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Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
Orthopockenviren sind große DNA-Viren, die im Zytoplasma der Wirtszelle replizieren und für über 200 Proteine kodieren. Sie besitzen ein breites Wirtszellspektrum (host-range) und modulieren auf komplexe Art und Weise zelluläre Prozesse, um ihre Replikation zu gewährleisten. Zu diesem Genus der Familie der Pockenviren gehört auch das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA). MVA ist ein hoch attenuiertes, replikationsdefizientes Impfvirus, dem im Vergleich zu ursprünglichen Vacciniavirus-Stämmen viele virale Genfunktionen fehlen. Zu diesen verlorengegangenen Genen zählen so genannte host-range-Gene, die für das breite Wirtszellspektrum des Vacciniavirus (VACV) verantwortlich sind, deren molekulare Funktion aber größtenteils unbekannt ist. Diese Arbeit befasste sich zum einen mit der Untersuchung der Rolle der host-range-Gene K1L und C7L in der MVA-Infektion. Zum anderen sollte geprüft werden, ob der im MVA-Genom unvollständige Leserahmen F11L durch Wiederherstellung seiner Funktionalität den Wirtstropismus von MVA erweitern kann. Das Fehlen von K1L und C7L in MVA ist mit dem Verlust der späten viralen Genexpression verbunden. Als mögliche Ursache hierfür wurde in dieser Arbeit die Phosphorylierung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2alpha (eIF2alpha) entdeckt, welche zum Abbruch der Proteinsynthese in der infizierten Zelle führt. Unter den möglichen Kinasen wurde die Proteinkinase R (PKR) als das verantwortliche Schlüsselenzym identifiziert und somit gezeigt, dass das K1- und C7-Protein den anti-viralen PKR-eIF2alpha-Signalweg inhibieren. Es stellte sich heraus, dass die eIF2alpha-Phosphorylierung alleine jedoch nicht für das Fehlen der späten Genexpression verantwortlich ist. Neben dem inhibitorischen Einfluss auf den PKR-eIF2alpha-Signalweg zeigte sich, dass C7 die Aktivierung des NFKB-Signalwegs reduziert, welcher für eine anti-virale Antwort der Wirtszelle wichtig ist. Ein weiterer Ansatz zur Aufklärung der K1- und C7-Funktion bestand darin, zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren. Hierbei konnte das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein K (HNRPK) als möglicher Interaktionspartner von C7 entdeckt werden. Neben den bisher bekannten host-range-Genen gibt es vermutlich weitere Gene, die den Wirtsbereich des VACV definieren. Das im MVA-Genom defekte F11L-Gen war ein guter Kandidat für eine solche Genfunktion, da es bei der Virionenmorphogenese, Virusausbreitung und der Migration VACV-infizierter Zellen eine Rolle zu spielen scheint. Deshalb wurde ein rekombinantes MVA mit vollständiger F11L-Gensequenz konstruiert und das Wirtszellspektrum dieses Virus untersucht. Die Reparatur des F11L-Gens ermöglichte MVA die Induktion von Zellbewegung nach Infektion, jedoch blieben seine unvollständige Morphogenese und eingeschränkte Vermehrungsfähigkeit in Säugetierzellen unbeeinflusst. F11L hat daher zumindest keine selbstständige Funktion als VACV host-range-Gen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind ein Beitrag zum besseren Verständnis der komplexen Virus-Wirts-Interaktionen des VACV sowie des eingeschränkten Wirtstropismus des Impfvirus MVA.
Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Die Neurowissenschaften sind in Forschungsarbeiten für Schüler und Studierende immer wieder als eines der schwierigsten Teilgebiete der Biologie angeführt. Die Inhalte werden überwiegend nicht verstanden. Als mögliche Ursache gelten die seltenen praktischen Zugänge für die Lernenden aufgrund limitierter Ressourcen. Diese Ursache konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Befragung der Lehrkräfte zu ihren Praxisumsetzungen bestätigt werden. 70 % der Lehrkräfte gaben an, dass sie keine Experimente in der Schule zum Thema Nervenzellen anbieten. Experimente zur Verhaltensbiologie führen 65 % der Lehrkräfte nicht durch.
Um Schülern die Möglichkeit zu geben, sich experimentell mit den Themenfeldern der Neuro- und Verhaltensbiologie auseinanderzusetzen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Schülerlabortage auf dem Feld der Neurowissenschaften konzipiert. Die Konzepte wurden schülerorientiert umgesetzt und neurowissenschaftliche Forschung durch den eigenen Umgang mit modernen Forschungsapparaturen erfahrbar gemacht. Die drei Labortage für die Sekundarstufe II wurden wissenschaftlich begleitet: 1) Verhaltensbiologie, 2) systemische Ebene der Elektrophysiologie, 3) elektrophysiologische Forschungsmethoden. Um die Qualität und Wirksamkeit der Labortage beurteilen zu können, wurden sie mit Feedbackerhebungen begleitet. Die drei Labortage wurden sowohl von den Lehrkräften als auch von den Schülern bezüglich ihrer Qualität positiv bewertet. Für die Schüler konnte gezeigt werden, dass die Beurteilung weitgehend unabhängig von einem zugrunde liegenden Interesse an Biologie und Forschung ausfällt. Anhand einer retrospektiven Erhebung wird außerdem gezeigt, dass alle drei Labortage eine höchst signifikante, selbsteingeschätzte Steigerung des „Wissens“, der „Anwendungszuversicht“ und des „Interesses“ bewirken. Schüler mit niedrigen Ausgangswerten zeigen einen besonders hohen Anstieg. Für das Interesse kann weiter gezeigt werden, dass auch Schüler mit hohem Ausgangswert eine große Interessenssteigerung durch den Labortag aufweisen. Das Interesse für den verhaltensbiologischen Labortag liegt etwas niedriger – die Labortage mit elektrophysiologischen Inhalten zeigen dagegen für die Anwendungszuversicht etwas niedrigere Werte.
Der Fokus der fachdidaktischen Forschung lag auf der Betrachtung des experimentellen Zugangs zur Elektrophysiologie über ein entwickeltes „EPhys-Setup“. Dabei handelt es sich um einen quasi-realen Messaufbau. Die Umsetzung kombiniert dazu Komponenten eines realen Elektrophysiologie-Setups (Hands-on Komponenten) mit einer speziell entwickelten schülerfreundlichen Software (Neurosimulation) und einem virtuellen Nervensystem in Form einer Platine. Als Modellnervensystem werden für diese Umsetzung Ganglien von Hirudo medicinalis verwendet – der Neurosimulation liegen originale elektrophysiologische Messspuren des Ganglions zugrunde. Experimentelle Vermittlungsansätze für die Elektrophysiologie finden sich kaum für den Schulbereich. Dem Bedarf einer entsprechenden Beforschung wurde mit verschiedenen Testinstrumenten nachgegangen, um den Vermittlungsansatz mit dem EPhys-Setup bewerten zu können. Dafür fand eine Wirksamkeitsanalyse über die Erhebung der Motivation der Schüler statt (Lab Motivation Scale; Dohn et al. 2016). Von Bedeutung war auch, inwiefern gegenüber der Umsetzung eine Technologieakzeptanz vorliegt (Technology Acceptance Model; Davis 1989), die im Schulkontext ausgehend von der steigenden Einbindung von Technologien einen entsprechenden Forschungsbedarf aufweist. Weiter wurde untersucht, ob sich die Bewertung des EPhys-Setups von der Bewertung einer Kontrollgruppe unterscheidet. Für die Kontrollgruppe wurde die Neurosimulation von den Hands-on Komponenten gelöst und die Schüler arbeiteten ausschließlich PC-basiert. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Umsetzungen die Motivation förderten und eine Technologieakzeptanz bei den Schülern aufwiesen. Der Unterschied der Untersuchungsgruppen fällt gering aus. Die Abhängigkeiten, die für die verwendete Simulationsumsetzung gefunden wurden, beziehen sich ausschließlich auf Komponenten der „Freude“. Somit wird der intrinsische Bereich von den Schülern die am EPhys-Setup gearbeitet haben höher bewertet. Zur weiteren Analyse der Testinstrumente wurde auch eine Abhängigkeit der Bewertung vom zugrunde liegenden Biologieinteresse sowie von den Computerfähigkeiten vergleichend betrachtet. Der Einfluss auf die Bewertungen der drei Testskalen ist in vielen Fällen höher als der Einfluss der verwendeten Simulation. Vom individuellen Biologieinteresse der Schüler zeigen alle untersuchten Komponenten eine Abhängigkeit. Die größeren Effekte beziehen sich auf die Komponenten der „Lernwirksamkeit“ oder der „Freude“. Von den individuellen Computerfähigkeiten der Schüler zeigen Komponenten zur „Zuversicht bezüglich der Methoden und der Inhalte“ eine Abhängigkeit.
Die Differenzierung zwischen Teilpopulationen hin zu unterschiedlichen Arten kann nur erfolgen, wenn zwischen diesen Teilpopulationen reproduktive Isolation besteht. Wie die unterschiedlichen Arten von reproduktiver Isolation zusammenwirken und welche Voraussetzungen bestehen müssen, um neue Arten zu bilden, muss in jedem Studiensystem untersucht werden. Ein idealer Ansatzpunkt sind Arten, die sich mehrfach an anspruchsvolle Habitate angepasst haben, deren Artbildung also von ökologischen Habitatparametern bestimmt wird. Dieser Vorgang wird als Ökologische Artbildung bezeichnet. Im Artkomplex Poecilia spec., der im Süden Mexikos mehrere schwefelangepasste Ökotypen ausgebildet hat, wurden erste Hinweise auf eine Korrelation zwischen der Selektionsstärke von natürlicher und sexueller Selektion gefunden, deren Einfluss zusammen die bestehenden reproduktiven Barrieren zwischen Klarwasser- und Schwefelökotyp formen. Wie diese Reproduktionsbarrieren beschaffen sind und wie die Umweltvariable Schwefel auf die Morphologie und das Verhalten der Poeciliiden Einfluss nimmt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand von fünf Fragestellungen untersucht. (1) Die Körperfärbung kann ein aussagekräftiges Signal für die Qualität des potentiellen Partners bei der Fortpflanzung sein. Wie beeinflusst die extreme Umweltvariable Schwefel die Ausbildung von Färbung? (2) Sind die gefundenen Anpassungen der Färbung erblich oder werden sie plastisch entsprechend des Nahrungsangebots ausgebildet? (3) In einem der untersuchten Flusssysteme konnte unvollständige reproduktive Isolation zwischen der Klarwasser- und Schwefelpopulation nachgewiesen werden. Sind in den Mischzonen zwischen diesen beiden Habitaten Hybriden genetisch nachweisbar und bilden diese die Färbungsanpassungen der Klarwasser-, der Schwefelpopulation oder eine intermediäre Form aus? (4) Die Gelbfärbung der Flossen bei Männchen scheint ein geeignetes Merkmal für die Anzeige der Qualität zu sein, da es möglicherweise unabhängig vom Nahrungsangebot ausgebildet wird. Besteht eine weibliche Präferenz für dieses Merkmal? (5) Auch die weibliche Partnerwahlpräferenz wird vom Habitat und dem eigenen Zustand beeinflusst. Wie verändert sich die Präferenz für Männchen mit gutem Ernährungszustand bei Weibchen, die hungrig sind?
Um diese Fragen zu beantworten, wurden in mehreren Jahren Männchen und Weibchen der Arten Poecilia mexicana und Poecilia sulphuraria aus sieben Populationen im Studiengebiet in Südmexiko gefangen und auf ihre Färbung untersucht sowie Laborpopulationen getestet. Es konnten generelle Anpassungen der Färbung an die Umweltvariable Schwefel nachgewiesen werden. Dazu gehören die Aufhellung der Körperregionen, die durch Tarnung (konkret: countershading und background matching) vor Entdeckung durch Prädatoren schützen, und die Reduktion von Gelb- und Rottönen. Diese Anpassung ist vermutlich auf das geringe Angebot an Karotinoiden in den schwefelbelasteten Extremhabitaten zurückzuführen. Außerdem konnten zahlreiche flusssystem¬spezifische Anpassungen beschrieben werden, deren Ursachen in den Unterschieden zwischen den Schwefelhabitaten untereinander begründet sind. Das Flusssystem des Río Tacotalpa stellt hier eine Besonderheit dar, da Männchen eine besonders starke Gelbfärbung der Flossen aufweisen. Wildgefangene und laborgeborene Männchen dieses Flusssystems wurden verglichen, um einen Hinweis auf den Einfluss des Nahrungsangebots auf dieses Merkmal zu untersuchen. Tatsächlich ist die Ausprägung dieses Merkmals, die Gelbfärbung der Flossen, unabhängig vom Angebot an Karotinoiden. Während die hier verwendeten genetischen Analysen nicht geeignet waren, Hybriden aus den Mischzonen zwischen Schwefel- und Klarwasserhabitat nachzuweisen, ergaben die Untersuchungen von Individuen aus den Mischzonen keine eindeutigen Ergebnisse über eine etwaige intermediäre Ausbildung der Färbung. Die Präsentation von Männchen, deren Gelbintensität an den Flossenspitzen künstlich verändert wurde, konnte bei Weibchen keine eindeutige Präferenz für stärker gefärbte Männchen aufzeigen. Vielmehr weist dieses Ergebnis auf eine starke Korrelation zwischen mehreren Merkmalen (z. B. weitere morphologische Merkmale, Verhalten) hin, die für die Beurteilung der männlichen Qualität herangezogen werden. Die weibliche Präferenz für konditionsabhängige Merkmale wird bei schwefelangepassten Weibchen leicht verstärkt, wenn diese hungrig sind. Eine solche flexible Präferenz sollte gerade in Habitaten mit starken Fluktuationen im Nährstoffangebot existieren. Dabei waren Weibchen, denen Videoaufnahmen präsentiert wurden, eher in der Lage, das qualitativ hochwertigere Männchen zu identifizieren, als Weibchen, denen animierte Bilder präsentiert wurden. Auch hier wird davon ausgegangen, dass die Reduktion auf eines oder wenige Merkmale, die für die Partnerwahl zur Verfügung stehen, keine ausreichend starke Reaktion auslösen können. Vielmehr ist der Zugriff auf alle Aspekte der männlichen Erscheinung wichtig, um die Qualität des potentiellen Partners zu beurteilen.
Färbung ist also generell geeignet, den Ökotyp eines Individuums zu bestimmen und ein solches Merkmal kann der Artbestimmung im ersten Schritt der Partnerwahl dienen. Dasjenige männliche Färbungsmerkmal, das über mehrere Generationen gleichbleibend ausgeprägt wurde – die Gelbfärbung der Flossen – reicht jedoch nicht aus, um bei der weiblichen Partnerwahl eine Reaktion auszulösen. Vielmehr deuten die Ergebnisse auf eine enge Korrelation der Färbung mit weiteren Merkmalen in Morphologie und Verhalten eines Individuums hin, die vom wählenden Weibchen stets gemeinsam entsprechend der Multiple-message-Theorie betrachtet werden. Auch der Vergleich zwischen Videoaufnahmen und animierten Fotografien als Stimuli bei der Partnerwahl ergab, dass der Aspekt Verhalten (nur verfügbar mit Videoaufnahmen) für eine Partnerwahlentscheidung von Bedeutung ist.
Meine Arbeit konnte den bestehenden Wissensschatz um die bestehenden reproduktiven Barrieren im Studiensystem um den Aspekt der Färbung erweitern. Meine Ergebnisse zeigen weitere spannende Fragestellungen auf. Je größer das Verständnis der vorliegenden Selektionskräfte und Mechanismen reproduktiver Isolation ist, desto besser kann die Wissenschaft verstehen, welche Umgebungsvariablen welchen Einfluss auf den Prozess der Artbildung haben.
Anfang Februar veröffentlichte die Pressestelle der Goethe-Universität die Meldung „In der Stadt bauen Kaninchen dichter: Große Bauten für die ländliche Großfamilie, kleine Bauten für das städtische Pärchen.“ Die Meldung beruhte auf einem Fachartikel der Arbeitsgruppe Ökologie und Evolution im Journal of Zoology. Rasend schnell verbreitete sich die Meldung in den Medien – wir haben Madlen Ziege, Doktorandin in der Arbeitsgruppe Ökologie und Evolution einmal danach befragt, wie die Forschung mit populären oder besser: popularisierten Meldungen umgeht.
Lieblingsbild
(2017)
Dieses Bild ist wichtig, weil wir daran verstanden haben, wie in der Zelle fehlerhaftes Spleißen verhindert wird. Dazu muss man wissen, dass unsere Gene sich aus Exons und dazwischenliegenden Introns zusammensetzen. Während des Spleißens werden die Introns entfernt und die Exons in ein reifes Transkript zusammengefügt, das dann für ein Protein kodiert. Allerdings gibt es innerhalb der Introns viele Bereiche, die einem Exon sehr ähnlich sehen. Werden diese sogenannten "PseudoExons" fälschlicherweise während des Spleißprozesses erkannt und in das reife Transkript eingebaut, kann das fatale Folgen für das kodierte Protein und oft die gesamte Zelle haben. ...
Studium der Lebewesen : im Masterprogramm »Ökologie und Evolution« wird Diversität großgeschrieben
(2021)
Die halophilen Archaea Haloferax volcanii und Halobacterium salinarum haben sich aufgrund ihrer metabolischen Vielseitigkeit und der Verfügbarkeit vieler molekulargenetischer und biochemischer Techniken zu archaealen Modellorganismen für die Untersuchung zellulärer Prozesse entwickelt. In den vergangenen Jahren wurden eine Vielzahl prokaryaler Genome sequenziert, es zeigte sich jedoch, dass ca. 30% aller Gene keine Funktion zugeordnet werden kann. Die funktionelle Genomforschung zielt darauf, durch parallele genomweite Untersuchung der Genexpression die Funktion der Transkripte bzw. der Proteine aufzuklären. In der vorliegenden Arbeit wurden für beide halophilen Archaea genomweite Genexpressionsanalysen unter Verwendung der DNA-Mikroarray- Technologie etabliert. Aufgrund der derzeit nicht vorhandenen Genomsequenz wurde für die Untersuchung der Genexpression von H. volcanii der erste und bisher einzig beschriebene genomweite shotgun-DNA-Mikroarray konstruiert. Dazu wurde zunächst eine Genombibliothek mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 1,5 kb hergestellt. Die Genombibliothek wurde anschließend in eine PCR-Produkt-Bibliothek umgewandelt, die dazu genutzt wurde, in einem hochdichten Raster zwei DNA-Mikroarrays herzustellen, einen 960-Sonden DNA-Mikroarray zur Etablierung und Optimierung der Methode und einen 2880-Sonden DNA-Mikroarray, der einer einfachen Genomabdeckung entspricht. Für den Vergleich der Genexpression nach einer Änderung der Kohlenstoffquelle wurden Zellen von H. volcanii einem Wechsel von Wachstum mit Aminosäuren zu Wachstum mit Glukose als alleiniger Kohlenstoff-Quelle unterzogen. Die Transkriptomänderungen vom Wechsel der Kohlenstoff-Quelle bis zum erneuten Beginn des exponentiellen Wachstums wurden zu fünf Zeitpunkten mit dem 2880-Sonden DNA-Mikroarray analysiert. Es wurden fünf verschiedene Klassen kinetisch gleichregulierter Gene gefunden, die entweder induziert, reprimiert oder transient induziert waren. Insgesamt wurden ca. 10% aller Gene zu mindestens einem Zeitpunkt mehr als 2,5 fach reguliert. Für Gene aller fünf Klassen wurden die Ergebnisse durch Northern-Analysen verifiziert. Die Identität der regulierten Gene wurde durch Sequenzierung der PCR-Produkte von beiden Enden ermittelt. Es wurde ein breites Spektrum an Genen identifiziert, deren Genprodukte für unterschiedliche funktionelle Kategorien wie Stoffwechselenzyme, ABC-Transporter, regulatorische Proteine und hypothetische Proteine usw. kodieren. Viele gleichregulierte Gene kodieren für Proteine gemeinsamer Funktion. Erwartete wie auch unerwartete Ergebnisse erlaubten Vorhersagen über den zentralen Metabolismus, die Transportkapazität und der zellulären Organisation bei Wachstum von H. volcanii auf Aminosäuren bzw. Glukose. Die Mikroarray-Analysen stehen im Einklang mit der Wachstumsrate und dem Ribosomengehalt von H. volcanii bei Wachstum auf den alternativen Kohlenstoffquellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein shotgun-DNA-Mikroarray mit einfacher Genomabdeckung die Charakterisierung der Regulation metabolischer Prozesse sowie die funktionelle Charakterisierung von Proteinen bzw. Proteinkomplexen erlaubt. Für Halobacterium salinarum, dessen Genomsequenz bekannt ist, wurde ein genomweiter genspezifischer DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurde jeder ORF des Genoms unter Verwendung von ORF-spezifischen Oligonukleotiden mittels PCR amplifiziert. Zur Etablierung dieses Systems wurden zunächst mit einem 200-Sonden DNA-Mikroarray exemplarisch Genexpressionsanalysen für zwei verschiedene Wachstumsbedingungen durchgeführt. Bei anaeroben Wachstum von H. salinarum durch fermentativen Argininabbau wurden im Vergleich zu aeroben Wachstum die für die Argininfermentation essentiellen Gene induziert. Dagegen wurden charakteristische Gene des aeroben Stoffwechsels reprimiert. Zur Untersuchung des Zellzyklusses von H. salinarum wurde der genomweite genspezifische DNAMikroarray verwendet. Um erstmals genomweit die zellzyklusspezifische Genexpression eines Archaeons zu analysieren, wurden Zellen von H. salinarum durch eine reversible Zellzyklusblockade mit Aphidicolin, einem DNA-Polymerase Inhibitor, synchronisiert. Vorläufige Transkriptomstudien mit einer synchron wachsenden H. salinarum-Kultur deuten an, dass die Transkription der Mehrzahl der Gene im Verlauf des Zellzyklusses nicht reguliert wird. Die Untersuchungen dieser Arbeit bilden die Grundlage für genomweite funktionelle Charakterisierungen haloarchaealer Genexpression und Regulationsprozesse.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Zinkfinger-µ-Protein HVO_2753 des halophilen Archaeons Haloferax volcanii hinsichtlich seiner biologischen Funktion und seiner Struktur charakterisiert.
Zinkfinger-µ-Proteine wurden bisher nur sehr wenig untersucht, während ihnen jedoch in den letzten Jahren steigendes Interesse entgegengebracht wird. Im Genom von H. volcanii sind mehr als 40 solcher Zinkfinger-µ-Proteine codiert. Von diesen besitzt mit HVO_2753 lediglich eines nicht nur zwei, sondern vier der charakteristischen C(P)XCG-Muster, was für die Anwesenheit von zwei Zinkfinger-Motiven spricht. Während Homologe von HVO_2753 in vielen Euryachaeota vorkommen und manche davon als Zink-Ribbon RNA-Bindeproteine annotiert sind, ist über ihre Funktion jedoch nichts bekannt. Zur Charakterisierung des Proteins wurde zunächst eine in frame-Deletionsmutante seines Gens erstellt und diese einer phänotypischen Charakterisierung unterzogen. Die Mutante wies, verglichen mit dem Wildtyp, keine Unterschiede im Wachstum in Komplexmedium oder in synthetischem Medium mit Glukose als Kohlenstoffquelle auf. Ein schweres Defizit konnte jedoch sowohl bei der Adhäsion und Biofilmbildung als auch der Schwärmfähigkeit der Deletionsmutante festgestellt werden. Während die Schwärmfähigkeit des Wildtyps durch plasmidische Expression von HVO_2753 in der Deletionsmutante teilweise wiederhergestellt werden konnte, war eine solche Komplementation bei der Biofilmbildung nicht möglich. Die Analyse der Relevanz ausgewählter Aminosäuren, wie beispielsweise das jeweils erste Cystein in jedem C(P)XCG-Muster zeigte, dass die Substitution jeder einzelnen der getesteten Aminosäuren einen Funktionsverlust des Proteins nach sich zieht. Die Untersuchung des HVO_2753-Transkripts mittels Northern Blot-Analyse bestätigte erste Hinweise aus vorangegangenen dRNA- und RNA-Seq-Studien, die eine Co-Transkription von HVO_2753 mit dem Nachbargen HVO_2752, das für den Translations-Elongationsfaktor aEF-1 beta codiert, aufzeigten. Daraufhin erfolgte eine Untersuchung des Ribosomenprofils, bei der keine Unterschiede zwischen der Deletionsmutante und der Überexpressionsmutante von HVO_2753 festgestellt werden konnten.
Eine Variante von HVO_2753 mit N-terminalem Hexahistidin-Tag wurde homolog überproduziert und aufgereinigt. Die Überproduktion und Aufreinigung wurden im Zuge dieser Arbeit weiter, speziell für HVO_2753, optimiert. So konnten große Mengen von HVO_2753n überproduziert und bei nativen Salzbedingungen mittels Nickel-Affinitätschromatographie und anschließender Größenausschlusschromatographie aufgereinigt werden. Eine massenspektrometrische Analyse bestätigte sowohl das Molekulargewicht als auch die Abwesenheit posttranslationaler Modifikationen. Die Untersuchung der Menge an gebundenem Zink im Protein erfolgte beim Zink-Assay mit Hilfe des hochsensitiven und hochspezifischen Fluorophors ZnAF-2F. Dabei konnte gezeigt werden, dass überraschenderweise lediglich ein Zink-Ion in HVO_2753 gebunden vorliegt.
Zur weiteren Funktionsaufklärung erfolgte eine Interaktionspartnersuche. Hierfür wurde HVO_2753 überproduziert, ein in vivo-Crosslink und anschließend eine native Aufreinung durchgeführt. Die massenspektrometrische Analyse ausgewählter Fraktionen nach der Größenausschlusschromatographie ergaben eine Vielzahl an möglichen Bindepartnern. Besonders häufig wurde hier die GalE family Epimerase/Dehydratase gefunden. Eine weitere Methode zur Suche nach Interaktionspartnern richtete sich auf RNAs. Hier konnten mittels eines eigens entwickelten Protokolls neben RNAs des Translationsapparates auch mehrfach die tRNA(Glu) gefunden werden.
Zusätzlich sollte die Transkriptomanalyse mittels RNA-Sequenzierung Unterschiede zwischen Wildtyp, Deletionsmutante und Komplementationsmutante aufzeigen. Hier wurden weitreichende Auswirkungen der Deletion von HVO_2753 gefunden. Zahlreiche Gene in mehreren Operons zur Motilität und Chemotaxis lagen in der Deletionsmutante stark herunterreguliert vor, während die Gene einiger Metallionen-Transporter und der Eisen(III)-Siderophor-Biosynthese hochreguliert vorlagen. In der Komplementationsmutante konnten nur von den letzteren Genen Transkriptlevel vergleichbar mit denen des Wildtyps wiedergefunden werden.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das kleine Zinkfinger-Protein HVO_2753 eine essenzielle Rolle in der positiven Regulation der Motilität, Chemotaxis und der Adhäsion bzw. Biofilmbildung spielt. Gleichzeitig übt HVO_2753 eine negative Regulation auf den Metallionen-Transport und die Biosynthese des Eisen(III)-Siderophors aus.
A method which serves to isolate the gonads from the sea cucumber (Holothuria polii) is outlined. Criteria that will secure a well determined status of maturity of the sperm are given. From this preparation a deoxyribonucleic acid is made, purified and analysed. It is concluded that the analytical data are in compliance with the theory of Crick and Watson. The ratio of Moles for this DNA while its nitrogen to phosphorus ratio on weight basis is 1,67.
In dieser Arbeit wurden Interaktionen zwischen Tumorzellen und Fibroblasten und die Rolle von MMPs auf Tumorwachstum und Invasion untersucht. Die Studien erfolgten in dem in vitro Modell der organotypischen Zellkulturen, in dem eine Haut-ähnliche Situation rekonstruiert wird. Hierbei wachsen maligne Epithelzellen auf einer extrazellulären Matrix (Kollagen Typ I) in enger Nachbarschaft zu hierin eingebetteten Fibroblasten und bilden ein mehrschichtiges Epithel. Dabei sind Epithelien von malignen Keratinozyten durch ein Fehlen einer definierten Struktur und Polarität charakterisiert. Im HaCaT-Tumormodell konnte der essentielle Beitrag des Tumorstromas zur Tumorprogression nachgewiesen werden da eine Steigerung der Malignität von HaCaT-Tumorzellen bis hin zur Metastasierung nur durch Wachstum in der in vivo Umgebung der Nacktmaus nicht aber durch Selektion in vitro induzierbar war. In der vorliegenden Arbeit wurden humane Fibroblasten und ihre Interaktion mit den prämalignen HaCaT Zellen in vitro analysiert. Interessanterweise, kam es nur in der Anwesenheit von Fibroblasten zu einer Kollagengel-Degradierung. Diese Beobachtungen gingen mit einer Expressionsänderung von MMPs sowie von angiogenen Faktoren, wie VEGF und PDGF, einher. Ferner zeigte sich, dass in der OTK in der Abwesenheit von Fibroblasten MMP-2 geringer exprimiert wurde und vorwiegend in den oberen Zellschichten des Epithels zu detektieren war. Parallel dazu konnte in diesen Zellschichten eine gesteigerte Proliferationsaktivität nachgewiesen werden. In Anwesenheit von Fibroblasten jedoch wurde MMP-2 vorgefunden. Die Kollagengel-Degradierung in der Anwesenheit der Fibroblasten korrelierte auch mit einer verringerten TIMP-1/TIMP-2-Expression. Die geringe TIMP-2-Expression führt zu einem Anstieg von MMP-2, welches direkt den Prozess der Kollagengel-Degradierung in der OTK fördert. TIMPs spielen nicht nur in die Regulation der MMP Expression sondern auch in der anderer Wachstumsfaktoren, wie VEGF und PDGF, eine Rolle. Während wir in der OTK keinen Zusammenhang zwischen einer VEGF- und TIMP-Expression detektieren konnten, wurde PDGF in der OTK in der Abwesenheit der Fibroblasten stärker exprimiert. In Folge einer MMP-Inhibition mit einem MMPI (Ro28-2653) der selektiv MMP-2/MMP-9 hemmt, konnte die Kollagengel-Degradierung aufgehalten werden. Nach der Behandlung mit Ro28-2653 wurden die Expression der Proteine MMP-1/MMP-2 signifikant herrunterreguliert. Dagegen war eine Verringerung der MMP-9-Expression nur zu Beginn der Behandlung detektierbar. In der OTK wurde zusätzlich initial VEGF in Folge einer MMP-Inhibition herunterreguliert. Ab der dritten Woche war die VEGF-Expression in behandelten und unbehandelten Proben vergleichbar hoch. PDGF wurde zunächst herunterreguliert, später ab der zweiten Woche signifikant hochreguliert. PDGF ist in der Lage eine TIMP-1-Expression zu induzieren. In der OTK trifft dies für TIMP-1 und TIMP-2 zu. ECM und BM Degradierung sind eine der Vorraussetzungen für Gefäßsprossung. Es kam in vivo bei malignen HaCaT-ras-A-5RT3-Tumoren in Folge einer MMP-Inhibition (Ag3340) zu einer Induzierung der Gefäßreifung und der Zerstörung kleiner, unreifer Blutgefäße. Zusätzlich ließ sich mit MRT und Hochfrequenzsonographie eine Reduzierung der Tumorgröße; des relativen Blutvolumens und ein Anstieg des mittleren Gefäßdurchmessers bei therapierten Tieren detektieren. Dieser Anstieg des mittleren Gefäßdurchmessers, quantifiziert mittels „Vessel Size Imaging“, unterstützt die Annahme, dass eine MMP-Inhibition vorwiegend die kleinen unreifen Gefäße zerstört. Die großen und reifen Gefäße sind gegen eine anti-angiogene Therapie resistent. Immunhistologische Analysen verifizierten diese Ergebnisse. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Fibroblasten bei der Tumorinvasion von malignen Keratinozyten eine fundamentale Rolle spielen. Nur in der Anwesenheit der Fibroblasten war eine MMP-2-Expression nachweisbar Wahrscheinlich stimulieren Tumorzellen Fibroblasten - über parakrine Mechanismen - MMP-2 zu synthetisieren. In vivo spielen MMPs und TIMPs und Wachstumsfaktoren, wie VEGF und PDGF, eine wichtige Rolle beim Prozess der Angiogenese. Dies ließ sich mit nicht-invasiver Bildgebung bei HaCaT ras A 5RT3 Tumoren unter MMP-Inhibition anhand des Nachweises einer zunehmenden Gefäßreifung und des Rückgangs der kleinen, unreifen Gefäße zeigen.
Fluorescense spectra of lactate dehydrogenase * (E.C. 1.1.1.27) were investigated in the presence of the coenzyme fragments dihydronicotinamide mononucleotide and dihydronicotinamide-ribose-5'-pyrophospho- (P2) -5“-ribose. The reduced mononucleotide is enzymatically less active as a hydrogen donor. However, formation of a complex with the enzyme was not observed under the conditions used. All the other substances: dihydronicotinamide-ribose-5'-pyrophospho- (P2) -5“-ribose, dihydronicotinamide- benzimidazole-dinucleotide, dihydronicotinamide-3-desazapurine-dinucleotide and dihydronicotinamide-6-mercaptopurine-dinucleotide form more or less stable complexes with lactate dehydrogenase. The complexes do not markedly differ from the complex formed with the natural cofactor. In all cases spectra indicate change in conformation of the coenzyme by forming the coenzyme-enzyme-complex which has been proposed by VELICK 1 too. The cysteine residues of the lactate dehydrogenase are not essential for binding the coenzyme to the active center; this was shown with mercury blocked enzyme.
Ohne das Eingreifen des Menschen wäre Mitteleuropa fast ein reines Waldgebiet. Noch heute beheimaten die Wälder eine große Vielfalt an Pflanzen und Tieren, die für diese Region spezifisch sind. Regionale Besonderheiten gehen aber verloren, je mehr Menschen in die Ökosysteme eingreifen: So unterscheiden sich die Pflanzenarten auf der North Charles Street in Baltimore nur wenig von denjenigen der Mainzer Landstraße in Frankfurt. Gleichzeitig verdrängen zugewanderte und eingeschleppte Arten heimische Tiere und Pflanzen. Allerdings gibt es auch im Frankfurter Stadtgebiet echte Horte der Biodiversität.
Dem Wandel rechtzeitig begegnen : Landesförderung ermöglicht richtungsweisende Klimafolgenforschung
(2008)
Die Makrophytenvegetation eines stillgelegten Kanalabschnittes ("Alte Fahrt") bei Senden in Westfalen hat sich seit Beginn der 90er Jahre drastisch verändert. Aus einem typischen Potamogetonetum lucentis sind Reinbestände von Myriophyllum spicatum geworden, denen stellenweise Ceratophyllum demersum beigemischt ist. Die Ursachen für diese gravierenden Vegetationsveränderungen sind nicht klar. Da es sich um einen der bedeutendsten westfälischen Standorte des Potamogetonetum lucentis, einer in Nordrhein-Westfalen stark gefährdeten Pflanzengesellschaft, handelte, sind weiterführende Untersuchungen und Versuche zur Wiederansiedlung zu fordern.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Die Haarzellen des Innenohrs setzen durch Schallreize ausgelöste Schwingungen der Basilarmembran in elektrische Impulse um, die über Nerven an das Gehirn geleitet werden und dort nach komplexer neuronaler Verarbeitung die Hörwahrnehmung auslösen. Gleichzeitig erhalten die äußeren Haarzellen über absteigende Nervenverbindungen, die olivo-cochleären Neurone, auch Informationen vom Gehirn, durch die ihre Empfindlichkeit verändert werden kann. Über die Mechanismen dieser efferenten Beeinflussung der Reizverarbeitung im Innenohr ist noch wenig bekannt und auch ihre biologische Funktion ist noch nicht geklärt. Diskutiert wird eine Rolle bei der Verbesserung des Signal-Hintergrundrausch-Verhältnisses und im Zusammenhang mit selektiver Aufmerksamkeit, durch die relevante Anteile der akustischen Umwelt gezielt „herausgehört“ werden können. Ziel dieser Promotionsarbeit ist die Untersuchung der efferenten Beeinflussung der Vorgänge im Innenohr mithilfe der nicht-invasiven Messung von akustischen Beiprodukten der aktiven Reizverstärkung durch die äußeren Haarzellen, den otoakustischen Emissionen. Bei dieser Methode werden mit einem empfindlichen Mikrophon im Gehörgang Schallereignisse aufgenommen, die das Ohr selbst produziert. Die olivo-cochleären Efferenzen können experimentell durch Applikation von Rausch-Stimuli auf dem kontralateralen Ohr aktiviert werden und ihre Wirkung auf die Empfindlichkeit des Innenohrs anhand der Veränderungen der otoakustischen Emissionen auf dem anderen, ipsilateralen Ohr gemessen werden. In Messungen unterschiedlicher Typen von otoakustischen Emissionen am Menschen und an der Mongolischen Wüstenrennmaus konnten deutliche Veränderungen der otoakustischen Emissionen bei gleichzeitiger Beschallung des kontralateralen Ohrs gezeigt werden, die als Modulation der Haarzelleigenschaften und Beeinflussung der cochleären Verstärkung durch Aktivierung der absteigenden Nervenbahnen interpretiert werden können: Spontane otoakustische Emissionen (SOAE), die ohne jegliche akustische Stimulation vom Innenohr generiert werden, zeigten bei kontralateraler akustischer Stimulation eine Verminderung ihres Pegels und eine Erhöhung ihrer Frequenz. Die Pegelverminderung deutet auf eine Dämpfung der cochleären Verstärkungsmechanismen und die Frequenzerhöhung auf eine Erhöhung der Steifigkeit im Corti-Organ und hierdurch veränderte Resonanzeigenschaften nach Aktivierung der efferenten Neurone hin. Distorsionsprodukt-otoakustische Emissionen (DPOAE), die bei Stimulation mit zwei Reintönen (f1 und f2) in Folge der nichtlinearen Verstärkung durch die äußeren Haarzellen entstehen, waren durch kontralaterale akustische Stimulation ebenfalls klar in ihrem Pegel beeinflusst. Die Effekte, sowohl auf SOAE als auch auf DPOAE, waren abhängig vom Pegel des kontralateralen Stimulus und traten bereits bei niedrigen kontralateralen Stimuluspegeln, deutlich unter der Schwelle des Mittelohrreflexes, auf. Durch ihren Zeitverlauf konnten die Effekte den in der Literatur beschriebenen efferenten Vorgängen zugeschrieben werden. Bei anhaltender akustischer Stimulation traten Adaptationsphänomene auf. Weiterhin zeigte sich in Experimenten mit kontralateralem Schmalbandrauschen und Reintönen, dass die efferente Modulation selektiv auf bestimmte Bereiche des tonotop organisierten Innenohrs zielt, also frequenzspezifisch agiert, wobei Reintöne mit Frequenzen, die etwas tiefer als die Stimulationsfrequenz lagen, die größten Effekte erzielten. Dies steht in guter Übereinstimmung zu anatomischen Daten. Besonders interessant an den DPOAE-Messungen war, dass das quadratische Distorsionsprodukt der Frequenz f2-f1 wesentlich empfindlicher reagierte als das kubische Distorsionsprodukt der Frequenz 2f1-f2. Bisher gibt es kaum Daten zu Veränderungen der f2-f1-DPOAE durch efferente Mechanismen. Die beiden DPOAE-Typen sind durch unterschiedliche Parameter der dem Verstärkungsprozess zu Grunde liegenden Transferfunktion beeinflusst, und die experimentell nachgewiesenen Unterschiede deuten darauf hin, dass die Aktivierung der olivo-cochleären Efferenzen ihre dämpfende Wirkung auf die Schallverarbeitung im Innenohr durch eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers entfaltet. Diese Hypothese wurde an der Wüstenrennmaus durch einen ergänzenden methodischen Ansatz unterstützt, bei dem zusätzlich zur Evozierung und Messung von DPOAE mit und ohne gleichzeitiger kontralateraler Aktivierung der Efferenzen ein sehr tieffrequenter „Bias“-Ton mit hohem Pegel appliziert wurde, der das Corti-Organ und damit den Arbeitspunkt des cochleären Verstärkers periodisch auslenkte. Diese Tieftonstimulation hatte eine sehr starke, von der Phase des Bias-Tons abhängige Modulation des f2-f1-Pegels zur Folge, während 2f1-f2 kaum beeinflusst wurde. Das Muster der f2-f1-Pegelmodulation änderte bei zusätzlicher kontralateraler Schallapplikation deutlich seinen Charakter. Entsprechende Veränderungen in den Verzerrungsmustern konnten mithilfe eines einfachen Modells zur DPOAE-Generation, das auf der Beschreibung des Verstärkungsmechanismus durch eine Boltzman-Funktion basierte, simuliert werden. Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Schallverstärkung im Innenohr durch efferente Mechanismen moduliert wird und dies anhand der nicht-invasiven Messung von otoakustischen Emissionen nachweisbar ist. Dabei deuten die Ergebnisse auf eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers als Mechanismus der olivo-cochleären Modulation der Reizverarbeitung im Innenohr hin.
Organisation und Steuerung des Treiberameisenverhaltens südostasiatischer Ponerinen der Gattung Leptogenys Treiberameisen zeichnen sich durch eine einzigartige Kombination aus Wanderverhalten (häufige Umzüge) und koordinierter Massenjagd (kollektive Raubzüge) aus. Obwohl allgemein angenommen wird, daß die Kommunikation dieser Ameisen zu einem bedeutenden Teil durch Spurpheromone erfolgt, sind bisher in den drei Unterfamilien Ecitoninae, Dorylinae und Aenictinae nur wenige Drüsen bekannt, die derartige Pheromone produzieren. Welche Rolle einzelne Pheromonkomponenten bei der Koordination des komplexen Schwarmverhaltens spielen, wurde bislang noch nicht untersucht. In der Gattung Leptogenys gibt es ein weites Spektrum verschiedener Ökotypen, u.a. auch Arten, die echtes Treiberameisenverhalten zeigen. Bei sieben malaiischen Leptogenys-Arten wurde die Koordination des kollektiven Verhaltens auf Basis der Kommunikation zwischen den Einzelindividuen untersucht. Bei allen Arten wurden mehrere Spurpheromone entdeckt, die in den Gift- und in den Pygidialdrüsen lokalisiert waren. Ökologisch verschiedene Arten wiesen Unterschiede im Kommunikationssystem auf. Die Koordination des Treiberameisenverhaltens von L. distinguenda wurde besonders ausführlich untersucht. Diese Art besitzt ein Mehr-Komponenten-Signalsystem, bei dem die einzelnen Pheromone multiple Funktionen erfüllen. Die Pygidialdrüse enthält eine Pheromonkomponente, die ca. 20 min lang gute Spurfolge bewirkt. Sie dient der Orientierung einzelner Individuen und damit dem Koloniezusammenhalt. Aufgrund konzentrationsabhängiger Spurfolge und durch Modulation der Spurkonzentration kann eine langsame Rekrutierung auf neues Territorium mit diesem Pheromon koordiniert werden. Die Giftdrüse enthält zwei Pheromone. Eine sehr flüchtige Substanz (4-Methyl-3-Heptanon) bewirkt nur 1-2 min lang eine außerordentlich starke Attraktion sowie Erregung, Beschleunigung der Fortbewegung und Aggressivität. Mit dieser Komponente werden Beuterekrutierungen koordiniert. Die starke Wirkung kann das Verhalten zahlreicher Tiere und auf diese Weise sogar die Vorstoßrichtung ganzer Raubzüge beeinflussen. Aufgrund der extremen Flüchtigkeit des Pheromons ist dieser Einfluß jedoch nur momentan, so daß die Raubzugformation außerordentlich dynamisch ist. Eine zweite Komponente der Giftdrüse bewirkt bis zu 5 min lang gute Spurfolge ohne Erregung. Diese Substanz dient ebenfalls dem Koloniezusammenhalt. In den chemischen Spuren können Komponenten gemischt und der Informationsgehalt dadurch variiert werden. Zudem reagieren einzelne Tiere je nach Motivation nur auf bestimmte Komponenten, was situationsspezifisches Verhalten ermöglicht. Beute eintragende Arbeiterinnen folgen selektiv einer Komponente der Pygidialdrüse und ignorieren Komponenten der Giftdrüse. Auf diese Weise steuern sie gezielt das Nest an. In ähnlicher Weise fungieren beim Nestumzug hoch konzentrierte Spuren aus Pygidialdrüsensekret als Leitlinie zum neuen Nest. Umziehende Tiere meiden zudem sehr empfindlich das Sekret der Giftdrüse. Auf diese Weise werden Raubzugspuren klar unterschieden und nicht betreten, so daß beide für Treiberameisen charakteristischen Verhaltensweisen synchron ausgeführt werden können. Der Nestumzug wird mit einem distinkten, mechanischen Signal ausgelöst. Im Notfall kann ein Umzug oder Raubzug mit einer spezifischen Alarmsubstanz aus der Mandibeldrüse abrupt beendet werden. Dies ist z.B. von Bedeutung, wenn sich artgleiche Kolonien begegnen. Das Kommunikationssytem von L. distinguenda zeigt, wie komplexes Verhalten mit einem minimalen Satz an Signalen koordiniert werden kann. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit reicht ein einziges Pheromon bei weitem nicht aus, um treiberameisentypisches Verhalten zu realisieren. Treiberameisen sind besonders reich an Myrmekophilen. Die Integration dieser Ameisengäste vor allem in das Kommunikationssystem ihrer Wirte wurde in der vorliegenden Arbeit ebenfalls untersucht. Dabei wurden unterschiedliche Strategien vorgefunden, mit denen Myrmekophile den häufigen Umzügen ihrer Wirtskolonie folgen. Ein Teil der Arten läßt sich von den Ameisen auf der Brut aufsitzend in das neue Nest tragen. Diese Arten reagieren i.d.R. nicht auf die Pheromonspuren der Ameisen. Ein anderer Teil ist in der Lage, den Pheromonspuren aktiv zu folgen. Diese Fähigkeit ist erstmalig bei einer Spinne (Gamasomorpha maschwitzi) nachgewiesen worden. Einen besonders bemerkenswerten Gast stellt die neu beschriebene Lungenschnecke Allopeas myrmecophilos dar. Sie sondert selektiv bei Kontakt mit L. distinguenda ein spezifisches Attraktionssekret ab, welches die Ameisen dazu veranlaßt, die Schnecke mit den Mandibeln aufzunehmen und ins Nest zu tragen. A. myrmecophilos ist der erste nachgewiesene Fall eines Myrmekophilen aus dem Stamm der Mollusken.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
Wirtszellreaktivierung chemisch induzierter Letalschäden im DNS-haltigen Serratia-Phagen Kappa
(1965)
After treating free phage Kappa with nitrous acid, triethylenemelamine, ethylmethanesulfonate, or hydroxylamin and using these phages for infecting Serratia H Y wildtype cells, at least 20% of the lethal damage in the phage-DNA can be reactivated by the host ( = host cell reactivation). It is known that all lethal agents tested so far attack the primary structure of the D N A in different ways. Therefore, we assume that the target for the host cell reactivation consists of some damage in the secondary structure of the DNA, because there is probably some coincidence in the action of all agents. The hypothesis that in the DNA changes of thymine are a prerequisite for host cell reactivation has been disproved by the experiments with nitrous acid and ethylmethanesulfonate because both substances do not act on thymine.
UV inactivated KAPPA can be reactivated like other temperate phages by plating on uvirradiated host cells (indicator). The capacity of the indicator Serratia HY for multiplication of unirradiated KAPPA was about 0.1% survivors (colony formers). The induction of clear plaque (c·) mutants by irradiating extracellular KAPPA and plating on untreated indicator can be increased further about 2 to 4 times by using UV irradiated indicator. The increase of the number of c mutants under the latter conditions, with increasing UV dose given to the phage, was never a firstorder reaction. The highest frequency of c mutants obtained was about 4.5 per cent. Plating of unirradiated KAPPA on irradiated indicator (lowest survival fraction was 0.01%) never increased the spontaneous mutation rate to c. Two c mutants studied in detail belong to two different cistrons as shown in a complementation test (map distance about 5.3%). Only one of both was revertible to the phenotype c+ spontaneously and with a higher rate by UV. However, as shown in crossing experiments with the wild type, the backmutants do not have the original genotype but originated from mutations in at least two different intragenic suppressor loci; the map distances between them and the original c mutation were 0.64% and 0.13 per cent. Host range (h) and virulent (v) mutants could not be induced by irradiation of the free phage and plating on untreated indicator. This indicates that the UV induced high mutability of the c loci in KAPPA represents an exceptional case of behavior (UV-hot spot). Some unstable h mutants could be isolated by plating irradiated phage on irradiated indicator.
Tiere und Menschen sind für das tägliche Überleben auf eine schnelle Bewertung und flexible Nutzung verschiedenster Umweltreize angewiesen. So nutzen Vögel, wie viele andere Tiere, sowohl den Magnetsinn als auch die Geometrie der Umgebung und Landmarken, um sich im Raum zu orientieren. Auch erfolgt eine schnelle und komplexe Auswertung des visuellen Inputs, beispielsweise, um bei der Futtersuche selektiv Futterkörner finden zu können. Unklar ist bislang, wie Raum- und Objektinformation in den beiden Hirnhälften verarbeitet werden und wie die Aufgabenteilung zwischen den Hemisphären aussieht. Zur Klärung dieser Thematik soll die vorliegende Arbeit beitragen, wobei die Versuche so angelegt wurden, dass mögliche, grundlegende Verarbeitungsstrategien unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden konnten: Zum einen wurden den Tieren prinzipiell unterschiedliche Aufgaben präsentiert, um über verschiedene Bereiche auf dem Gebiet der Raum- und Objektverarbeitung hinweg vergleichen zu können. Zum anderen wurde mit den beiden zurzeit wichtigsten Vogelmodellen gearbeitet, der Brieftaube (Columba livia) und dem Haushuhnküken (Gallus gallus). Dies erlaubt einerseits den Vergleich eigener Ergebnisse mit anderen Befunden innerhalb derselben Art, während andererseits auch Parallelen und Unterschiede zwischen verschiedenen Arten betrachtet werden können. Vögel eignen sich hierbei aufgrund ihrer Anatomie besonders gut für die Erforschung von Hemisphärenunterschieden. Durch ein nahezu vollständiges Überkreuzen der Sehnerven und das Fehlen eines Corpus callosum oder anderer funktionell entsprechender Strukturen zum Informationsaustausch zwischen den Hirnhälften wird der visuelle Input eines Auges überwiegend in der gegenüberliegenden Hirnhälfte verarbeitet. Lateralisation kann daher sehr leicht durch Abdecken eines Auges untersucht werden. Bei Brieftauben wurde die Repräsentation von Geometrie und Landmarken untersucht (Kapitel 2). Die Tiere lernten hierbei, das Zentrum einer quadratischen Arena mithilfe rein geometrischer Hinweise oder mittels einer Kombination von Geometrie und Landmarken zu finden. Durch Verändern der verfügbaren Informationsart wurde untersucht, welche Informationen die Tauben zum Lokalisieren des Zentrums nutzten. Die Ergebnisse zeigen mit einer beidseitigen Verarbeitung ein qualitativ anderes Muster der Repräsentation von Rauminformationen als bislang bei anderen Arten, wie z.B. dem Haushuhnküken, beschrieben. Ferner hing der relative Gebrauch von Geometrie und Landmarken in starkem Maße von der vorherigen Erfahrung der Tauben ab. In einer weiteren Studie wurde die Verarbeitung von Magnetkompassinformation bei Brieftauben untersucht (Kapitel 3). Hierbei wurde erstmals erfolgreich ein Versuchsdesign zur Laboruntersuchung entwickelt. Auch bei dieser Raumkognitionsaufgabe wurde ein Unterschied zu der bei anderen Arten gefundenen linkshemisphärischen Spezialisierung zugunsten einer Verarbeitung sowohl in der linken als auch in der rechten Hirnhälfte gefunden. Während die Tauben hierbei mit der rechten Hirnhälfte lediglich die richtige Achse wahrnahmen, erfassten sie mit der linken Hemisphäre die spezifische Richtung. Dies könnte die gefundene linkshemisphärische Überlegenheit im Freiland erklären. Erstmals bei Vögeln wurde beim Haushuhnküken in einem weiteren Versuch die hemisphärische Verarbeitung von Raumfrequenzinformation untersucht, die sowohl für die visuelle Raumorientierung als auch für das Objekterkennen von großer Bedeutung ist (Kapitel 4). Die Raumfrequenz ist hierbei allgemein als ein Maß für die Wiederholungen einer Struktur über eine bestimmte Strecke definiert und kann zur Charakterisierung beliebig komplexer Objekte verwendet werden. Die Küken wählten zwischen simultan dargebotenen Objekten, deren Oberflächen sich hinsichtlich ihrer Raumfrequenzen unterschieden. Die Ergebnisse weisen auf eine Spezialisierung der linken Hirnhälfte für hohe und der rechten Hirnhälfte für niedrige Raumfrequenzen hin. Aufgrund der Parallelen zu Befunden beim Menschen könnte dies auf eine gemeinsame Grundlage der Lateralisationsentwicklung bei Wirbeltieren hindeuten. Während sich die vorangehenden Studien der vorliegenden Arbeit mit Spezialisierungen der linken und rechten Hirnhälfte bei der Verarbeitung von Raum- und Objektinformation befassten, wurde in Kapitel 5 das Zusammenwirken von linker und rechter Hirnhälfte bei der selektiven Nahrungssuche untersucht. Hierbei konnte am Beispiel des Haushuhnkükens erstmals bei Vögeln Hemisphärenkooperation gezeigt werden, was als Hinweis darauf zu werten ist, dass eine bilaterale Repräsentation im Vogelhirn in komplexen Situationen, die eine rasche und effiziente Beurteilung des gesamten überschaubaren Bereichs erfordern, möglich ist. Insgesamt zeigen die Ergebnisse für mehrere wichtige Fragen der Lateralisationsforschung wie die Erfahrungsabhängigkeit, den Nachweis unterschiedlicher Lateralisationsmuster bei Brieftauben und Haushuhnküken in der geometrischen Orientierung oder die Kooperation der Hirnhemisphären, dass bisherige Ansichten über die Verarbeitung von Raum- und Objektinformation bei Vögeln einer kritischen Überarbeitung bedürfen.
Im Hauptteil der Dissertation wird die Expression und Lokalisation organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, die unter der Kontrolle des GFAP-Promotors EGFP exprimiert, analysiert. Zum einen wird ein grundlegender Vergleich der Expression synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der Ratte und der PGFAPEGFP-Maus angestellt, zum anderen werden Kulturdauer- und Altersabhängigkeit der Expression untersucht. Des weiteren wird die Expression organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der PGFAPEGFP-MauS in situ überprüft. Die immuncytologischen Untersuchungen zeigten zum einen die Expression und organelläre Lokalisation der synaptischen Proteine SNAP-25, SV2, VAMP2 und Synaptophysin in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, zum anderen einen kulturdauerabhängigen Rückgang der Expression von SNAP-25, wie er für kultivierte Astrocyten aus Neopallia der Ratte beschrieben ist. Des weiteren wird festgestellt, dass die Expression organellärer und synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der PGFAPEGFP-Maus keine Eigenschaft undifferenzierter Astrocyten oder Vorläuferzellen ist. Eine vergleichbare Expression solcher Proteine findet sich in astroglialen Primärkulturen, die aus den Gehirnen unterschiedlich alter Tiere gewonnen worden waren. In der vorliegenden Arbeit gelingt erstmals der Nachweis der Expression und organellären Lokalisation verschiedener organellärer und synaptischer Proteine (SNAP-23, SNAP-25, Synaptophysin, Cellubrevin, SCAMP, vATPase) in Astrocyten in situ. Dieser Befund birgt weitreichende Implikationen bezüglich der in der glialen Signalübertragung und bidirektionalen Kommunikation mit Neuronen verwendeten zellulären Mechanismen in sich. Aufgrund des proteinären Repertoires erscheint es möglich, dass Astrocyten in situ eine mit Neuronen vergleichbare molekulare Maschinerie zur regulierten exocytotischen Freisetzung besitzen. Ein weiterer Teil der Arbeit stellt die Expression und Calcium-abhängige Freisetzung des modulatorischen Neuropeptids Secretogranin II aus U373MG Astrocytoma-Zellen dar. Dieser Zelltyp wird als mögliches Modellsystem für kultivierte hippocampale Astrocyten vorgeschlagen.
Reaktive Sauerstoffspezies lösen molekular Schäden aus und werden als möglicher Auslöser des Alterungsprozesses gesehen. Sie sind allerdings auch wichtige Signalgeber, deren Einfluss in den letzten Jahren immer mehr Beachtung findet. Im der vorliegenden Arbeit wurde die Signalwirkung von ROS auf das Alternsmodell P. anserina untersucht. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden.
1. Die H2O2–Konzentration im Extrazellularraum und im Cytoplasma steigt bei PQ-Stress und während des Alterns an.
2. Bei PQ-Stress und während des Alterns treten Ähnlichkeiten der globalen Transkriptregulation auf, die vermutlich durch die angestiegene H2O2-Konzentration ausgelöst werden.
3. Die Transkriptmenge von SODs und die Gesamt-SOD-Aktivität sind bei PQ-Stress leicht herunterreguliert. Transkripte für PaCCP1 und PaCATB treten dagegen bei PQ-Stress vermehrt auf und auch die Gesamt-Katalase-Aktivität steigt an. Dies deutet darauf hin, dass der Fokus des enzymatischen Abbaus von ROS bei PQ-Stress nicht im Abbau von Superoxid-, sondern von Wasserstoffperoxid liegt.
4. Bei PQ-Stress steigt die Transkriptmenge von Schlüsselgenen der Carotinoid-Biosynthese.
5. Transkripte von mitochondrial lokalisierten Proteinen werden bei PQ-Stress stark hochreguliert, die Menge an Mitochondrien nimmt allerdings nicht zu. Dies deutet auf einen verstärkten Abbau mitochondrialer Proteine, gefolgt von einer Neusynthese hin.
6. Bei PQ-Stress sinkt die Expression von Genen, die für den Kupferimport benötig werden. Dies wird höchstwahrscheinlich durch die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors GRISEA ausgelöst. Es kommt zu einem Kupfermangel, der eine verstärkte alternative PaAOX-abhängige Atmung auslöst und dafür sorgt, dass kupferabhängige Prozesse, wie die Melanin- und Sterigmatocystin-Synthese transkriptionell herunterreguliert werden. Durch die verringerte Transkriptmenge von Kupferimportern bei PQ-Stress kommt es zu starken Gemeinsamkeiten in der globalen Genregulation von PQ-gestressten Kulturen und der Kupfer-depletierten Mutante grisea.
7. Kupfer und PQ haben einen synergistisch negativen Effekt auf Wuchsrate und Lebensspanne von P. anserina. Bei hohen Kupfer und Superoxid-Konzentrationen kommt es vermutlich zur verstärkten Bildung von Hydroxyl-Radikalen, wodurch molekulare Schäden entstehen. Durch eine verringerte Kupferkonzentration wird der Organismus bei PQ-Stress möglicherweise vor der Bildung von Hydroxyl-Radikalen geschützt.
Insgesamt haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROS wichtige Signalmoleküle sind, die einen starken Einfluss auf die Regulation von Transkripten haben. Viele dieser transkriptionellen Regulationen führen zu physiologischen Veränderungen. Der Fokus der Regulationen liegt unter den verwendeten Bedingungen im Schutz vor den schädlichen Effekten von ROS.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für industrielle Fermentationsprozesse an. Dabei könnte z.B. die Hefe Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung von Bioalkohol eingesetzt werden. S. cerevisiae kann jedoch die in großen Mengen in der Biomasse enthaltenen Pentosen D-Xylose und L-Arabinose nicht vergären. Deshalb wäre ein Hefestamm mit entsprechend erweitertem Substratspektrum von großem wirtschaftlichen Interesse. In dieser Arbeit sollte rekombinante Hefestämme konstruiert bzw. optimiert werden, die in der Lage sind D-Xylose und/oder L-Arabinose zu Ethanol zu vergären. Zunächst wurde ein bereits vorhandener L-Arabinose vergärender Hefestamm unter Einsatz der Methoden der „gerichteten Evolution“ optimiert, L-Arabinose effektiver zu verstoffwechseln. Dies geschah durch repetitive Selektion auf Wachstum mit L-Arabinose als einziger Kohlenstoffquelle unter Sauerstoff-limitierten Bedingungen. Eine genetische und physiologische Charakterisierung des Stammes ergab, dass dieser sowohl Mutationen im Hefegenom als auch auf den L-Arabinose Stoffwechselweg exprimierenden Plasmiden erworben hatte. Dieser Stamm exprimierte die für den L-Arabinose Katabolismus notwendigen Enzyme und Transporter von vier verschiedenen Plasmiden. Für den industriellen Einsatz eines rekombinanten Hefestammes ist es jedoch unerlässlich, die Gene des L-Arabinose Katabolismus stabil in das Genom zu integrieren. In dieser Arbeit ist es gelungen, zwei der insgesamt drei essentiellen Gene des Stoffwechselweges in funktioneller Form in den rDNA-Locus von S. cerevisiae zu integrieren. Im letzten Teil der Arbeit konnte erstmals ein Hefestamm konstruiert werden, der sowohl die Gene des Stoffwechselweges für den L-Arabinose- als auch die des Stoffwechselweges für den D-Xylose-Katabolismus exprimiert. Der Stamm war in der Lage auf Nähragarplatten zu wachsen, bei denen L-Arabinose oder/und D-Xylose die einzigen Kohlenstoffquellen darstellten. Wachstumstests mit Flüssigkulturen sowie HPLC-Analysen des Zuckerverbrauchs ergaben jedoch, dass der Hefestamm überraschenderweise nicht in der Lage war, D-Xylose in Flüssigmedien zu verstoffwechseln. Mögliche Erklärungen hierfür werden diskutiert.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für biotechnologische Fermentationsprozesse an. Für die Herstellung von Bioethanol ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae der wichtigste Produktionsorganismus. Allerdings kann S. cerevisiae die in Biomasse in großer Menge enthaltenen Pentosen Xylose und Arabinose nicht verwerten. Für einen ökonomisch effizienten Fermentationsprozess ist es daher essentiell, das Substratspektrum der Hefe entsprechend zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, den bereits in Hefe etablierten bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg signifikant zu verbessern. Genetische und physiologische Analysen ergaben, dass eines der heterolog produzierten Enzyme, die L-Arabinose-Isomerase aus Bacillus subtilis, einen limitierenden Schritt innerhalb des Stoffwechselweges darstellte. In einem genetischen Screening konnte ein aktiveres Isoenzym aus Bacillus licheniformis gefunden werden. Zusätzlich wurde der Codon-Gebrauch aller heterologen bakteriellen Gene dem Codon-Gebrauch der hoch-exprimierten glykolytischen Gene von S. cerevisiae angepasst. Mit diesem rationalen Ansatz konnte die Ethanolproduktivität aus Arabinose um mehr als 250% erhöht werden, der Ethanolertrag wurde um über 60% gesteigert. Dies stellte die erste erfolgreiche Verbesserung eines heterologen Stoffwechselwegs in S. cerevisiae über Codon-optimierte Gene dar. In einem breit angelegten Screening wurde zum ersten Mal eine prokaryontische Xylose-Isomerase gefunden, die in S. cerevisiae eine hohe Aktivität aufweist. Durch das Einbringen des xylA-Gens aus Clostridium phytofermentans in verschiedene Hefe-Stämme wurden diese in die Lage versetzt, Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen. Zusätzlich konnte damit die Vergärung von Arabinose und Xylose in einem einzigen S. cerevisiae-Stamm kombiniert werden. Vorherige Versuche, einen Pentose-vergärenden Stamm zu konstruieren, der einen bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg mit dem eukaryontischen Xylose-Reduktase/Xylitol-Dehydrogenase-Weg kombinierte, scheiterten an der unspezifischen Umsetzung der Arabinose durch die Xylose-Reduktase zu dem nicht weiter verstoffwechselbaren Arabitol. Für einen industriellen Einsatz der rekombinanten Hefen war es unerlässlich, die Eigenschaften für die Pentose-Umsetzung in Industrie-relevante Hefe-Stämme zu übertragen. Durch die Etablierung von genetischen Methoden und Werkzeugen ist es in dieser Arbeit gelungen, Industrie-Stämme zu konstruieren, die in der Lage sind, Arabinose oder Xylose zu metabolisieren. Dabei wurden die heterologen Gene stabil in die Chromosomen der Stämme integriert. Diese wurden mit Hilfe von „Evolutionary Engineering“ so optimiert, dass sie die Pentose-Zucker als alleinige Kohlenstoffquellen zum Wachstum nutzen konnten. Fermentationsanalysen zeigten eine effiziente Umsetzung der Pentosen zu Ethanol in diesen Stämmen. Damit ist ein neuer Startpunkt für die Konstruktion von industriellen Pentose-fermentierenden Hefe-Stämmen markiert, der zukünftig effizientere Bioethanol-Produktion ermöglichen wird.
Das Thema der vorliegenden Arbeit war die molekulargenetische Charakterisierung der Funktion der Glukosesensoren Snf3 und Rgt2 in der Hefe S. cerevisiae. Snf3 und Rgt2 gehören zur Familie der Hexosetransporter. Sie unterscheiden sich von ihnen jedoch in ihrer Funktion als Glukosesensoren wie auch durch ihre ungewöhnlich langen Cterminalen Domänen. Snf3 und Rgt2 sind integrale Membranproteine, die als Reaktion auf extrazelluläre Glukose Signale auslösen, die zur Expression bestimmter Hexosetransporter führt. Einige Komponenten, die an der Signaltranduktion beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Jedoch ist der genaue Mechanismus, der zur Expression der Hexostransporter führt, noch nicht vollständig aufgeklärt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Proteine Snf3, Rgt2, Mth1, Std1 und Rgt1 auf direkte Interaktionen untereinander getestet, um Einblicke in den molekularen Mechanismus der Signaltransduktion zu erhalten. Desweiteren sollte festgestellt werden, ob die Protein-Wechselwirkungen von der C-Quelle abhängig sind. Es konnte gezeigt werden, dass zwischen den Membranproteinen Rgt2 bzw. Snf3 und den löslichen Proteinen Mth1 bzw. Std1 Interaktionen in Abhängigkeit von Glukose stattfanden. Diese Ergebnisse unterstützen das von Moriya und Johnston aufgestellte, gegenwärtige Modell für eine glukoseinduzierte HXT Genexpression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob sich aus dem Glukosesensor Snf3 durch eine Aminosäuresubstitution ein bifunktionaler Sensor für Glukose und Galaktose erzeugen läßt. Dazu wurden die für den Galaktosetransport verantwortlichen Aminosäuren in den homologen Positionen von Snf3 ausgetauscht. Die Bestimmungen der Regulation des Snf3-kontrollierten HXT7 Promotors ergaben, dass das mutierte Snf3 Protein, wie das Wildtyp-Snf3 Protein, eine normale Glukosesensorfunktion ausübt aber keine Galaktosesensorfunktion vorzeigt.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Fachliche Exzellenz und Bildungsnotstand – diese beiden Extreme beherrschen gegenwärtig die Diskussion um Schul- und Hochschulausbildung. Die Universität Frankfurt stellt sich der Elitediskussion und setzt auf Fokussierung und Schwerpunktbildung. Studiengänge werden modifiziert, die Art und Vielfalt möglicher Abschlüsse internationalen Standards angepasst. Die Universität will und wird wettbewerbsfähig sein, auch im internationalen Vergleich. Darüber sprach Dr. Monika Mölders mit Prof. Dr. Günther Wess, Honorarprofessor der Universität Frankfurt, Forschungsleiter Europa von Aventis und Mitglied der Geschäftsführung der Aventis Pharma Deutschland GmbH.
Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.
Hypoxie entsteht, wenn das Sauerstoffangebot bzw. die Sauerstoffversorgung unter ein Niveau sinkt, das benötigt wird, um physiologische O2-Drücke des betreffenden Gewebes aufrecht zu erhalten. Sinkt der Sauerstoff-Partialdruck, so werden adaptive Mechanismen aktiviert. Neben der Anpassung durch das kardiovaskuläre System werden auch verschiedene Gene aktiviert. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass Hypoxieinduzierte Genexpression insbesondere von zwei Transkriptionsfaktoren, HIF (hypoxia inducible factor) -1 und -2 , gesteuert wird. Man kennt über 70 Gene, die von HIF transaktiviert werden. Dabei handelt es sich um Modulatoren von Angiogenese und Vasodilatation, Erythropoese sowie der Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse. Die Hypoxie-induzierbare Genexpression wird sowohl über eine Steigerung der Transaktivierungsaktivität als auch der Proteinmenge der HIF- -Untereinheiten reguliert. Die Regulation der HIF-Proteinmenge erfolgt über eine vom O2-Partialdruck abhängige Stabilisierung der -Untereinheit des Proteins. Unter normoxischen Bedingungen wird das Protein durch die Prolylhydroxylasen (PHD) O2-abhängig hydroxyliert, pVHL-vermittelt (VHL = von Hippel-Lindau), ubiquitiniert und proteosomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen dagegen wird das Protein stabilisiert, akkumuliert im Zellkern und bindet an eine spezifische Zielsequenz, das Hypoxia-responsive element oder HRE, imPromotor von Hypoxie-aktivierten Genen. Die PHDs gehören zu einer Familie von Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen. Neben diesen Faktoren wird eine Regulation von HIF durch Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) in der Literatur sehr kontrovers diskutiert, da die Wirkung von ROS auf HIF sich unter Normoxie, Hypoxie oder dem Einfluss von Wachstumsfaktoren unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Frage, welche Rolle die PHDs bei der ROS-vermittelten HIF-Regulation spielen, beantwortet werden. Der zugrunde liegende Mechanismus wurde anhand von Glioblastom-Zelllinien untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt eine Stabilisierung von HIF nach Verringerung der ROS-Konzentration unter Normoxie. Eine Erhöhung der ROS-Konzentration führt dagegen zu einer dosisabhängigen Verminderung von HIF und der HIF-Targetgen-Expression. Es konnte eine direkte Abhängigkeit der Destabilisierung von VHL und den Prolylhydroxylasen gezeigt werden, da sowohl eine VHL-Defizienz als auch eine Mutation der Prolylreste oder eine Inhibition der PHDs zu einer Aufhebung des Effekts führen. Eine vergleichbare destabilisierende Wirkung auf HIF übt Ascorbat aus. Überraschenderweise führt sowohl die Zugabe von H2O2 mit seiner oxidativen Wirkung als auch die Zugabe des Reduktionsmittels Ascorbat zu einer Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes. Dieser Befund kann durch eine Aktivierung von Enzymen mit eisenreduzierenden Eigenschaften erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinfamilie der Ferrireduktasen (FR) identifiziert und fünf Enzyme, die eine Homologie zur cytb561-Domäne aufweisen, kloniert. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte, dass die Enzyme tatsächlich eine eisenreduzierende Aktivität aufweisen, die durch die exogene Zugabe von ROS noch erhöht wird. Eine Überexpression der FR führt zu einem erhöhten Abbau von HIF. Ein knock down mittels siRNA führt dagegen zu einer Akkumulation von HIF und die destabilisierende Wirkung von ROS ist nach einemknock down der FR deutlich reduziert. Aufgrund der in dieser Doktorarbeit gezeigten Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Die primäre oxidative Wirkung von ROS führt vermutlich zu einer Aktivierung der Ferrireduktasen, die in Abhängigkeit von Ascorbat dann vermehrt Eisen reduzieren, so dass dies den PHDs als Substrat zur Verfügung steht. Der regulierende Einfluss auf HIF wird somit vermutlich über eine erhöhte Aktivität der Prolylhydroxylasen durch eine Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes vermittelt. Die erhobenen Daten deuten an, dass die Familie der Ferrireduktasen ein zentrales Bindeglied im O2-Sensing darstellt, das in Abhängigkeit von Redox-Signalen homeostatische Antworten auf Hypoxie moduliert.
In dieser Arbeit wurde erstmals ein monokolonaler Antikörper gegen die GlyRbeta-Untereinheit (GlyRbeta) hergestellt. Zur Immunisierung der Mäuse wurde die 120 AS lange große cytoplasmatische Schleife (engl. loop) zwischen den transmembranen Domänen 3 und 4 von GlyRbeta gewählt, da diese nur geringe Sequenzhomologie zu GlyRalpha-Untereinheiten aufweist. Diese Schleifenregion wurde als GST-Fusionsprotein in Bakterien exprimiert und affinitätsgereinigt. Sowohl die Immunisierung der Mäuse als auch die Herstellung der Hybridoma-Klone wurde in Zusammenarbeit mit Synaptic Systems GmbH (Göttingen) durchgeführt. Die Spezifität der Antikörperbindung an GlyRbeta wurde zunächst in Western Blot-Experimenten mit affinitätsgereinigtem GlyR aus Rattenrückenmark demonstriert. Eine nachfolgende Untersuchung der Antikörperbindestelle führte zur Identifikation der ersten 20 AS des beta-loop (GlyRbeta336-355) als Epitop. Ein 20 AS kurzes, synthetisches Peptid, welches die Epitop-Sequenz enthielt, war ausreichend, um Färbungen von Western Blots und Gewebeschnitten durch den Antikörper effizient zu verhindern. Außerdem wurden Protokolle für die Antikörperfärbung von GlyRbeta in transfizierten Zelllinien und primären Neuronen aus Rattenrückenmark etabliert. Weiterhin ermöglichte die Herstellung dieses Antikörpers erstmals die direkte immunhistochemische Färbung von GlyRbeta-Protein im ZNS von Mäusen. GlyRbeta konnte hierbei im Hirnstamm, Rückenmark, dem Bulbus olfactorius und der Retina von Mäusen nachgewiesen werden, was zeigt, dass GlyRbeta-Protein weit weniger verbreitet ist als aufgrund von in situ Hybridisierungs-Studien vermutet. Die gefundene Verteilung von GlyRbeta-Protein unterscheidet sich demnach stark von der Verteilung der GlyRbeta-mRNA, was für eine posttranskriptionelle Regulation der GlyRbeta-Proteinmenge spricht. Weiterführende immunhistochemische Untersuchungen an der Retina von Mäusen zeigten, dass GlyRbeta in diesem Gewebe wie erwartet mit Gephyrin an inhibitorischen Synapsen kolokalisiert ist. In Bezug auf GlyRalpha-Untereinheiten geht man bislang davon aus, dass sie an Synapsen des adulten ZNS immer mit GlyRbeta assoziiert sind, und somit indirekt mit Gephyrin verbunden werden, wodurch das Clustering der Rezeptoren gewährleistet wird. Entgegen dieser Hypothese wurde in Doppelfärbungen von GlyRbeta und GlyRalpha-Untereinheiten gefunden, dass eine Ansammlung von GlyRalpha4-Clustern in der Retina adulter Mäuse vermutlich eine Ausnahme hierzu bildet. Für GlyRalpha4-Cluster in Stratum 3 und 4 der IPL konnte gezeigt werden, dass sie teilweise nicht mit GlyRbeta, und zu ebenso großem Teil nicht mit Gephyrin kolokalisiert sind. Dennoch scheinen diese GlyRalpha4-Untereinheiten in Clustern angereichert und zudem synaptisch lokalisiert zu sein. Der Mechanismus, durch den GlyRalpha4 in Abwesenheit dieser beiden Proteine an Synapsen immobilisiert wird, ist bislang völlig unklar. Funktionell wäre denkbar, dass derartige Rezeptorkomplexe den synaptischen Eingängen von ON-Starburst-Amakrinzellen besondere Leitungseigenschaften verleihen und somit maßgeblich an der Verarbeitung richtungsselektiver Signale in der Retina beteiligt sein könnten. In dieser Arbeit wurden außerdem Mutagenesestudien durchgeführt, um zu klären, über welchen Mechanismus die Inhibition der Proteinphosphatasen 1 und 2A (PP1 und PP2A) zum Verlust von synaptischem Gephyrin führt. Es konnte gezeigt werden, dass eine direkte Dephosphorylierung von Gephyrin durch PP1 hierfür wahrscheinlich nicht verantwortlich ist, da die Mutation etablierter Phosphorylierungsstellen von Gephyrin keinen, oder nur einen marginalen Einfluss auf dessen synaptische Lokalisation und das Clustering von GABAARs hatte. Dies spricht dafür, dass PP1/PP2A abhängige Dephosphorylierungs-/Phosphorylierungsprozesse wahrscheinlich andere Gephyrin- oder Cytoskelett-assoziierte Proteine beeinflussen, jedoch nicht direkt an Gephyrin wirken. Die Erstellung von genomweiten Expressionsprofilen ist eine effiziente Methode zur Identifikation neuer Regulationsmechanismen und potentieller Interaktionspartner von Genprodukten und wurde in dieser Arbeit auf Vorderhirnproben von WT- und Gephyrin-KO-Mäusen vergleichend angewendet. Hierbei wurde gefunden, dass die Transkription bekannter Gephyrin-Interaktionspartner durch den Verlust des Gephyrin-Gens nicht messbar verändert wird. Weil die ermittelten Unterschiede in Transkriptmengen generell sehr gering waren, ist zu vermuten, dass Gephyrin keine wesentlichen genregulatorischen Funktionen im Mausgehirn ausübt. Andererseits ergab die Expressionchip-Analyse Hinweise auf neue Genprodukte, für die in WT- und Gephyrin-KO-Mäusen signifikant verschiedene Transkriptionsmengen gefunden wurden. Die Validierung dieser Daten mit anderen Methoden steht jedoch noch aus.
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.
Die vorliegende Studie vermittelt einen epidemiologischen Überblick über das mit Haut- und Nagelläsionen assoziierte Pilzspektrum im Westen Panamas. Hierzu wurden Proben von vermutlich durch Pilzinfektionen verursachten Haut- sowie Nagelläsionen gesammelt und zum Anlegen von Kulturen verwendet. Die isolierten Pilze wurden basierend auf dem D-H-S System (Rieth), anhand morphologischer Merkmale, rDNA Sequenzdaten sowie phylogenetischen Analysen klassifiziert und mit Hilfe von Literaturdaten sowie physiologischen Eigenschaften als saprotrophe, opportunistische oder pathogene Organismen beurteilt. In Panama wurden 52 Proben von 51 Personen gesammelt, wobei das Material von 42 Haut- und Nagelläsionen der Füße, vier Läsionen der Fingernägel, zwei Chromomykosen, einer Tinea nigra und drei sonstigen Hautläsionen stammt. Bei 75 Prozent (n = 39) der Proben konnten Pilze kultiviert und insgesamt 201 Pilzstämme isoliert und subkultiviert werden. Hiervon wurden 50 Isolate (24,9 %) als Dermatophyten, 24 Stämme (11,9 %) als Hefen und 127 Isolate (63,2 %) als Schimmelpilze klassifiziert. Bei 19 Probanden (48,7 %) konnten Dermatophyten isoliert werden, wobei aus dem Probenmaterial von 12 Personen (63,2 %) ebenfalls andere Pilzarten nachgewiesen wurden. Von zwei Läsionen (5,1 %) wurden nur Hefen isoliert, wobei einmal eine Schwarze Hefe kultiviert wurde. In dem Material acht weiterer Proben (20,5 %) wurden Schimmelpilze und Hefestämme nachgewiesen und bei zehn Probanden (25,6 %) konnten aus dem Probenmaterial nur Schimmelpilze kultiviert werden. 172 Isolate wurden taxonomisch klassifiziert und 44 Arten aus 25 Gattungen, 17 Familien, 15 Ordnungen, sechs Klassen sowie den Abteilungen Ascomycota oder Basidiomycota zugeordnet. Die Ascomyceten stellen mit 164 Stämmen 40 verschiedener Arten aus 23 Gattungen, 15 Familien, 11 Ordnungen und vier Klassen die am häufigsten isolierte und vielfältigste Gruppe dar, während die Basidiomycota nur mit acht Isolaten vier verschiedener Arten zwei unterschiedlicher Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen nachgewiesen wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Panama die anthropophilen Dermatophyten Trichophyton rubrum und T. interdigitale dokumentiert, wobei T. rubrum die am häufigsten isolierte Art darstellt. Kultivierte Hefen waren Candida albicans, C. duobushaemulonii, C. tropicalis, Hortaea werneckii, Sporobolomyces sp., Trichosporon asahii, T. japonicum und T. montevideense. Die Schimmelpilze stellen die größte und ökologisch diverseste Organismengruppe der kultivierten Pilze dar. So wurden von den untersuchten Läsionen sowohl humanpathogene Erreger, als auch opportunistische Arten und rein saprotrophe Pilze sowie mehrere Vertreter wahrscheinlich bisher nicht wissenschaftlich beschriebener Arten bzw. Gattungen nachgewiesen. Aus dem Probenmaterial wurden die Pilze Acremonium collariferum, Aspergillus awamori, A. clavatus, A. flavus, A. giganteus, A. heteromorphus, A. niger, A. ochraceus, A. sclerotiorum, A. versicolor, Chaetomium globosum, Chrysosporium tuberculatum, Cladosporium sphaerospermum, C. tenuissimum, Curvularia geniculata, C. lunata, Fonsecaea pedrosoi, Fusarium oxysporum, F. solani, Lophotrichus bartlettii, Microascus cinereus, Neoscytalidium dimidiatum, Penicillium commune, Scolecobasidium sp., Scopulariopsis carbonaria, S. croci, Verticillium cf. epiphytum und Wardomycopsis litoralis isoliert. Zudem wurden vier Isolate von zwei vermutlich neuen Arten der Gattung Acremonium (Bionectriaceae, Hypocreales), zwei Stämme mit einer genetischen Affinität zu der Gattung Cryptendoxyla (Cephalothecaceae, Sordariales) und jeweils ein mit den Gattungen Fusicladium (Venturiaceae, Venturiales), Knufia (Trichomeriaceae, Chaetothyriales) bzw. Rhexothecium (Eremomycetaceae, Dothideomycetidae) assoziierter Stamm kultiviert. Im Rahmen dieser Studie wurden A. giganteus, C. tenuissimum, L. bartlettii, S. carbonaria, S. croci, V. epiphytum und W. litoralis erstmalig von Mykosen des Menschen dokumentiert und die in der Literatur als Verursacher sowie Besiedler von Haut- und Nagelläsionen beschriebenen Organismen A. clavatus, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, C. tropicalis, C. globosum, C. sphaerospermum, C. lunata, F. oxysporum, M. cinereus, P. commune, T. asahii, T. japonicum und T. montevideense wurden das erste Mal in klinischem Probenmaterial aus Panama nachgewiesen. Die Arten A. awamori, A. heteromorphus, C. globosum, C. tenuissimum, L. bartlettii, M. cinereus, P. commune, S. croci, T. asahii, T. japonicum, T. montevideense, V. epiphytum, W. litoralis und die Gattung Scolecobasidium wurden zudem erstmalig für Panama dokumentiert. Die Isolation von W. litoralis ist ebenfalls der erste Nachweis dieses Pilzes außerhalb von Spanien und auf dem amerikanischen Kontinent. Die große Anzahl im Rahmen dieser Arbeit beschriebener, bisher für die Wissenschaft unbekannter bzw. nicht in Panama dokumentierter Pilzarten lässt auf eine große mykologische Biodiversität in Panama schließen und zeigt den Bedarf weiterer Forschung.
Kenntnisse über die dreidimensionale Struktur therapeutisch relevanter Zielproteine bieten wertvolle Informationen für den rationalen Wirkstoffentwurf. Die stetig wachsende Zahl aufgeklärter Kristallstrukturen von Proteinen ermöglicht eine qualitative und quantitative rechnergestützte Untersuchung von spezifischen Protein-Liganden Wechselwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Algorithmen für die Identifikation und den Ähnlichkeitsvergleich von Proteinbindetaschen und ihren Eigenschaften entwickelt und in dem Programm PocketomePicker zusammengefasst. Die Software gliedert sich in die Routinen PocketPicker, PocketShapelets und PocketGraph. Ferner wurde in dieser Arbeit die Methode ReverseLIQUID reimplementiert und im Rahmen einer Kooperation für das strukturbasierte Virtuelle Screening angewendet. Die genannten Methoden und ihre wissenschaftliche Anwendungen sollte hier zusammengefasst werden: Die Methode PocketPicker ermöglicht die Vorhersage potentieller Bindetaschen auf Proteinoberflächen. Diese Technik implementiert einen geometrischen Ansatz auf Basis „künstlicher Gitter“ zur Identifikation zusammenhängender vergrabener Bereiche der Proteinoberfläche als Orte möglicher Ligandenbindestellen. Die Methode erreicht eine korrekte Vorhersage der tatsächlichen Bindetasche für 73 % der Einträge eines repräsentativen Datensatzes von Proteinstrukturen. Für 90 % der Proteinstrukturen wird die tatsächlich Ligandenbindestelle unter den drei wahrscheinlichsten vorhergesagten Taschen gefunden. PocketPicker übertrifft die Vorhersagequalität anderer etablierter Algorithmen und ermöglicht Taschenidentifikationen auf apo-Strukturen ohne signifikante Einbußen des Vorhersageerfolges. Andere Verfahren weisen deutlich eingeschränkte Ergebnisse bei der Anwendung auf apo-Strukturen auf. PocketPicker erlaubt den alignmentfreien Ähnlichkeitsvergleich von Bindetaschenfor-men durch die Kodierung berechneter Bindevolumen als Korrelationsdeskriptoren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für Funktionsvorhersage von Bindetaschen aus Homologiemodellen von APOBEC3C und Glutamat Dehydrogenase des Malariaerregers Plasmodium falciparum angewendet. Diese beiden Projekte wurden in Zusammenarbeit mit Kollaborationspartnern durchgeführt. Zudem wurden PocketPicker Korrelationsdeskriptoren erfolgreich für die automatisierte Konformationsanalyse der enzymatischen Tasche von Aldose Reduktase angewendet. Für detaillierte Analysen der Form und der physikochemischen Eigenschaften von Proteinbindetaschen wurde in dieser Arbeit die Methode PocketShapelets entwickelt. Diese Technik ermöglicht strukturelle Alignments von extrahierten Bindevolumen durch Zerlegungen der Oberfläche von Proteinbindetaschen. Die Überlagerung gelingt durch die Identifikation strukturell ähnlicher Oberflächenkurvaturen zweier Taschen. PocketShapelets wurde erfolgreich zur Analyse funktioneller Ähnlichkeit von Bindetaschen verwendet, die auf Betrachtungen physikochemischer Eigenschaften basiert. Zur Analyse der topologischen Vielfalt von Bindetaschengeometrien wurde in dieser Arbeit die Methode PocketGraph entwickelt. Dieser Ansatz nutzt das Konzept des sog. „Wachsenden Neuronalen Gases“ aus dem Bereich des maschinellen Lernens für eine automatische Extraktion des strukturellen Aufbaus von Bindetaschen. Ferner ermöglicht diese Methode die Zerlegung einer Bindestelle in ihre Subtaschen. Die von PocketPicker charakterisierten Taschenvolumen bilden die Grundlage für die Methode ReverseLIQUID. Dieses Programm wurde in dieser Arbeit weiterentwickelt und im Rahmen einer Kooperation zur Identifikation eines Inhibitors der Serinprotease HtrA des Erregers Helicobacter pylori verwendet. Mit ReverseLIQUID konnte ein strukturbasiertes Pharmakophormodell für das Virtuelle Screening erstellt werden. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifikation einer Substanz mit niedrig mikromolarer Affinität gegenüber der Zielstruktur.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung der neuronalen Prozesse, die auditorischen Lokalisationsleistungen zugrunde liegen. Viele der hierzu aktuell diskutierten Modellvorstellungen lassen sich auf ein von L. Jeffress bereits in der Mitte des letzten Jahrhunderts vorgeschlagenes Netzwerkmodell zurückführen: Nach Jeffress werden interaurale Laufzeitunterschiede (ITDs) zwischen beiden auditorischen Pfaden in einem Netzwerk von Detektorneuronen (Koinzidenzdetektoren) ausgewertet. Systematische Laufzeitunterschiede resultieren aus der Architektur des Netzwerks, die sogenannte Delay-Lines realisieren soll. Trotz einer Reihe von Evidenzen für das im auditorischen Diskurs inzwischen als Paradigma geltende Modell, findet Kritik am Jeffress-Modell in jüngerer Zeit zunehmend Beachtung und Interesse. So argumentieren B. Grothe und D. McAlpine gegen die Übertragung des Delay-Line Modells auf die Verhältnisse bei Säugern. Zentrales Moment ihrer Kritik ist eine Afferenz der MSO aus einem weiteren Teilgebiet der Olive (MNTB). Wesentlicher Effekt der von der Projektion gebildeten inhibitorischen Synapse ist eine relative Verschiebung der Best-Delays der MSO-Zellen zur Präferenz contralateraler Delays. Damit besteht nicht nur zu der nach dem Jeffress-Modell notwendigen Aufteilung der Best-Delays ein Widerspruch, die ITDs liegen bei tiefen Frequenzen für kleine Säuger aufgrund deren geringer Kopfgröße außerhalb des Bereichs physiologisch auftretender Delays. In dieser Arbeit werden die Ergebnisse von Grothe und McAlpine durch Compartmental Modeling analysiert. Gegenüber einer Simulationsstudie aus den Gruppen von Grothe und McAlpine werden von uns durch explizite Modellierung der Dendriten zusätzliche Effekte der Inhibiton beschrieben. Wir stellen dar, wie die Topographie von Inhibiton und Excitation die Verarbeitungsprozesse in Bipolar-Zellen durch dendritische Low-Pass Filterung und Kontrastverst ärkung zwischen minimaler und maximaler Spikerate unterstützt. Unsere Ergebnisse können die empirisch nachgewiesene Verteilung excitatorischer (distaler) und inhibitorische (proximaler) Synapsen erklären. In der abschliessenden Analyse der von den Bipolar-Zellen generierten Spike Trains wird das von Grothe und McAlpine entworfene alternative ITD-Codierungsmodell auf der Basis von Ratencodes problematisiert: Bislang erklärt ihr Vorschlag nicht, wie organismische Lokalisationsleistungen auf der Basis weniger Spikes realisiert werden können.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der i-AAA Protease in P. anserina, besonders während des Alterns des Ascomyceten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. Unter Standardbedingungen ist der PaIap-Deletionsstamm langlebiger als der Wildstamm, ohne feststellbare physiologische Beeinträchtigungen aufzuweisen. Dass dies auf den Verlust von PaIap zurückzuführen ist, bestätigen die PaIap-Revertantenstämme, in denen das Gen wieder eingeführt wurde, wodurch deren Lebensspanne wieder Wildtyp-artig ist. Dies zeigt, dass PaIAP zelluläre Prozesse beeinflusst, die die Lebensspanne kontrollieren.
2. Bei Hitzestress weist der PaIap-Deletionsstamm dagegen eine höhere Hitzesensitivität auf als der Wildstamm, was sich in einer verkürzten Lebensspanne und der Störung vitaler Funktionen äußert. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von PaIAP bei der Hitzestressantwort hin.
3. Im Einklang mit dem hitzesensitiven Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms konnte in mitochondrialen Extrakten des Wildtyps gezeigt werden, dass die Proteinmenge von PaIAP durch Hitzestress signifikant zunimmt. Gleichzeitig weisen mitochondriale Proteinextrakte von PaIap-Deletionsstämmen nach Hitzestress signifikant geringere Mengen an PaHSP60 und PaCLPP auf, zwei weiteren Komponenten der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle. Dies unterstreicht die Beteiligung von PaIAP an der Hitzestressantwort von P. anserina.
4. Darüber hinaus beeinflusst der Verlust von PaIap die Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette und führt bei 27°C zu einer vermehrten Organisation der Komplexe in stabilere Superkomplexe. Dieser Mechanismus wird beim Wildstamm erst nach Hitzestress beobachtet, wogegen der PaIap-Deletionsstamm die Superkomplexmenge nicht mehr weiter steigern kann.
5. Die Genexpression von proteolytisch inaktiven Varianten von PaIAP (PaIAPE540Q bzw. PaIAPE540QG) kann den Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms bei 27°C nicht komplementieren und führt ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensspanne von P. anserina. Dies liefert wichtige Informationen über den Mechanismus wie PaIAP die Lebensspanne von P. anserina beeinflusst, da dazu die proteolytische Aktivität von PaIAP benötigt wird.
6. Darüber hinaus zeigt die Analyse des PaIap/PaClpP-Deletionsstamms, dass sich die Mechanismen, wie PaIAP und PaCLPP die Lebensspanne von P. anserina beeinflussen, unterscheiden. Die unterschiedlichen zellulären Aufgaben werden auch bei Hitzestress deutlich, wovon der PaIap/PaClpP-Deletionsstamm noch stärker betroffen ist als durch die Deletion von PaIap bzw. PaClpP. Dies verdeutlicht, dass sich die Effekte der Deletionen der beiden Gene addieren.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die i-AAA Protease PaIAP auch bei P. anserina wichtige zelluläre Funktionen besitzt, die sich auf den Alterungsprozess des Ascomyceten auswirken. Dabei war es möglich verschiedene neue Mechanismen zu identifizieren, wie die i-AAA Protease diese Funktionen ausübt. Dazu gehören z.B. der Einfluss der proteolytischen Aktivität auf die Lebensspanne, die durch die Abwesenheit der i-AAA Protease ausgelöste Reorganisation der Atmungskettenkomplexe in stabile Superkomplexe, und die Induktion der Hitzestressantwort durch PaIAP. Diese Befunde tragen zum besseren Verständnis der zellulären Funktion der i-AAA Protease bei und stellen einen entscheidenden Ausgangspunkt für weiterführende Analysen der bislang wenig verstandenen Aufgaben der Protease dar.
Riboswitche – Vorbilder für die Konstruktion synthetischer RNA Schalter Riboswitche sind natürliche RNA Regulatorelemente. Sie sind in den nicht kodierenden Regionen von messenger RNAs (mRNAs) lokalisiert und beeinflussen die Expression nachfolgender Gene. Riboswitche bestehen aus zwei Domänen. Die Binde- oder Aptamerdomäne bildet eine Bindetasche, die einen Liganden ohne die Hilfe zusätzlicher Faktoren hoch spezifisch und affin binden kann. Die zweite Domäne, die sogenannte Expressionsplattform, interpretiert den Bindestatus der Aptamerdomäne und beeinflusst die Expression der nachfolgenden Gene. Liganden sind meist kleine, organische Moleküle wie Nukleotide, Aminosäuren oder Vitamine. Riboswitche regulieren Gene, die für die Synthese oder Verwertung ihres jeweiligen Liganden in der Zelle von Bedeutung sind. Kontrolliert wird die Genexpression meist durch Transkriptionstermination oder durch Maskierung der ribosomalen Bindestelle (SD = Shine Dalgarno Sequenz). Auch Eukaryoten nutzen das Prinzip der direkten RNA-Ligand-Interaktion zur Genregulation, wenn gleich in geringerem Ausmaß. In Pilzen und Pflanzen wird durch Ligandenbindung alternatives Spleißen von prä-mRNAs induziert, was entweder zur mRNA Degradation durch alternative Polyadenylierung oder der Repression der Translation durch alternative Leserahmen (uORFs) führt. Charakteristisch für eine Regulation über Riboswitche ist die direkte Wechselwirkung des niedermolekularen Liganden mit der RNA. In trans kodierte Proteinfaktoren sind aufgrund dieser direkten Bindung nicht notwendig. Dies macht natürliche Riboswitche zu geeigneten Vorbildern für die Entwicklung künstlicher RNA Schalter. Synthetische Riboswitche Aptamere sind kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige RNA oder DNA Moleküle, die hochaffin und sehr spezifisch ein Zielmolekül binden können. Man kann Aptamere gegen nahezu jedes Molekül der Wahl über einen Prozess der in vitro Selektion gewinnen (SELEX = systematic evolution of ligands by exponential enrichment). Eine Eigenschaft der meisten Aptamere ist, dass sie ihre endgültige Struktur erst in Gegenwart des spezifischen Liganden ausbilden („induced fit“). Dies kann ausgenutzt werden, um RNA Aptamere als regulatorische Elemente einzusetzen. Hierzu inseriert man Aptamere in nicht translatierte Regionen einer mRNA. In Abwesenheit des Liganden bildet sich die Struktur nur teilweise aus und interferiert nicht mit zellulären Funktionen. Erst im Komplex mit einem Liganden kommt es zur effizienten Beeinflussung der Genexpression. Inseriert man ein regulatorisch aktives Aptamer in den 5’ nicht translatierten Bereich (5’UTR) einer eukaryotischen mRNA, erlaubt das Aptamer in der nicht ligandengebundenen Form die Translation nachfolgender Gene. Erst der Aptamer-Ligand-Komplex interferiert mit der Translationsinitiation. Ist das Aptamer nahe der cap-Struktur positioniert, behindert es die initiale Bindung des Ribosoms an die mRNA. Bei einer weiter stromabwärts gelegenen Insertion interferiert es mit dem Scannen der kleinen ribosomalen Untereinheit nach dem Startcodon. Die beste Regulationseffizienz wird hierbei bei einer Insertion direkt vor dem Startcodon erreicht. Es zeigte sich jedoch, dass nur eine sehr geringe Anzahl an Aptameren in der Lage ist, als RNA Schalter aktiv zu sein. Dies führte dazu, dass bis heute nahezu alle Systeme entweder auf dem Theophyllin oder dem Tetrazyklin Aptamer basieren. Ziele dieser Arbeit In dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum nur wenige Aptamere regulatorisch aktiv sind und was diese von inaktiven Varianten unterscheidet. Dafür wurden ein Tetrazyklin und ein Neomycin Aptamer detailliert charakterisiert. Desweiteren wurden neue RNA-basierte Regulationssysteme aufgebaut und ihr regulatorischer Mechanismus analysiert. Innerhalb dieser Arbeit wurde dabei ein System zur aptamerabhängigen Regulation des prä-mRNA Spleißens in Hefe etabliert. Außerdem konnte das bekannte Translationssystem für die Regulation essentieller Gene in Hefe weiter entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erhalten: 1.Das Tetrazyklin Aptamer – In vitro Charakterisierung eines synthetischen Riboswitches. Das Tetrazyklin Aptamer ist 69 Nukleotide lang. Es besteht aus drei Stämmen (P1, P2 und P3) sowie drei einzelsträngigen Bereichen (J1/2, J2/3 und die Schleife L3; siehe Abbildung 1, links). Die Domäne oberhalb von P2 ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und kann ausgetauscht werden. Die Stämme P1-P3 sind bereits vor Ligandenbindung ausgebildet. Tetrazyklin wird über die drei einzelsträngigen Bereiche gebunden (siehe Abbildung 1, rechts). Durch fluorimetrische und kalorimetrische Methoden wurde eine Bindekonstante von Tetrazyklin an das Aptamer von 770 pM ermittelt. Diese Affinität ist außergewöhnlich hoch. Vergleichbare Aptamere und natürliche Riboswitche binden niedermolekulare Liganden 10- bis 1000-fach schlechter. Wir konnten zeigen, dass hohe Affinität eine Grundvoraussetzung für die regulatorische Aktivität ist, da Aptamermutanten mit verschlechterten Bindekonstanten keine in vivo Aktivität mehr aufweisen sind (Seiten 19-29). Durch Größenausschlußchromatographie konnte gezeigt werden, dass das Tetrazyklin Aptamer durch Ligandenbindung keine größeren globalen Konformationsänderungen erfährt. Dies weist auf eine weitgehende Vorformung der Bindetasche bereits ohne Tetrazyklin hin. Bei Ligandenbindung nimmt das Aptamer eine pseudoknotenähnliche Tertiärstruktur an, welche wahrscheinlich für die inhibitorische Wirkung auf das Ribosom verantwortlich ist (Seiten 19-29). Im Laufe dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des Aptamers im Komplex mit Tetrazyklin in der Arbeitsgruppe von A. R. Ferré-D’Amaré gelöst. Die Struktur zeigt, dass die Stämme P1 und P3 aufeinander gestapelt sind (Abbildung 1, rechts). Stamm P2 bildet die Verlängerung einer irregulären Helix, die aus den einzelsträngigen Bereichen J1/2 und J2/3 gebildet wird. Nukleotide der Schleife L3 interagieren mit dieser irregulären Helix und bilden mit ihr zusammen die Bindetasche für Tetrazyklin. Diese hochauflösende Struktur diente uns in weiteren Arbeiten als Ausgangspunkt für die detaillierte Charakterisierung von ligandeninduzierten Änderungen (siehe 6.). 2. Das Tetrazyklin Aptamer ist in der Lage, prä-mRNA Spleißen in Hefe zu inhibieren. Der Aptamer-Tetrazyklin-Komplex kann nicht nur mit der Translationsinitiation, sondern auch mit dem Spleißen der prä-mRNA in Hefe interferieren (Seiten 31-37). Dazu wurde ein Hefe-Intron in den Leserahmen von GFP inseriert. Nur bei korrektem prä-mRNA Spleißen wird die reife mRNA aus dem Kern transportiert und GFP exprimiert. Für eine RNA-basierte Regulation des Spleißens wurde die Konsensussequenz der 5’ Spleißstelle in den Stamm P1 des Tetrazyklin Aptamers integriert. Dieser ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und seine Sequenz daher variabel. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Tetrazyklin das Intron vom Spleißosom erkannt und entfernt wird. Die Expression des Gens ist dann möglich. Durch die Zugabe von Tetrazyklin wird das Spleißen inhibiert und GFP nicht länger exprimiert. Biochemische Strukturkartierungen der RNA in An- und Abwesenheit von Tetrazyklin zeigten, dass der Stamm P1 durch Ligandenbindung verfestigt wird. Die Ligandenbindung beeinflusst also nicht nur die Struktur der Bindetasche, sondern wird auch auf angrenzende Stammbereiche übermittelt. Durch Stabilisierung des Stammes P1 wird die 5’ Spleißstelle für das Spleißosom maskiert. Somit konnten wir den Mechanismus für die Aptamer basierte Regulation des prä-mRNA Spleißens aufklären. 3. Die Tetrazyklin Aptamer basierte Inhibition der Translationsinitiation ermöglicht die Regulation essentieller Gene in Hefe. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Insertion mehrerer Aptamerkopien in den 5’UTR zu einem effizienten Abschalten der Genexpression führt. Dies wurde genutzt, um ein neuartiges System für die konditionale Expression essentieller Gene in Hefe zu etablieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. K.-D. Entian wurden Insertionskassetten für eine PCR-basierte chromosomale Integration von Tetrazyklin Aptameren unter Kontrolle verschieden starker Promotoren konstruiert. Dafür wurden 1-3 Kopien des Tetrazyklin Aptamers unter Kontrolle des hoch exprimierenden TDH3-Promoters und des etwas schwächeren ADH1-Promoters gestellt. Außerdem wurde eines HA-tag angefügt, um die Genexpression mittels Westernblot verfolgen zu können. Zur Überprüfung der chromosomalen Insertion diente eine Kanamycin-Resistenz. Das neue System wurde erfolgreich an von fünf essentiellen Genen getestet. Es zeigte sich, dass die Zugabe von Tetrazyklin zu einem schnellen und effizienten Abschalten aller getesteten Gene führt. Die Vorteile dieses neuartigen konditionalen Genexpressionssystems in Hefe liegen in der einfachen Handhabung und der Unabhängigkeit vom verwendeten Stamm. Es müssen keine in transkodierten Proteinfaktoren coexprimiert werden. Durch dieses System konnte zum ersten Mal die Aptamer-basierte Regulation endogener, essentieller Gene gezeigt werden (Seiten 49-57). 4. Die Kombination von in vitro Selektion und in vivo Screening ermöglicht die Identifikation neuer regulatorisch aktiver Aptamere – ein Neomycin Riboswitch. Nur wenige in vitro selektierte Aptamere sind als synthetischer Riboswitch aktiv. In unserer Arbeitsgruppe wurde daher ein in vivo Screeningsystem zur Identifizierung neuer Aptamere in Hefe entwickelt. Eine Bibliothek in vitro selektierter Aptamere wurde hierzu in den 5’UTR des GFP Gens kloniert und die Aktivität einzelner Kandidaten durch Vergleich der Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden überprüft. Wir verwendeten eine Bibliothek aus Neomycin-bindenden Aptameren und analysierten 5000 Hefeklone. Hierbei konnten zehn Sequenzen isoliert werden, die abhängig von Neomycin die Initiation der Translation inhibieren. Das 33 Nukleotid lange Aptamer N1 zeigt eine 7,5-fache Regulation und wurde näher charakterisiert. Es besteht aus einer internen asymmetrischen und einer terminalen Schleife, die durch zwei GC Basenpaare getrennt sind. Enzymatische Strukturkartierung und Mutationsanalyse zeigten, dass beide einzelsträngigen Bereiche für die Ligandenbindung wichtig sind. Der abschließende Stamm ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und hat geringen Einfluss auf die regulatorische Aktivität. N1 kann außerdem gegen andere Aminoglykosidantibiotika diskriminieren (Seiten 39-47). Interessanterweise sind die regulatorisch aktiven Aptamere in der in vitro selektierten Bibliothek stark unterrepräsentiert und konnten durch zufälliges Sequenzieren nicht identifiziert werden. Dieses Beispiel verdeutlicht eindrucksvoll die Notwendigkeit eines Screenings in vivo. 5. Regulatorisch aktive Neomycin Aptamere unterscheiden sich von inaktiven durch eine größere thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung. Durch weitere Mutationsanalysen von N1 konnte ein aktivitätsvermittelndes Element im Neomycin Riboswitch identifiziert werden. Dazu wurde entweder die terminale oder die interne asymmetrische Schleife mutiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz der terminalen Schleife nur einen modulierenden Einfluss auf die Aktivität hat, wobei die Asymmetrie der internen Schleife (aber nicht deren exakte Sequenz) ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität ist. Für weitere Analysen wurde N1 mit fünf mutierten Varianten und dem inaktiven Neomycin bindenden Aptamer R23 verglichen. Alle sieben Aptamer haben eine ähnliche Sekundärstruktur und Ligandenaffinität, zeigen aber unterschiedliche Aktivität in vivo. Durch Bestimmung des Schmelzpunktes der verschiedenen Aptamere in An- und Abwesenheit von Neomycin zeigte sich, dass aktive Aptamere thermisch deutlich mehr durch Ligandenbindung stabilisiert werden als inaktive. Dabei ist die thermische Stabilität der Aptamer-Neomycin-Komplexe ähnlich. Jedoch ist die Stabilität ohne Ligand bei aktiven Aptameren gegenüber inaktiven Varianten deutlich erniedrigt. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit Prof. J. Wöhnert konnte bestätigt werden, dass aktive Aptamere weniger stark vorgeformt sind als inaktive. Das in den Mutationsanalysen identifizierte Element nimmt nicht an der Ligandenbindung teil, sondern dient als Schalter, der den freien Zustand das Aptamers destabilisiert. Damit sorgt es für den großen Unterschied in der thermischen Stabilität des freien und des gebundenen Zustandes aktiver Aptamere. Dies zeigt, dass Unterschiede in der Stabilität die regulatorische Aktivität vermitteln (Seiten 73-102). Laufende Arbeiten sollen nun klären, ob thermische Stabilisierung durch Ligandenbindung ein allgemeingültiger Vermittler von regulatorischer Aktivität ist. Dazu werden weitere Aptamere überprüft, welche in Abwesenheit des Liganden unterschiedlich stark strukturiert sind und eventuell durch Ligandenbindung unterschiedlich stabilisiert werden. Außerdem werden wir testen, ob es die gewonnen Erkenntnisse erlauben, durch rationelles Design synthetische Riboswitche zu verbessern oder inaktive Aptamere in aktive zu verwandeln. 6. Was macht ein Aptamer zu einem regulatorisch aktiven Riboswitch? Für das Tetrazyklin Aptamer konnten wir zeigen, dass zum einen eine extrem hohe Bindekonstante und zum anderen eine hoch komplexe Bindetasche für die regulatorische Aktivität entscheidend sind. Dabei ist die Bindetasche in Abwesenheit des Liganden stark vorstrukturiert und erfährt keine globalen strukturellen Änderungen (Seiten 19-29). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wachtveitl untersuchen wir den Einfluss von Bindekinetik und Lebensdauer des Aptamer-Tetrazyklin-Komplexes auf die regulatorische Aktivität. Dafür vergleichen wir das Tetrazyklin Aptamer mit drei regulatorisch inaktiven Mutanten. Für die Messungen nutzen wir die Eigenfluoreszenz des Tetrazyklins. Diese ist in wässriger Lösung geqenched und steigt bei Bindung an die RNA deutlich an. Erste Ergebnisse zeigen große Unterschiede zwischen den Aptameren in der Geschwindigkeit der Ligandenbindung. Außerdem zeigen sich geringe Unterschiede in der Lebensdauer der verschiedenen Komplexe. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert können die Veränderungen einzelner Basen bei Ligandenbindung untersucht werden. Hierbei zeigen erste Messungen am Tetrazyklin Aptamer, unterschiedliches Verhalten einzelner an der Bindung beteiligter Nukleotide. Eine detaillierte Aufklärung der ligandeninduzierten Veränderungen gewährt uns weitere Einblicke, warum das Tetrazyklin Aptamer als Riboswitch aktiv ist. Die regulatorische Aktivität Neomycin abhängiger Riboswitche wird durch thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung vermittelt. Dabei zeigte sich, dass durch Neomycin neue Basenpaare und Basenstapelungen entstehen. Durch weiterführende strukturelle Untersuchungen sollen nun ligandeninduzierte Veränderungen in N1 detailliert geklärt werden. Größere globale Änderungen konnten bereits durch EPR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. T. F. Prisner ausgeschlossen werden. Hierzu wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. J. W. Engels spinmarkierte Neomycin Aptamere hergestellt und die Abstände der Sonden in An- und Abwesenheit von Neomycin bestimmt. Es zeigte sich, dass sich der Abstand der Spinmarkierungen durch Zugabe von Neomycin (oder anderen Aminoglykosiden) nicht ändert (Seiten 59-72). Dies weist auf eher lokale Änderungen in der Bindetasche hin. Durch NMR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert werden im Moment die Strukturen verschiedener N1-Aminoglykosid-Komplexe gelöst. Dabei zeigt sich, dass in vivo aktive und inaktive Liganden eine ähnliche Struktur im Aptamer induzieren. Was die einzelnen Komplexe unterscheidet und damit die verschiedene Aktivität begründet ist Ziel der Analyse. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein Regulationssystem für die Aptamer-basierte Kontrolle des prä-mRNA Spleißens in Hefe entwickelt und das bestehende Translationssystem für die Applikation auf essentielle Gene angewendet werden. Außerdem wurden wichtige Punkte, warum Aptamere als Riboswitch funktionieren aufgeklärt. Damit legt diese Arbeit einen wertvollen Grundstein für die Weiterentwicklung RNA-basierter Genregulationselemente für die Anwendung in der synthetischen Biologie.
mRNA-Abbau ist ein essentieller Prozess der Genexpression, der den Zellen ermöglicht, die Qualität und die Quantität der mRNA zu kontrollieren. Besonders unter Stressbedingungen könnte der mRNA-Abbau eine bedeutende Rolle neben der Speicherung von mRNAs sowie der Regulation der Proteinhomöostase zum Schutz vor schädigenden Einflüssen spielen. Studien mit Hefen und Säugerzellen zeigten, dass dem 5'-3'mRNA-Abbau ein wichtige Rolle sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stressbedingungen zukommt und dieser in zytoplasmatischen Processing bodies (P-bodies) stattfindet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Erkenntnisse über den 5'-3'mRNA-Abbau erhalten werden. Im Vordergrund stand die Frage nach der Existenz von P-bodies in Arabidopsis thaliana und die Identifikation und Charakterisierung deren Komponenten. Weiterhin sollten Erkenntnisse über die Rolle der P-bodies unter Stressbedingungen gewonnen werden. Dabei sollten besonders Informationen über die Beziehungen zwischen den P-bodies und RNA Stressgranula (mRNA Speicherkompartimente) und Hitzestressgranula (Regulation der Proteinhomöostase) erhalten werden. Das komplette sequenzierte Genom von Arabidopsis thaliana eignete sich zur Identifikation von mRNA-Abbauproteine kodierender Gene. Unter Verwendung von Aminosäuresequenzen bereits bekannter mRNA-Abbauproteine aus Hefe und Säugerzellen konnten Homologe für die Decappingproteine Dcp1 und Dcp2 sowie für die Proteine LSm1,2,5,8 als Untereinheiten des LSm1-7 Komplexes, welcher an der Regulation der Decappingreaktion beteiligt ist, identifiziert werden. Über Hefe-Zwei-Hybrid Analysen konnten anschließend Protein-Protein-Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen identifiziert werden. Weiterhin konnte unter Einsatz der BIFC-Analyse gezeigt werden, dass die Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen hauptsächlich in zytoplasmatischen Strukturen stattfanden. Aufbauend auf diesen Befunden wurde ein Antikörper gegen Dcp1 als Marker für die zytoplasmatischen Strukturen erstellt. Dieser ermöglichte erstmals die Detektion der endogenen Strukturen in Arabidopsis thaliana. Die weitere Charakterisierung über Immunofluoreszenzanalysen zeigten, dass diese P-bodies sind. Wie die P-bodies anderer Organismen sind sie hochdynamisch und benötigen untranslatierte mRNA für die Assemblierung. Die Größe und Anzahl der P-bodies hängt dabei vom Verhältniss des Zuflusses von mRNA und der mRNA-Abbaurate ab. Weiterhin konnte beobachtet werden, das die P-bodies besonders groß unter Stressbedingungen sind und deuten eine wichtige Funktion des mRNA-Abbaus unter Stress an. Dies führte zu der Frage nach der Beziehung der P-bodies zu RNA Stressgranula, die der Speicherung von mRNA unter Stressbedingungen dienen, sowie zu Hitzestressgranula, die an der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase beteiligt sind. Durch Kolokalisationsanalysen mit Markern der RNA Stressgranula, der Hitzestressgranula und der P-bodies konnte erstmals gezeigt werden, dass es sich um voneinander unabhängige Mikrokompartimente handelt, und dass unter Stressbedingungen die zellulären Prozesse mRNA-Abbau, mRNA-Speicherung und Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase auf einzelne Mikrkompartimente beschränkt sind. Allerdings konnte zwischen P-bodies und RNA Stressgranula häufig eine räumliche Nähe beobachtet werden. Dies deutet auf einen Austausch von Komponenten zwischen diesen Strukturen hin. Zusammen zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass die identifizierten Proteine Komponenten des 5'-3'mRNA-Abbaus darstellen, und dass der 5'-3'mRNA-Abbau in Pflanzen auch in P-bodies stattfindet. Die Identifizierung und Charakterisierung der pflanzlichen P-bodies bildet eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen. Vor allem die massive Bildung von P-bodies unter Stressbedingungen und die Interaktion der P-bodies mit RNA Stressgranula zeigen neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort auf.
Die phylogenetisch hochkonservierte Jak/Stat‐Signaltransduktionskaskade repräsentiert eines der zentralen Säulen zellulärer Signalübertragung eukaryotischer Organismen. Ubiquitär im Organismus exprimiert und über eine Vielzahl von Zytokinen, Hormonen und Wachstumsfaktoren aktiviert, sind Stat‐Transkriptionsfaktoren maßgeblich an dem Erhalt der Physiologie und Homöostase von Organen und Geweben beteiligt. So sind die Mitglieder Stat5A und Stat5B (als homologe Proteine im Verbund als Stat5 bezeichnet) entscheidende Regulatoren des Immunsystems und der Hämatopoese, der Funktion und Entwicklung des Prostata‐ und Brustdrüsengewebes (Mammogenese) oder bestimmter Funktionen der Leber. Wie auch Stat3, konnten Stat5 Proteine in aberrant aktiver Form in verschiedensten Typen und Stadien humaner Tumore nachgewiesen werden, wo sie über die Expression ihrer Zielgene sowie über weitere nicht‐kanonische Funktionen im Zytoplasma und im Zellkern einer fortschreitend malignen Entartung entscheidend beitragen. Als Folge der Unterstützung essentieller Tumorgenese‐
Mechanismen, wie gesteigertes Zellwachstum, Apoptosehemmung, Migration und Metastasierung, Sauerstoff‐unabhängiger Energiestoffwechsel, Angiogenese oder Umgehung der Immunabwehr, entwickeln Tumore häufig eine Abhängigkeit gegenüber der gesteigerten Aktivität dieser Vertreter der Stat‐Proteinfamilie und reagieren mit einem Wachstumsstopp und Apoptoseinduktion auf ihre Inhibierung. Perspektivisch stellt die gezielte Interferenz mit aberranten, Tumortyp‐spezifischen Stat5‐Aktivitäten einen relevanten Ansatz in der personalisierten Therapie Stat5‐abhängiger Tumore, vorrangig leukämischen Ursprungs, dar. ...
Seit den 1950er Jahren hat sich Plastik als unverzichtbare Ressource im menschlichen Alltag etabliert. Als negative Folge dieses Booms wird seit einigen Jahrzehnten jedoch eine zunehmende Belastung aquatischer Ökosysteme mit Plastikmüll bzw. dessen Degradationsprodukten, sogenanntes „Mikroplastik“ (MP, < 5 mm) bzw. „Nanoplastik“ (NP, < 1 µm), beobachtet. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des aktuellen Vorkommens von MP in limnischen Gewässern, die Analyse der Interaktion zwischen MP und limnischen Wirbellosenarten und der daraus resultierenden Toxizität sowie eine erste Risikoabschätzung.
Das Vorkommen von Mikroplastik in limnischen Gewässern wurde exemplarisch anhand der Elbe als großes Fließgewässer in Deutschland untersucht. Durch die Auswertung von elf Probestellen entlang des Verlaufs der Mittel- und Unterelbe konnte gezeigt werden, dass die MP-Konzentrationen im Sediment (2,26x10^4 – 2,27x10^7 P m^-3) im Mittel fast 150.000-fach höher sind als in der Wasserphase (0,88–13,24 P m^-3). Sedimente sind somit eine Senke für MP. Die Zusammensetzung der Polymerarten sowie MP-Formen deuten zudem an, dass die Partikel sowohl aus diffusen wie auch aus Punktquellen (z.B. Industrieabwässer) stammen. Im globalen Vergleich können die MP-Konzentrationen in deutschen Fließgewässern z. Z. als durchschnittlich betrachtet werden. Allerdings muss insgesamt davon ausgegangen werden, dass die bisher bestimmten MP-Umweltkonzentrationen die realen Konzentrationen möglicherweise unterschätzen. So zeigte die Elbestudie, dass die Sedimentfeinfraktion < 100 µm einen bedeutenden Polymeranteil enthielt. Die meisten bisher durchgeführten Studien zur Bestimmung von MP-Partikeln in Flüssen haben Partikel < 100 µm jedoch nicht in ihrer Analyse berücksichtigt.
Die Interaktion von MP mit limnischer Biota wurde anhand der Artgruppen der Muscheln (Bivalvia), Schnecken (Gastropoda) sowie Krebstiere (Crustacea) näher untersucht. Die Intensität der Interaktion ist maßgeblich von der Aufnahme von MP durch die verschiedenen Arten abhängig. Anhand von zahlreichen Aufnahmestudien mit verschiedenen limnischen Arten, darunter den Muschelarten Dreissena polymorpha, Sinanodonta woodiana und Anodonta anatina, der Lungenschnecke Lymnaea stagnalis sowie der Amphipodenart Gammarus pulex, wurde nachgewiesen, dass die MP-Aufnahme von den Eigenschaften der exponierten Arten bzw. Individuen, den MP-Charakteristika sowie den Expositionsbedingungen abhängt. Die Experimente mit Muscheln verdeutlichten die rasche Aufnahme, aber auch Exkretion von MP-Partikeln innerhalb weniger Stunden. In allen drei Artgruppen war die Aufnahme konzentrationsabhängig mit zunehmender Aufnahme bei steigenden MP-Konzentrationen. Die Muschelexperimente zeigten jedoch auch, dass eine gleichzeitige Exposition mit anderen Partikeln (z.B. Nahrung) zu einer reduzierten Aufnahme führt. Auch die Größe der Testorganismen beeinflusste die Aufnahme: So nahmen im Fall der Muscheln und Krebse kleinere Individuen (bzw. im Fall der Muscheln auch Arten) relativ pro Körpermasse mehr MP-Partikel auf als größere Individuen bzw. Arten. Für alle untersuchten Arten wurde darüber hinaus gezeigt, dass die MP-Größe relevanten Einfluss auf die Menge an aufgenommenen Partikeln hat.
Ein Vergleich zwischen den Artgruppen zeigte, dass Muscheln als filtrierende Organismen in den Laboruntersuchungen bei gleicher Expositionskonzentration mehr MP aufnahmen als Krebse (Zerkleinerer) und Schnecken (Weidegänger). Im Gegensatz zu Muscheln nutzen Krebstiere und Schnecken allerdings die Grenzschicht zwischen Wasser- und Sedimentphase als Suchraum für ihre Nahrung und sind in der Umwelt (auf Grund des höheren MP-Vorkommens in Sedimenten) somit möglicherweise gegenüber höheren MP-Konzentrationen exponiert als Muscheln. Die Extrapolation der gewonnenen Labordaten sowie der Vergleich mit publizierten Umweltdaten legen allerdings nahe, dass das MP-Vorkommen in Individuen aller drei Artgruppen bisher auf einige wenige MP-Partikel begrenzt ist. Ausgeprägte Unterschiede zwischen den Artgruppen sind bisher nicht erkennbar.
MP-Toxizitätsstudien mit G. pulex, L. stagnalis sowie D. polymorpha konnten trotz der Berücksichtigung einer Vielzahl an Endpunkten (Mortalität, Reproduktion, Nahrungsaufnahme, oxidativer Stress, Energiereserven, Immunzellaktivität) und trotz des Einsatzes zum Teil sehr hoher MP-Konzentrationen weit oberhalb aktueller Umweltkonzentrationen nur sehr wenige MP-induzierte Effekte nachweisen, darunter eine Steigerung der Filtrationsaktivität (D. polymorpha) bzw. Veränderung der Immunfunktion von Hämolymphzellen (L. stagnalis).
Zur weiteren Risikoabschätzung wurden diese Studienergebnisse mit publizierten Daten für marine und limnische Muschel- und Krebsarten in Artenempfindlichkeitsverteilungen (Species Sensitivity Distributions, SSD) zusammengeführt und jeweils eine SSD für Muscheln und Krebstiere erstellt. Die Erstellung einer SSD nur für limnische Arten ist zum jetzigen Zeitpunkt auf Grund der geringen Datenlage noch nicht möglich.
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In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Waldvegetation des Rothaargebirges sowie andererseits der Vergleich mit historischen Bearbeitungen zur Ermittlung von Vegetationsveränderungen. Die aktuelle Vegetation wurde mit Hilfe pflanzensoziologischer Methoden erfaßt und klassifiziert. Ergänzend erfolgte eine Kartierung vieler Waldvegetationseinheiten, welche in Verbreitungskarten dargestellt ist. Von großer Bedeutung im Bereich der Waldgesellschaften ist das Luzulo-Fagetum, welches in einer Reihe unterschiedlicher Ausbildungen vorkommt und im gesamten Gebiet verbreitet ist. Weitere Buchenwälder sind dem Galio odorati-Fagetum und in geringem Umfang dem Hordelymo-Fagetum zuzuordnen. Als Ersatzgesellschaften der Buchenwälder sind die große Flächen einnehmenden Fichtenforste, die überwiegend aus der Haubergswirtschaft entstandenen Wälder des Betulo-Quercetum und die wenigen dem Carpinion zugehörigen Bestände einzustufen. An feuchtere Standorte gebunden sind die Schluchtwälder des Fraxino-Aceretum pseudoplatani sowie Auenwälder, die durch das Carici remotae-Fraxinetum und das Stellario nemorum-Alnetum repräsentiert sind. Weiterhin kommen Bruchwälder des Betuletum carpaticae und des Sphagno-Alnetum vor, welche auf nassen Standorten siedeln. Ebenfalls pflanzensoziologisch dokumentiert wurden Gesellschaften, die im räumlichen Verbund der Wälder auftreten oder mit diesen in einem syndynamischen Zusammenhang stehen. Hierzu gehören insbesondere krautige Formationen der Schlagfluren sowie deren strauchige Folgegesellschaften. Des weiteren wurden Gesellschaften der Heiden, der Quellfluren, der Bachröhrichte und der Felsen erfaßt. Für eine Gegenüberstellung des Luzulo-Fagetum mit seinen forstlichen Ersatzgesellschaften erfolgte eine Betrachtung struktureller Parameter, floristischer Unterschiede sowie von Zeigerwerten. Sowohl Fichtenforst als auch Betulo-Quercetum weisen im Vergleich zum Luzulo-Fagetum eine geringere Anzahl an Varianten auf und Arten der Ordnung Fagetalia treten zurück. Im Fichtenforst häufiger sind Säurezeiger sowie Arten der Schlag- und Ruderalfluren, im Betulo-Quercetum vor allem Säure- und Magerkeitszeiger. Bezogen auf mittlere Zeigerwerte äußern sich die Unterschiede beider Gesellschaften zum Luzulo-Fagetumin höheren Werten für den Faktor Licht, während in bezug auf die Faktoren Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff lediglich das Betulo-Quercetum deutlich vom Luzulo-Fagetum abweicht, wobei die Werte jeweils deutlich geringer ausfallen. Die Relevanz dieser beobachteten Unterschiede offenbart sich an einer exemplarisch durchgeführten Darstellung des Bestockungswandels der Markenwaldungen Winterberg. Hier wurde für das 20. Jahrhundert ein deutlicher Anstieg der mit Fichten bewachsenen Flächen registriert, der auf Kosten des Buchenanteils geht. Zur ergänzenden Beurteilung der Waldvegetation wurden Analysen geringeren Umfangs angestellt. Hierunter fällt zum einen die Darstellung der Waldgesellschaften in einem Ökogramm anhand der mittleren Zeigerwerte für Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff. Bei der Betrachtung der Naturverjüngung in den einzelnen Waldgesellschaften erwiesen sich insbesondere Fagus sylvatica, Picea abies, Acer pseudoplatanus und Sorbus aucuparia als die sich am häufigsten verjüngenden Baumarten. Zur Beurteilung des Faktors Wild wurde die Verbißhäufigkeit an Waldpflanzen registriert. Danach gehören Athyrium filix-femina, Epilobium angustifolium, Dryopteris dilatata und Polygonatum verticillatum zu den beliebtesten Äsungspflanzen. Weiterhin wurde exemplarisch die Vegetation auf den im Rothaargebirge häufig anzutreffenden Meilerflächen dokumentiert. Im Bereich dieser Plätze werden nicht selten Arten der Ordnung Fagetalia sowie andere nährstoffliebende Taxa gefördert. Eine Gegenüberstellung der Aufnahmen von Fagion-Gesellschaften, Luzulo-Fagetum, Fichtenforst und Betulo-Quercetum mit vergleichbaren Aufnahmen historischer Bearbeitungen ergab eine Reihe von Unterschieden. Deutlich zeichnet sich eine Zunahme an stickstoffliebenden Arten ab, die pflanzensoziologisch überwiegend den Klassen Epilobietea angustifolii und Artemisietea vulgaris zuzuordnen sind. In den Fichtenforsten ist dieser Wandel besonders auffällig und spiegelt sich in erhöhten mittleren Zeigerwerten für Stickstoff und Bodenreaktion wider. Für die Fagion-Gesellschaften wurde zudem eine Abnahme an Arten der Ordnung Fagetalia registriert, so daß die Veränderungen der mittleren Zeigerwerte nur gering ausfallen, da diese Arten ebenfalls als Stickstoffzeiger einzustufen sind. Für das Luzulo-Fagetum fällt der Zuwachs an den betreffenden Arten zwar geringer als im Fichtenforst aus, zeigt sich aber in einzelnen Aufnahmen mit dominantem Auftreten der stickstoffzeigenden Arten. Im Betulo-Quercetum ist die Zunahme an Stickstoffzeigern am geringsten ausgeprägt und der Anstieg des entsprechenden mittleren Zeigerwertes beruht primär auf einem Rückgang an Säure- und Magerkeitszeigern. Letztere verzeichnen auch in den anderen Waldgesellschaften unterschiedlich stark ausgeprägte Verluste. Als Ursache für die Veränderungen werden insbesondere stickstoffreiche Immissionen diskutiert, sowie Kompensationskalkungen und Bestandsauflichtungen. Ergänzend sind Nutzungsänderungen in Erwägung zu ziehen, die sich vor allem bei den ehemals als Hauberg bewirtschafteten Beständen des Betulo-Quercetum auswirken. Die ermittelten Ergebnisse fügen sich in eine Reihe ähnlicher Untersuchungen ein und bestätigen damit auch die angewendete Methode des pflanzensoziologischen Typenvergleichs zum Monitoring von Vegetationsveränderungen. Weiterhin wurde in vorliegender Arbeit ein Blick auf die Situation des Wald-Naturschutzes im Rothaargebirge geworfen und Empfehlungen für eine weitere Entwicklung kurz angerissen. Als Beispiel für das Vorkommen gefährdeter Arten und deren Abhängigkeit von der Waldvegetation wurden Verbreitungskarten von Bärlapp-Arten angeführt.