäne 1 von NS5A vermittelt wird, wobei die Domänen 2 und 3 die Affinität zu den Lipidbindungspartnern erhöht, aber nicht das Phospholipid-Bindungsmuster verändert.
DCV hatte im PLOA keine qualitativen Auswirkungen auf das Lipid-Bindungsmuster. Die Lipidinteraktionen wurden mittels eines Liposomen-Rekonstitutionsmodells validiert.
In silico konnten basierend auf verfügbaren, experimentellen Strukturdaten und einem dynamischen Modell drei Cluster basischer Aminosäuren in NS5A-D1-AH als mögliche
PPI-Bindungsstellen identifiziert werden. Basierend auf dem Strukturmodell wurde eine Mutationsstrategie zur Charakterisierung der potentiellen PPI-Bindungsstellen entwickelt.
...
Hintergrund: Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die Haupttodesursache in den Industrienationen. Viele betroffene Patienten haben nur ein geringes Verständnis für ihre Erkrankung. Insbesondere endovaskuläre Eingriffe überschreiten Vorstellungskraft und Verständnis der Patienten häufig um ein Vielfaches. Die ärztliche Eingriffsaufklärung soll den Patienten Einsicht über das Verfahren und mögliche Komplikationen ermöglichen, um dem Patienten autonome Entscheidungen zu erleichtern. In der einschlägigen Literatur wird vielfach diskutiert, wie sich der Aufklärungsprozess komplizierter Prozeduren, wie etwa einer Herzkatheteruntersuchung, optimieren lässt. Jüngst wurden dabei insbesondere moderne Ansätze, wie multimediale Verfahren oder interaktive Tools evaluiert, wobei diese Methoden nach aktueller Studienlage zu einer Verbesserung des Verständnisses und einer Reduktion der Untersuchungsangst führen konnten. Insbesondere Patienten mit geringem Bildungsniveau profitieren dabei von persönlichen Erfahrungen zur Verbesserung des prozeduralen Verständnisses. Diesen Ergebnissen entsprechend, macht es sich die vorliegende Arbeit zur Aufgabe, zu evaluieren, ob sich die Implementierung eines VR-Simulators in den Aufklärungsprozess einer Herzkatheteruntersuchung positiv auf Informiertheit und Untersuchungsangst bei den Patienten auswirkt.
Patienten und Methoden: Nach mündlicher Einwilligung zur Teilnahme an unserer Studie, erhielt ein Teil der Patienten zusätzlich zur herkömmlichen verbalen Aufklärung eine Demonstration des Untersuchungsablaufs einer PCI an einem VR-Simulator. Zusätzlich erhielten diese Patienten die Möglichkeit eine Katheteruntersuchung am Simulator nachzuempfinden. Für unsere Studie verwendeten wir einen VR-Simulator der Firma Xitact® (später Mentice®) mit einer Software der Firma Cathi®. Der Simulationsgruppe wurden 3 verschiedene Komplikationen mittels Abbildungen demonstriert. Im Anschluss beantworteten sowohl die konventionell, als auch die mit Simulation aufgeklärten Patienten einen von uns konzipierten Fragebogen.
Ergebnisse: Beide Gruppen fühlten sich nach der Aufklärung ausreichend informiert. Bezüglich der subjektiven Informiertheit zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zur konventionellen Aufklärungsmethode (p=0.11). In der Kontrollgruppe bestanden nach konventioneller Aufklärung, trotz guter subjektiver Informiertheit, bei fast 90% der Patienten weiterhin offene Fragen bezüglich der Untersuchung, während sich diese Diskrepanz in der Simulationsgruppe nicht ergab (p<0.00001). Ferner standen die Patienten der Simulationsgruppe der anstehenden Untersuchung ruhiger gegenüber (0=0.049), während die Patienten der Kontrollgruppe angaben, tendenziell unruhig in die Untersuchung zu gehen (p=0.002). Es boten sich keinerlei Hinweise darauf, dass die Demonstration möglicher Komplikationen zu einer verstärkten Untersuchungsangst geführt hätte. Die Implementierung des Simulators hat sich insgesamt positiv auf das prozedurale Interesse des Patienten ausgewirkt.
Schlussfolgerung: Insgesamt hatte die Implementierung des VR Simulators in die Patientenaufklärung überwiegend positive Effekte und keinerlei negativen Effekte. Im direkten Vergleich zur konventionellen Aufklärung zeigten sich bezüglich der Informiertheit zunächst keine signifikanten Unterschiede zur konventionellen Aufklärungsmethode. Die erhobenen Daten deuten jedoch auf eine Überlegenheit der simulationsgestützten Aufklärung in Bezug auf Verständnis und Untersuchungsangst hin. Festzuhalten ist allerdings der hohe zusätzliche zeitliche Aufwand, mit dem eine simulationsgestützte Aufklärung verbunden ist. Die generelle Implementierung eines VR Simulators allein zum Zwecke der Patientenaufklärung wird daher nur bedingt empfohlen. Kliniken, die bereits über einen VR Simulator verfügen, sollten allerdings erwägen, diesen nicht nur für Ausbildungszwecke zu verwenden, sondern auch zum Zwecke der Patientenaufklärung.
Die vorliegende Arbeit Zeitaufgelöste NMR-spektroskopische Untersuchung konformationeller Dynamiken in DNA G-Quadruplexen befasst sich mit der detaillierten biophysikalischen Untersuchung wichtiger strukturdynamischer Eigenschaften von nicht-kanonischen Nukleinsäure Sekundärstrukturelementen.
Im Genom aller eukaryotischer Lebewesen, insbesondere dem menschlichen Genom finden sich DNA-Sequenzabschnitte, die überdurchschnittlich Guanosin (G)-reich sind. Diese poly-G Abschnitte sind nicht zufällig im Genom verteilt, sondern häufen sich vermehrt in Genabschnitten, die besonders wichtig für die Regulation der Genexpression sind. G-reiche DNA-Sequenzen können unter geeigneten Umständen alternative Sekundärstrukturen ausbilden, die von der doppelsträngigen, kanonischen Watson-Crick Konformation abweichen. In Anwesenheit monovalenter Kationen können sich G-Nukleotide in einer Tetrade über Hoogsteen Interaktionen anlagern. Diese Tetraden können sich stapeln und dadurch sogenannte G-Quadruplexe (G4) ausbilden. Das menschliche cMYC Gen wird typischerweise als proto-Onkogen bezeichnet. Es kodiert für einen unspezifischen Transkriptionsfaktor, der bei einer Vielzahl von systematischen und soliden Tumorerkrankungen stark überexprimiert wird. Die zelluläre Konzentration des Genprodukts kann zu 90% über ein G4 cis-Element in der Promotorregion reguliert werden. Der cMYC G4 hat die Möglichkeit verschiedene Konformationen einzunehmen. Im Falle des cMYC G4 kann man zusätzliche, nicht-konventionelle Formen der konformationellen Isomerie finden. Zum einen gibt es die Möglichkeit, dass bei einem G4, der aus drei Tetraden und vier intramolekularen Strangabschnitten (dreistöckiger G4) besteht, einzelne Strangabschnitte mehr als drei konsekutive G-Nukleotide besitzen. Dadurch können sich Faltungs-Isomere bilden, die sich durch Verschieben des Strangs relativ zum verbleibenden dreistöckigen Tetradengerüst ergeben. Man spricht von G-Register Isomeren. Eine zweite Möglichkeit der Strukturisomerie ergibt sich, wenn in einer Nukleotidsequenz mehr als vier G-reiche Strangabschnitte aufeinander folgen. Jeweils vier dieser Strangabschnitte können in unterschiedlicher Weise kombiniert werden, um ein G4 Isomer auszubilden. In jedem dieser so zustande gekommenen G4 verbleibt ein (oder mehrere) G-reicher Strangabschnitt, der im konkreten Isomer nicht zur Faltung verwendet wird. Diese zusätzlichen G-Stränge werden daher auch Ersatzräder (engl. spare-tires) genannt; man erhält spare-tire Isomere.
Obwohl diese Formen des Polymorphismus, deren biologischer Kontext und die biophysikalischen Konsequenzen in Arbeiten von C. Burrows (2015) und A. Mittermaier (2016) erstmals umfassend beschrieben wurden, gab es bis zum Ausgangspunkt dieser Arbeit keine Kenntnisse über deren strukturelle Dynamik, den Faltungswegen und den zugrundeliegenden molekularen Mechanismen. Zeitaufgelöste Kernspinresonanz (engl. nuclear magnetic resonance, NMR) Spektroskopie ist eine bestens geeignete Methode, um die Dynamik von Biomakromolekülen mit atomarer Auflösung zu studieren. Um solche Experimente durchführen zu können, braucht es geeignete Herangehensweisen für die Präparation eines Nicht-Gleichgewichtszustands. In dieser Arbeit wird eine neu erarbeitete Strategie vorgestellt, die es erlaubt, Einblick in die Faltungs- und Umfaltungskinetiken eines dynamischen Konformations-Ensembles nicht-konventioneller Strukturisomere der cMYC G4 DNA-Sequenz zu erhalten.
Hierzu wurden photolabile Schutzgruppen (engl. Photocages) positionsspezifisch an bestimmten G-Nukleobasen (O6-(R)-NPE) angebracht. Die Schutzgruppen blockieren die Basenpaar-Interaktionen des Nukleotids, wodurch dieses sich nicht mehr an einer Tetradenbildung beteiligen kann. Die Photocages wurden jeweils an den Nukleotiden eingeführt, die nur in jeweils einem der G-Register Isomere an der Tetradenbildung beteiligt sind. Durch diese gezielte Destabilisierung konnten die Isomere getrennt und im gefalteten Zustand isoliert werden. Die so erhaltenen Konformationen wurden umfassend spektroskopisch charakterisiert. Der Ansatz, das konformationelle Gleichgewicht durch Photocages transient zu stören, wurde daraufhin weiterentwickelt. Mehrere Photocages wurden an Nukleobasen in zentraler Position einzelner G-Strangabschnitte angebracht. Dadurch konnte eine ausreichende Destabilisierung erreicht werden, die die Faltung jedweder G4 Strukturen unterbindet. Somit wurde ein ungefalteter Zustand erzeugt, der unter ansonsten frei wählbaren, physiologischen Bedingungen besteht. Durch in situ Photolyse der Schutzgruppen konnte so die Licht-induzierte G4 Faltung unter konstanten Puffer- und Temperaturbedingungen untersucht werden. Dieser Ansatz wurde auf die Untersuchung der Faltungswege, die zu verschiedenen spare-tire Isomeren führen, fokussiert.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass es insgesamt erstmalig gelungen ist, die Kinetiken der wesentlichen Faltungs- und Umfaltungswege entlang der konformationellen Energielandschaft des cMYC G4 Elements zu untersuchen. Das komplexe, dynamische Zusammenspiel aller relevanten, nicht-konventionellen isomeren G4 Strukturen konnte entworren und umfassend experimentell beschrieben werden. Der dafür weiterentwickelte Ansatz über konformationelle Selektion mit Hilfe photolabiler Schutzgruppen hat dabei experimentelle Einblicke erlaubt, die bislang nicht zugänglich waren. Die Strukturen und Faltungszustämde, die mit den chemisch modifizierten Oligonukleotiden erhalten und isoliert wurden, sind umfassend spektroskopisch untersucht worden. Die Anwendung verschiedener spektroskopischer Ansätze und deren Kombination mit weiteren biophysikalischen Methoden hat eine Methoden-unabhängige Validierung der erhaltenen kinetischen und thermodynamischen Daten ermöglicht.
Background: During ECMO therapy ischemia of the limbs or internal organs are potential lethal complications. This study analyzed incidence and type of ischemic complications during ECMO therapy, divided in limb, mesenteric, cardiac and neurological ischemia.
Methods: In this single-center retrospective observational study data from 348 patients treated with veno-venous, veno-arterial or veno-venous-arterial ECMO at the Asklepios Klinik Langen between April 1st 2011 and March 31st 2020 was screened. 321 patients with diagnosis of acute respiratory distress syndrome, cardiogenic or septic shock were included.
Primary outcome variable was type of ischemic complication. Further variables were serum lactate levels 24h before and immediately after diagnosis of the ischemic complication, duration of ICU and hospital stay, ECMO therapy and duration of invasive ventilation and arterial blood gas analysis on day of admission to the ICU. Age, sex, ECMO mode, diagnosis, SAPS II, SOFA score, hospital mortality, the use of renal replacement therapy and tracheotomy, the occurrence of infections during the ICU stay and the need of CPR before ECMO implantation were recorded as well.
Results: 62/321 patients (19.3%) were diagnosed with an ischemic complication. Most common areas were limbs (n=32) and mesenteric ischemia (n=21). Patients who were diagnosed with a septic shock had the highest rate of ischemic complications (36.2%). In VV mode there was a difference in survival between patients with and without ischemic complication (p=0.025). Using multivariate logistic regression, age ≥50 years (p=0.029; OR=2.793; CI 1.109 – 7.033), use of hemodialysis (p=0.003; OR=3.283; CI=1.513 – 7.124) and initial diagnosis of a septic shock (p=0.049; OR=2.144; CI=1.003 – 4.583) could be identified as predictors for ischemic complications.
Conclusions: Ischemic complications are frequent during ECMO therapy. An age of at least 50 years, the use of hemodialysis and diagnosis of a septic shock were predictors of ischemic complications. No correlation between ECMO mode and ischemic complications was found. An influence of ischemic complications on survival could be found only in patients treated with VV mode.
Das Lebenswerk von Prof. Dr. Eduard Güntz mit Schwerpunkt auf seiner Frankfurter Zeit (1951-1969)
(2021)
Der Arzt Eduard Güntz (1903-1973) begann nach dem Studium der Medizin in Marburg, Würzburg und München seine medizinische Laufbahn 1929 am Pathologisch-anatomischen Institut in Dresden unter dem Pathologen Georg Schmorl. Ab 1932 arbeitet er unter Prof. Georg Hohmann an der Orthopädischen Universitätsklinik in Frankfurt, wo er sich 1937 über das Thema „Schmerzen und Leistungsstörungen bei Erkrankungen der Wirbelsäule“ habilitierte. Es folgte seine Berufung an die Universität Kiel, wo er ab 1938 als Leiter der orthopädischen Abteilung der Poliklinik der Universität tätig war. 1939 infizierte er sich im Rahmen seiner beruflichen Tätigkeit mit Poliomyelitis. Davon erholte er sich nie vollständig, nahm aber bereits Ende 1940 seinen Dienst am Patienten wieder auf.
Während der NS-Zeit war Güntz Mitglied der NSDAP und der SA, was 1946 zur Entlassung aus seinem Dienstverhältnis in Kiel und schließlich sogar zum Entzug der Berufserlaubnis führte. Der Entnazifizierungsausschuss stellte letztendlich nach Sichtung vieler Gutachten und Bescheinigungen früherer Mitarbeiter und Patienten die Unbedenklichkeitsbescheinigung aus, sodass Güntz im November 1946 als Facharzt und Professor in Kiel wiedereingestellt wurde.
1951 erfolgte seine Berufung auf den Lehrstuhl für Orthopädie in Frankfurt am Main, den er bis 1969 innehatte. In sein Ordinariat und Tätigkeit als ärztlicher Direktor der Orthopädischen Universitätsklinik Frankfurt am Main (Friedrichsheim) fällt der größte Teil des Wiederaufbaus der durch eine Brandbombe zerstörten Einrichtung nach dem 2. Weltkrieg, mit Gründung eines modernen Rehabilitationszentrums, Orthopädischer Werkstatt und staatlich anerkannter Lehranstalt für Krankengymnastik und Massage. Güntz´ Arbeitsschwerpunkt lag in der konservativen Orthopädie. Er
verfasste 88 wissenschaftliche Arbeiten.
Das Güntz-Zeichen, die von ihm beschriebene abnorme Geradhaltung des Wirbelsäulenabschnitts über einer Bandscheibenschädigung als radiologisches Frühsymptom, wurde nach ihm benannt.
Eduard Güntz verstarb 1973 an den Folgen seiner PoliomyelitisErkrankung.
Die Fähigkeit der spezifischen und kontextabhängigen zellulären Adaption auf intrinsische und/oder extrinsische Signale ist das Fundament zellulärer Homöostase. Verschiedene Signale werden von Membranrezeptoren oder intrazellulären Rezeptoren erkannt und ermöglichen die molekulare Anpassung zellulärer Prozesse. Komplexe, ineinandergreifende Proteinnetzwerke sind dabei elementar in der Regulation der Zelle. Proteine und deren Funktionen werden dabei nach Bedarf reguliert und unterliegen einem ständigen proteolytischen Umsatz.
Die stimulusabhängige Gentranskription und/oder Proteintranslation nimmt hier eine zentrale Stellung ein, da die zugrundeliegende Maschinerie die Komposition und Funktion der Proteinnetzwerke entsprechend anpassen kann. Zusätzlich zur Regulation der Proteinabundanz werden Proteine posttranslational modifiziert, um deren Eigenschaften rasch zu ändern. Zu posttranslationalen Modifikationen zählen die Ubiquitinierung und/oder Phosphorylierung, welche die Proteinfunktionen hochdynamisch regulieren. Deregulierte Proteinnetzwerke werden oft mit Neurodegeneration und Autoimmun- oder Krebserkrankungen assoziiert. Auch Infektionen mit humanpathogenen Bakterien greifen stark in den Regulierungsprozess von Proteinnetzwerken und deren Funktionen ein. Die zelluläre Homöostase wird dadurch herausgefordert.
Bakterien der Gattung Salmonella sind zoonotische, gramnegative, fakultativ intrazelluläre Pathogene, welche weltweit millionenfach Salmonellen-erkrankungen hervorrufen. Von besonderer Bedeutung ist dabei Salmonella enterica serovar Typhimurium (hiernach Salmonella), welches im Menschen, meist durch mangelnde Hygienemaßnahmen, Gastroenteritis auslöst.
Immunität in Epithelzellen wird über das angeborene Immunsystem vermittelt und dient der Pathogenerkennung und -bekämpfung. Die Toll-like Rezeptoren (TLR) gehören zu den Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors), welche spezifische mikrobielle Strukturen detektieren und eine kontextabhängige zelluläre Antwort generieren. Danger-Rezeptoren erkennen hingegen nicht direkt das Pathogen, sondern zelluläre Perturbationen, welche durch Zellschäden oder bakterielle Invasionen verursacht werden. Die intrinsische Fähigkeit der Wirtszelle, sich gegen Infektionen/Gefahren zu wehren wird dabei als zellautonome Immunität bezeichnet. Dabei nehmen induzierte proinflammatorische Signalwege und zelluläre Stressantworten eine wichtige Stellung ein. Die zelluläre Stressantwort aktiviert unter anderem die selektive Autophagie. Diese kann spezifisch aberrante Organelle, Proteine und invasive Pathogene abbauen. Ein weiterer Stresssignalweg ist die integrated stress response (ISR), welche eine selektive Proteintranslation erlaubt und damit die Auflösung des proteintoxischen Stresses ermöglicht.
Zur Penetration von Epithelzellen benötigt Salmonella ein komplexes System an Virulenzfaktoren, welches die bakterielle Internalisierung und Proliferation in der Wirtszelle ermöglicht. Salmonella nutzt dazu ein Typ-III-Sekretionssystem. Das System sekretiert bakterielle Virulenzfaktoren in die Zelle, sodass eine hochspezifische Modulierung des Wirtes erzwungen wird.
Die Virulenzfaktoren SopE und SopE2 spielen dabei eine Schlüsselrolle, da sie die Pathogenität von Salmonella maßgeblich vermitteln. Durch molekulare Mimikry von Wirts GTP (Guanosintriphosphat) -Austauschfaktoren aktivieren SopE und SopE2 die Rho GTPasen CDC42 und Rac1. GTP-geladenes CDC42 und Rac1 wiederum aktivieren das Aktinzytoskelett und stimulieren die Polymerisierung von Aktinfilamenten über den Arp2/3-Komplex an der Invasionsstelle. Das Pathogen wird dadurch in ein membranumhülltes Vesikel, die sogenannte Salmonella-containing Vakuole (SCV), aufgenommen. Die SCV stellt eine protektive, replikative, intrazelluläre Nische des Pathogens dar und wird permanent durch verschiedene Virulenzfaktoren moduliert.
Im Allgemeinen führt die Aktivierung von Mustererkennungsrezeptoren und Danger-Rezeptoren also zu einer zellulären Stressantwort und Entzündungsreaktion, wodurch es zur Bekämpfung der Infektion kommt. Inflammatorische Signalwege werden meist über den zentralen Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells) vermittelt. NF-κB bewirkt die Induktion von proinflammatorischen Effektoren und Stressgenen. Zellautonome Immunität wird zusätzlich durch antibakterielle Autophagie ermöglicht, wobei Salmonella selektiv über das lysosomale System abgebaut werden. Das bakterielle Typ-III-Sekretionssystem verursacht an einigen wenigen SCVs Membranschäden, sodass Salmonella das Wirtszytosol penetrieren. Zytosolische Bakterien werden dabei spezifisch ubiquitiniert. Dies erlaubt die Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zellautonome Immunität von Epithelzellen während einer akuten Salmonella Infektion durch quantitative Proteomik untersucht...
Wir betrachten Algorithmen für strategische Kommunikation mit Commitment Power zwischen zwei rationalen Parteien mit eigenen Interessen. Wenn eine Partei Commitment Power hat, so legt sie sich auf eine Handlungsstrategie fest und veröffentlicht diese und kann nicht mehr davon abweichen.
Beide Parteien haben Grundinformation über den Zustand der Welt. Die erste Partei (S) hat die Möglichkeit, diesen direkt zu beobachten. Die zweite Partei (R) trifft jedoch eine Entscheidung durch die Wahl einer von n Aktionen mit für sie unbekanntem Typ. Dieser Typ bestimmt die möglicherweise verschiedenen, nicht-negativen Nutzwerte für S und R. Durch das Senden von Signalen versucht S, die Wahl von R zu beeinflussen. Wir betrachten zwei Grundszenarien: Bayesian Persuasion und Delegated Search.
In Bayesian Persuasion besitzt S Commitment Power. Hier legt sich S sich auf ein Signalschema φ fest und teilt dieses R mit. Es beschreibt, welches Signal S in welcher Situation sendet. Erst danach erfährt S den wahren Zustand der Welt. Nach Erhalt der durch φ bestimmten Signale wählt R eine der Aktionen. Das Wissen um φ erlaubt R die Annahmen über den Zustand der Welt in Abhängigkeit von den empfangenen Signalen zu aktualisieren. Dies muss S für das Design von φ berücksichtigen, denn R wird Empfehlungen nicht folgen, die S auf Kosten von R übervorteilen. Wir betrachten das Problem aus der Sicht von S und beschreiben Signalschemata, die S einen möglichst großen Nutzen garantieren.
Zuerst betrachten wir den Offline-Fall. Hier erfährt S den kompletten Zustand der Welt und schickt daraufhin ein Signal an R. Wir betrachten ein Szenario mit einer beschränkten Anzahl k ≤ n Signale. Mit nur k Signalen kann S höchstens k verschiedene Aktionen empfehlen. Für verschiedene symmetrische Instanzen beschreiben wir einen Polynomialzeitalgorithmus für die Berechnung eines optimalen Signalschemas mit k Signalen.
Weiterhin betrachten wir eine Teilmenge von Instanzen, in denen die Typen aus bekannten, unabhängigen Verteilungen gezogen werden. Wir beschreiben Polynomialzeitalgorithmen, die ein Signalschema mit k Signalen berechnen, das einen konstanten Approximationsfaktor im Verhältnis zum optimalen Signalschema mit k Signalen garantiert.
Im Online-Fall werden die Aktionstypen einzeln in Runden aufgedeckt. Nach Betrachtung der aktuellen Aktion sendet S ein Signal und R muss sofort durch Wahl oder Ablehnung der Aktion darauf reagieren. Der Prozess endet mit der Wahl einer Aktion. Andernfalls wird der nächste Aktionstyp aufgedeckt und vorherige Aktionen können nicht mehr gewählt werden. Als Richtwert für unsere Online-Signalschemata verwenden wir das beste Offline-Signalschema.
Zuerst betrachten wir ein Szenario mit unabhängigen Verteilungen. Wir zeigen, wie ein optimales Signalschema in Polynomialzeit bestimmt werden kann. Jedoch gibt es Beispiele, bei denen S – anders als im Offline-Fall – im Online-Fall keinen positiven Wert erzielen kann. Wir betrachten daraufhin eine Teilmenge der Instanzen, für die ein einfaches Signalschema einen konstanten Approximationsfaktor garantiert und zeigen dessen Optimalität.
Zusätzlich betrachten wir 16 verschiedene Szenarien mit unterschiedlichem Level an Information für S und R und unterschiedlichen Zielfunktionen für S und R unter der Annahme, dass die Aktionstypen a priori unbekannt sind, aber in uniform zufälliger Reihenfolge aufgedeckt werden. Für 14 Fälle beschreiben wir Signalschemata mit konstantem Approximationsfaktor. Solche Schemata existieren für die verbleibenden beiden Fälle nicht. Zusätzlich zeigen wir für die meistern Fälle, dass die beschriebenen Approximationsgarantien optimal sind.
Im zweiten Teil betrachten wir eine Online-Variante von Delegated Search. Hier besitzt nun R Commitment Power. Die Aktionstypen werden aus bekannten, unabhängigen Verteilungen gezogen. Bevor S die realisierten Typen beobachtet, legt R sich auf ein Akzeptanzschema φ fest. Für jeden Typen gibt φ an, mit welcher Wahrscheinlichkeit R diesen akzeptiert. Folglich versucht S, eine Aktion mit einem guten Typen für sich selbst zu finden, der von R akzeptiert wird. Da der Prozess online abläuft, muss S für jede Aktion einzeln entscheiden, diese vorzuschlagen oder zu verwerfen. Nur empfohlene Aktionen können von R ausgewählt werden.
Für den Offline-Fall sind für identisch verteilte Aktionstypen konstante Approximationsfaktoren im Vergleich zu einer Aktion mit optimalem Wert für R bekannt. Wir zeigen, dass R im Online-Fall im Allgemeinen nur eine Θ(1/n)-Approximation erzielen kann. Der Richtwert ist der erwartete Wert für eine eindimensionale Online-Suche von R.
Da für die Schranke eine exponentielle Diskrepanz in den Werten der Typen für S benötigt wird, betrachten wir parametrisierte Instanzen. Die Parameter beschränken die Werte für S bzw. das Verhältnis der Werte für R und S. Wir zeigen (beinahe) optimale logarithmische Approximationsfaktoren im Bezug auf diese Parameter, die von effizient berechenbaren Schemata garantiert werden.
Studying large discrete systems is of central interest in, non-exclusively, discrete mathematics, computer sciences and statistical physics. The study of phase transitions, e.g. points in the evolution of a large random system in which the behaviour of the system changes drastically, became of interest in the classical field of random graphs, the theory of spin glasses as well as in the analysis of algorithms [78,82, 121].
It turns out that ideas from the statistical physics’ point of view on spin glass systems can be used to study inherently combinatorial problems in discrete mathematics and theoretical computer sciences(for instance, satisfiability) or to analyse phase transitions occurring in inference problems (like the group testing problem) [68, 135, 168]. A mathematical flaw of this approach is that the physical methods only render mathematical conjectures as they are not known to be rigorous.
In this thesis, we will discuss the results of six contributions. For instance, we will explore how the
theory of diluted mean-field models for spin glasses helps studying random constraint satisfaction problems through the example of the random 2−SAT problem. We will derive a formula for the number of satisfying assignments that a random 2−SAT formula typically possesses [2].
Furthermore, we will discuss how ideas from spin glass models (more precisely, from their planted versions) can be used to facilitate inference in the group testing problem. We will answer all major open questions with respect to non-adaptive group testing if the number of infected individuals scales sublinearly in the population size and draw a complete picture of phase transitions with respect to the
complexity and solubility of this inference problem [41, 46].
Subsequently, we study the group testing problem under sparsity constrains and obtain a (not fully understood) phase diagram in which only small regions stay unexplored [88].
In all those cases, we will discover that important results can be achieved if one combines the rich theory of the statistical physics’ approach towards spin glasses and inherent combinatorial properties of the underlying random graph.
Furthermore, based on partial results of Coja-Oghlan, Perkins and Skubch [42] and Coja-Oghlan et al. [49], we introduce a consistent limit theory for discrete probability measures akin to the graph limit theory [31, 32, 128] in [47]. This limit theory involves the extensive study of a special variant of the cut-distance and we obtain a continuous version of a very simple algorithm, the pinning operation, which allows to decompose the phase space of an underlying system into parts such that a probability
measure, restricted to this decomposition, is close to a product measure under the cut-distance. We will see that this pinning lemma can be used to rigorise predictions, at least in some special cases, based on the physical idea of a Bethe state decomposition when applied to the Boltzmann distribution.
Finally, we study sufficient conditions for the existence of perfect matchings, Hamilton cycles and bounded degree trees in randomly perturbed graph models if the underlying deterministic graph is sparse [93].
This study explores literary representations of gender and sexuality in contemporary Malaysian Popular Fiction in English (MPFE) written by Malay Muslim authors that are published in between the years 2010 to 2020. It questions why gender and sexuality are considered sensitive topics and the public discussion of these topics is deemed taboo by some Malay Muslim traditionalists and contemporary scholars of Malay literature. Previous studies suggests that Islamic rules and regulations influence the Malaysian Malays worldview. Its sacred book, the Quran, has established clear-cut prohibitions against any sexual indulgence among its believers. Muslim writers must learn to restrict themselves from indulging in sexual writings in order to prevent them from intentionally or unintentionally arousing their readers’ sexual fantasies that may lead both parties to sinning. However, at the end of the twentieth century, many factors such as the impact of modernisation through scientific and industrial revolution on Malaysian society, the influence of Western Humanities theories among local intellects, and the introduction of Internet culture have contributed tremendously to the dramatic social changes in Malaysia. These changes are reflected heavily in its literary culture. In recent years, the Malay people’s awareness of their body and individuality is heightened. There is a surge of curiosity among contemporary Malay Muslims about their gender and sexuality and they would want a discussion. Following this development, the first objective of this study is to provide the latest discussion on gender and sexuality in MPFE by Malay Muslim authors. The second objective is to provide observations on how MPFE authors employ their literary strategies to approach aspects of gender and sexuality in their literary works. It pays attention to how writers express their acceptance, negotiations, and/or rejections towards the dominant “normative” or “common” values in the Malay society with regards to their body and sexuality. Using textual analysis to examine one novel and six short stories from the MPFE genre, this paper cross-examines Malay literary theories on sexual and erotic literature available in Pengkaedahan Melayu (Malay Methodology), Persuratan Baru (Genuine Literature), as well as Western theoretical approaches in Postcolonialism, Postmodernism and Feminism on gendering system and sexuality, in its aim to explain the growing interest in the topics in spite of the red-tape around sexual taboos in Malaysian literature.
Die vorliegende Dissertation behandelt das Thema der Wechselstromleitfähigkeit nano-granularer Metalle, welche mit Hilfe der fokussierten elektronenstrahlinduzierten Direktabscheidung (FEBID) hergestellt wurden, sowie der dielektrischen Relaxation in metall-organischen Gerüstverbindungen (MOFs). Sie war eingebettet in das interdisziplinäre Projekt „Dielectric and Ferroelectric Surface-Mounted Metal-Organic Frameworks (SURMOFs) as Sensor Devices“ im Rahmen des DPG-Schwerpunktsprogramms „Coordination Networks: Building Blocks for Functional Systems“ (SPP 1928, COORNETs). Dabei verfolgt sie ein Sensorkonzept zur selektiven Detektion von Analytgasen. Der zentrale Erfolg der Arbeit besteht dabei in neuen Erkenntnissen über die Wechselstromleitfähigkeit nano-granularer Pt(C)-FEBID-Deponate. Die hierbei gewonnen Erkenntnisse können in Zukunft einen weiteren Baustein in der theoretischen Beschreibung dieses grundlegend interessanten und für sensorische Anwendungen wichtigen Teilgebiets der Festkörperphysik darstellen.
Die Autophagie ist ein in Eukaryonten evolutionär konservierter Prozess, bei dem es zu einem lysosomalen Abbau von cytosolischen Bestandteilen kommt. Die dabei entstehenden biochemischen Bausteine stehen anschließend erneut zum Aufbau benötigter Strukturen zur Verfügung. Verschiedene Stimuli, wie beispielsweise Nährstoffmangel, können die Aktivität der Autophagie erhöhen und ermöglicht Zellen dadurch die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase, selbst unter Stressbedingungen. Im Verlauf der Autophagie bildet sich eine tassenförmige Doppelmembran-Struktur, das sogenannte Phagophor. Dieses wächst, um das abzubauende Material zu umschließen und wird dabei von sogenannten Atg-Proteinen (autophagy-related genes) prozessiert. Nach der Schließung spricht man vom Autophagosom, welches letztlich mit einem Lysosom verschmilzt und das Autophagolysosom bildet, welches wiederum die eingeschlossenen Bestandteile zerlegt und die recycelten Bausteine freigibt. Die einzelnen Schritte während der Autophagie sind hochgradig durch die Atg-Proteine reguliert. Eines dieser Atg-Proteine, das Atg8, ist an einigen entscheidenden Schritten wie dem Phagophor-Wachstum, der Autophagosom-Reifung sowie der Schließung beteiligt. Während es in Hefen nur ein einziges Atg8-Protein gibt, so zeigt sich in höheren Eukaryonten meist eine gewisse Diversität. So codiert beispielsweise das humane Genom mindestens sechs Atg8-Homologe. Neben den drei Proteinen der LC3-Familie (A, B, C) zählen auch GABARAP, GABARAPL1 und GABARAPL2 dazu. Die Gründe für diese Diversität sind noch nicht vollständig aufgeklärt, weshalb es wichtig ist, möglichst selektive Modulatoren zu entwickeln, um so die Aufgaben der einzelnen Homologen entschlüsseln zu können. Eine weitere wichtige Aufgabe übernimmt Atg8 beim Binden des abzubauenden Materials über sogenannte Autophagie-Rezeptoren, wie beispielsweise p62. Der Bindevorgang beruht dabei auf der Interaktion von p62 mit ubiquitinierten Zellbestandteilen auf der einen Seite und der Interaktion zwischen p62 und LC3 auf der anderen Seite. Letztgenannte beruht auf dem Binden des LIR-Motivs (LC3-interagierende Region) von p62 an die LDS (LIR-docking site) des LC3-Proteins. Das LIR-Motiv zeichnet sich durch Aminosäure-Sequenz D-D-D-W/F/Y-X1-X2-L/I/V aus. Währende die aromatische Seitenkette (W/F/Y) die hydrophobe Tasche 1 (HP1) der LDS besetzt, ragt die aliphatische Seitenkette (L/I/V) in die HP2 hinein. Damit sollte es möglich sein, die LIR-LC3-Interaktion, durch das Besetzen der LDS zu stören bzw. zu inhibieren. Solche Inhibitoren könnten zum einen der weiteren Aufklärung der Prozesse, an denen die Autophagie beteiligt ist, dienen, zum anderen jedoch auch die Untersuchung fehlerhafter Autophagie ermöglichen. Ausgangspunkt für diese Arbeit stellt die Verbindung Novobiocin dar, die im Rahmen eines Mitteldurchsatz-Screenings als potenzieller Inhibitor der LIR-LC3-Interaktion identifiziert und mittels ITC, TSA und 1H-15N-HSQC verifiziert werden konnte. Die Struktur des Novobiocins setzt sich aus dem 3-Amino-4-hydroxy-8-methylcoumarin-Kern, der über eine Amidbindung an 3-iso-Prenyl-4-Hydroxybenzoesäure gebunden ist, sowie einer O-glykosidischen Bindung in Position C7 des Coumarins mit L-Noviose zusammen. Da es sich bei Novobiocin (XL6) um ein verhältnismäßig komplexes Molekül handelt, wurde der Einfluss einzelner funktionellen Gruppen des Moleküls auf die Bindungsaffinität hin untersucht. Hierfür wurden Synthesestrategien sowohl für die Coumarin-Gerüste als auch verschiedene Benzoesäuren entwickelt. Die erhaltenen Verbindungen wurden mittels ITC und TSA untersucht. Dabei wurde die Verbindung MH507 als geeigneter Ausgangspunkt für die Untersuchung der Struktur-Aktivitätsbeziehungen (SAR) bezüglich der Benzamid-Seite identifiziert. Im Rahmen einer ersten SAR-Untersuchung wurden neben verschiedenen 3-Alkyl-benzoesäuren, auch verschiedene divalente Isostere (-O-, -S-, -NHSO2-) der benzylischen Methylengruppe synthetisiert. Diese, sowie kommerzielle Aminosäuren, wurden mit 3-Amino-4,7-dihydroxycoumarin zu den entsprechenden Endverbindungen gekuppelt. Ergänzend dazu wurden auch eine Verbindung mit umgekehrter Konstitution der Amidbindung dargestellt, um den Einfluss der Reihenfolge zu verifizieren. In einer weiteren SAR-Studie wurden Derivate synthetisiert, die zusätzlich eine Funktionalisierung am C7 des Coumarin-Gerüstes über Amidkupplung, Sulfonamid-Bildung bzw. Suzuki-Reaktion erlauben und somit eine Interaktion mit der HP1 ermöglichen könnten. Dafür wurde eine weitere Synthesestrategie zur Darstellung von 7-Nitro- bzw. 7-Brom-3-amino-4-hydroxycoumarinen ausgearbeitet und eine Reihe von Endverbindungen dargestellt. Neben den Coumarin-Derivaten wurden auch vier Peptidomimetika synthetisierten. Hierfür wurde, basierend auf den Interaktionen zwischen dem LIR-Motiv und der LC3 Proteinoberfläche, ein Pharmakophor-Modell erstellt. Neben einem Pentapeptid wurden auch drei Verbindungen dargestellt, die ein 5-Amino 2-methoxybenzohydrazid-Gerüst besitzen. Um die synthetisierten Verbindungen auf ihre inhibitorische Aktivität auf LC3A bzw. LC3B gegenüber dem LIR-Motiv von p62 hin untersuchen zu können, wurde ein HTRF-basierter Verdrängungsassay entwickelt. Dabei diente ein mit dem LIR-Motiv modifiziertes sGFP als FRET-Akzeptor, während das jeweilige Terbium-Kryptat-gelabelte SNAP-LC3-Fusionsprotein als FRET-Donor fungierte. Neben den Titrationsexperimenten zur Bestimmung der IC50-Werte wurden auch die jeweiligen Dissoziationskonstanten (Kd) von LC3A und LC3B gegenüber dem LIR-sGFP-Fusionsprotein bestimmt, um die IC50-Werte in inhibitorische Konstanten (Ki) zu überführen, da diese untereinander besser vergleichbar sind.
Die Verbindung MH209 zeigte die höchste Aktivität auf LC3A bzw. LC3B und besitzt aufgrund der Noviose-Einheit eine gute Wasserlöslichkeit, weshalb sie für die weiteren Untersuchungen ausgewählt wurde. Im Zuge von Kristallisationsexperimenten gelang die Isolierung und Vermessung eines Co-Kristalls von LC3A mit Verbindung MH209. Durch die Kristallstruktur wurden wichtige Einblicke in die intermolekularen Wechselwirkungen der 4-Hydroxycoumarine mit der LC3A- bzw. LC3B-Proteinoberfläche gewonnen und die Bindungsmode aufgeklärt. Diese Erkenntnisse passen gut zu den Ergebnissen aus den durchgeführten TSA-, ITC- und HTRF-Assays, wie beispielsweise der korrekten Konstitution der Amidbindung am C3 des Coumarin-Gerüstes. Mittels ITC wurde die Verbindung MH209 auf ihre Bindungsaffinität gegenüber den anderen humanen Homologen der Atg8-Proteinfamilie hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass MH209 abgesehen von LC3A und LC3B keinerlei Aktivität auf den humanen Atg8-Homologen besitzt. Diese Selektivität ist nützlich, um die biologische Bedeutung der Diversität von Atg8-Homologen in höheren Eukaryonten zu untersuchen und Prozesse, in die diese involviert sind, aufzuklären.
Laut C.S. Peirce ist der abduktive Schluss das einzige logische Verfahren, das in der Lage ist, neue Erkenntnisse einzuführen. Dieser funktioniert in etwa so, dass auf Basis eines bereits bestehenden, jedoch unbewusst verwendeten, Regel- bzw. Vorwissens etwas Neues, bislang Unbekanntes, generiert wird, indem eine Ähnlichkeitsrelation bzw. eine Differenz zwischen Alt und Neu erzeugt wird. Damit scheint bei der Abduktion das einsam handelnde und denkende Subjekt die zentrale Instanz der Entstehung des Neuen zu sein.
Aus soziologischer Sicht von Interesse ist dabei, welche, hier zu unterstellende, tragende Rolle der soziale Austausch bei dieser Erkenntnisgenese überhaupt spielt, wenn, dem abduktiven Schluss zufolge, das monologisch handelnde Individuen über quasi „eingelagerte“ Erkenntnis-Instinkte, wie Peirce sagt, verfügt. Die Rolle des anderen im sozialen Austausch würde dadurch jedoch hinfällig oder zumindest randständig.
Der logische Ausweg, um den anderen als konstitutiver Bestandteil der Erkenntnisgenese zu integrieren, besteht in der These, dass interagierende Individuen sich auf eine Art und Weise wechselseitig identisch sein müssen. Ähnlichkeitsbezüge herstellen zu können würde dadurch primär zu einem Produkt der Interindividualität und nicht zu jenem einzelner Individuen.
Um diese These zu prüfen, werden in einem ersten Schritt Peirce’ Theorien zur Abduktion untersucht. Im Weiteren sollen aber auch soziologische Erkenntnistheorien und interdisziplinäre Ansätze, wie die der (Social) Neuroscience, auf die Möglichkeit einer interindividuellen Verquickung im Sinne des wechselseitig Identisch-Seins untersucht.
In einem letzten Schritt wird die berechtigte Frage gestellt, wie denn überhaupt Erkenntnis erzeugt werden kann, wenn Individuen sich differenzlos identisch gegenüberstehen. Dabei wird die These vorgeschlagen, dass Differenz dadurch eingespielt wird, indem Subjekte sich nie dieselbe Raumzeitstelle teilen. Die am Individuum gebundene Fähigkeit, Unterschiede bzw. Ähnlichkeitsbezüge erkennen zu können (Abduktion), wird somit erst durch Praxis selbst möglich.
Abschließend sollen durch forschungsübergreifende Überlegungen Konsequenzen aus diesen Thesen gezogen werden.
Rule in International Relations is increasingly observed as an empirical phenomenon and academically conceptualized. This book describes rule in International Relations using four practice-theoretical dimensions. A method is developed to analyze rule from a practice-theoretical point of view - the Practice Analysis of Rule (PAR). The argumentation is followed that resistance is an important dimension of rule, which enables the researcher to understand the quality of rule. However, the empirical analysis of resistance as an indicator of rule does not allow for the analysis of subtle forms of rule sufficiently, which can have grave consequences in international relations. Therefore, to make this possible, the symbolic dimension is formulated after Bourdieu. In the following, three practice-theoretical dimensions are developed and a methodical approach is presented. Resistance is described as a practice-theoretical dimension. Based on actor-network-theory materiality is described a dimension of rule. At last, iterability is described as dimension of rule which can show the repeatability of practices. It can thus indicate the extent of consolidation of rule in each case. Through the analysis of an empirical case using the four practice-theoretical dimensions the researcher will be enabled to analyze transnational relations of rule in a theory guided and history sensitive manner.
The aim of this work was to establish a new way of predicting novel dual active compounds by combining classical fingerprint representation with state-of-the-art machine learning algorithms. Advantages and disadvantages of the applied 2D- and 3D-fingerprints were investigated. Further, the impact of various machine learning algorithms was analyzed. The new method developed in this work was used to predict compounds, which inhibit two different targets (LTA4H and sEH) involved in the same disease pattern (inflammation). The development of multitarget drugs has become more important in recent years. Many widespread diseases like metabolic syndrome, or cancer are of a multifactorial nature, which makes them hard to be treated effectively with a single drug. The new in silico method presented in this work can help to accelerate the design and development of multitarget drugs, saving time and efforts.
The nowadays readily available access to a large number of 3D-structures of biological targets and published activity data of millions of synthesized compounds enabled this study and was used as a starting point for this work. Four different data sets were compiled (crystalized ligands from the PDB, active and inactive compounds from ChEMBL23, newly designed compounds using a combinatorial library). Those data sets were collected and processed using an automated KNIME workflow. This automation has the advantage of allowing easy change and update of compound sources and adapted processing ways.
In a next step, the compounds from the compiled data sets were represented using a variety of well-established 2D- and 3D-fingerprints (PLIF, AtomPair, Morgan, FeatMorgan, MACCS). All those fingerprints share the same underlying bit string scheme but vary in the way they describe the molecular structure. Especially the difference between 2D- and 3D-fingerprints was investigated. 2D-fingerprints are solely based on ligand information. 3D-fingerprints, on the other hand, are based on X-ray structure information of protein-ligand complexes. One major difference between 2D- and 3D-fingerprints usage is the need for a 3D-conformation (pose) of the compound in the targets of interest when using 3D-fingerprints. This additional step is time-consuming and brings further uncertainties to the method.
Based on the calculated fingerprints state-of-the-art machine learning algorithms (SVC, RF, XGB and ADA) were used to predict novel dual active compounds. The models were evaluated by 10-fold cross validation and accuracy as the primary measure of model performance was maximized. Second, individual parameters of the four machine learning algorithms were optimized in a grid search to achieve maximal accuracy using the optimized partitioning scheme. Overall accuracies, regardless of fingerprint and machine learning algorithm, are slightly better for LTA4H than for sEH.
The goal to predict dual active compounds was realized by comparing the set of predicted to be active compounds for LTA4H and sEH. For the 3D-fingerprint PLIF the machine learning algorithm Random Forest was chosen, from which compounds for synthesis and testing were selected. Of 115 predicted to be active compounds, six compounds were cherry picked. Two compounds showed very good/moderate dual inhibitory activity. Of the 2D-fingerprints, the AtomPair fingerprint in combination with the machine learning algorithm Random Forest was chosen from which compounds were selected for synthesis and testing. 116 compounds were predicted to be dual active against LTA4H and sEH. One of those compounds showed good dual inhibitory activity.
In this work it was possible to show advantages and disadvantages of using 2D- and 3D-fingerprints in combination with machine learning algorithms. Both strategies (2D: ligand-based, 3D: structure-based) lead to the prediction of novel dual active compounds with moderate to very good inhibitory activity. The method developed in this work is able to predict dual active compounds with very good inhibitory activity and novel (previously unknown) scaffolds inhibiting the targets LTA4H and sEH. This contribution to in silico drug design is promising and can be used for the prediction of novel dual active compounds. Those compounds can further be optimized regarding binding affinity, solubility and further pharmacological and physicochemical properties.
Die Synthese und Charakterisierung von neuartigen metallorganischen Koordinationsverbindungen hat in den vergangenen Jahrzehnten einen wahren Aufschwung erlebt. Aufgrund ihrer außerordentlichen strukturellen Vielfalt eröffnen sich zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten über alle naturwissenschaftlich-technischen Domänen hinweg. Daher besteht ein allgemeines Interesse nicht nur in der Entwicklung neuer Verbindungen und Untersuchungen von Struktur-Eigenschafts-Beziehungen, sondern auch in einer Verbesserung ihrer Darstellungsmethoden.
Diese Dissertation beschäftigt sich mit Koordinationspolymeren und -netzwerken, die aus zweiwertigen 3d-Übergangsmetallhalogeniden (MX2, wie bspw. MnCl2 oder FeBr2) und Pyridin (py) bzw. Pyridinderivaten (CNpy, wie bspw. 3-Cyanopyridin) aufgebaut sind. Die Darstellung der Koordinationsverbindungen erfolgte in erster Linie über gewöhnliche Kristallisationsexperimente in alkoholischer Lösung, bei denen Phasen der Stöchiometrie [MX2(CNpy)4] oder [MX2(CNpy)2]n anfielen. Diese wurden anschließend systematisch erhitzt (“getempert“), was in der Regel zu einer stufenweisen und irreversiblen Abgabe eines Teils der Liganden führte, also bspw. von [MX2(CNpy)2]n zu [MX2(CNpy)1]n. Für diesen sog. „thermischen Abbau“ hat sich die Verwendung eines DTA-TG-Gerätes bewährt. Da die Zielverbindungen als mikrokristalline Pulver anfielen, erfolgte die Bestimmung ihrer Kristallstrukturen auf Basis von Röntgenpulverdaten.
Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit 41 neue Phasen synthetisiert und deren Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdaten bestimmt. Zusammenfassend ist für die verschiedenen Pyridinderivate folgendes zu konstatieren:
3-Cyanopyridin
Im Falle der MBr2-Serie wurden für M = Mn, Fe, Co und Ni Koordinationsverbindungen der Stöchiometrie [MBr2(3-CNpy)4] erhalten, deren Kristallstrukturen aus diskreten Komplexmolekülen bestehen. Derart ligandenreiche Verbindungen konnten bei keiner der übrigen Serien erhalten werden. Alle Kristallstrukturen der Zusammensetzung [MX2(3-CNpy)2]n zeigen bei M = Mn, Fe, Co, Ni und Cu eine Kettenstruktur, in der die Halogenatome als µ2-Brückenliganden fungieren. Die Ketten weisen eine Fischgrät-Anordnung auf. Im Falle von [ZnX2(3-CNpy)2] werden ausschließlich diskrete Komplexmoleküle beobachtet. In allen Kristallstrukturen der [MCl2(3-CNpy)1]n-Serie liegen Doppelketten mit µ2- und µ3-verbrückenden Cl-Atomen vor. Hingegen weisen die Verbindungen der [MBr2(3-CNpy)1]n-Serie Netzwerkstrukturen auf, in denen, zusätzlich zu µ2-Cl-Atomen, über NCN-Atome gebrückt wird.
3,5-Dicyanopyridin
Aufgrund der umfassenden Erkenntnislage bei [NiCl2(CNpy)x]n und [NiCl(py)x]n- Verbindungen wurde NiCl2 für erste Experimente mit 3,5-Dicyanopyridin als neuem, bifunktionalem Liganden ausgewählt. Erwartungsgemäß führte deren Umsetzung zur Bildung von [NiCl2(3,5-CNpy)2]n, dessen Kristallstruktur das hinlänglich bekannte charakteristische Kettenmotiv aufweist. Thermischer Abbau von [NiCl2(3,5-CNpy)2]n führt indes nicht zur Bildung von [NiCl2(3,5-CNpy)1]n (bzw. grundsätzlich zu [NiCl2(3,5-CNpy)x<2]n (mit bi- oder gar tridentatem Liganden), sondern unmittelbar zur vollständigen Zersetzung in NiCl2 und 3,5-CNpy. Daher sollten weitere Experimente mit NiBr2 als Edukt durchgeführt werden, da in [NiBr2(CNpy)1]n neben Npy auch NCN an Ni-Atome zu koordinieren vermag, wodurch ja deren Netzwerkstrukturen resultieren.
4-Cyanopyridin
Alle Kristallstrukturen der Zusammensetzung [MX2(4-CNpy)2]n zeigen bei M = Mn, Fe, Co, Ni und Cu ebenfalls eine Kettenstruktur, in der die Halogenatome als µ2-Brückenliganden fungieren. Auch in diesen Kristallstrukturen liegt eine Fischgrät-Anordnung der Ketten vor. Im Falle von [ZnX2(4-CNpy)2] werden ausschließlich diskrete Komplexmoleküle beobachtet. In allen Kristallstrukturen der [MX2(4-CNpy)1]n-Serie liegen Netzwerkstrukturen vor, in denen die Metallatome über µ2-Halogenatome und NCN-Atome verbrückt werden. Alle Kristallstrukturen der [MBr2(4-CNpy)1]n-Serie sind charakteristisch fehlgeordnet, da die Orientierung der 4-CNpy-Liganden invertiert wird („Kopf-Schwanz“-Fehlordnung).
Ziel dieser Arbeit war es, einen genaueren Einblick in die Rolle von PaCLPXP für den Energiemetabolismus von P. anserina zu erhalten und mögliche Komponenten zu identifizieren, welche wichtig für die Langlebigkeit der PaClpP-Deletionsmutante sind. Folgende neue Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden:
1. Die Substrat-Analyse durch eine Cycloheximid-Behandlung und anschließender Proteom-Analyse legte erfolgreich eine Reihe potentieller bisher nicht bekannter Substrate von PaCLPP offen. Interessanterweise waren unter den identifizierten Proteinen viele ribosomale Untereinheiten und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege des Energiemetabolismus zu finden. Am auffälligsten unter diesen Substraten war die extreme Anreicherung eines Retikulon-ähnlichen Proteins, das einen neuen Aspekt der möglichen molekularbiologischen Rolle von PaCLPP in P. anserina andeutet.
2. Durch die Zugabe von Butyrat zum Medium, konnte erfolgreich die Autophagie sowohl im P. anserina Wildtyp als auch in der PaClpP-Deletionsmutante reduziert werden. Diese Verminderung der Autophagie sorgt bei ΔPaClpP für eine Verkürzung der Lebensspanne. Dieser Effekt ist spezifisch für die PaClpP-Deletionsmutante, während die Auswirkung von Butyrat auf den Wildtyp nur marginal ist. Dieses Ergebnis untermauert frühere Analysen dieser Deletionsmutante, welche besagen, dass die Langlebigkeit von ΔPaClpP Autophagie abhängig ist (Knuppertz und Osiewacz, 2017).
3. Die Metabolom-Analyse von ΔPaClpP im Vergleich zum Wildtyp zeigt, dass das Fehlen der PaCLPP zu Veränderungen in der Menge der Metaboliten der Glykolyse und des Citratzyklus kommt. Außerdem sind die Mengen der meisten Aminosäuren und der Nukleotide betroffen. Diese Analyse beweist, dass das Fehlen dieser mitochondrialen Protease weitreichende Folgen für die ganze Zelle hat. Durch die signifikante Verringerung von ATP und die Anreicherung von AMP in jungen ΔPaClpP-Stämmen und durch den Umstand der gesteigerten Autophagie in dieser Mutante, fiel das Augenmerk auf die AMPK. Dieses veränderte AMP/ATP-Verhältnis ist ein Indiz für eine gesteigerte AMPK-Aktivität und könnte auch den Umstand der gesteigerten Autophagie in ΔPaClpP erklären.
4. Das Gen codierend für die katalytische α-Untereinheit der AMPK (PaSnf1) konnte erfolgreich in P. anserina deletiert werden. Das Fehlen von PaSNF1 führt zu einer reduzierten Wuchsrate, eine beeinträchtige weibliche Fertilität und eine verzögerte Sporenreifung. Es konnte gezeigt werden, dass die Autophagie infolge einer PaSnf1-Deletion nicht gänzlich unterdrückt wird, PaSNF1 allerdings für die Stress-induzierte Autophagie notwendig ist. Überraschenderweise führt die Abwesenheit von PaSNF1 zu einer verlängerten Lebensspanne im Vergleich zum Wildtyp. Die meisten Effekte infolge einer PaSnf1-Deletion konnten durch die Einbringung eines FLAG::PaSNF1-Konstrukts komplementiert werden.
5. Eine gleichzeitige PaSnf1 und PaClpP-Deletion führt zu eine unerwarteten, extremen Lebenspannenverlängerung, die die Verlängerung der Lebensspanne bei der PaClpP-Deletionsmutante noch übertrifft. Interessanterweise geht dieser Phänotyp nicht mit einer erhöhten Autophagie einher. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass das Fehlen von PaSNF1 sowohl in ΔPaSnf1 als auch in ΔPaSnf1/ΔPaClpP zu einer veränderten Mitochondrien-Morphologie im Alter führt. Die Abwesenheit von PaSNF1 verursacht, dass die Stämme auch im Alter (20d) noch überwiegend filamentöse Mitochondrien aufweisen. Zudem zeigen die drei analysierten Deletionsstämme (ΔPaSnf1, ΔPaClpP und ΔPaSnf1/ΔPaClpP) massive Einschränkungen wenn sie auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind.
6. Auffallend war, dass bei ΔPaSnf1, ΔPaClpP und bei ΔPaSnf1/ΔPaClpP die Stämme mit dem Paarungstyp „mat-“ langlebiger sind als die Stämme mit dem Paarungstyp „mat+“. Dieser Effekt ist bei der ΔPaSnf1/ΔPaClpP-Doppelmutante am stärksten ausgeprägt. Weitere Untersuchungen dazu ergaben, dass die Paarungstypen immer dann eine Rolle spielen, wenn die Stämme mitochondrialem Stress ausgesetzt, oder aber auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind. Verantwortlich für diese Unterschiede sind zwei rmp1-Allele, die mit den unterschiedlichen Paarungstyp-Loci gekoppelt sind und mit dem jeweiligen Paarungstyp-Locus vererbt werden (rmp1-1 mit „mat-“; rmp1-2 mit „mat+“).
The deubiquitinase USP32 regulates non-proteolytic ubiquitination in the endosomal-lysosomal system
(2021)
The regulation of essential cellular processes requires tightly controlled and directed transport of proteins and membranes. The highly dynamic endosomal and lysosomal system forms the key network for exchange and trafficking of molecules with its early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, lysosomes, and additionally autophagosomes.
In this system, the small GTPase Rab7 has an essential role at the late endosomal stage regulating vesicle transport, tethering, and fusion, and retromer mediated receptor recycling back to the trans-Golgi network (TGN). Thus, Rab7 is also important for autophagosomes and lysosomes.
Lysosomes do not only represent the end point of the degradation pathway with several feeder pathways. But these organelles are also a dynamic signaling hub for a variety of metabolic processes. The ever-important regulator of cellular biosynthetic pathways mTORC1 dynamically associates with lysosomes where it is activated. mTORC1 activation is a complex multi-step process where a series of signaling events converge in dependence of amino acid levels thereby enabling interactions between the lysosomal v-ATPase, Ragulator complex (consisting of LAMTOR1-5), and Rag GTPases.
Ubiquitin signals are involved in almost all cellular processes. With this, their regulatory mechanism is also described for the endosomal-lysosomal system as well as mTORC1 signaling. Deubiquitinases (DUBs) release conjugated ubiquitin from proteins and thereby maintain the dynamic state of the cellular ubiquitinome.
The ubiquitin-specific protease 32 (USP32) is a poorly characterized DUB with only emerging cellular function. However, its predicted domain structure includes two unique domains within the entire DUB family. It has been linked to the development of breast cancer and small cell lung cancer. Furthermore, overexpressed GFP-USP32 was localized at the TGN, and a global mass spectrometry-based DUB interactome study suggested an interaction with the retromer complex. Based on these data, USP32 was a very interesting candidate to study its cellular function in this PhD project.
To investigate the function without disease background, a polyclonal USP32 knockout (USP32KO) RPE1 cell line was generated using the CRISPR/Cas9 technology. First experiments revealed different protein expression levels in various cell lines, and a subcellular localization of USP32 at membranes of the Golgi and lysosomal compartments. In a subsequent SILAC-based ubiquitinome analysis potential substrates of USP32 were identified. Interestingly, various proteins of the endosomal-lysosomal system were detected with enriched non-proteolytic ubiquitination upon USP32 depletion.
The further characterization of Rab7 as USP32 substrate confirmed the USP32-sensitive ubiquitination of Rab7 at lysine (K) residues 191 and 194. The ubiquitination in USP32KO cells did not change the subcellular localization of Rab7, but enhanced the interaction with the effector protein RILP. This implied that Rab7 was either more active or RILP had higher affinity to ubiquitinated Rab7. The subsequent results verified this theory. The retromer mediated recycling of CI-M6PR back to the TGN was faster or more efficient in USP32-depleted cells.
Accompanying this, levels of hydrolases were enriched in lysosomes isolated from USP32KO cells. Notably, USP32 had no direct effect on expression level or assembly of the retromer complex itself.
The observed lysosomal phenotypes connected another identified substrate to the function of USP32 in the endosomal-lysosomal system: LAMTOR1. LAMTOR1 is a component of the Ragulator complex and thus involved in the activation of mTORC1 at the lysosomal surface. Similar as for Rab7, the first experiments to characterize LAMTOR1 as USP32 substrate confirmed the USP32-sensitive ubiquitination at K20 independent of amino acid availability. However, ubiquitination of LAMTOR1 decreased its lysosomal localization in untreated and amino acid starved USP32KO cells. The following label-free interactome study detected a reduced interaction of LAMTOR1 and subunits of the lysosomal v-ATPase upon loss of USP32. This resulted in a shifted subcellular localization of mTOR (subunit of mTORC1) away from lysosomes. Furthermore, direct substrates of mTORC1 were less or slower re-phosphorylated after long amino acid starvation and re-activation of mTORC1 in USP32KO cells indicating a reduced mTORC1 activity.
Both USP32-dependent regulations of Rab7 and LAMTOR1/Ragulator converged in enhanced autophagic processes analyzed by increased LC3 levels upon amino acid starvation and USP32 depletion.
In summary, the presented thesis described the diverse role of USP32 in the endosomal and lysosomal system, and contributes to the understanding of novel ubiquitin signals in this context.
Durch die sich verändernde Altersstruktur nehmen die Inzidenz und Prävalenz von Herzklappenerkrankungen wie der Mitralinsuffizienz weltweit zu, verbunden mit einem Verlust an Lebensqualität und Lebensjahren für den individuellen Patienten und hohen Kosten für das Gesundheitssystem. Die Standardtherapie, eine chirurgische Rekonstruktion oder ein Ersatz der Mitralklappe kommt aufgrund von Alter und Begleiterkrankungen (insbesondere der Herzinsuffizienz) bei bis zu 50% der Patienten nicht in Frage. Die MitraClip- Prozedur ist ein etabliertes Verfahren zur minimalinvasiven Therapie der hochgradigen Mitralklappeninsuffizienz bei Patienten mit hohem Operationsrisiko. In einigen, jedoch nicht allen Patientenkohorten konnte ein positiver Einfluss auf Rehospitalisierungen und Sterblichkeit gezeigt werden. Insbesondere Patienten mit Rechtsherzdysfunktion (RVD) scheinen weniger zu profitieren. Aufgrund des individuellen Risikos des Eingriffs und der erheblichen Kosten ist es notwendig, Patienten zu identifizieren die von dem Eingriff profitieren und solche bei denen ein ungünstiges Nutzen/ Risikoverhältnis besteht.
Im Rahmen des Frankfurter Mitralklappenregisters wurden 119 Patienten im interdisziplinären Konsens („Heart Team“) vom 07/2013 bis 02/2017 mit der MitraClip Prozedur behandelt und nach ihrem schriftlichen Einverständnis in die Analyse eingeschlossen. Der Langzeitverlauf wurde bis zum 31.12.2017 beobachtet.
Ziel der Studie war, zu erfassen, ob die Anwendung von bei Herzinsuffizienz etablierten Prognosemodellen bei diesen Patienten sinnvoll ist und ob sich das Seattle Heart Failure Model (SHFM) und der Meta-Analysis Global Group in Chronic Heart Failure (MAGGIC) Score in ihrer Genauigkeit bei diesen Patienten unterscheiden insbesondere im Kontext einer RVD.
Die Diagnose einer RVD erfolgte über den im Herzultraschall leicht zu erfassenden Parameter „Tricuspid Annular Plane Excursion“ (TAPSE), der die während der Systole zurückgelegte Strecke des Trikuspidalrings misst.
Die Genauigkeit in der Vorhersage der 1- Jahres Mortalität der beiden Scores wurde durch die Bestimmung der Area under the Receiver Operating Characteristic (AUROC) ermittelt.
Innerhalb eines Jahres nach MitraClip- Therapie verstarben 29 Patienten (28.2%) des Gesamtkollektivs. Bei Patienten mit funktioneller Mitralklappeninsuffizienz (FMR) betrug die 1- Jahres Mortalität 23,3%, bei Patienten mit degenerativer Mitralklappeninsuffizienz (DMR) 31,7%. In der Kaplan- Meier Analyse bestand eine signifikant erhöhte 1- Jahres Mortalität für Patienten mit RVD (34.8 vs 22.8%; p=0.009). Patienten mit FMR wiesen eine erhöhte Sterblichkeit auf, wenn gleichzeitig eine RVD bestand (38.1% vs 9.1% ohne RVD). Diese Assoziation bestand bei Patienten mit DMR nicht (32% mit RVD vs. 34.3%).
Die prognostische Genauigkeit beider Scores war im Gesamtkollektiv vergleichbar (SHFM: 0.704, MAGGIC: 0.692). Das gilt auch für separate Analysen nach funktioneller/ degenerativer Genese der Mitralklappeninsuffizienz (FMR: SHFM 0.696, MAGGIC 0.722; DMR: SHFM 0.727, MAGGIC 0.629). Bei Patienten ohne RVD zeigt das SHFM jedoch eine höhere diagnostische Genauigkeit als der MAGGIC Score (SHFM: 0.775; MAGGIC: 0.551, p <0.05). Bei Patienten mit Rechtsherzdysfunktion bestehen keine signifikanten Unterschiede (SHFM: 0.615; MAGGIC: 0.799, p>0.05), auch wenn ein Trend zugunsten des MAGGIC Scores bestand.
Eine bestehende RVD ist ein wichtiger prognostischer Marker für Patienten, die mit einem Mitraclip behandelt werden und sollte in der Entscheidungsfindung des „Heart Teams“ berücksichtigt werden. SHFM und MAGGIC Score besitzen eine adäquate prognostische Trennschärfe in unserer Patientenkohorte, Unterschiede bestehen bei Patienten mit/ ohne RVD. Aufgrund der Heterogenität der Erkrankung sowie der Begleiterkrankungen besteht für beide Scores nur eine moderate Trennschärfe, sie dürfen beim individuellen Patienten nicht einziges Entscheidungskriterium sein. Denkbar wäre, durch einen „machine learning“ Ansatz unter Einbeziehung klinischer, anatomischer, demographischer und laborchemischer Daten ein Score System zu entwerfen, mit dem eine höhere prognostische Genauigkeit erreicht werden könnte.
Die allergische Rhinitis (AR) zählt zu einer der häufigsten chronischen Atemwegserkrankungen und betrifft weltweit etwa 500 Millionen Menschen. Bei einem Teil der Patienten mit rhinitischer Symptomatik lassen sich in den herkömmlichen Tests jedoch keine Hinweise für eine Allergensensibilisierung aufweisen. Diese Patienten wurden in der Vergangenheit häufig der Gruppe der nicht-allergischen Rhinitis (NAR) zugeordnet, welche über 200 Millionen Menschen weltweit betrifft. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die lokale allergische Rhinitis (LAR) als wichtige Differentialdiagnose zur NAR oder idiopathischen Rhinitis (IR) ergeben. Einige Autoren postulieren, dass bis zu einem Viertel der chronischen Rhinitiker von LAR betroffen sein könnten und bis zu 62,5 % der bisher als NAR oder IR klassifizierten Patienten eine LAR haben könnten. Die LAR wird durch allergiesuggerierende Rhinitissymptome, eine positive Reaktion im nasalen Provokationstest (NPT) mit Inhalationsallergenen und das gelegentliche Vorhandensein spezifischer Antikörper in der Nasen-schleimhaut definiert, ohne dass ein Nachweis systemischer Sensibilisierung zu finden ist.
Da große Unterschiede der LAR-Prävalenzangaben herrschen, war es das Ziel der Arbeit, diese bei Personen mit ganzjähriger Rhinitis herauszufinden und die nasale Mukosa auf lokales spezifisches IgE (sIgE) zu untersuchen.
Hierfür wurden aus einer Gruppe von insgesamt 156 gescreenten Testpersonen 63 weitergehend erforscht. Einundzwanzig Patienten mit ganzjähriger NAR wurden herausgefiltert, untersucht und deren Ergebnisse mit denen von
24 AR Patienten und Hausstaubmilben (HDM)-Allergie sowie 18 Kontrollen verglichen. Wir untersuchten die Ausprägung der klinischen Symptomatik sowie die Reaktion im Haut-Prick-Test, das Gesamt-IgE und sIgE gegen die Milbenspezies Dermatophagoides pteronyssinus (D1) und Dermatophagoides farinae (D2) in Serum und Nasensekret (NS) und führten mit allen einen NPT mit D2 durch. Der NPT wurde mithilfe der Messung des peak nasal inspiratory flow (PNIF) und des Lebel-Scores bewertet.
Während sich die Ausprägung der klinischen Symptomatik der NAR- und AR Patienten sehr ähnelte, wies keiner der NAR-Patienten nasales sIgE gegen HDM oder eine positive Reaktion im NPT gegen D2 auf. Der Nasensummenscore lag sowohl bei AR- und NAR-Patienten im Median bei 11 von 24 Punkten (Range: 6–21 Punkte beziehungsweise 6–20 Punkte) und hob sich signifikant von dem der Kontrollen ab, welche einen Score von 0 Punkten (Range: 0–5 Punkte) aufwiesen. Der Median des sIgE-D1 und sIgE-D2 im NS lag sowohl bei NAR Patienten als auch Kontrollen bei 0,1 kU/L (Range: 0,1–0,1 kU/L) und unterschied sich nicht signifikant voneinander. Im Gegensatz dazu zeigten 94,12 % der untersuchten AR-Proben erhöhtes sIgE-D1 oder sIgE-D2 im NS. Die mediane Konzentration im NS lag bei AR-Patienten für sIgE-D1 bei 1,19 kU/L (Range: 0,1–14,93 kU/L) und für sIgE-D2 bei 2,34 kU/L (Range: 0,1–22,14 kU/L). Der NPT mit D2 war bei 13/14 AR-Patienten (= 92,86 %) und keinem der NAR-Patienten oder Kontrollen positiv. Sowohl die absolute als auch die prozentuale PNIF-Abnahme nach HDM-Provokation unterschied sich zwischen AR-Patienten und Kontrollen sowie zwischen Patienten mit AR und NAR signifikant. Die prozentuale PNIF-Reduktion lag nach HDM-Provokation in der AR-Gruppe bei 55,85 %, der NAR-Gruppe bei 7,14 % und bei Kontrollen bei 0 %. Es ließ sich jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen Kontrollen und NAR-Patienten feststellen.
Aufgrund der erhobenen Ergebnisse ist festzuhalten, dass wir nur in der Gruppe der AR positive NPTs und nasales sIgE gegen HDM-Spezies nachweisen konnten und wir demnach für diese Studie eine Prävalenz der LAR unter den NAR-Patienten von 0 % feststellen. Wir gehen in Zusammenschau unserer Befunde daher davon aus, dass die Prävalenz von LAR im Bereich der NAR oder IR in der untersuchten in Deutschland lebenden Population deutlich niedriger sein muss als zuvor in anderen Populationen berichtet.
Hämophilie A (HA) ist eine X-chromosomal-rezessiv vererbte Blutgerinnungsstörung mit einem vollständigen Fehlen oder einem funktionellen Defizit des Gerinnungsfaktors VIII (FVIII). Trotz der Therapiefortschritte innerhalb der letzten Jahre, zeigen HA-Patienten auch unter der regelmäßigen FVIII-Substitutionstherapie weiterhin multiple Komplikationen, einschließlich Gelenkschäden, Entstehung einer Immunantwort (Hemmkörper) und reduzierter Lebensqualität. Im Gegensatz zu den bisherigen Therapieoptionen stellt die Gentherapie (GT) die vielversprechende Möglichkeit einer dauerhaften Anhebung des FVIII-Spiegels bis hin zur Heilung der HA in Aussicht.
In der vorliegenden Arbeit konnte ein geeignetes HA-Zellmodell auf Basis der primären humanen hepatischen sinusoidalen Endothelzellen (HHSEC) etabliert werden, um die zukünftige Erforschung einer SaCas-CRISPR-basierten HA-GT in vitro zu evaluieren, sowie wichtige Erkenntnisse für weiterführende Arbeiten gewonnen werden.
Mittels stabiler Integration des Doxycyclin-induzierbaren large T-Onkogens konnte eine gut charakterisierte, immortale HHSEC_LT-Zelllinie hergestellt werden, welche funktionalen FVIII exprimiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Immortalisierung in Abhängigkeit von Doxycyclin für weiterführende Experimente in der Zellkultur essenziell ist, um Stressreaktionen der HHSEC, aufgrund ra-scher Seneszenz und Apoptose, zu umgehen.
Im weiteren Verlauf des GT-Projektes sollten verschiedene HHSEC-F8-Mutations-Zelllinien hergestellt werden. Neben der Gensequenzierung wurden in der vorliegenden Arbeit mehrere in Betracht kommende FVIII-Detektionsverfahren getestet, um den Erfolg einer eingeführten F8-Genmutation in HHSEC sowie ihrer anschließenden Reparatur im weiteren Verlauf des GT-Projektes auch auf Proteinebene zu demonstrieren. Hierbei konnte gezeigt wer-den, dass für die vorliegende Fragestellung sich insbesondere die Immunfluoreszenz- (IF-) Mikroskopie und die Quantifizierung der FVIII-Aktivität (FVIII:C) mittels aPTT-basierter Messung zur spezifischen Detektion von FVIII in HHSEC bewähren.
In Anlehnung an patientenspezifische F8-Genmutationen mit einem Frameshift-Effekt wurden fünf verschiedene sgRNA/SaCas9-CRISPR-Expressionsvektoren konstruiert und mittels lentiviralem Gentransfer in die immortalisierten HHSEC stabil transduziert. Nach PCR-Amplifikation der betreffenden genomischen Loci dieser fünf verschiedenen stabil transduzierten HHSEC-F8-Mutations-Zelllinien zeigte die anschließende Sequenzierung, dass vier der fünf hergestellten Konstrukte Genveränderungen mit potenziellen Frameshift-Effekten in HHSEC generieren konnten, wovon zwei sehr gute Ergebnisse erzielten. Korrelierend zu den Sequenzierergebnissen konnten ebenfalls Verminderungen der FVIII-Fluoreszenzintensität mittels mikroskopischer IF-Aufnahmen sowie der FVIII:C mittels aPTT-basierter Messung dargestellt werden.
Weiterhin konnte bei der Beurteilung des morphologischen Erscheinungsbildes der stabil transduzierten HHSECs eine optisch veränderte Zellmorphologie sowie ein Wachstumsnachteil innerhalb der beiden Zellpools mit den höchst erreichten Indel-Raten und der niedrigsten FVIII:C beobachtet werden. Diese Beobachtungen erlaubten die Formulierungen neuartiger, vielversprechender Hypothesen in Bezug auf das Grundverständnis der HA-Erkrankung.
Hydro-climatic causes of widespread floods in central Europe : on rain-on-snow and Vb-cyclone events
(2021)
The presented work investigates the hydro-meteorological and hydro-climatological drivers of widespread floods in Central Europe during the past century. Due to the strong seasonality of the detected flood drivers, the thesis is divided into two parts: the first part focuses on widespread winter floods and the second one on extreme summer floods. For analysing past flood events, we profited from the dynamically downscaled centennial ERA-20C reanalysis (continuously from 1901—2010). The downscaling was performed over Europe with a coupled regional atmosphere-ocean model (COSMO-CLM+NEMO) to represent the water cycle more realistic. These high resolution atmospheric data allowed us to study the four-dimensional atmospheric state during selected floods during the early decades of the 20th century for the first time with such a high temporal and spatial resolution.
During the winter half-year, the observed floods were particularly widespread. High peak discharges were recorded simultaneously in the Rhine, Elbe, and Danube catchments. Most of these trans-basin floods were compound events caused by rainfall during extensive snowmelt (i.e., rain-on-snow events). Interestingly, the winter flood time series exhibited a remarkable high flood frequency during the 1940s and 1980s, while other decades were flood-poor. We detected a synchronization of the inter-annual flood frequency with the superposition of the North Atlantic Oscillation (NAO) and the Scandinavian pattern (SCA). The negative NAO phase is often associated with large snowfall and cyclone tracks over southern Europe, while the negative SCA pattern correlates with total precipitation in the affected river catchments.
During the summer half-year, most extreme floods in Central Europe were caused by so-called Vb-cyclones propagating from the Mediterranean Sea north-eastward to Central Europe. So far in the literature, only a few Vb-events, which occurred during the past two decades, have been analysed. We extended the previous case studies by several past Vb-cyclone floods since 1900. We investigated the processes that intensify Vb-cyclone precipitation with Lagrangian moisture-source diagnostics and the parametric transfer entropy measure TE-linear. Overall, an enhanced and dynamically driven moisture uptake over the Mediterranean Sea was found to be characteristic for Vb-events with heavy precipitation. This is supported by high information exchange from evaporation over the western basin of the Mediterranean Sea towards heavy precipitation in the Odra catchment. The dominating moisture uptake regions during the investigated events were, however, the European continent and the North Sea. A possible cause could be the pre-moistening of non-saturated continental moisture sources upstream of the affected river catchments as indicated by significant information exchange from land surface evaporation and soil moisture content along the Vb-cyclone pathway. Besides, evaporation over the Mediterranean Sea might contribute to Vb-cyclone intensification in the early stages of their development through latent heat release. On the catchment scale, orographic rainfall and convective precipitation further enhance the flood triggering rainfall. As expected, the Vb-cyclones mainly trigger precipitation along west-east orientated mountain ranges such as the Alps or Ore mountains due to their meridional pathway. Remarkably, during summer, we detected a convective fraction of up to 90% during the afternoons of individual days and up to 23% on average (based on convective cell tracking and convection-permitting simulations of selected flood events since 1900).
The presented analyses deepened the knowledge on atmospheric and hydroclimatic drivers of widespread floods in Central Europe. This will serve as a basis for future studies on the predictability of floods induced by rain-on-snow and Vb-cyclone precipitation events in the context of a changing climate.
Specialized transporter proteins facilitate controlled uptake and extrusion of molecules across biological membranes that would otherwise be impermeable to them. The superfamily of solute carriers (SLC) comprises the second largest group of membrane proteins in humans, acting on a variety of small polar and non-polar molecules and ions. Because of their central role in metabolism, malfunctioning of these proteins often is pathogenic. The interest in SLC transporters as drug targets – as well as for drug delivery – has therefore increased in the past years. For many SLC subfamilies, however, structural and functional information remains scarce to date.
The here presented data provides important insights into different aspects of the transport mechanism of the SLC23 and SLC26 protein families. Importantly, we show that SLC23 nucleobase transporters, in contrast to what was been previously reported, work as uniporters rather than as proton-coupled symporters. In order to do so, we developed the first and only in vitro transport assay for the SLC23 family, which enables investigation of protein function in a defined environment. Moreover, we provide a hypothesis on the role of the extremely conserved negative charged substrate binding site residue found not only in the SLC23, but also SLC4 and SLC26 families. Based on a detailed analysis of binding and transport we conclude that this conserved negative charged has a relevance for protein stability rather than for substrate binding, which explains its conservation for all three protein families that otherwise differ in their substrate specificities and modes of transport. Lastly, we investigated the relevance of oligomerization for the SLC23 and SLC26 families, highlighting the importance of the STAS domain for forming active dimers in the SLC26 anion transporter family.
RNA ist vor allem als Vermittler von Erbinformationen bekannt. Doch neben der Translation in Proteine ist sie auch maßgeblich an regulatorischen Prozessen in der Zelle beteiligt. So kommen in vielen Organismen Argonautenproteine vor, die zusammen mit microRNA einen Komplex bilden, der in der Lage ist, mRNA zu spalten oder auf andere Weise deren Translation zu unterdrücken. Da die Deregulierung von microRNA bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Parkinson oder Alzheimer auftritt, wurden in dieser Arbeit Alkylanzien entwickelt, die zur besseren Inhibierung von microRNA beitragen sollen.
Als Alkylierungsmittel wurden ortho-Chinonmethide verwendet, die zunächst in geschützter Form synthetisiert wurden und nach Aktivierung mit einer Nukleobase reagieren können. Für die Erkennung der miRNA-Sequenz wurden diese zu einem Konjugat mit Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) verbunden. Es wurden zwei Arten von Chinonmethid-Präkursoren hergestellt: Mit o Nitrobenzyl photolabil geschützte, die sich mit Licht der Wellenlänge 365 nm aktivieren lassen, und über ein Disulfid geschützte, die mithilfe eines Reduktionsmittels aktiviert werden. Die photolabil geschützten Derivate lassen sich damit gezielt örtlich und zeitlich aktivieren. Vom reduktiv aktivierbaren Präkursor wurden drei Derivate mit sterisch unterschiedlichen Resten am Disulfid (Benzyl-, Isopropyl- oder tert-Butyl-Rest) hergestellt, die einen Einfluss auf die Kinetik der Entschützung haben. Diese Derivate können nach Eintritt in eine Zelle durch die dort vorherrschende hohe Glutathion-Konzentration aktiviert werden, während sie extrazellulär unreaktiv sind.
Zunächst wurde die Kinetik eines photolabil geschützten Konjugats ohne RNA untersucht. Hier kommt es nach Bestrahlung zur Selbstalkylierung, bei der die Nukleobasen der PNA angegriffen werden. Bei 37 °C erfolgte dies mit einer Halbwertszeit von 0.43 h unter Annahme einer Reaktion 1. Ordnung. Die Kinetik der Alkylierung der komplementären RNA ließ sich durch zwei parallel ablaufende Reaktionen 1. Ordnung abbilden. Die Schnelle hatte eine Halbwertszeit von 0.42 h und die Langsame 11 h mit einer Ausbeute von 73 % nach 168 h. Bei Bestrahlung des Konjugats und erst anschließender Zugabe der RNA wurde ebenfalls eine Halbwertszeit von 11 h bei einer einzelnen Reaktionen 1. Ordnung erhalten. Dies lässt sich mit der Reversibilität mancher Reaktionsprodukte erklären. Die schnelle Reaktion entspricht der direkten Reaktion des Chinonmethids mit der RNA, die langsame entsteht durch Umlagerung von reversiblen Addukten.
Die Analyse der RNA-Alkylierung erfolgte mithilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bei der in Abhängigkeit der Gel-Temperatur scheinbar unterschiedliche Kinetiken gemessen wurden. Dies ist ebenfalls eine Folge der Reversibilität. Bei 57 °C kann ein Teil der Bindungen zwischen RNA und den Konjugaten brechen und es wird am Anfang der Reaktion eine geringere Ausbeute gemessen als bei 25 °C Geltemperatur. Die Ausbeute nach 168 h änderte sich jedoch nicht, da im Verlauf der Reaktion die reversiblen Addukte in irreversible umgewandelt werden.
Mit miRNA-20a als Ziel wurden mit einem 10mer Konjugat zunächst nur 13 % Ausbeute nach 72 h und mit einem 15mer Konjugat 41 % nach 75 h erreicht. Durch internen Einbau des Chinonmethid-Präkursors in die PNA, sodass es einem Adenosin der RNA gegenübersteht, konnte die Ausbeute auf 75 % nach 72 h gesteigert werden, da Adenosin bevorzugt alkyliert wird.
Bei den reduktiv aktivierbaren Chinonmethid-Präkursoren waren alle synthetisierten Konjugate in Puffer ohne Glutathion (GSH) stabil. Die Reihenfolge der Reaktionsgeschwindigkeit der Disulfidspaltung war bei 0.5 mM und 10 mM GSH: Benzyl > Isopropyl > tert-Butyl. Die Halbwertszeit bei 10 mM GSH betrug weniger als 5 min (Benzyl-Konjugat) bis 2 h (t Butyl Konjugat). Jedoch bildeten sich mit allen Konjugaten bei 10 mM GSH auch Addukte mit GSH.
Die Reaktivitätsreihenfolge blieb bei der Alkylierung von RNA erhalten. Allein das Benzyl-Konjugat erreichte bei einer GSH-Konzentration von 0.5 mM schon die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit wie das photolabil geschützte Chinonmethid. Bei 10 mM GSH erreichten die Derivate zwar nach wenigen Stunden ihre maximale Ausbeute, diese betrug jedoch nur 23 % (tert-Butyl-Konjugat) bis 43 % (Benzyl-Konjugat), da die Chinonmethide auch durch GSH als Nukleophil abgefangen werden.
Mit einem Konjugat, das ein photolabiles Chinonmethid sowie Biotin trägt, wurde ein Fluoreszenzpulldown mit Cy5-markierter RNA durchgeführt. Hier zeigte die bestrahlte Probe eine deutlich höhere Fluoreszenz (6.8x), als eine unbestrahlte Vergleichsprobe. Bei einem Pulldown-Versuch mit miRNA-20a bzw. mit RISCs aus HeLa-Zelllysat konnte das Argonautenprotein jedoch nicht eindeutig mittels Westernblot nachgewiesen werden.
Anhand des reduktiv aktivierbaren Benzyl-Konjugats konnte gezeigt werden, dass sich das Konjugat in Zelllysat zersetzt und nur ein Teil zu Addukten mit Nukleobasen reagiert. Die Ursache wurde in der hydrolyselabilen Abgangsgruppe gesehen, sodass weitere photolabil geschützte Derivate mit Dimethylamino-, Trimethylammonium-, Pivaloylester- und Benzoylestergruppe synthetisiert wurden. Von diesen war nur das Benzoylester-Konjugat in der Lage, RNA mit 72 % Ausbeute nach 48 Stunden zu alkylieren. Zudem war es für mindestens 1 h in Zelllysat stabil.
Uneindeutiger Verlust unterscheidet sich von eindeutigem Verlust durch Tod dadurch, dass der Verlust nicht sicher ist, da Verbleib und Schicksal der verlorenen Person unklar sind (physischer uneindeutiger Verlust; die Person wird vermisst) oder aber da die Person zwar physisch präsent, aber psychisch abwesend ist (psychologischer uneindeutiger Verlust, bspw.
durch Alzheimer; Boss, 1999, 2006). Klinische Fallberichte legen nahe, dass die Uneindeutigkeit des Verlusts einer geliebten Person den Trauerprozess erschwert, doch mangelt es an systematischen Studien. Die vorliegende Studie ist die erste, die beide Arten uneindeutigen Verlusts systematisch mit Verlust durch Tod unter nicht-gewaltsamen Umständen vergleicht. Publikation 1 und 2 zielen darauf, ein multidimensionales Verständnis davon zu gewinnen, wie die Uneindeutigkeit eines Verlusts dessen Verarbeitung beeinflusst. Untersucht wurde auch, ob die Auswirkungen der Uneindeutigkeit eines Verlusts sich auf die Erzählung des Verlusts selbst beschränkt oder sich auch auf andere Erinnerungen auswirkt. Artikel 3 geht einen Schritt weiter und untersucht protektive Faktoren, die ein erfolgreiches Verstehen und adaptive Folgen befördern können. Alle drei Veröffentlichungen basieren auf derselben Studie, in der je 30 Erwachsene mit physischem sowie mit psychologischem uneindeutigen Verlust untersucht wurden sowie weitere 30 mit eindeutigem Verlust eines Elternteils durch Tod (N = 90). Alle Teilnehmenden erzählten fünf Erinnerungen (n = 450), einmal eine offene Erzählung des Verlusts sowie je eine Erzählung eines spezifischen Ereignisses, nämlich eines verlustbezogenen Ereignisses, eines traurigen Ereignisses, eines Wendepunkt-Erlebnisses sowie eines selbstdefinierenden Erlebnisses. Zudem füllten sie symptombezogene Fragebögen aus. Insgesamt wurden neun Kodiermanuale auf die Erzählungen angewendet, um zu erfassen, wie Verluste verarbeitet und bewältigt werden. Der erste Artikel zeigt, dass Personen mit uneindeutigem Verlust, verglichen mit Personen mit eindeutigem Verlust, zwar nicht mehr in dem Verlusterlebnis aufgehen, aber doch schlechter mit ihm zurecht kommen. Die Uneindeutigkeit des Verlusts erschwert es, dem Verlust einen Sinn zu verleihen, und lässt seine Folgen negativer erscheinen. Der zweite Artikel zeigt, dass Menschen, die einen uneindeutigen Verlust erlebt haben, diesen sowie selbstdefinierende Erinnerungen mit mehr sogenannten Kontaminations- und weniger Erlösungssequenzen erzählen, und nur das Verlusterlebnis mit weniger Themen der Agentizität und Gemeinschaft, sich aber nicht in traurigen und Wendepunkterzählungen unterscheiden. Diese Gruppenunterschiede waren nicht auf unterschiedliche Symptomausprägungen zurück zu führen. Im dritten Artikel schließlich kann gezeigt werden, dass die relative Häufigkeit von Verknüpfungen zwischen der eigenen Person und einem Lebensereignis sowie ihre Positivität und Veränderungs- versus Stabilitätsbezug damit korrelierte, wie erfolgreich Lehren aus dem Ereignis gezogen werden konnten. Zudem korrelierte eine höhere Schulbildung mit erfolgreicherem Ziehen von Lehren aus den Ereignissen und mit positiveren Implikationen für Erzählende. Schließlich korrelierte die Positivität autobiographischen Urteilens mit weniger verzögerter Trauer. Diese Arbeit stützt zum Teil die von Boss beschriebenen, im Vergleich zu eindeutigen Verlusten schwerwiegenderen Folgen uneindeutigen Verlusts, spricht aber gegen die von Boss behaupteten traumatischen Folgen. Die Uneindeutigkeit eines Verlusts sollte bei der klinischen Behandlung von Trauernden berücksichtigt werden. Allerdings lässt sich aufgrund des Fehlens einer Kontrollgruppe ohne Verlust nicht beurteilen, ob die festgestellten Besonderheiten des Verarbeitens eines Verlusts als unangemessen zu beurteilen sind. Erst longitudinale Studien werden es erlauben, Verarbeitungs- und Bewältigungsprozesse uneindeutigen Verlusts in Erzählungen im Zeitverlauf zu untersuchen.
Operons wurden zuerst im Jahre 1961 beschrieben. Bis heute ist bekannt, dass die prokaryotischen Domänen Bacteria und Archaea Gene sowohl in monocistronischen als auch in bi- oder polycistronischen Transkripten exprimieren können. Häufig überlappen Gene sogar in ihren Sequenzen. Diese überlappenden Genpaare stehen nicht in Korrelation mit der Kompaktheit ihres Genoms. Das führt zu der Annahme, dass eine Art der Regulation vorliegt, welche weitere Proteine oder Gene nicht benötigt. Diese könnte eine gekoppelte Translation sein. Das bedeutet die Translation des stromabwärts-liegenden Gens ist abhängig von der Translation eines stromaufwärts-liegenden Gens. Diese Abhängigkeit kann zum Beispiel durch lang reichende Sekundärstrukturen entstehen, bei welchen Ribosomenbindestellen (RBS) des stromabwärts-liegenden Gens blockiert sind. Die de novo-Initiation am stromabwärts-liegenden Gen kann nur stattfinden, wenn das erste Gen translatiert wird und dabei die Sekundärstruktur an der RBS aufgeschmolzen wird. Für Genpaare in E. coli ist dieser Mechanismus gut untersucht. Ein anderes Beispiel für die Translationskopplung ist die Termination-Reinitiation, bei welcher ein Ribosom das erste Gen translatiert bis zum Stop-Codon, dort terminiert und direkt am stromabwärts-liegenden Start-Codon reinitiiert. Der Mechanismus via Termination-Reinitiation ist bis jetzt nur für eukaryontische Viren beschrieben worden. Im Gegensatz zu einer Kopplung über Sekundärstrukturen kommt es bei der Termination-Reinitiation am stromabwärts-liegenden Gen nicht zu einer de novo-Initiation sondern eine Reinitiation des Ribosoms findet statt. Diese Arbeit analysiert jene Art der Translationskopplung an Genen polycistronischer mRNAs in jeweils einem Modellorganismus als Vertreter der Archaea (Haloferax volcanii) und Bacteria (Escherichia coli). Hierfür wurden Reportergenvektoren erstellt, welche die überlappenden Genpaare an Reportergene fusionierten. Für diese Reportergene ist es möglich die Transkriptmenge zu quantifizieren sowie für die exprimierten Proteine Enzymassays durchgeführt werden können. Aus beiden Werten können Translationseffizienzen berechnet werden indem jeweils die Enzymaktivität pro Transkriptmenge ermittelt wird. Durch ein prämatures Stop-Codon in diesen Konstrukten ist es möglich zu unterscheiden ob es für die Translation des zweiten Gens essentiell ist, dass das Ribosom den Überlapp erreicht. Hiermit konnte für neun Genpaare in H. volcanii und vier Genpaare in E. coli gezeigt werden, dass eine Art der Kopplung stattfindet bei der es sich um eine Termination-Reinitiation handelt. Des Weiteren wurde analysiert, welche Auswirkungen intragene Shine-Dalgarno Sequenzen bei dem Event der Translationskopplung besitzen. Durch die Mutation solcher Motive und dem Vergleich der Translationseffizienzen der Konstrukte, mit und ohne einer SD Sequenz, wird für alle analysierten Genpaare beider Modellorganismen gezeigt, dass die SD Sequenz einen Einfluss auf diese Art der Kopplung hat. Zwischen den Genpaaren ist dieser Einfluss jedoch stark variabel. Weiterhin wurde der maximale Abstand zwischen zwei bicistronischen Genen untersucht, für welchen Translationskopplung via Termination-Reinitiation noch stattfinden kann. Hierfür wird durch site-directed mutagenesis jeweils ein prämatures Stop-Codon im stromaufwärts-liegenden Gen eingebracht, welches den intergenen Abstand zwischen den Genen in den jeweiligen Konstrukten vergrößert. Der Vergleich aller Konstrukte eines Genpaars zeigt in beiden Modellorganismen, dass die Termination-Reinitiation vom intergenen Abstand abhängig ist und die Translationseffizienz des stromabwärts-liegenden Reporters bereits ab 15 Nukleotiden Abstand abnimmt.
Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit war es, den genauen Mechanismus der Termination-Reinitiation zu analysieren. Für Ribosomen gibt es an der mRNA nach der Termination der Translation zwei Möglichkeiten: Entweder als 70S Ribosom bestehen zu bleiben und ein weiteres Start-Codon auf der mRNA zu suchen oder in seine beiden Untereinheiten zu dissoziieren, während die 50S Untereinheit die mRNA verlässt und die 30S Untereinheit über Wechselwirkungen an der mRNA verbleiben kann. Um diesen Mechanismus auf molekularer Ebene zu untersuchen, wird ein Versuchsablauf vorgestellt. Dieser ermöglicht das Event bei der Termination-Reinitiation in vitro zu analysieren. Eine Unterscheidung von 30S oder 70S Ribosomen bei der Reinitiation der Translation des stromabwärts-liegenden Gens wird ermöglicht. Die Idee dabei basiert auf einem ribosome display, bei welchem Translationskomplexe am Ende der Translation nicht in ihre Bestandteile zerfallen können, da die eingesetzte mRNA kein Stop-Codon enthält Der genaue Versuchsablauf, die benötigten Bestandteile sowie proof-of-principal Versuche sind in der Arbeit dargestellt und mögliche Optimierungen werden diskutiert.
This thesis investigates the structure of research articles in the field of Computational Linguistics with the goal of establishing that a set of distinctive linguistic features is associated with each section type. The empirical results of the study are derived from the quantitative and qualitative evaluation of research articles from the ACL Anthology Corpus. More than 20,000 articles were analyzed for the purpose of retrieving the target section types and extracting the predefined set of linguistic features from them. Approximately 1,100 articles were found to contain all of the following five section types: abstract, introduction, related work, discussion, and conclusion. These were chosen for the purpose of comparing the frequency of occurrence of the linguistic features across the section types. Making use of frameworks for Natural Language Processing, the Stanford CoreNLP Module, and the Python library SpaCy, as well as scripts created by the author, the frequency scores of the features were retrieved and analyzed with state-of-the-art statistical techniques.
The results show that each section type possesses an individual profile of linguistic features which are associated with it more or less strongly. These section-feature associations are shown to be derivable from the hypothesized purpose of each section type.
Overall, the findings reported in this thesis provide insights into the writing strategies that authors employ so that the overall goal of the research paper is achieved.
The results of the thesis can find implementation in new state-of-the-art applications that assist academic writing and its evaluation in a way that provides the user with a more sophisticated, empirically based feedback on the relationship between linguistic mechanisms and text type. In addition, the potential of the identification of text-type specific linguistic characteristics (a text-feature mapping) can contribute to the development of more robust language-based models for disinformation detection.
Thermoanaerobacter kivui ist ein thermophiles acetogenes Bakterium, das chemolithoautotroph auf CO2 unter Verwendung von molekularem H2 als Elektronendonor wächst und Acetat als Produkt über den Wood-Ljungdahl-Weg (WLP) bildet. Im WLP werden 2 Mol CO2 reduziert, um ein Mol Acetyl-CoA zu bilden. Erste Studien wurden durchgeführt, um die Physiologie von T. kivui zu verstehen. T. kivui wächst autotroph auf H2 + CO2 und nach Adaptation auch auf CO oder Syngas. T. kivui wächst ebenfalls auch in Minimalmedium ohne weitere Zugabe von Vitaminen, was es zu einem Biokatalysator mit hohem Potenzial für die Produktion von Chemikalien mit hohem Mehrwert macht. Heterotroph wächst T. kivui auf Glucose, Fructose, Mannose, Pyruvat oder Formiat. Kürzlich wurde beschrieben, dass T. kivui in der Lage ist, auf dem Zuckeralkohol Mannitol in Gegenwart und Abwesenheit von HCO3- (oder externem CO2) zu wachsen. Allerdings war das Wachstum in Abwesenheit von externem CO2 deutlich verlangsamt. Daher wurde in dieser Studie getestet, ob eine Zugabe von externem Formiat das "fehlende" CO2 kompensieren kann. In Kombination mit Formiat wurde das Wachstum auf Mannitol in CO2 und HCO3- freien definierten Medien bis zu einer maximalen OD600 von 2,34 und mit einer Verdopplungszeit von 2,0 ± 0,0 stimuliert, was dem Wachstumsverhalten auf Mannitol in Anwesenheit von CO2/HCO3- entsprach. In Abwesenheit von Formiat (oder CO2) erreichte T. kivui nur eine endgültige optische Dichte von bis zu 0,7 mit einer verlängerten Verdoppelungszeit von 5,2 ± 0,2 Stunden. Dieses Experiment zeigte die höhe metabolische Flexibilität von T. kivui durch die Nutzung von Formiat als Elektronenakzeptor, wenn kein oder nur wenig CO2 vorhanden ist.
Genomanalysen ergaben, dass T. kivui ein Trehalose- und Maltose-Transportsystem-Permeaseprotein (MalF) besitzt. Darüber hinaus verfügt T. kivui über Trehalose- und Maltosehydrolase-Gene, die als Kojibiose-Phosphorylase annotiert sind. Obwohl in der Originalveröffentlichung beschrieben wurde, dass der Organismus nicht auf Maltose oder Trehalose wachsen kann, konnte T. kivui im Laufe dieser Arbeit an das Wachstum auf Maltose und Trehalose adaptiert werden. Nach dem Transfer von einer Glukose-Vorkultur auf ein Medium mit 25 mM Maltose oder 25 mM Trehalose als alleinige C-Quelle wurde kein Wachstum erzielt. Bei Verwendung der gleichen Vorkultur in einem Medium mit höherer Konzentration (50 mM) Maltose oder Trehalose, begannen die Zellen zu wachsen. Bei Verwendung dieser adaptierten kulturen als Vorkultur wuchsen die Zellen in Gegenwart von in 25 mM Maltose oder Trehalose bis zu einer maximalen OD600 von 1,12 bzw. 0,73. Die Adaptation hing mit der Tatsache zusammen, dass der Organismus eine höhere Konzentration benötigt, um sich an diese Kohlenstoffquellen zu gewöhnen. Durch diese Daten wird das heterotrophe Potenzial von T. kivui erhöht.
Um die Bedeutung der wasserstoffabhängigen Kohlendioxidreduktase (HDCR) während des Wachstums auf Formiat oder auf H2 + CO2 im Stoffwechsel von T. kivui zu verstehen, wurden Studien auf molekularer Ebene durchgeführt. Die HDCR nutzt H2 direkt für die Reduktion von CO2 zu Formiat im ersten Schritt des Wood-Ljungdahl-Wegs (WLP). Um die Rolle der HDCR in dieser Reaktion zu untersuchen, wurde das hdcr-Gencluster mit Hilfe des kürzlich entwickelten Mutagenesytems für T. kivui deletiert. In Wachstumstudien konnte anschliessend gezeigt werden, dass die ߡhdcr-Deletionsmutante nicht mehr auf Formiat oder H2 + CO2 als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen konnte. Nach Komplementation der Mutante mit dem hdcr-Gene in cis wuchsen die Kulture wieder auf Formiat oder H2 + CO2. Diese Experimente zeigten, dass die HDCR für das Wachstum auf H2 + CO2 oder Formiat essentiell ist. Interessanterweise konnte in der ߡhdcr-Mutante ebenfalls ein verändertes Wachstum auf Glukose als alleiniger C-Quelle festgestellt werden. Die T. kivui ߡhdcr-Mutante wuchs nur bis zu einer OD600 von 0,2, während der Wildtyp und der hdcr-komplementierte Stamm bis zu einer OD600 von 2,64 bzw. 2,4 wuchsen. Damit wurde bewiesen, dass die HDCR auch für die vollständige Glukoseoxidation in T. kivui erforderlich ist. Durch die Zugabe von Formiat wurde das Wachstum vollständig wiederhergestellt, ähnlich wie beim Wildtyp. Dies belegt wieder die Nutzung Formiat als terminalen Elektronenakzeptor. Auch auf Mannitol oder Pyruvat konnte die Mutanten nur in Gegenwart von Formiat wachsen. Der Substratverbrauch und die Produktbildung der T. kivui ߡhdcr-Mutante wurden in einem Zellsuspensionsexperiment untersucht. Die Zellen verbrauchten Formiat nur in Gegenwart von Glukose und produzierten Acetat mit einem Acetat/Substrat-Verhältnis von etwas mehr als 3,0, während die Acetatproduktion nur 12 mM betrug, wenn Glukose als alleiniges Substrat verwendet wurde. Diese Ergebnisse zeigen eine enge Kopplung der Oxidation von Multikohlenstoffsubstraten an den WLP.
T. kivui ist eines der wenigen Acetogenen, die CO als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen können. ...
Probing the photointermediates of light-driven sodium ion pump KR2 by DNP-enhanced solid-state NMR
(2021)
KR2 is a light-driven sodium ion pump found in marine flavobacterium Krokinobacter Eikastus. The protein belongs to the microbial rhodopsin family, which is characterized by seven transmembrane helices and a retinal cofactor covalently bound to a conserved lysine residue through a Schiff base linkage. Specific features of KR2 and other sodium pumping rhodopsins are the NDQ motif, the N-terminal helix capping the protein at the extracellular side, and the sodium ion bound at the protomer interface in the pentameric structure. The ability to pump sodium ions was a surprising discovery since the positive charge at the Schiff base was long thought to hinder the transport of non-proton cations and the Grotthuss mechanism could not be applied to explain the Na+ transport. The photocycle of KR2 revealed by flashed photolysis and ultrafast femtosecond absorption spectroscopy consists of consecutive intermediates, named K, L, M, and O.
Here, DNP-enhanced ssNMR was used to analyze various aspects of these intermediate states. The K/L-state can be generated and trapped by in-situ illumination inside the magnet at 110 K. The trapping of L-state together with the K-state at this temperature is unexpected as this usually leads to the trapping of only K-state in bacteriorhodopsin (BR), proteorhodopsin (PR), and channelrhodopsin 2 (ChR2). This observation suggests a lower energy barrier between K- and L-state in KR2. For the O-state, the intermediate was generated by illuminating outside the magnet, followed by rapid freezing in liquid nitrogen and transfer to the magnet. Based on these procedures, the retinal conformation, and the electrostatic environment at the Schiff base in KR2 dark, K-, L- and O-intermediates were probed using 13C-labeled retinals bound to 15N-labeled KR2 by both 1D and 2D magic angle spinning (MAS) NMR experiments.
The obtained data show an all-trans retinal conformation with the distortion of 150° at H-C14-C15-H in the dark state whereas the retinal has a 13-cis, 15-anti conformation in the K- and L-state after light activation. Differences between K- and L-intermediates were observed. The retinal chemical shifts of the K-state show a large deviation from the model compound behavior between the middle and end part of the polyene chain. In the L-state, these differences are much less pronounced. These observations indicate that the light energy stored in the K-state dissipates into the protein in the subsequent photointermediate states. Furthermore, an additional shielding observed for C14 in L-state indicates the slight rotation toward a more compact 13-cis, 15-syn conformation. The distortion of the H-C14-C15-H angle in the L-state (136°) is larger than in the dark state. This twist of the retinal in the L-state would play an important role in lowering the pKa of the Schiff base, which is a prerequisite for the proton transfer from the Schiff base to the proton acceptor (D116). The electrostatic environments at the Schiff base in K- and L-states cause a de-shielding of the 15N nitrogen compared to the dark state. This indicates a stepwise stronger interaction with the counterion as the Schiff base proton moves away from the Schiff base and comes closer to the D116 in the transition from K- to L-state and approaches the proton transfer step during the M-state formation. In the O-state, the retinal was found to be in the all-trans conformation but differed to the dark state in the C13, C20, and Schiff base nitrogen chemical shifts. The largest effect (9 ppm) was observed for the Schiff base nitrogen, which could be explained by the effect of the positive charge of bound Na+ near the Schiff base in the O-state, coordinated by N112 and D116 as observed in the O-state crystal structure in the pentameric form.
The structural change at the opsin followed the retinal isomerization and the energy transfer from the chromophore to the surrounding were also investigated in this thesis using various amino acids labeling schemes. Moreover, 1H-13C hNOE in combination with CE-DNP was applied to probe the dynamics of retinylidene methyl groups and 23Na MAS NMR was employed to detect the bound sodium ion at the protomer interface in KR2 dark state.
Einflüsse epigenetischer Mechanismen auf die Gefäßtonusregulation sind bisher kaum untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung bekannter epigenetischer Modifikatoren in der Gefäßtonuskontrolle aufzuzeigen und molekulare Mechanismen zu identifizieren. Hierzu wurden Vasoreaktivitätsstudien an Mausgefäßen im Organbad durchgeführt und molekularbiologische Methoden eingesetzt. Verwendet wurde ein Mausstamm mit induzierbarem Knockout der Histondemethylase JARID1B (KDM5B) sowie verschiedene Inhibitoren von Histonmethylasen und -demethylasen.
Mittlerweile sind eine Vielzahl an Inhibitoren epigenetischer Modifikatoren kommerziell erhältlich. Getestet wurde u.a. der Wirkstoff GSK343, welcher spezifisch die Funktion der H3K27me3-Methyltransferase Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2) inhibiert. Bekannt ist eine Beteiligung von EZH2 in der Carcinogenese und Zellzykluskontrolle. Unter basalen Bedingungen sowie deutlich verstärkt nach mehrstündiger Inkubation mit murinem Lipopolysaccharid (mLPS) zeigte sich eine verzögerte Phenylephrin-induzierte Kontraktion von Präparaten der murinen Aorta thoracica. Da unter inflammatorischen Bedingungen die induzierbare NO-Synthase iNOS stark induziert wird, wurde die Hypothese formuliert, dass eine höhere Bioverfügbarkeit von NO ursächlich für diese Beobachtung ist. NO ist ein potenter Vasodilator und wird im Gefäßendothel produziert. Organbadversuche mit Inhibitoren der iNOS und eNOS konnten jedoch keine Differenzen in der NO-Bioverfügbarkeit zeigen, weder vor noch nach Stimulation mit mLPS. Über schrittweise Depolarisation durch K+-Ionen konnte eine Beeinträchtigung des kontraktilen Apparats der glatten Gefäßmuskelzellen ausgeschlossen werden. Auch die Thromboxan-induzierte Kontraktion, ausgelöst durch das Thromboxan-Analogon U46619, war nicht beeinflusst. Inhibition von EZH2 unter inflammatorischen Bedingungen, wie beispielsweise in der Sepsis, scheint einer Gefäßdysfunktion vorzubeugen. Dies geschieht unabhängig von der NO-Bioverfügbarkeit und ohne Beeinträchtigung der Kontraktilität der glatten Gefäßmuskelzellen sowie der Thromboxan-induzierten Gefäßkontraktion. Es ergibt sich die Hypothese, dass EZH2 nicht in die eigentliche Gefäßtonuskontrolle, sondern in der Transduktion inflammatorischer Signale involviert ist und damit in der Entstehung einer Gefäßdysfunktion. Diese Annahme sollte weiter untersucht werden, da sich durch Inhibition von EZH2 eine mögliche Therapieoption in der Sepsis bietet. Neuste Publikationen bestätigen eine Rolle von EZH2 in der inflammatorischen Signalkaskade.
Die H3K4me3-Histondemethylase JARID1B wird in Gefäßendothelzellen stark exprimiert, bekannt sind eine Rolle in der Embryogenese, Cancerogenese sowie Angiogenese. Die Arteria mesenterica superior der Tamoxifen-induzierbaren globalen Jarid1b-Knockout Maus zeigte eine verstärkte Acetylcholin-induzierte Vasorelaxation. Diese Beobachtung konnte durch Behandlung von Wildtyp- Arterienpräparaten mit dem JARID1B-Inhibitor 2‐4(4‐methylphenyl)‐1,2‐Benziso-thiazol‐3(2H)‐on (PBIT) reproduziert werden. Ein spezifischer Knockout von Jarid1b in Makrophagen zeigte keinen vergleichbaren Phänotyp. Untersucht wurde auch hier die Hypothese, dass Veränderungen der NO-Bioverfügbarkeit Ursache des beobachteten Phänotyps sind. Unterschiede in der NO-Bioverfügbarkeit, der Expression oder des Aktivierungsgrades der eNOS konnten in Versuchen mit Inhibitoren der Synthasen sowie mittels Proteinisolation nicht festgestellt werden. Neben NO wirken Metabolite der Arachidonsäure als Vasorelaxantien. Die Inkubation mit Arachidonsäure im Organbad ergab zunächst keine Unterschiede im Relaxationsverhalten zwischen Knockout- und Wildtypgefäßen. Zur weiteren Untersuchung der Hypothese veränderter Prostanoid-Signalwege sind weitere Studien notwendig. Nach Abschluss der Arbeit konnte gezeigt werden, dass der JARID1B-Knockout die lösliche Epoxid-Hydroxylase (sEH) destabilisiert und damit über verminderten Abbau von Epoxyeicosatriensäuren (EETs) relaxierend und unter Angiotensin II-Einfluss gefäßprotektiv wirkt.
Modifikationen der epigenetischen Regulation in Gefäßzellen wirken sich auf die Gefäßtonusregulation aus. Die Experimente in dieser Arbeit zeigen, dass dies abseits der häufigsten vasoaktiven Autacoid-Signalwege und unter bestimmten Voraussetzungen stattfinden kann. Epigenetische Regulation ermöglicht es, die Gefäßtonuskontrolle den Umgebungsbedingungen anzupassen und spielt in der Pathophysiologie von Gefäßerkrankungen eine entscheidende Rolle.
In this thesis, we characterized megasynthases such as fatty acid synthases (FASs) and polyketide synthases. The obtained insights into structure and function were used to engineer such systems to produce new-to-nature compounds.
The in vitro characterization of megasynthases requires reproducible access to these enzymes in high quality. Therefore, we established purification strategies for the yeast FAS and the methylsalicylic acid synthase (MSAS) from Saccharopolyspora erythraea (SerMSAS) and applied the latter one on MSAS from Penicillium patulum (PenPaMSAS) and on 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS) module 6. With the purified samples, we were able to obtain initial structural data for SerMSAS and solve the complete structure of the yeast FAS (PDB: 6TA1). On the example of the yeast FAS, we could show that the sample can suffer from adsorption to the water-air interface during the grid preparation for electron microscopy and presented how the use of graphene-based grids can overcome this problem. The combined structural and functional analysis of the yeast FAS showed that the structural domains trimerization module and dimerization module 2 are not essential for the assembly of the whole system. Therefore, they can potentially be used for domain exchange approaches. The in-depth functional analysis of SerMSAS revealed that not SerMSAS itself releases the product, but a 3-oxoacyl-(acyl-carrier protein) synthase like enzyme within the gene cluster transfers 6-methyl salicylic acid from SerMSAS to another carrier protein for subsequent modifications. In contrast, we showed that PenPaMSAS can release its product by hydrolysis and that non-native substrates can be incorporated although at significantly slower turnover rates compared to the native starter substrate. Our further investigation demonstrated that the substrate specificity of the acyltransferase (AT) is a critical factor for the incorporation of non-native substrates.
With the insight from the functional and structural characterization, we engineered megasynthases for the biosynthesis of natural product derivatives. We targeted the AT of PenPaMSAS for active site mutagenesis and discovered a mutant which can transfer non-native substrates significantly faster (~200-300%). Additionally, the malonyl/acetyl transferase (MAT) of the mammalian FAS was used as a promising target for protein engineering because of its previously reported properties including polyspecificity, fast transfer kinetics, robustness, and plasticity. We showed that the MAT can transfer fluorinated substrates and accept the acyl carrier protein of DEBS module 6. By exchanging the substrate specific AT of DEBS with the polyspecific MAT of the mammalian FAS, we demonstrated an efficient DEBS/FAS hybrid and an optimal truncation site for the applied ATs. In contrast to the wild type system, the DEBS/FAS enzyme was able to synthesize demethylated and fluorinated derivatives. The production and purification of a fluoro-methyl-disubstituted polyketide was of particular interest, as it has a high potential for the generation of new drugs and shows the potential of protein engineering. Furthermore, the incorporation of the disubstituted substrate had important implication in the mechanistic details of the ketosynthase-mediated C-C bond formation.
Aktive Hörimplantate befinden sich seit Mitte der 1980er Jahre im klinischen Einsatz. Aufgrund der inzwischen sehr hohen Anwendungszahl und durch-schnittlich sehr langen Anwendungsdauer gelten diese als sehr sicher. Dennoch können Komplikation auftreten. Eine Komplikation wurde in der vorliegenden Arbeit als Auftreten eines negativen Ereignisses außerhalb des gewünschten Behandlungsablaufes gewertet.
Ziel dieser Arbeit war es, aufgetretene Komplikationen zu kategorisieren und zu quantifizieren. Ferner sollte untersucht werden, ob bestimmte Faktoren Einfluss auf die Häufigkeit von Komplikationen haben, insbesondere in Bezug auf die verschiedenen Implantat- und Elektrodenträgermodelle. Es wurden neben der Erfassung und Quantifizierung unerwünschter Ereignisse vier Hypothesen for-muliert, die sich aus der klinischen Erfahrung der Anwendung der Systeme ergaben: (H1) Kinder entwickeln nach Cochlea-Implantation häufiger Entzün-dungen. (H2) Implantatmodelle mit Magnettasche führen häufiger zu Infektio-nen. (H3) Perimodiolare Elektrodenträger führen häufiger zu „Tip fold-over“ (Umschlagen der Elektrodenträgerspitze). (H4) Gerade Elektrodenträger führen häufiger zu Elektrodenträgerdislokation.
In dieser Arbeit wurden alle von Januar 2006 bis Dezember 2016 im Universi-tätsklinikum Frankfurt mit aktiven Hörimplantaten versorgten Patienten einge-schlossen. Unter den 1274 Patienten befanden sich 583 Patienten, bei denen mindestens eine Komplikation auftrat. Hiervon machten den Großteil Schmer-zen (16,9 %), Drehschwindel (15,6 %) und Infektionen im Verlauf (8,3 %) aus.
Es wurde aus dem Datenmaterial eine Patientengruppe von 503 betroffenen Patienten gebildet, die nach der Operation erstmals eine Komplikation angaben. In dieser Kohorte „Erstereignis“ traten Komplikationen vor allem in den Bereichen Entzündung (281 Patienten), Hören (183 Patienten) und Gleichgewicht (158 Patienten) auf. Bei den unilateral versorgten Patienten dieser Kohorte zeigte sich das erste Ereignis durchschnittlich nach 5,64 Jahren, bei den beid-seitig Operierten trat das erste Ereignis durchschnittlich nach 7,35 Jahren auf.
Die Implantatmodelle wichen im Auftreten von Komplikationen voneinander ab: Die höchsten Komplikationsraten traten bei den Modellen HiRes90K mit 37 von 81 (45,7 %), Synchrony mit 62 von 140 (44,3 %), und Nucleus 5 mit 115 von 274 (42,0 %) auf. Die Elektrodenträgerbauformen wiesen signifikante (p < 0,001) Unterschiede untereinander auf: Die meisten Komplikationen traten bei den Elektrodenträgerbauarten Medium (75 %), Midscala (58,8 %), Slim Modi-olar (54,3 %), und Straight (52,1 %) auf. Eine Infektion trat besonders bei den Implantaten Synchrony (1,34 Jahre) und Clarion (1,57 Jahre) früh auf. Die Modelle Pulsar (7,51 Jahre) und CI24RE (6,13 Jahre) zeigten ein eher spätes Auftreten. Für das Auftreten einer Infektion der Implantatmodelle lag p unter 0,001, was für signifikante Unterschiede bezüglich des Zeitpunktes des Auftretens spricht. Die Elektrodenträgerbauart zeigte in Bezug auf eine Hörbeeinträchtigung und in Bezug auf das Auftreten einer Elektrodenträger bezogenen Komplikation, wie Tip fold-over, Migration oder inkomplette Insertion hoch signifikante (p < 0,001) Unterschiede. Elektrodenträgerbauformen wie Midscala, Straight und Slim Modiolar führten früh nach durchschnittlich einem (Slim Modiolar) bis 2,5 (Straight) Jahren zum ersten Auftreten von einem veränderten Höreindruck nach CI-Implantation. Etwas häufiger traten Probleme mit dem Elektrodenträger wie Tip fold-over, Migration oder inkomplette Insertion bei den Modellen Flex Soft und Helix auf, am häufigsten bei dem Modell Flex 24.
(H1) Bei Kindern traten signifikant (p < 0.001) häufiger implantatbezogene Entzündungen auf als bei Erwachsenen. In der Gruppe „Erstereignis“ hatten 66,0 % der Kinder und 23,7 % der Erwachsenen eine Entzündung. (H2) Das Vor-handensein einer Magnettasche an der Implantat-Empfänger-Spule führte nicht signifikant häufiger zum Auftreten einer Entzündung. (H3) Vorgekrümmte (engl. pre-curved) Elektrodenträger zeigten eine höhere Inzidenz für Tip fold-over als gerade Elektrodenträger. (H4) Gerade Elektrodenträger zeigten eine höhere Inzidenz für eine Migration des Elektrodenträgers. Insgesamt traten im betrach-teten Kollektiv „Erstereignis“ 11 Migrationen auf, 10 davon bei geraden Elektro-denträgern (p = 0,03).
Insgesamt führen Faktoren wie die Implantatmodelle, Elektrodenträgerbauformen, Alter des Patienten früher zum Auftreten von Komplikationen. Für zukünftige Studien wäre eine eigene Auswertung der noch relativ neuen (2012) Mittelohrimplantate interessant.
Um Wissen in einer Form abzulegen, in der es automatisiert verarbeitet werden kann, werden unter anderem Ontologien verwendet. Ontologien erlauben über einen als Inferenz bezeichneten Prozess die Ableitung neuen Wissens. Bei inhaltlichen Überschneidungen werden Ontologien über Ontologie-Alignments miteinander verbunden, die Entitäten aus den verschiedenen Ontologien in Beziehung zueinander setzen. Üblicherweise werden diese Alignments als Mengen von Äquivalenzen formuliert, die beschreiben, welche Konzepte aus einer Ontologie Konzepten aus einer anderen Ontologie entsprechen. Ebenfalls verbreitet sind Ober- und Unterklassenbeziehungen in Alignments.
Diese Ontologie-Alignments werden zum Beispiel in der Biomedizin in Forschungsdatenbanken verwendet, da durch Alignments Informationen aus verschiedenen Bereichen zusammengeführt werden können. Der manuelle Aufwand, um große Ontologien und Alignments zu erstellen, ist sehr hoch. Dementsprechend wäre es wünschenswert, bei einer Veränderung von Ontologien nicht wieder von vorne beginnen und eine neue Ontologie erstellen zu müssen und möglichst viel aus der veränderten Ontologie und den die Ontologie betreffenden Alignments wiederverwenden zu können. Daher sollten möglichst automatisierte Verfahren verwendet werden. Diese Arbeit untersucht vier Ansätze, um die Anpassung von Alignments an Veränderungen in Ontologien zu automatisieren.
Der erste Ansatz bezieht Inferenzen in den Prozess zur Vorhersage von Alignment-Änderungen mit ein. Dazu werden die Inferenzen vor und nach der Änderung der Ontologien berechnet und auf Basis der Unterschiede mit einem regelbasierten Algorithmus bestimmt, wie sich das Alignment ändern soll. Der zweite Ansatz, wie auch die weiteren Ansätze, hat nicht zum Ziel das Alignment direkt anzupassen. Stattdessen soll vorhergesagt werden, welche Teile des Alignments angepasst werden müssen. Dazu werden die Ontologien und das Alignment als Wissensgraph-Embeddings repräsentiert. Diese Embeddings bilden Knoten aus den Ontologien in einen Raum mit 300-1000 Dimensionen so ab, dass in dem Raum auch die Beziehungen zwischen den Entitäten der Ontologien repräsentiert werden können. Diese Embeddings werden dann verwendet, um verschiedene Klassifikationsalgorithmen zu trainieren. Auf diese Weise wird vorhergesagt, welche Teile des Alignments sich verändern werden. Der dritte Ansatz verbindet Embeddings mit einem Veränderungsmodell. Das Veränderungsmodell kategorisiert die an den Ontologien vorgenommenen Veränderungen. Auf diese Kategorisierung und das Embedding werden dann Klassifikationsalgorithmen angewandt. Der vierte Ansatz verwendet eine speziell auf Wissensgraphen ausgerichtete Architektur für neuronale Netze, sogenannte Graph Convolutional Networks, um Veränderungen an Alignments vorher zu sagen.
Diese Ansätze werden auf ihre jeweiligen Vor- und Nachteile untersucht. Dazu werden die Verfahren an zwei Anwendungsfällen untersucht. Der Ansatz zur regelbasierten Einbeziehung von Inferenzen wird anhand eines Anwendungsbeispiels aus dem Bereich der Interweaving Systems betrachtet. In dem Beispiel wird eine allgemeine Methode für Interweaving Systems angewandt um das Selbstmanagement von Ampelsteuerungen zu ermöglichen. Die auf maschinellem Lernen aufbauenden Ansätze werden auf einem Auszug aus der biomedizinischen Forschungsdatenbank UMLS evaluiert.
Dabei konnte festgestellt werden, dass die betrachteten Ansätze grundsätzlich zur Anpassung von Alignments an Ontologie-Veränderungen eingesetzt werden können. Der Ansatz zur regelbasierten Einbeziehung von Inferenzen kann dabei vor allem auf sehr kleinen Datensätzen eingesetzt werden, bei denen alle Gesetzmäßigkeiten der Veränderungen grundsätzlich bekannt sind. Diese Anwendbarkeit ergibt sich aus dem Entwurf der Problemstellung für den ersten Ansatz. Die auf maschinellem Lernen aufbauenden Ansätze eignen sich besonders für große Datensätze und bieten den Vorteil, dass auch ohne ein vollständiges Verständnis des Veränderungsprozesses Vorhersagen getroffen werden können.
Unter den Ansätzen, die maschinelles Lernen einsetzen, zeigte die Einbeziehung von Veränderungsmodellen keine Vorteile gegenüber den anderen Ansätzen. Auf einem etwas
kleineren Datensatz waren die Ergebnisse des Embedding-basierten Ansatzes und der Relational Graph Convolutional Networks vergleichbar, während auf einem größeren Datensatz
die Graph Convolutional Networks etwas bessere Ergebnisse erreichen konnten.
Weitere Ergebnisse dieser Arbeit stellen eine Formalisierung der Problemstellung der Anpassung von Ontologie-Alignments an Veränderungen sowie eine formale Darstellung der Ansätze dar. Ein weiterer Beitrag der Arbeit ist die Vorstellung eines Anwendungsfalls aus dem Bereich der Interweaving Systems für Ontologie-Alignments. Außerdem wurde das Problem der Anpassung von Alignments an Veränderungen so formuliert, dass es mithilfe von
maschinellem Lernen betrachtet werden kann.
In dieser Arbeit wird sowohl das Potenzial von molekularen Photoschaltern als lichtempfindliche Komponenten für photopharmakologische Anwendungen als auch das von künstlichen RNA-Aptameren als regulatorische Schalteinheiten für die Entwicklung von funktionellen Riboschaltern untersucht. Verschiedene wesentliche Aspekte beider Anwendungs-felder wurden eingehend einzeln untersucht und die beiden Schaltsysteme schließlich durch das Design eines synthetischen RNA-Aptamers kombiniert, dessen Ligandbindung durch licht-induzierte Isomerisierung seines Photoschalterliganden reguliert werden kann.
Molekulare Photoschalter wie Azobenzole und Spiropyrane haben sich als vielversprechende photochemische Werkzeuge erwiesen, um lichtgesteuert reversible und biochemisch nutzbare Effekte erzeugen. Spiropyrane bergen aufgrund der drastischen Veränderungen ihrer molekularen Eigenschaften infolge der Photoisomerisierung zum Merocyanin (MC) ein enormes Anwendungs-potenzial. Von den hier untersuchten wasserlöslichen Pyridin- (Py-) und Nitro-BIPS-Derivaten zeigt insbesondere die Py-BIPS-Verbindung 2 ein außerordentlich vielseitiges Verhalten. Im Vergleich zu anderen Vertretern dieser Photoschalterklasse wird ein deutlich höherer MC-Anteil von etwa 50% thermisch innerhalb von wenigen Minuten akkumuliert. Durch lichtinduzierten Ringschluss zum reinen Spiropyran (SP) und thermische Wiederherstellung des Gleichgewichts, kann diese hohe Schaltamplitude über mehrere Zyklen ohne signifikante Zersetzung beibehalten werden. Der Einsatz von schädlichem UV-Licht kann somit vermieden werden, was zusätzlich sehr vorteilhaft für einen möglichen Einsatz in einem biochemischen Kontext ist.
Verbindung 2 weist zudem mehrere Protonierungsstellen auf, die ihr in Abhängigkeit des pH-Wertes faszinierende photosaure Eigenschaften verleihen. Das einfach protonierte HMC Isomer ermöglicht eine lichtstimulierte reversible Kontrolle des pH-Wertes in einem Bereich von etwa 4,5 bis 7,5, mit möglichen pH-Sprüngen von bis zu 1,5 Einheiten. Durch transiente Absorptionsstudien wurde ein Mechanismus für die Protonenfreisetzung nachgewiesen, der lediglich auf der Veränderung des pKs-Wertes der N-protischen Position infolge des lichtinduzierten Ringschlusses beruht. Im Gegensatz dazu wird das phenolische Proton des doppelt protonierten HMCH Isomers innerhalb von 1-2 Pikosekunden nach Anregung aus dem angeregten Zustand an das Lösemittel übertragen. Durch eingehende Ultrakurzzeitmessungen der Freisetzung des phenolischen Protons, konnten die protonierten Spezies der Py- und Nitro-Merocyanine als Superphotosäuren etabliert werden. Sie können somit als ultraschnelle Auslöser für protonenvermittelte Prozesse eingesetzt werden, die zu den fundamentalsten Reaktionen in der Natur gehören.
Was potenzielle pharmakologische Zielsysteme betrifft, so dürfte RNA eine große Zukunft bevorstehen, da sie einfach zu synthetisieren ist und Zugang zu verschiedenen Ebenen zellulärer Regulationsmechanismen bietet. Insbesondere RNA-Aptamere, die in der Lage sind, niedermolekulare Liganden mit außergewöhnlich hoher Affinität und Spezifität zu binden, sind für die Entwicklung von künstlichen Riboschaltern hoch interessant. Während künstliche Aptamere für beliebige Liganden durch einen in vitro Selektionsprozess generiert werden können, ist nicht zur Gänze geklärt warum nur wenige von ihnen als aktive in vivo Riboschalter funktionieren. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen die Bedeutung der konformationellen Aptamerdynamik während der Ligandenbindung für das Regulationspotential. Die Mg2+-abhängigen Bindungsstudien des hochfunktionellen Tetrazyklin (TC) -Aptamers zeigen, dass zweiwertige Kationen nicht nur für die korrekte Vorfaltung des Aptamers wichtig sind, sondern auch an der Ligandenbindung und RNA-Strukturanpassung selbst beteiligt sein können. Nach der Assoziation von TC an die Bindungstasche pflanzt sich eine Konformationsanpassung zur entfernten Dreifachhelixregion fort, wo Mg2+ zusätzlich für die Ausbildung endgültig gebundenen Zustandes benötigt wird.
Neben dem Einfluss von Mg2+, zeigen zeitaufgelöste Ligandenbindungsstudien von drei Ciprofloxacin (CFX) -Aptameren eine klare Korrelation zwischen der Kinetik des Struktur-anpassungsschrittes der RNA an den Liganden und dem beobachteten Regulationspotenzial in parallel durchgeführten in vivo Assays. Es wird geschlussfolgert, dass eine beschleunigte und irreversible RNA-Anpassung auf eine Konformationsänderung hindeutet, die ausgeprägt genug ist, um eine Aktivität als Riboschalter zu ermöglichen. Diese Erkenntnisse werden durch die berichteten Ligandenbindungskinetiken von anderen künstlichen Aptameren und auch von natürlichen Riboschaltern bestätigt und sollten weitreichende Implikationen für die Optimierung von Selektionsprotokollen für funktionelle Aptamere haben.
Schließlich wird ein lichtempfindliches RNA-Aptamer vorgestellt, dessen Ligand auf dem Antibiotikum Chloramphenicol (Cm) basiert, welches synthetisch mit einem Azobenzolfragment versehen wurde (azoCm). Durch systematische Optimierung von in vitro Selektionsprotokollen und die erfolgreiche Implementierung eines Belichtungsschrittes zur Isomerisierung des Liganden konnten Aptamere erhalten werden, die spezifisch an die trans-Form von azoCm binden. Bindungsaffinitätsstudien bestätigen diese Selektivität und durch Zirkulardichroismusstudien konnte zudem eine lichtinduzierte reversible Dissoziation des von cis-azoCm gezeigt werden. Damit wird hier eine erfolgreiche Entwicklungsstrategie für lichtabhängige RNA-Aptamer – Ligandsysteme dargelegt, welche wiederum fundamental neuartige Ansätze für die Erschließung lichtstimulierter biologischer Regulationswege zugänglich machen.
In the past decades, the use and production of chemicals has been on the rise globally due to increasing industrialization and intensive agriculture; resulting in the occurrence and ecotoxicological risks of chemicals of emerging concern (CECs) in the aquatic compartments. Risks include changes in community structure resulting in the dominance of one species and ecosystem imbalance. When dominant disease-causing organisms are in the environment, the disease transmission is increased. For example, host snails for the schistosomiasis, a human trematode disease, are known to be tolerant to pesticide
exposure compared to the predators. This would therefore result in an increased abundance of snails which consequently increase the disease transmission in the human population.
Kenya, being a low income country faces a lot of challenges with provision of clean water, diseases and sanitation facilities, and increasing population which results in intensive agriculture coupled with pesticide use. Although a lot of research has been carried out on the environmental occurrence and risk of CECs (Chapter 1), most of these studies have been done in developed countries with limited information from Africa. Additionally, research in Africa focused on urban areas with limited number of compounds analyzed and mostly in the water phase, and inadequate information on the effects of CECs on the aquatic organisms. In order to reduce this knowledge gap, this dissertation focused on identification and quantification of CECs present in water, sediment and snails from western Kenya, and the contribution of pesticides to the transmission of schistosomiasis.
Chapter 2 gives a summary of the results and discussion of the dissertation. In Chapter 3, a comprehensive chemical analysis was carried out on 48 water samples to identify compounds, spatial patterns and associated risks for fish, crustacean and algae using toxic unit (TU) approach. A total of 78 compounds were detected with pesticides and biocides being the compounds most frequently detected. Spatial pattern analysis revealed limited compound grouping based on land use. Acute risk for crustaceans and algae were driven by one to three individual compounds. These compounds responsible for toxicity were prioritized as candidate compounds for monitoring and regulation in Kenya.
In Chapter 4, an extension of Chapter 3 was done to cover the CECs present in snails and sediment from the 48 sites. A total of 30 compounds were found in snails and 78 in sediments with 68 additional compounds being found which were not previously detected in water. Higher contaminant concentrations were found in agricultural sites than in areas without anthropogenic activities. The highest acute toxicity (TU 0.99) was determined for crustaceans based on compounds in sediment samples. The risk was driven by diazinon and pirimiphos-methyl. Acute and chronic risks to algae were driven by diuron whereas fish were found to be at low to no acute risk.
In Chapter 5, the effect of pesticide contamination on schistosomiasis transmission was evaluated by applying complimentary laboratory and field studies. In the field studies, the ecological mechanisms through which pesticides and physical chemical parameters affect host snails, predators and competitors were investigated. Pesticide data was obtained from the results in chapter 3. The overall distribution of grazers and predators was not affected by pesticide pollution. However, within the grazers, pesticide pollution increased dominance of host snails. On the contrary, the host-snail competitors were highly sensitive to pesticide exposure. For the laboratory studies, macroinvertebrates including Schistosoma-host snails, competitors and predators were exposed to 6 concentrations levels of imidacloprid and diazinon. Snails showed higher insecticide tolerance compared to competitors and predators. Finally, Chapter 6 summarizes the conclusions of this dissertation, placing it in a broader
context. In this dissertation, a comprehensive chemical characterization and risk assessment of CECs has been carried out in freshwater systems; together with the effects of pesticides on schistosomiasis transmission in rural western Kenya. Results of this dissertation showed that rural areas are contaminated posing a risk to aquatic organisms which contribute to schistosomiasis transmission. This shows the need for regular monitoring and policy formulation to reduce pollutant emissions which contributes negatively to both ecological and human health effects.
In the last two decades, our understanding of human gene regulation has improved tremendously. There are plentiful computational methods which focus on integrative data analysis of humans, and model organisms, like mouse and drosophila. However, these tools are not directly employable by researchers working on non-model organisms to answer fundamental biological, and evolutionary questions. We aimed to develop new tools, and adapt existing software for the analysis of transcriptomic and epigenomic data of one such non-model organism, Paramecium tetraurelia, an unicellular eukaryote. Paramecium contains two diploid (2n) germline micronuclei (MIC) and a polyploid (800n) somatic macronuclei (MAC). The transcriptomic and epigenomic regulatory landscape of the MAC genome, which has 80% protein-coding genes and short intergenic regions, is poorly understood.
We developed a generic automated eukaryotic short interfering RNA (siRNA) analysis tool, called RAPID. Our tool captures diverse siRNA characteristics from small RNA sequencing data and provides easily navigable visualisations. We also introduced a normalisation technique to facilitate comparison of multiple siRNA-based gene knockdown studies. Further, we developed a pipeline to characterise novel genome-wide endogenous short interfering RNAs (endo-siRNAs). In contrary to many organisms, we found that the endo-siRNAs are not acting in cis, to silence their parent mRNA. We also predicted phasing of siRNAs, which are regulated by the RNA interference (RNAi) pathway.
Further, using RAPID, we investigated the aberrations of endo-siRNAs, and their respective transcriptomic alterations caused by an RNAi pathway triggered by feeding small RNAs against a target gene. We find that the small RNA transcriptome is altered, even if a gene unrelated to RNAi pathway is targeted. This is important in the context of investigations of genetically modified organisms (GMOs). We suggest that future studies need to distinguish transcriptomic changes caused by RNAi inducing techniques and actual regulatory changes.
Subsequently, we adapted existing epigenomics analysis tools to conduct the first comprehensive epigenomic characterisation of nucleosome positioning and histone modifications of the Paramecium MAC. We identified well positioned nucleosomes shifted downstream of the transcription start site. GC content seems to dictate, in cis, the positioning of nucleosomes, histone marks (H3K4me3, H3K9ac, and H3K27me3), and Pol II in the AT-rich Paramecium genome. We employed a chromatin state segmentation approach, on nucleosomes and histone marks, which revealed genes with active, repressive, and bivalent chromatin states. Further, we constructed a regulatory association network of all the aforementioned data, using the sparse partial correlation network technique. Our analysis revealed subsets of genes, whose expression is positively associated with H3K27me3, different to the otherwise reported negative association with gene expression in many other organisms.
Further, we developed a Random Forests classifier to predict gene expression using genic (gene length, intron frequency, etc.) and epigenetic features. Our model has a test performance (PR-AUC) of 0.83. Upon evaluating different feature sets, we found that genic features are as predictive, of gene expression, as the epigenetic features. We used Shapley local feature explanation values, to suggest that high H3K4me3, high intron frequency, low gene length, high sRNA, and high GC content are the most important elements for determining gene expression status.
In this thesis, we developed novel tools, and employed several bioinformatics and machine learning methods to characterise the regulatory landscape of the Paramecium’s (epi)genome.
The main aim of this thesis work was to elucidate the catalytic mechanism of several enzyme complexes on the basis of their three-dimensional structure. All investigated enzyme complexes occur in the anaerobic energy metabolism and have an essential function by the challenging degradation of aromatic compounds and the flavin-based electron bifurcation (FBEB)/confurcation, an energy-coupling mechanism. More specifically, I studied the phthaloyl-CoA decarboxylase of Thauera chlorobenzoica (Pcd) involved in phthalate ester decomposition, the FBEB protein complexes lactate dehydrogenase/electron-transfer flavoprotein (Ldh/EtfAB) of Acetobacterium woodii, the heterodisulfide-related subunit HdrA of the sulfur- oxidizing bacteria Hyphomicrobium denitrificans (sHdrA). In addition, I contributed to the structure determination of the caffeyl-CoA reductase- EtfAB complex of A. woodii and the naphthoyl-CoA reductase of the sulfate-respiring enrichment culture N47 (mentioned in the Appendix E and F).
Viele Studien konnten nachweisen, dass die Produktion von cGMP eine entscheidende Funktion im nozizeptiven System einnimmt. Hierbei wurde vor allem die cGMP-Produktion über lösliche Guanylatzyklasen untersucht. Welche Rolle die partikulären Guanlyatzyklasen bei der Entstehung von Schmerzen haben ist weitgehend ungeklärt. Die vorliegende Arbeit zeigte, dass die partikuläre Guanylatzyklase NPR2 stark in DRG-Neuronen exprimiert wird und dort mit cGKI-alpha sowie CRP4 colokalisiert ist. Aktiviert wird NPR2 über den Peptidliganden CNP. Hervorzuheben ist, dass CNP nicht in primär afferenten Neuronen, dafür jedoch vermehrt im Dorsalhorn des Rückenmarks gebildet wird. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten, dass SNS-Npr2-/--Mäuse ein verringertes Schmerzverhalten bei thermischer Stimulation aufwiesen. Während sie im Capsaicin-Test keinen Phänotyp zeigten, wiesen sie in Phase II des Formalin-Modells ein signifikant reduziertes Leckverhalten auf. Diese Ergebnisse liefern Hinweise für eine Beteiligung des CNP/NPR2/cGKI Signalwegs an der Detektion von Hitzeschmerz und an der TRPA1-vermittelten Schmerzantwort. Dabei scheint NPR2 eine pronozizeptive Funktion zu besitzen. CRP4 als Zielprotein scheint hingegen eine antinozizeptive Wirkung zu haben. Zudem kann die Hypothese aufgestellt werden, dass CNP über einen retrograden Transport aus dem Rückenmark die Aktivierung von NPR2 auslösen könnte. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass eine cGMP-abhängige Aktivierung durch NPR2 primär für die Detektion thermischer Reize zuständig ist, während die Literatur Hinweise darauf gibt, dass lösliche Guanylatzyklasen vor allem an inflammatorischen und neuropathischen Prozessen beteiligt sind. Daher scheinen partikuläre und lösliche Guanylatzyklasen unterschiedliche Eigenschaften im nozizeptiven System zu besitzen.
Background: Mastectomy in male transgender patients is an important (and often the first) step toward physical manhood. At our department, mastectomies in transgender patients have been performed for several decades.
Methods: Recorded data were collected and analyzed for all male transgender patients undergoing mastectomy over a period of 24 years at our department.
Results: In total, 268 gender-reassigning mastectomies were performed. Several different mastectomy techniques (areolar incision, n=172; sub-mammary incision, n=96) were used according to patients' habitus and breast features. Corresponding to algorithms presented in the current literature, certain breast qualities were matched with a particular mastectomy technique. Overall, small breasts with marginal ptosis and good skin elasticity allowed small areolar incisions as a method of access for glandular removal. In contrast, large breasts and those with heavy ptosis or poor skin elasticity often required larger incisions for breast amputation. The secondary correction rate (38%) was high for gender reassignment mastectomy, as is also reflected by data in the current literature. Secondary correction frequently involved revision of chest wall recontouring, suggesting inadequate removal of the mammary tissue, as well as scar revision, which may reflect intense traction during wound healing (36%). Secondary corrections were performed more often after using small areolar incision techniques (48%) than after using large sub-mammary incisions (21%).
Conclusions: Choosing the suitable mastectomy technique for each patient requires careful individual evaluation of breast features such as size, degree of ptosis, and skin elasticity in order to maximize patient satisfaction and minimize secondary revisions.
Morbus Parkinson (abgekürzt als PD vom Englischen Parkinson’s disease) ist nach Alzheimer die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Die Hauptmerkmale sind Rigidität und Bradykinesie, sowie Tremor und posturale Instabilität. Im Gehirn lässt sich bei Parkinsonpatienten post mortem ein Verlust an Neuronen in der Substantia nigra feststellen, was zu den ersten beiden Anzeichen führt. Zudem gibt es intrazelluläre Einschlüsse in den betroffenen Nervenzellen – Lewy-Körperchen genannt – die aus Alpha-Synuklein und anderen Proteinen wie Ubiquitin zusammengesetzt sind. Außerdem ist der Eisenmetabolismus in Gehirnen von Parkinsonpatienten gestört und man findet Eisen-Ablagerungen, vor allem im Mittelhirn. Die Ursachen für PD sind bislang nicht abschließend geklärt. Der Großteil der Fälle ist sporadischer Natur mit unbekannter Ursache und nur bei einem geringen Anteil liegt eine Mutation in einem einzelnen Gen zugrunde. Die häufigsten Mutationen tritt in den Genen für Alpha-Synuklein (SNCA), PINK1 und PARKIN auf.
Die Serin-Threonin-Kinase PINK1 und die E3-Ubiquitin-Protein-Ligase PARKIN sind zwei Proteine, die in Stresssituationen an der Mitochondrien-Außenmembran am Abbau von alten oder nicht richtig funktionierenden Mitochondrien beteiligt sind. Dieser Vorgang nennt sich Mitophagie.
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Publikationen gehen den Zusammenhängen zwischen mitochondrialen Fehlfunktionen und der Pathogenese von PD nach. Da die Krankheit meist erst im hohen Alter auftritt, davon größtenteils ohne direkte Ursache, liegt der Schluss nahe, dass neben genetischen Ursachen auch Umweltfaktoren eine größere Rolle spielen könnten. Um dies näher zu analysieren, wurden experimentell verschiedene Stressoren eingesetzt.
Insgesamt wurden folgende Aspekte untersucht:
I. Welche Auswirkungen hat das Fehlen von PINK1 auf die Zelle? Gibt es einen Biomarker, der mit höherem Alter immer stärker verändert ist?
II. Welchen Einfluss haben Umweltfaktoren wie veränderte Eisen-Exposition auf die Zelle und was verändert sich beim Fehlen von PINK1?
III. Wie können mitochondriale Fehlfunktionen präferentiell das Nervensystem betreffen, wenn es nicht um respiratorische Insuffizienz geht?
Die einzelnen Studien zeigten folgende Ergebnisse:
Torres-Odio/Key et al. 2017 widmete sich der Suche nach molekularen Biomarkern, wodurch PD präsymptomatisch erkannt und die Progression der Erkrankung eingeschätzt werden kann. Die Transkriptom-Analyse der Kleinhirne von Mäusen mit Pink1-/--Mutation in drei verschiedenen Altersstufen zeigte eindrücklich, dass nicht ein einzelner Faktor immer stärker verändert war, sondern, dass immer mehr Faktoren und daher auch eine steigende Zahl an
Signalwegen mit höherem Alter beteiligt waren. Diese Veränderungen betrafen inflammatorische Signalwege, insbesondere Faktoren, die mit der Erkennung und Verarbeitung von zellfremden Nukleinsäuren assoziiert sind. Aufgrund der evolutionären Herkunft von Mitochondrien als frühere Protobakterien haben mitochondriale Nukleinsäuren und Proteine zum Teil bakterielle Ähnlichkeiten, und könnten bei Fehlfunktionen ins Zytosol gelangen. Vor diesem Hintergrund lassen die Ergebnisse der Studie den Schluss zu, dass das angeborene Immunsystem in Neuronen durch eine PINK1-assoziierte mitochondriale Störung aktiviert wird.
In der Publikation Key et al. 2020 wurde Eisen als ein im täglichen Leben vorkommender Stressor eingesetzt und es wurden systematisch Faktoren des Eisenstoffwechsels bei hohen und niedrigen Eisenspiegeln im Zusammenhang mit Parkinson-Mutationen untersucht. Da Eisen für die Gesundheit von Mitochondrien eine große Rolle spielt und Eisen-Chelatoren als Therapie bei PD Patienten bereits diskutiert werden, haben die molekularen Befunde große Relevanz. Die Ergebnisse zeigen, dass unter niedrigen Eisenspiegeln Proteine reduziert waren, die am Nukleotid-Stoffwechsel beteiligt sind, sowie Faktoren, die Eisen-Schwefel-Cluster als Cofaktoren haben und wichtig für die Nukleotid-Qualitätskontrolle sind. Das Fehlen von Eisen führte zu einer Induktion von Pink1 und Prkn, was auf verstärkte Mitophagie hindeutet. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die mitochondriale Eisen-Schwefel-Cluster Biogenese und die post-transkriptionelle Eisenregulation entscheidend für die Pathogenese von PD, bzw. das gesunde Fortbestehen einer Zelle und letztlich auch eines Organismus sind.
In Key et al. 2019 wurde erstmalig das Gesamt-Ubiquitylom aus Gehirnen von gealterten Parkin-knockout (KO) Mäusen erhoben und analysiert, um Ubiquitylierungs-Substrate von PARKIN zu identifizieren. Hierbei zeigte sich eine veränderte Ubiquitylierung von mehreren Faktoren, die an der zellulären Calcium-Homöostase beteiligt sind. Weitere elektrophysiologische Experimente in Gehirnen von gealterten Parkin-/--KO Mäusen ergaben, dass in Nervenzellen im Locus coeruleus die Geschwindigkeit der spontanen Taktgeber erhöht, dass die langsame Nachhyperpolarisation reduziert und, dass die Dauer der Aktionspotentiale erniedrigt war, ohne Veränderung der Kaliumkanal-Ströme.
Insgesamt geht aus den drei Studien hervor, dass mitochondriale Fehlfunktionen bei dauerhaftem Bestehen weitreichende Folgen für die Gesundheit des Nervensystems haben können, denn auch kleine Veränderungen, seien es durch Mutationen oder Umweltfaktoren wie Eisen, können in einer so großen Lebensspanne wie der des Menschen über Krankheit oder Gesundheit entscheiden!
Reactive oxygen species are a class of naturally occurring, highly reactive molecules that change the structure and function of macromolecules. This can often lead to irreversible intracellular damage. Conversely, they can also cause reversible changes through post-translational modification of proteins which are utilized in the cell for signaling. Most of these modifications occur on specific cysteines. Which structural and physicochemical features contribute to the sensitivity of cysteines to redox modification is currently unclear. Here, I investigated the in uence of protein structural and sequence features on the modifiability of proteins and specific cysteines therein using statistical and machine learning methods. I found several strong structural predictors for redox modification, such as a higher accessibility to the cytosol and a high number of positively charged amino acids in the close vicinity. I detected a high frequency of other post-translational modifications, such as phosphorylation and ubiquitination, near modified cysteines. Distribution of secondary structure elements appears to play a major role in the modifiability of proteins. Utilizing these features, I created models to predict the presence of redox modifiable cysteines in proteins, including human mitochondrial complex I, NKG2E natural killer cell receptors and proximal tubule cell proteins, and compared some of these predictions to earlier experimental results.
Die Funktion nukleärer Rezeptoren (NR) beruht auf einem empfindlichen Zusammenspiel zwischen ihren Domänen, Coregulatoren und Liganden. Die meisten Rezeptoren binden die DNA als Homo- oder Heterodimere und transregulieren die Gentranskription in Folge von Ligandenbindung. Klassische Assay-Systeme, die sich auf die Untersuchung der NR-Funktion oder auf die Charakterisierung von Substanzen richten, bilden nur die Coregulator-Rekrutierung zu isolierten NR-Ligandenbindungsdomänen (LBDs) ab und vernachlässigen dabei die NR:NR-Interaktion. Damit klammern sie die NR:NR-Wechselwirkung aus, obwohl die Rekrutierung von Cofaktoren durch allosterischen Crosstalk mit der Oligomerisierung verbunden ist. Dies war die Motivation dafür, Assay-Systeme zu entwickeln, welche die Untersuchung von NR-Interaktionen,
insbesondere der NR-Dimerisierung, und deren Modulation durch verschiedene Arten von Liganden ermöglichen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird ein vielfältiges modulares Set von Assays für die Untersuchung der NR-Dimerisierung und NR-Coregulator-Rekrutierung vorgestellt und deren Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von NRs demonstriert. Die Verwendung einer
rekrutierungsunfähigen RXRα-Variante mit einer mutierten AF-2-Domäne ermöglichte den spezifischen Nachweis der Coaktivatorrekrutierung durch PPARγ im Kontext des Heterodimers mit seinem obligatorischen Dimerpartner RXRα. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der RXRα LBD mit ihrem Agonisten SR11237 zu einer Destabilisierung des RXRα-Homodimers, aber zu einer Förderung der Bildung des Heterodimers mit der PPARγ LBD führte.
Ein zentrales Ergebnis war das Phänomen, dass der Einbau von PPARγ in das Heterodimer zu einem erheblichen Anstieg an Affinität gegenüber Coaktivatoren führt, auch in Abwesenheit von Liganden. Somit fördert die RXRα-Aktivierung die Coaktivator-Rekrutierung von PPARγ indirekt durch eine Verschiebung der Oligomerisierungspräferenz von RXRα in Richtung des Heterodimers. Zusätzlich wurde die Wirkung von Tetrac, einem nicht-klassischen Schilddrüsenhormon, auf PPARγ und RXRα untersucht und dessen Aktivierungsvermögen gegenüber beiden Rezeptoren mit einer deutlich vervielfachten Wirkung auf das Heterodimer demonstriert. Mit Hilfe des neu etablierten Cofaktor-Rekrutierungsscreens konnte die Dynamik
zwischen dem Nurr1 NR und 29 kanonischen Coregulatoren, von denen einige ligandenabhängig hohe Affinitäten zum Rezeptor aufwiesen, beleuchtet werden. Diese Interaktionen wurden
bidirektional durch eine Reihe von strukturell unterschiedlichen nicht-steroidalen Antirheumatika moduliert, die auch die Affinitäten sowohl des Nurr1-Homodimers als auch des Heterodimers mit der RXRα LBD beeinflussen konnten. Die Nurr1-Dimere zeigten zudem auch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber dem Endocannabinoid Anandamid. Zusätzlich zu PPARγ, RXRα und Nurr1 wurden erste Schritte zur Untersuchung der TLX NR-Funktion unternommen. Unter Anwendung der entwickelten Assays konnte die Heterodimerbildung der TLX und der RXRα LBD
beschrieben und die ligandenabhängige Rekrutierung des Corepressors SMRT beobachtet werden.
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit einen Satz von Werkzeugen für die Untersuchung von ligandenabhängiger NR-Coregulator-Interaktion und Oligomerisierung. Auf diese Weise trug sie zu einer umfassenderen Identifizierung und Charakterisierung von NR-Liganden bei und stellt eine valide Basis für die weitere Assayentwicklung und Ligandendesign dar.
Morbus Parkinson ist die zweithäufigste neurodegenerativen Erkrankung, die durch Untergang der dopaminergen Neuronen im Mesenzephalon zu einer Störung des extrapyramidalen motorischen Systems führt. Daraus resultierende Bewegungsstörungen, zu denen Rigor, Tremor, Hypokinese und posturale Instabilität gehören, werden von nichtmotorischen Symptomen wie autonome Dysregulation, veränderte sensorische Wahrnehmung, sowie kognitive und psychische Störungen begleitet.
Mehrere Studien berichten über erhöhte Schmerzprävalenz bei Parkinson Patienten. Die genaue Pathogenese der gestörten Schmerzwahrnehmung bleibt unklar. Zusätzlich zu den zentralen Mechanismen entstehen die Schmerzen bei Morbus Parkinson wahrscheinlich durch eine Schädigung der peripheren somatosensorischen und autonomen Neuronen, die sich in sensorischen Defiziten, sowie in erhöhter Schmerzempfindlichkeit manifestieren. Als Korrelat dazu wurden abnormale somatosensorisch evozierte Potenziale, pathologische Ergebnisse in der quantitativen sensorischen Testung und eine Abnahme der Nervenfaserdichte beschrieben.
Ein Schwerpunkt unserer Untersuchungen lag auf der Erforschung von potentiellen Veränderungen von Lipidsignalmolekülen. Eine Reihe von Studien zeigen eine Schmerzlinderung durch Cannabis-Einnahme, sowie eine Tendenz zur Schmerzentwicklung bei Parkinson Patienten mit dem bekannten FAAHPolymorphismus. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Störung im Endocannabinoid-System höchstwahrscheinlich zu erhöhter Schmerzprävalenz bei Morbus Parkinson beiträgt. Eine weitere wichtige Lipid-Gruppe sind Glycosylceramide. Ihr Abbau kann durch heterozygote Mutationen des lipidabbauenden Enzyms Glukocerebrosidase 1 (GBA1) gestört sein. GBA1 Mutationen sind mit der schnell progredienten sporadischen Verlaufsform der Parkinson-Krankheit assoziiert.
Im Rahmen der Studie wurden zwei Kohorten von Parkinson Patienten analysiert. Die 128 Patienten aus Israel wurden im ersten Teil mit 224 jungen gesunden deutschen Probanden verglichen. Im zweiten Teil wurden 50 deutschen Patienten und 50 gesunde altersgleiche Probanden untersucht. Die Schmerzevaluation erfolgte anhand der "Brief Pain Inventory“ und "Neuro Detect“ Fragebögen. Bei allen Probanden wurde quantitative sensorische Testung durchgeführt und die Plasmakonzentrationen der Lipidsignalmoleküle mittels quantitativer HPLC-Tandem-Massenspektrometrie analysiert.
Nach Auswertung der Schmerzevaluation konnte eine erhöhte Schmerzprävalenz bei Parkinson Patienten festgestellt werden. Die Prävalenz betrug 66% im ersten Teil der Studie und 74% in der deutschen Kohorte, im Vergleich zu 40% bei den altersgleichen gesunden Probanden. Ergebnisse der quantitativen sensorischen Testung zeigen einen Verlust der thermischen Empfindung (erhöhte Schwellen) bei der gleichzeitigen mechanischen Überempfindlichkeit (erniedrigte Schwellen). In der multivariaten LipidAnalyse konnten erniedrigte Konzentrationen von Anandamid und Lysophosphatidsäure 20:4 und eine Erhöhung der Glucosylceramide nachgewiesen werden. Diese Veränderungen waren bei Parkinson Patienten mit Schmerzen stärker ausgeprägt. Außerdem wurde eine lineare Korrelation zwischen Glucosylceramiden (GlcCer 18:1, GlcCer 24:1) und der Schmerzintensität, sowie sensorischem Defizit festgestellt.
Nach sorgfältiger Auswertung der Studienergebnisse kommen wir zu der Schlussfolgerung, dass eine Veränderung der Endocannabinoide und der Glucosylceramide zur Pathogenese der Schmerzen und der sensorischen Neuropathie bei Morbus Parkinson beitragen. Die Erkenntnisse könnten zukünftig zur Diagnosestellung durch frühzeitige Erkennung prämotorischer sensorischer Symptome beitragen. Darüber hinaus könnten unsere Ergebnisse zur Therapieoptimierung durch Wiederherstellung der Lipid-Homeostases beitragen.
The Compressed Baryonic Matter (CBM) Experiment will investigate heavy ion collisions and reactions at interaction rates of 100 kHz in a targeted energy range of up to 11 AGeV for systems such as gold-gold or lead-lead. It will be one of the major scientific experiments of the Facility for Antiproton and Ion Research in Europe (FAIR) currently under construction at the site of the GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung (GSI) in Darmstadt, Germany. CBM is going to be a fixed target experiment consisting of a superconducting magnet, multiple detectors of various types, and high-performance computing for online event reconstruction and selection. The detector closest to the interaction point of the experiment will be the Micro Vertex Detector (MVD). Consisting of four planar stations equipped with custom CMOS pixel sensors, it will allow to reconstruct the primary vertex with high precision and will help to reconstruct secondary vertices and identify particles originating from conversion in the detector material.
Due to the high interaction rates foreseen for CBM, understanding and minimizing systematic errors due to the detectors’ operating conditions will become all the more important to obtain significant measurement results, as statistical errors in the measurements of many observables are diminishing due to the enormous amount of data available.
Furthermore, the MVD will be the first detector based on CMOS pixel sensors used in a large physics experiment, that will be operated in vacuum. As a result, many aspects of the mechanical and electrical integration of the detector require careful testing and validation.
This thesis addresses both those challenges specifically for the Micro Vertex Detector with the development of a control system for the operation and validation of the MVD prototype “PRESTO” in vacuum. The prototype was selected as device under test as the final MVD is not yet built.
The developed control system helps a) to operate the prototype safely and keep it at the desired working point and b) to record important time-series data of the state of the detector prototype. Those two aspects allow the control system (which might later serve as a ‘blueprint’ for the final detector) to minimize the mentioned systematic errors as much as possible and to contribute to the understanding of remaining systematic errors using correlations with the time-series data. The controlled operation of the prototype in vacuum allowed to validate the integration concepts from a wide range of mechanical and electrical aspects in an endurance test for more than a year with 24/7 operation.
The prototype for this study itself was named “PRESTO” (standing for ‘PREcursor of the Second sTatiOn of the CBM-MVD’). It represents one quadrant of an MVD detector plane, equipped with a total of 15 MIMOSA-26 sensors on the front and back side of a carrier plate. Within this thesis, major parts of the prototype itself were designed. Custom ultra-thin flat flexible cables for data and power were designed and validated. Furthermore, the CNC-machined Aluminium heatsink to mount and cool the prototype design was refined to increase thermal performance. A custom vacuum feedthrough for a total of 21 flat ribbon cables was designed and fabricated. The read-out chain for MIMOSIS-26 was extended to cover a total of 8 sensors with a single and newer TRB-3 FPGA board and was set-up with the prototype. Vacuum equipment including chambers, hoses, pumps, valves and gauges were integrated to form a large vacuum testing system. A cooling circuit for the prototype was assembled comprising an external chiller, hoses, vacuum feedthroughs, as well as temperature, flow and pressure sensors.
The control system was developed to serve the needs of the prototype, while taking the requirements of the final MVD already into account. The main design goals of the control system are:
• compatibility with the other detectors and the overall CBM experiment,
• access to real-time measurements of all necessary parameters (‘process values’),
• reliable, fail-safe operation of the detector,
• recording of all time-series data (‘archiving’),
• cost efficiency and acceptance within the physics community,
• good usability for the users (‘operators’),
• long-term maintainability.
The recorded time-series data of the process variables (i.e. sensor readings) allow a post-measurement analysis of variations in the detector performance. The longterm archiving of all relevant system parameters is therefore of outstanding importance, which is why the software intended for this purpose – called “archiver” – was given special attention in this thesis.
For this reason in particular, it is necessary to implement a comprehensive control system that allows the detector to be operated safely under these conditions and cooled effectively. Before the start of this doctoral thesis, vigilant and extensively trained operators were always necessary for this. The control system that has been developed makes it possible that, after basic training, the detector can also be operated by a less specialised shift supervisor during measurement campaigns.
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