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Synthese und Struktur-Wirkungsbeziehungen neuer rezeptorselektiver Dopamin-D 2- und -D 3-Liganden
(2003)
Dopaminrezeptoren gehören zur Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, der bisher größten Rezeptorklasse. Seit der Identifizierung der zuvor unbekannten Rezeptorsubtypen D3-D5 in den Jahren 1990 und 1991 hat die Erforschung des dopaminergen Systems neuen Anschub erhalten, der maßgeblich auf das spezifische Vorkommen jeweiliger Subrezeptoren in diskreten Hirnarealen zurückzuführen ist. Während dopaminerge Neuronen an neurologischen und psychiatrischen Störungen wie Morbus Parkinson, Schizophrenie und Drogenmißbrauch bzw. -abhängigkeit seit geraumer Zeit in einen ursächlichen Zusammenhang gebracht werden, begründen die unterschiedlichen Charakteristika der Rezeptorsubtypen hinsichtlich Lokalisation, Aminosäuresequenz und pharmakologischem Verhalten die Hoffnung, mit subrezeptorselektiven Wirkstoffen neue therapeutische Ansätze verwirklichen zu können, die eine Reduktion der gravierenden, mit bisherigen Therapiekonzepten korrelierten Nebenwirkungen erlauben. In der vorliegenden Arbeit wurden, ausgehend von den D2- und D3-rezeptorbevorzugenden Wirkstoffen ST 177, L-741,626, ST 314, NAN190, ST 198 und BP 897, gezielte Modifikationen an unterschiedlichen Molekülteilen unternommen, um ihre jeweils charakteristischen pharmakologischen Eigenschaften stärker zu profilieren.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Herstellung von codierten Peptidbibliotheken durch kombinatorische Synthese, sowie deren Selektion auf Wechselwirkung mit einer verkürzten Sequenz der TAR-RNA des HI-Viruses.
Die zur Selektion benötigte RNA wurde dazu auf chemischem Wege hergestellt und mit einem Fluoreszensfarbstoff für eine optische Selektion markiert. Ausgehend von dieser RNA wurde ein Anfärbeassay entwickelt. Bei der Anwendung des Assays auf Tri- und Pentapeptide, die auf einem Polymerträger immobilisiert waren, zeigten sich einige intensiv leuchtende Polymerkügelchen. Die hellsten unter ihnen wurden selektiert. Die Synthese der Trimeren und Pentamerenbibliothek erfolgte zuvor an wasserquellbarem, polymerem Trägermaterial. Die Identifizierung der polymergebundenen Verbindungen erfolgte über die Codierung nach W.C. Still, welche im Rahmen dieser Dissertation in der Arbeitsgruppe von Hr. Prof. Göbel erfolgreich etabliert wurde und die einfache Unterscheidung zwischen Enantiomeren ermöglicht. Drei der am häufigsten auftretenden Trimerensequenzen wurden im Nachhinein erneut synthetisiert und Experimenten an Zellen zugeführt. Unabhängig davon, wurde ihre Wechselwirkung mit RNA als auch mit RNA-Peptid Komplexen direkt getestet.
Weiterhin wurde exemplarisch anhand von Aminopyridinen die Möglichkeit getestet, neuartige Synthesemonomere für die automatische Synthese polymergebundener Verbindungen darzustellen.
Die vorliegende Arbeit macht deutlich, dass man durch kombinatorische Synthese im Verbund mit gerichteter Selektion, die Entwicklung von in vitro RNA-Liganden für RNA mit bekannter Struktur vorantreiben kann. Umgekehrt müsste dies auch bald die Selektion von Liganden für strukturell nicht charakterisierte RNA ermöglichen.
Das nächste Ziel sollte, die Entwicklung weiterer Selektionstests sein und die Etablierung von NMR-Methoden, welche die genauen Bindungsmodi der selektierten Verbindungen an RNA aufklären, um somit die gezielte Synthese neuartiger Liganden vorantreiben zu können, da letztendlich das "Wie", für die Weiterentwicklung einer Leitstruktur ausschlaggebend ist.
Weiterhin sollten die Transportmechanismen von körperfremden Substanzen zu dem gewünschten Wirkort studiert werden, damit die vorab in vitro getestete Substanz auch im späteren Entwicklungsstadium in vivo die gewünschten Eigenschaften zeigen kann.
Der retinoid-related orphan receptor α (RORα) ist ein nukleärer Rezeptor, der nach Bindung an sein Responselement die Transkription zahlreicher Gene reguliert. Pharmazeutisches Interesse erlangt der Rezeptor vor allem durch seine Verwicklung in pathophysiologische Prozesse wie Osteoporose und Arteriosklerose sowie durch seine antiinflammatorische Wirkung, die auf der negativen Interferenz mit dem NF-κB-Signalweg beruht. Bisher konnten vier RORα-Isoformen isoliert werden, die durch alternatives Spleißen sowie durch die Regulation über unterschiedliche Promotorregionen entstehen. In verschiedenen Studien konnte eine isoformspezifische Regulation als Antwort auf pathophysiologische Veränderungen der Zellen festgestellt werden, wie beispielsweise die Induktion der RORα4-Transkription in Leberzellen infolge einer Sauerstoffunterversorgung. Um Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, die der spezifischen Regulation der RORα4-Expression zugrunde liegen, wurde in der vorliegenden Arbeit der RORα4-Promotor als erster Promotor einer RORα-Isoform identifiziert und analysiert.
Sechs Fragmente mit einer Länge von bis zu 5,1 kbp der aus Datenbanken entnommenen, putativen Promotorsequenz wurden in einen Reportergenvektor kloniert. Transiente Transfektionsexperimente und Reportergenanalysen deckten die Promotoraktivität der gewählten Sequenz auf.
In dem durch einen hohen Gehalt an den Nukleotiden G und C auffallenden Promotor wurden drei einzelne GC-Boxen (A, B und C) sowie eine Viererkette (Box D) und eine Tandem-GCBox (Box E) als mögliche Bindungsmotive für Sp-Transkriptionsfaktoren gefunden. Mithilfe von Kotransfektionen konnte eine Induktion der Promotoraktivität durch die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp4 nachgewiesen werden, während Sp3 die Promotoraktivität in diesen Experimenten nicht beeinflusste.
Durch die gezielte Mutation oder Deletion, bzw. die Inkubation mit verschiedenen Substanzen konnten diesen GC-Boxen unterschiedliche Funktionen zugeordnet werden. Durch transiente Transfektionen stark verkürzter Promotorfragmente wurde ein für die Promotoraktivität nötiger Sequenzbereich von 170 Basenpaaren eingegrenzt. In Mutationsanalysen wurde demonstriert, dass die beiden proximalen GC-Boxen A und B für die basale Promotoraktivität essentiell sind.
Die RORα4-Promotoraktivität ließ sich zelltypabhängig durch den Phorbolester TPA induzieren. In Deletionsanalysen ließ sich dieser Effekt teilweise auf die GC-Boxen C und D zurückführen. Der distalen GC-Box E konnte ebenfalls eine Funktion zugeordnet werden. In Reportergenanalysen konnte demonstriert werden, dass sie die Induktion der Promotoraktivität durch den HDAC-Inhibitor Trichostatin A vermittelt.
Durch die Untersuchungen an den TK-luc-Konstrukten mit RORα-Responselementen konnte gezeigt werden, dass der virale Promotor aufgrund der einklonierten RORα-Responselemente sehr stark auf die Kotransfektion der RORα-Isoformen reagiert. Die Reportergenanalyse mit diesen Konstrukten stellt daher eine effiziente Methode dar, um die RORα-vermittelte Transaktivierung zu bestimmen.
Obwohl der RORα4-Promotor zahlreiche RORα-Responselemente trägt, konnte in den Kotransfektionen mit Expressionsplasmiden für die einzelnen Isoformen in keiner der drei Zelllinien eine Autoregulation gefunden werden. Ebensowenig zeigte sich ein Einfluss des putativen RORα-Liganden Melatonin auf die Promotoraktivität.
Des Weiteren wurde gezeigt, dass die RORα4-Promotoraktivität in HeLa und MCF-7-Zellen durch das cAMP-Analogon DbcAMP induzierbar ist, während in HEK 293 keine Beeinflussung der Promotoraktivität erzielt wurde. Neben der Steigerung der Promotoraktivität durch TPA, konnte mit der DbcAMP-Induktion folglich ein zweiter, zelltypabhängiger Effekt auf die RORα4-Promotoraktivität identifiziert werden.
Chemieunterricht in der Schule wird von Schülerinnen und Schülern in weiten Bereichen als schwer verstehbar, für das Alltagsleben als unnütz und wenig motivierend erlebt. Dies hat zur Folge, dass der Chemieunterricht von einer großen Zahl Lernender in der Oberstufe abgewählt wird. Dabei wird bewusst die Bedeutung der Chemie für die Industriegesellschaft ignoriert und die Konsequenz des Nachwuchsmangels nicht ernst genommen.
Bei der Suche nach Lösungsansätzen aus der Krise des schulischen Chemieunterrichts gibt es viele Ansätze, die sich seit einigen Jahrzehnten mit der Kontextorientierung und der Erschließung neuer Felder für den Chemieunterricht befasst haben und befassen. Ausgehend von Themen, deren Bedeutung für das Individuum und die Gesellschaft einen hohen Stellenwert haben, wird der Chemieunterricht mehr an die Lebenswelt der heranwachsenden Generation angepasst. Diese Vorgaben sind in der vorliegenden Arbeit einbezogen worden und haben das Thema HIV für den Chemieunterricht der gymnasialen Oberstufe als sinnvoll erscheinen lassen.
Vor dem Hintergrund der kognitionspsychologischen Erkenntnisse der vergangenen fünfzehn Jahre ist ein Weg der Unterrichtsgestaltung gewählt worden, mit dem die Selbständigkeit der Lernenden unterstützt, gefördert und weiterentwickelt werden kann. Kognitionspsychologische Untersuchungen der Eingangskanäle bei Lernvorgängen stellen die hohe Bedeutung mehrer Sinnesmodalitäten in den Vordergrund, durch die eine verbesserte Behaltensleistung erzielbar ist. Nach diesen Erkenntnissen kann Wissen nur dann als aktives Wissen in neuen Zusammenhängen eingesetzt werden, wenn Lernern die Möglichkeit geboten wird ihr individuelles Gedankengebäude zu konstruieren. Besonders effizient sind nach diesen Untersuchungen kombinierte Sinnesmodalitäten mit guter Behaltensleistung bei der Nutzung von Sprache, Text und Bewegtbildern. Hier gilt die alte Erkenntnis "ein Bild sagt mehr als tausend Worte" auch im übertragenem Sinne. Besonders die konstruktivistischen Überlegungen für den Vorgang des Wissensaufbaus wurden in dieser Arbeit berücksichtig.
Diese Forschungsergebnisse waren ein Grund für die multimediale Aufbereitung des Themas. Hoher Verbreitungsgrad, gesellschaftliche Bedeutung und Motivation durch Multimedia sind weitere Gründe für diese Entscheidung.
Sowohl curriculare als auch gesellschaftliche Entwicklungen fordern darüber hinaus das Denken in vernetzten Systemen, dies bedeutet ein über die Grenzen des Fachs Chemie hinausgehendes Planen und Realisieren von Unterricht. Mit der Themenwahl werden direkt die Fächer Chemie und Biologie angesprochen, Fächer wie Kunst, Religion, Ethik, Sozialkunde und Sprachen können einbezogen werden. Mit dem der Unterrichtseinheit, die von fünf Kursen mit insgesamt 60 Schülerinnen und Schülern erprobt wurde, zu Grunde liegenden Programm zum Thema HIV verknüpfen sich die Fragen:
* Ist der Einsatz von Computern als Medium bereits die Norm?
* Welche medialen Angebote werden schulisch/außerschulisch genutzt?
* Welche Informationsquellen werden verwendet?
* Welche Medien sind für die Testpersonen beim Lernprozess bedeutend?
* Wird die Lehrperson bei dem Einsatz der modernen Medien ersetzt?
* Fördert das Projekt die Selbstbestimmung beim Lernprozess?
* Welche Effekte hat das multimediale Projekt auf den Lernprozess?
* Welche Probleme treten beim Umgang mit dem verwendeten Programm auf?
Diese Punkte wurden mit einem Fragebogen vor und einem nach der Durchführung des Projektes bearbeitet...
Ferroelektrische Strontium-Wismut-Tantalat- (SBT) Filme werden in der Mikroelektronik als nicht-flüchtige Speichermedien verwendet und weiterentwickelt. Informationen werden durch Polarisation des Materials gespeichert und bleiben ohne weiteren Energieaufwand über einen Zeitraum von Jahren in solchen Speichern erhalten – sogenannten FeRAMs (Ferroelectric Random Access Memories). Darüber hinaus können gespeicherte Daten innerhalb von wenigen Nanosekunden wieder ausgelesen werden. Zusammengefasst ist eine Langzeitspeicherung kombiniert mit niedrigem Energieverbrauch und schneller Informationsverarbeitung durch den Einzug ferroelektrischer Materialien in die Computertechnologie möglich geworden.
Da die fortschreitende Miniaturisierung in der Mikroelektronik von zentraler Bedeutung ist, sind zur Charakterisierung der verwendeten Materialien Untersuchungsmethoden mit hoher Ortsauflösung unverzichtbar. Das Rasterkraftmikroskop – engl. Atomic Force Microscope (AFM) – ist eine solche Technik, mit der im Submikrometerbereich die Topographie sowie physikalische Eigenschaften von Materialien abgebildet werden können. Die vorliegende Arbeit widmet sich der Untersuchung von SBT-Filmen mit solchen AFM-Methoden.
Besonders die Rauhigkeit der einzelnen Filme in schichtartig aufgebauten Mikrochips ist bei der Herstellung von Halbleiterbauelementen von großer Bedeutung, wobei möglichst glatte Filme favorisiert werden. Deshalb wurden zunächst verschiedene SBT-Filme auf ihre topographischen Merkmale hin charakterisiert. Die Rauhigkeiten von SBT Filmen verschiedener Herstellungsverfahren wie der Metal Organic Decomposition (MOD) und der Metal Organic Chemical Vapour Deposition (MOCVD) wurden gegenübergestellt. Außerdem ist der Einfluss der SBT-Schichtdicke sowie der des Ferro-Anneals untersucht worden – Ferro-Anneal ist ein Temperungs-Schritt während der Filmherstellung, der zur Bildung der ferroelektrischen Aurivillius-Phase durchgeführt werden muss. Zudem wurde das unterschiedliche Kurzschlussverhalten zweier SBT-Filme in Zusammenhang mit ihren verschiedenen RMS-Rauhigkeitsdaten gebracht.
Der größte Teil der Arbeit setzt sich mit einer Methode auseinander, mit der die Polarisationseigenschaften von ferroelektrischen SBT-Filmen charakterisiert werden sollen – dem AFM/EFM-Polarisationsexperiment – engl. Electrostatic Force Microscope (EFM). Die SBT-Filme werden dabei mit einer AFM-Spitze polarisiert und in einem zweiten Schritt die daraus resultierenden elektrostatischen Felder mit einem EFM über der Probe abgebildet. Es wurde dabei kritisch hinterfragt, in wieweit diese Methode als Beurteilungskriterium der Materialeigenschaften herangezogen werden kann. Zudem wurden Aufladungsphänomene bei dieser Versuchsführung dokumentiert.
Außerdem wurde das Leckstromverhalten von SBT-Filmen auf der Submikrometerskala mit einer relativ neuen Messmethode, dem conducting-AFM (C-AFM), untersucht.
Die Ergebnisse aller Untersuchungen sind im folgenden stichpunktartig dargestellt.
Topographieuntersuchungen:
• Die RMS-Rauhigkeit von MOD/SBT-Filmen ist größer als die der MOCVD/SBTFilme. Mit steigender Prozesstemperatur des Ferro-Anneals wird die Oberflächenrauhigkeit von SBT-Filmen erhöht.
• SBT-Filme, die mit niedrigen Prozesstemperaturen hergestellt wurden, hier als Niedrigtemperatur-Filme bezeichnet, erfahren mit zunehmender Schichtdicke eine Glättung. Sie ist auf die Einbettung der Kristallite in die verhältnismäßig glatte FluoritPhase zurückzuführen, die wegen der geringen Temperaturen während des FerroAnneal-Prozesses noch nicht vollständig in die rauere ferroelektrische AurivilliusPhase umgesetzt wurde.
• Die unterschiedliche Zusammensetzung der Filme SrxBi2.2Ta2O8,3+x mit X1 = 0.9 und X2 = 1,0, im Text als Sr0,9-Film und Sr1,0-Film bezeichnet, führte zu höheren Kurzschlussraten des Sr0,9-Films in fertiggestellten FeRAM-Kondensatoren. Die Ursache kann auf die höhere Oberflächenrauhigkeit des Sr0,9-Films zurückgeführt werden. EFM-Untersuchungen:
• Bei der Polarisation ferroelektrischer SBT-Filme mit einer elektrisch gepolten AFMSpitze werden Ladungen in undefinierbarer Anzahl auf die Oberflächen gebracht. Diese Ladungen sind mehr oder weniger auf den Oberflächen beweglich. Mit zunehmender Polarisierbarkeit des ferroelektrischen Films wird die Ladung stärker am Polarisationsort durch elektrostatische Anziehung zwischen den orientierten Dipolen und der Oberflächenladung fixiert.
Das positions-spezifisch integrierende TRE5-A Retrotransposon besitzt zwei Promotorregionen (A- und C-Modul). Für das C-Modul konnte ein spezifisch bindendes Protein (CbfA) gefunden werden, das vermutlich über die Expression des Minusstrang-Transkripts regulativ in den Transpositionsmechanismus eingreift. Gleichzeitig stellt CbfA in D. discoideum einen kritischen Faktor dar, der sowohl auf das Wachstum als auch auf die Differenzierung Einfluss nimmt.
Es konnte gezeigt werden:
• Der AT-Haken in CbfA ist für die DNA-Bindung essentiell. Die Inaktivierung hat zur Folge, dass keine Differenzierung stattfindet. Es scheint, dass primär der AT-Haken für die DNA-Bindung sorgt und von den Zinkfingern unterstützt wird.
• Die JmjC-Domäne in CbfA ist essentiell. Transformanden mit CbfA ohne aktive JmjC-Domäne zeigen Defekte sowohl in Wachstum als auch Differenzierung.
• CbfA ist ein nukleares Protein. Es konnte zwar keine Kernlokalisationssequenz identifiziert werden, jedoch weisen die Versuche auf zumindest eine Kernlokalisierungssequenz im C-Terminus des cbfA hin.
• Ein C-terminal verkürztes CbfA ist funktionslos: wahrscheinlich aufgrund fehlender Kernlokalisation und somit fehlender DNA-Bindung.
• Ein N-terminal verkürztes CbfA ist teilweise funktionsfähig: die Komplementation in JH.D2-Zellen führt zu einer partiellen Revertierung hin zum Phänotyp der AX2-Zellen.
• Struktur-Homologien der JmjC-Domäne in CbfA zu Mitgliedern aus der Familie der Fe(II)/2OG-Oxygenasen, DNA-bindende Motive und die Lokalisation im Zellkern weisen auf eine Funktion des CbfAs als Chromatin-Remodeller im Zellkern hin.
• In der Transit von Wachstums- zu Entwicklungsphase kann der CbfA-Mangel durch artifizielle Proteinase A-Expression ausgeglichen werden, aber nicht durch Komplementation mit YakA, Adenylat-Zyklase oder cAMP Rezeptor 1.
• CbfA fungiert wahrscheinlich als Regulator der acaA-Transkription auf Ebene der chromosomalen Strukturen.
• cbfB, ein weiteres Gen mit einer JmjC-Domäne wurde in D. discoideum identifiziert, die Gensequenz vervollständigt und vom Dictyostelium Genom-Projekt verifiziert.
Die Bande q23 auf Chromosom 11 ist in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen verwickelt. Diese sind dominant mit dem Krankheitsphänotyp einer AML, ALL und seltener mit malignen Lymphomen und myelodysplastischen Syndromen assoziiert. Mittlerweile sind fünfundachtzig cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Das auf 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homolog of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40 %), AF9 (27 %), sowie ENL, AF6, ELL und AF10 (4-7 %).
Die Bruchpunkte von t(11;V) Translokationen sind nicht gleichmäßig über das gesamte, 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in der 8,3 kb großen Bruchpunktsregion Bpr. Auch innerhalb der Bpr ist die Verteilung der Translokationsbruchpunkte nicht homogen. Die Bruchpunkte von Patienten mit de novo Leukämien und einem Alter über einem Jahr liegen mehrheitlich in der 5’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster I. Dagegen liegen die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien und einem Alter unter einem Jahr überwiegend in der 3’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster II.
Neuere Forschungsergebnisse zeigten, daß DNA-Doppelstrangbrüche auf zwei verschiedenen Chromosomen eine hinreichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind. Aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte im MLL-Gen stellte sich die Frage, ob bestimmte Regionen dieses Gens für DNA-Doppelstrangbrüche prädisponiert sind. Interessanterweise ist Subcluster II extrem sensitiv gegenüber DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch cytotoxische Agenzien oder Apoptose-auslösende Ereignisse induziert werden können. In unserer Arbeitsgruppe konnte eine etwa 200 bp große Region lokalisiert werden, über die sich nahezu alle Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche verteilten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen in dieser Region durch die Gabe eines Caspase-Inhibitors gehemmt werden kann. Eine Etoposid-induzierte Protein-DNA-Wechselwirkung konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. In der Literatur fanden sich Hinweise darauf, daß Subcluster II im Gegensatz zu Subcluster I eine verstärkte Histonacetylierung aufweist. Basierend auf diesen Hinweisen sollte die Arbeitshypothese untersucht werden, ob Subcluster II einen geninternen Promotor des MLL-Gens darstellt.
Die potentielle Promotorregion wurde zunächst durch Computeranalysen eingegrenzt. Mit RT-PCR Experimenten wurde anschließend der potentielle geninterne Promotor des murinen Mll-Gens in einer murinen Fibroblastenzellinie lokalisiert, die einen Transkriptionsstop und eine Polyadenylierungssequenz in Exon 4 des Mll-Gens trug. Um die am Mausmodell gewonnenen Erkenntnisse auch im humanen System zu überprüfen, wurde die geninterne Promotorregion des humanen MLL Gens vor ein Luciferasereportergen kloniert. Durch RTPCR konnte der geninterne Transkriptionsstart im Subcluster II des humanen MLL-Gens lokalisiert werden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß Transkriptionsinitiation und genetische Instabilität im Subcluster II des humanen MLL-Gens kolokalisieren.
Durch Deletionsmutanten wurde die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotorregion ermittelt. Dabei zeigte sich, daß die Anwesenheit von zwei retromobilen Elementen eine Enhancer-Funktion haben. Demgegenüber zeigte die homologe murine Sequenz, die in unserer Arbeitsgruppe gleichzeitig von S. Scharf untersucht wurde und für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-Doppelstrangbrüche bekannt ist, nur eine schwache Promotoraktivität. Dies weist auf einen Zusammenhang zwischen der genetischen Instabilität von Subcluster II und der Rate geninterner Transkriptionsinitiationsprozesse hin.
Das Protein, für das das Transkript des geninternen murinen Promotors kodiert, wurde mittels immunhistologischer und Western Blot Experimente nachgewiesen. Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses Protein, wie auch das MLL-Protein, proteolytisch durch Taspase1 und daß sich ein Mini-MLL-Komplex bildet.
Nach allogenen Stammzelltransplantation und der damit einhergehenden lang andauernden Immuninkompetenz bzw. Immunsuppression sind die betroffenen Patienten stark für lebensgefährliche invasive Pilzinfektionen empfänglich. Trotz der derzeit verfügbaren antimykotischen Medikamente liegt die mit diesen Infektionen assoziierte Mortalität je nach Literatur bei 90 %. Aus diesem Grund rücken zelltherapeutische Behandlungen, die die Immunität der Patienten mit Pilzinfektionen verbessern und so die Sterblichkeit verringern könnten, immer mehr in den Fokus der Forschung auf diesem Gebiet. Leider ist die Interaktion von humanen Natürlichen Killer Zellen mit den wichtigen Verursachern invasiver Mykosen A. fumigatus und R. oryzae bisher nicht untersucht. Die Wichtigkeit von TH-Zellen in der Pilzabwehr wird zunehmend erkannt. Daher wurde bereits versucht die Prognose von Patienten mit invasiven Aspergillosen nach SZT durch den Transfer von Spender-Aspergillus-spezifischen T-Zellen zu verbessern. Die Generierung anti-R. oryzae T-Zellen sowie die Charakterisierung dieser Zellen ist bisher nicht durchgeführt worden.
Deshalb sollte im ersten Teil dieser Arbeit sollte die antifungale Aktivität humaner NK-Zellen gegenüber A. fumigatus sowie R. oryzae untersucht und charakterisiert werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Generierung von spezifischen T-Zellen gegen R. oryzae aus Zellen des peripheren Blutes gesunder Individuen durchgeführt werden und die generierten Zellen im Hinblick auf ihre Funktionalität, Sicherheit und Wirkspektrum in vitro charakterisiert werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte die direkte antimykotische Aktivität humaner NK-Zellen gegenüber Hyphen von A. fumigatus und R. oryzae gezeigt werden und ein Mechanismus dieser Aktivität identifiziert werden. So induzierte der Kontakt von IL-2 stimulierten NK-Zellen mit Pilzhyphen die Degranulierung der NK-Zellen und die Ausschüttung von Perforin, welches zumindest partiell, die antimykotische Aktivität humaner NK-Zellen gegenüber A. fumigatus und R. oryzae Hyphen vermittelte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen allerdings auch, dass der therapeutische Nutzen adoptiv transferierter NK-Zellen durch einige Faktoren begrenzt werden könnte. Einerseits hatten NK-Zellen keinen zytotoxischen Effekt auf Konidien beider getesteten Pilze, andererseits deutet die beobachtete Immunsuppression darauf hin, dass ein stimulierender Effekt durch die transferierten NK-Zellen auf andere Zellen des Immunsystems durch die Hyphen der beiden Pilze inhibiert werden könnte.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass sich T-Zellen gegen R. oryzae in allen getesteten gesunden Individuen nachweisen lassen und diese isoliert und kultiviert werden können. Das deutet darauf hin, dass hinsichtlich anti-R. oryzae T-Zellen keine Restriktionen bei der Spenderauswahl zu erwarten sind. Die hergestellten Zellen konnten anhand der Expression ihrer Oberflächenantigene sowie des Profils der ausgeschütteten Zytokine dem TH1-Typ zugeordnet werden, welcher mit der protektive Immunantwort bei Pilzinfektionen assoziiert wird. Nach spezifischer Stimulation produzierten die generierten anti-R. oryzae T-Zellen die bei der Bekämpfung von Pilzinfektionen eine wichtige Rolle spielenden pro-inflammatorischen Zytokine IFN-γ und TNF-α und erhöhten die Aktivität der für die Abwehr von Pilzen wichtigen Granulozyten und Monozyten in vitro.
Zwar zeigten die generierten T-Zellen bei Kontakt mit allogenen APZ eine geringe Proliferationsantwort, diese war jedoch mit der nach Stimulation mit autologen, unbeladenen APZ gesehenen Proliferation vergleichbar. Diese Ergebnisse zeigen, dass die generierten anti-R. oryzae T-Zellen zumindest in vitro ein deutlich geringeres alloreaktives Potential als unselektionierte T-Zellen haben. Entsprechende Resultate zeigten sich auch bei Betrachtung der IFN-γ Sekretion der generierten anti-R.oryzae
T-Zellen. Die Stimulation mit Fremdspender-APZ beeinflusste die Sekretion von IFN-γ durch die anti-R. oryzae T-Zellen im Vergleich zu der IFN-γ-Sekretion durch anti-R. oryzae T-Zellen, mit autologen, unbeladenen APZ stimulierten wurden, kaum.
Des Weiteren wiesen die hergestellten anti-R. oryzae T-Zellen zahlreiche Kreuzreaktivitäten gegenüber anderen Pilzspezies, auch Genera übergreifend, auf. So zeigten sie Kreuzreaktivität gegenüber klinisch bedeutenden Pilzen wie Rhizopus microsporus, Mucor circinelloides, Rhizomucor pusillus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Candida albicans und Candida glabrata, die alle als Erreger invasiver Mykosen bei immunsupprimierten Patienten bekannt sind. Die Stimulation mit Antigenen dieser Pilze mittels Antigenpräsentierenden Zellen führte zur einen deutlichen IFN-γ-Produktion durch die generierten Zellen.
Mit einer Prävalenz von rund 5% bildet das Hereditäre Nonpolypöse Kolorektalkarzinom (HNPCC), auch Lynch Syndrom genannt, die häufigste genetische Disposition unter allen Kolorektalkarzinomen in Deutschland. Das Lynch Syndrom wird autosomal-dominant vererbt und tritt im Schnitt bereits ab dem 44. Lebensalter auf, während die Mehrheit der Kolorektalkarzinome erst mit 63 Jahren diagnostiziert wird. Ein wichtiges Merkmal sind sogenannte HNPCC-assoziierte Malignome, welche sich außerhalb des Dickdarms befinden. Die Diagnose gestaltet sich allerdings relativ schwierig, da bei Lynch Syndrom-Patienten kein eindeutiger klinisch auffälliger Phänotyp vorliegt und die Diagnosestellung nur in Zusammenhang mit einer Familienanamnese des Patienten möglich ist.
Mittlerweile ist bekannt, dass für das charakteristische Auftreten von hochgradigen Mikrosatelliteninstabilitäten im Tumorgewebe ein defektes DNA-Mismatch-Reparatursystem verantwortlich ist. Diese Defekte treten vor allem in den Genen MLH1, MSH2, MSH6 oder PMS2 auf und können über die Keimbahn vererbt werden.
Das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 wurde im Jahr 2009 publiziert, nachdem es bei einer Familie aus Französisch-Guyana gehäuft identifiziert wurde. Mehrere Familienmitglieder waren an unterschiedlichen Krebsarten erkrankt, und die Tatsache, dass neben Dickdarmtumoren auch synchrones und metachrones extrakolonisches Tumorwachstum auftrat, ließen den Schluss einer positiven Familienanamnese für das Lynch Syndrom zu. Auffällig war jedoch, dass das Spektrum dieser extrakolonischen Tumoren nicht im Einklang mit den typischen HNPCC-assoziierten Malignomen stand. Daher lag die Vermutung nahe, dass das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 für diesen Phänotyp verantwortlich ist.
Das dem zugrundeliegende Fusionsgen MLH1•ITGA9 ist das Resultat einer interstitiellen Deletion auf Chromosom 3p21.3. Es kodiert für den N-Terminus des Mismatch-Reparaturgens MLH1 sowie den C-Terminus des rund 400 kb downstream gelegenen Integrin α9. Aufgrund der fehlenden nukleären Lokalisationssequenz und weiterer wichtiger im C-Terminus gelegenen Domänen des MLH1-Proteins ist davon auszugehen, dass es außer Stande ist, Basenfehlpaarungen zu reparieren; ebenso sollte das Fusionsprotein theoretisch keine Funktionen des Wildtyp Integrin α9 mehr ausüben können.
Diese Annahmen konnten durch diverse Versuche wie Zelladhäsions- und Zellmigrationsassays bestätigt werden; das Fusionsprotein hatte dabei keinerlei Einfluß auf das Adhäsions- oder Migrationsverhalten unterschiedlicher Zelllinien.
Bezüglich der Lokalisation von MLH1•ITGA9 wurde über Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der fehlenden nuklären Lokalisationssequenz im MLH1-Proteinteil der Nachweis erbracht, dass sowohl das Fusionsprotein als auch seine Variante MLH1∆ (bestehend aus dem MLH1-Teil) lediglich im Zytoplasma, und nicht wie der Wildtyp auch im Zellkern, zu finden ist.
Desweiteren zeigten Co-Immunopräzipitationsexperimente eine Interaktion zwischen dem Fusionsprotein und MLH1∆ mit dem Tumorsuppressor BRCA1. Die Folgen dieser Interaktion wurden auf translationeller und Proteinebene mit dem Ergebnis untersucht, dass Zellen, welche das Fusionsprotein oder seine trunkierte Variante MLH1∆ exprimieren, nach Etoposidstimulierung teilweise in gravierendem Ausmaß einen negativen Einfluss auf die p53-abhängige DNA-Reparaturmaschinerie aufweisen. Dies zeigte sich besonders deutlich auf transkriptioneller Ebene in einer bis zu 96%igen Herunterregulierung wichtiger Zellzyklus- sowie proapoptotischer Gene. Die durchflusszytometrische Analyse dieser Zellen zeigte außerdem eine höhere Apoptoseresistenz nach Etoposidstimulierung im Vergleich zu Wildtyp-MLH1 exprimierenden Zellen.
Die Wechselwirkungen von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) mit Eis in der Atmosphäre sind für viele umweltrelevante Aspekte von Interesse, dennoch gibt es bisher erst wenige Untersuchungen zu dieser Thematik.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen verschiedener VOCs mit Eis durch Kraftfeldrechnungen simuliert. Als Substanzen wurden das Keton Aceton, die Kohlenwasserstoffe Isopren und Mesitylen, die Alkohole Ethanol, tert-Butanol, 2-Methyl-3-buten-2-ol (MBO) und Perillylalkohol, die Ether Methyl-tert-butylether und Ethyl-tert-butylether (ETBE) sowie die Aldehyde Nonanal und Methacrolein ausgewählt.
Hierbei wurden sowohl die Adsorption an verschiedenen Oberflächen von hexagonalen Eis (Eis Ih) und von kubischem Eis (Eis Ic) als auch die Absorption in Eiskristallen und an den darin enthaltenen Linien- und Flächendefekten betrachtet. Für jedes VOC wurden die resultierenden Strukturen sowie die dazu gehörigen Enthalpien ermittelt und mittels Boltzmann-Statistik ausgewertet.
Für die Berechnung der Wechselwirkungen von VOC mit Eis wurde ein Kraftfeld entwickelt, das sowohl die Strukturen von Eis Ih und Eis Ic als auch die Strukturen der organischen Moleküle und ebenso die Wechselwirkungen zwischen Eis und organischem Molekül gut wiedergibt. Es basiert auf dem für organische Moleküle verwendeten DREIDING-Kraftfeld und wurde modifiziert mit Parametern für Wasser aus dem TIP5P-E-Kraftfeld. Das Kraftfeld wurde an Ab-initio-Rechnungen und experimentellen Daten validiert.
Die Simulationen erbrachten folgende Ergebnisse:
– Unpolare Kohlenwasserstoffe werden nur in geringem Maße an den Eisoberflächen adsorbiert; eine Absorption in die Eiskristalle ist energetisch noch wesentlich ungünstiger. Für diese Verbindungen ist der Austrag aus der Atmosphäre durch Wechselwirkungen mit der Eisphase daher nicht relevant.
– Sauerstoffhaltige Verbindungen werden an der Eisoberfläche gut adsorbiert. Zwischen dem VOC-Molekül und der Eisoberfläche bilden sich Wasserstoffbrückenbindungen aus. Ihre Anzahl ist abhängig von der Art des Moleküls (Keton, Aldehyd, Ether oder Alkohol). Die Simulationen zeigen, dass die nasse Deposition durch Wechselwirkungen mit der Eisphase für diese Stoffe ein Austragsweg aus der Atmosphäre ist, der nicht vernachlässigt werden darf.
– Bei einem Einbau von VOC-Molekülen in den Eiskristall wird die Eisstruktur teilweise erheblich verzerrt. Je kleiner die VOC-Moleküle sind, desto geeigneter sind sie für einen Einbau in den Eiskristall; bei größeren Molekülen ist der Einbau aufgrund des sterischen Anspruchs behindert. Zunehmende Größe des Moleküls begünstigt andererseits die Adsorption.
Parallel zu den theoretischen Untersuchungen wurde eine Apparatur entwickelt, mit der sich die Ad- und die Absorption von VOCs beim Wachsen der Eiskristalle experimentell untersuchen lässt. Die Eiskristalle entstehen dabei unter kontrollierten Bedingungen und wachsen, wie in der Atmosphäre, durch Anlagerung von Wasserdampf. Gleichzeitig wird dem Wasserdampf eine definierte Menge an VOC zugegeben. Das entstehende Eis wurde mittels GC analysiert. Als alternatives Analyseverfahren zur Bestimmung von VOCs in Wasser wurde ein NMR-Verfahren entwickelt, das quantitative Messungen im dreistelligen ppm-Bereich erlaubt. Erste Untersuchungen an Eiskristallen, die in Gegenwart von ETBE erzeugt wurden, zeigten, dass dieses VOC − wie auch in den Simulationen vorhergesagt − überwiegend an der Oberfläche von Eis adsorbiert, und nicht in den Eiskristall eingebaut wird.
Für ETBE wurde im Rahmen dieser Arbeit zusätzlich die Kristallstruktur der alpha-Phase aus Röntgenpulverdaten durch Kristallstrukturvorhersage und Realraummethoden bestimmt. ETBE kristallisiert in der für organische Verbindungen sehr seltenen Raumgruppe C 2/m. Die experimentelle Kristallstruktur entspricht der von der Dichte her günstigsten, von der Gitterenergie her zweitgünstigsten vorhergesagten Kristallstruktur. Die Kristallstruktur eines zweiten VOCs, MBO, konnte ebenfalls aus Röntgenpulverdaten bestimmt werden, obwohl die Kristallstruktur drei symmetrieunabhängige Moleküle pro asymmetrischer Einheit enthält. Da sowohl ETBE als auch MBO bei Raumtemperatur flüssig sind, wurden beide für die Messungen bei tiefer Temperatur kristallisiert.
Die Kristallstrukturen dieser beiden VOCs können wiederum zur Simulation von sekundären organischen Aerosolen in der Atmosphäre genutzt werden.
Auch die Kristallstrukturen zweier weiterer Verbindungen konnten aus Röntgenpulverdaten bestimmt werden: zum einen die Strukturen des Trihydrates, des Monohydrates und des Anhydrates von Pigment Red 57:1 (C18H12CaN2O6S), dem wichtigsten industriellen Rotpigment, mit dem weltweit die Mehrheit aller Zeitungen und Zeitschriften gedruckt werden, zum anderen die Struktur des 2-Butanol-Hemisolvats von Methyl-(2R,3R)-2-{3-[amino(imino)methyl]benzyl}-3-{[4-(1-oxido-4-pyridinyl)benzoyl]¬amino}butanoat-hydrochlorid. Mit diesen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Kristallstrukturen organischer Verbindungen aus Röntgenpulverdaten auch dann bestimmt werden können, wenn verschiedene Probleme kombiniert auftreten, z. B. schlecht kristalline Pulver, Textur, Solvate, Hydrate, Fehlordnung, funktionelle Gruppen mit vergleichbarer Streukraft, mehrere symmetrieunabhängige Moleküle, hohe Anzahl von Parametern bei der Strukturlösung etc.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, dass die Wechselwirkungen zwischen sauerstoffhaltigen VOC-Molekülen und der Eisphase nicht vernachlässigt werden dürfen. Sie sollten in Simulationen der Atmosphäre berücksichtigt werden, um so Aussagen über Auswirkungen auf das Klima und andere umweltrelevante Aspekte zu verbessern.
Nikotinische Acetylcholin Rezeptoren (nAChR) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle der pentameren Cys-Loop Familie, welche nach Bindung des Neurotransmitters Acetylcholin exzitatorische Signale in Muskeln und Neuronen vermitteln. Während die Funktion der Rezeptoren an der synaptischen Membran relativ gut untersucht wurde, gibt es bis heute kaum Erkenntnisse über die intrazellulären Prozesse und Proteine, die der selektiven Assemblierung von homologen Untereinheiten zu funktionalen Rezeptorpentameren zugrundeliegen.
Das C. elegans Genom kodiert für mehr als 29 nAChR Untereinheiten-Gene und besitzt damit die größte Anzahl bekannter Homologe innerhalb der untersuchten Arten. An der neuromuskulären Synapse (NMJ) des Nematoden sind zwei Typen von nAChR bekannt: der heteromere Levamisolrezeptor (L-AChR) und der homomere Nikotinrezeptor (N-AChR). Innerhalb dieser Arbeit wurde der funktionale Zusammenhang zwischen den nikotinischen Rezeptoren der NMJ von C. elegans und einem neuen rezeptorassoziierten ER-Proteinkomplex der Proteine NRA-2 und NRA-4 untersucht. Ihre vertebraten Homologe Nicalin und Nomo wurden zuerst im ER vom Zebrafisch im Zusammenhang mit dem TGF-β Signalweg beschrieben. Mutation der Proteine hat einen Agonist-spezifischen Einfluss auf die Aktivität von L-AChR und N-AChR. Die subzellulären Lokalisationsstudien demonstrierten, dass die beiden Proteine im ER von Muskelzellen wirken und dort mit Rezeptoruntereinheiten co-lokalisieren. Weiterhin ließ sich nachweisen, dass die relative Menge einzelner L-AChR-Untereinheiten an der synaptischen Oberfläche reduziert bzw. erhöht ist. Da die Rezeptoraktivität in Zusammenhang mit der Untereinheiten Komposition steht, wurde die Rolle von zusätzlichen Untereinheiten wie ACR-8 untersucht. Dies zeigte, dass die zusätzliche Mutation der Untereinheit acr-8 in nra-2 Mutanten den Einfluss der nra-2 Einzelmutation auf die Aktivität des L-AChR revertiert. Basierend auf diesen Ergebnissen lässt sich die Hypothese formulieren, dass der NRA-2/NRA-4 Komplex im ER von C. elegans als Kontrollinstanz fungiert welche dafür sorgt, dass nur die jeweils „korrekten“ Untereinheiten in funktionale Rezeptoren eingebaut bzw. andere vom Einbau in das Pentamer abgehalten werden. Durch Fehlen des aktiven Komplexes in Mutanten können nicht vorgesehene -Untereinheiten (z. B. ACR-8) in funktionale Pentamere mit veränderter Funktionalität eingebaut werden.
Das Myc-Bindeprotein 2 (MYCBP2) könnte aufgrund seiner enormen Größe, seiner multiplen funktionalen Domänen und seiner ubiquitären Expression in die verschiedensten Signaltransduktionswege involviert sein. Bisher wurde überwiegend die Funktion der C-terminalen RING-Finger-Domäne untersucht, die die E3-Ubiquitinligase-Aktivität des MycBP2 bedingt. Über die Interaktion mit verschiedenen Signalwegen, wie den p38-Signalweg oder die mTOR-Aktivierung, kann MycBP2 über Ubiquitylierung und anschließendem proteosomalen Abbau diverse Prozesse der Synaptogenese und der spinalen Schmerzverarbeitung, aber auch der peripheren Nozizeption regulieren. Über die Funktionen der N-terminalen RCC1-ähnlichen Domäne ist dagegen weniger bekannt. Bisher konnte eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit dem neuronenspezifischen elektroneutralen Kalium- und Chlorid-Ionen Co-Transporter KCC2 und mit der Adenylylcyclase nachgewiesen werden. Bindet MycBP2 oder seine RCC1-ähnliche Domäne an membranständiges KCC2 führt dies einem verstärkten Transporteraktivität, während die Bindung an die Adenylylcyclase in deren Hemmung resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollten nun auf Basis eines Antikörperarrays neue Interaktionspartner des MycBP2 und deren Funktion bestimmt werden.
Der Antikörperarray vergleicht die Expression diverser Proteine in DRG-Lysat von SNS-Cre positiven und SNS-Cre-negativen MycBP2lox/lox Mäusen und weist Unterschiede im Vorkommen von SUMO1 auf. Durch Analyse mittels Western Blot zeigte sich ein verstärktes Signal für ein 85 kDa-Protein. Mittels Immunpräzipitation sowohl aus HeLa-Zellen als auch aus DRG-Neuronen wurde das Protein als SUMOyliertes RanGAP1 identifiziert. Durch CO-Immunpräzipitationen konnte eine direkte Protein-Protein Interaktion nachgewiesen werden, die während einer Zymosan-induzierten Hyperalgesie zu einer MycBP2-abhängig Regulation der RanGAP1 Expression und SUMOylierung führt. Die erhöhte RanGAP1 Menge in Abwesenheit von MycBP2 ist dabei nicht auf eine MycBP2-abhängige Ubiquitinierung des RanGAP1 zurückzuführen. Dagegen konnte eine Hemmung der Ubiquitinligaseaktivität des MycBP2 in Anwesenheit von SUMOyliertem RanGAP1 festgestellt werden, die sowohl bei der Autoubiquitylierung als auch beim proteosomalen Abbau von TSC2 nachgewiesen werden konnte. Weitere Untersuchungen zeigen eine durch SUMOyliertes RanGAP1-vermittelte Translokation des MycBP2 an den Zellkern, die durch Transfektion mit RanGAP1 siRNA sowohl in HeLa-Zellen als auch in primären DRG-Kulturen gehemmt werden kann.
Im nächsten Schritt wurde die mögliche Interaktion von MycBP2 mit Ran untersucht. Es zeigte sich, dass die Ranexpression in DRGs von Cre-positiven MycBP2lox/lox Mäusen im Gegensatz zu Cre-negativen MycBP2lox/lox Mäusen signifikant gesteigert ist und auch hier eine MycBP2-abhängige Expressionsregulation während der Zymosan-induzierten Hyperalgesie vorliegt. Ein 3D-Modell von primären DRG-Kulturen nach Immunfärbung weist eine Kolokalisation von MycBP2 und Ran sowohl im Cytosol als auch im Zellkern auf. Immunfärbungen von DRG-Schnitten zeigten außerdem, dass Ran in Abwesenheit von MycBP2 verstärkt im Zellkern vorliegt, was auf eine direkte Interaktion von MycBP2 mit Ran hindeutet. Auf Grund des stationären GTPase Assays konnte eine Integration des MycBP2 in den RanGTPase Zyklus belegt werden, da die Anwesenheit von MycBP2 zu einer gesteigerten GTP-Hydrolyse führte. Anhand des Ein-Zyklus-GAP-Assay wurde daher der Einfluss des MycBP2 auf die GAP-Aktivität des RanGAP1 überprüft, wodurch sich zeigte, dass MycBP2 die GAP-Aktivität des RanGAP1 hemmt. Damit bedingt die MycBP2/RanGAP1-Interaktion eine gegenseitige Hemmung der Enzymaktivität der beteiligten Proteine. Weitere Untersuchungen durch 35S-GTP-Bindeassays deckten eine konzentrationsabhängige GEF-Aktivität des MycBP2 für Ran auf, wobei die GEF-Aktivität von der RCC1-ähnlichen Domäne des MycBP2 vermittelt wird. Des Weiteren zeigte sich anhand von Versuchen mit der konstitutiv aktiven Ran-Mutante Q69L und der inaktiven Ran-Mutante T24N, dass MycBP2 verstärkt die inaktive Form des Ran, also RanGDP bindet.
In dieser Arbeit konnte so zum ersten Mal eine Integration des MycBP2 in den RanGTPase-Zyklus gezeigt werden, die es MycBP2 ermöglicht, sowohl in die nukleare Import/Export-Maschinerie, in den Aufbau der mitotischen Spindel und die Bildung der Kernmembran einzugreifen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
Die Entstehung von Leukämien steht meist im Zusammenhang mit chromosomalen Translokationsereignissen, bei denen vor allem das MLL (Mixed Lineage Leukemia)-Gen auf Chromosom 11q23 involviert ist. Die häufigste Translokation, die eine Akute Lymphatische Leukämie (ALL) bei Kleinkindern auslöst, stellt die t(4;11)-Translokation dar. Die Rekombination der Chromosomen 11 und 4 führt hierbei zur Entstehung der beiden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL. Bisherige Studien, die den Krankheitsmechanismus hinter dieser ALL-Form untersuchten, identifizierten eine charakteristische Überexpression der HOXA-Gene als einen besonderen Treiber dieser Krankheitsentstehung. Durch die Deregulierung des HOX-Clusters durch das chimäre MLL-AF4-Protein wird ein Differenzierungs- und Apoptoseblock induziert und eine stetige Proliferation der Zellen gefördert. Arbeiten von Trentin et al. (2009) klassifizierten eine Subgruppe von t(4;11)-Patienten, die, im Gegensatz zu den bisher charakterisierten ALL-Leukämien, eine Reprimierung ihrer HOXA-Cluster aufwiesen und mit einer schlechteren Prognose assoziiert waren. Das Genexpressionsprofil dieser HOXAlow-Patienten sprach für einen neuen Krankheitsmechanismus. Allen HOXAlow-Patienten war zudem gemein, dass sie eine Überexpression des Transkriptionsfaktors IRX1 aufwiesen. Die Relevanz dieses Transkriptionsfaktors im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde durch diese Doktorarbeit genauer untersucht. Durch Vorarbeiten mit transient exprimiertem IRX1 in HEK293T-Zellen wurde eine DNA-Microarray-Analyse durchgeführt, durch die ein Genexpressionsprofil (GEP) dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (mit dem Leervektor transfiziert) erstellt wurde. Dies schuf die Grundlage für die Durchführung weiterer Experimente, die mit Hilfe von RT-PCR-, Chromatin-Immunpräzipitations-, Co-Immunpräzipitations- und Western Blot-Versuchen den Effekt und das Verhalten des IRX1-Proteins im Zusammenhang mit MLL-AF4, bzw. die Funktion von IRX1 alleine, charakterisieren sollten. Es zeigte sich, dass IRX1 eine Reprimierung der HOXA-Gene induziert und dieser Effekt über den aktivierenden Effekt des chimären MLL-AF4-Proteins dominiert. Dies geschah jedoch auf zwei unterschiedliche Wege, da zum einen das IRX1 in der Abwesenheit von MLL-AF4 nicht direkt an die HOXA-Gene binden kann und zum anderen durch MLL-AF4 eine Inkorporation des IRX1 in den Multiproteinkomplex des chimären Onkoproteins stattfindet und IRX1 dadurch direkt an die HOXA-Promotoren gelangt. Zudem wurden weitere direkte und indirekte Zielgene des IRX1 identifiziert. Zu ihnen zählen MEIS1, HOXB4 und EGR1-3. Durch die Erweiterung der Versuche durch Behandlungen mit dem pan-HDAC-Inhibitor Trichostatin A konnte belegt werden, dass MLL-AF4 vom Promotor seiner Zielgene dissoziiert und durch das endogene wt-MLL ersetzt werden kann. Trotz der inhibitorischen Wirkung des IRX1 auf das MLL-AF4 verursacht es eine Stabilisierung des MLL-AF4 an den Promotoren seiner Zielgene, was eine Dissoziation des Komplexes durch TSA verhindert. Die Applikation von TSA führt unabhängig von der vorherigen Konstitution (±IRX1) aber auch zu einer Normalisierung der HOXA-Expression. Die vorgelegten Daten verdeutlichen, dass IRX1 kausal für das GEP der HOXAlow-Patienten verantwortlich ist und durch seine Anwesenheit wichtige Regulatoren der Differenzierung und der Zellzyklusregulierung gestört werden. Zudem wurde der Benefit einer Histondeacetylaseinhibitor (HDACi)-Behandlung bei dieser Patientenkohorte hervorgehoben, da der inhibierende Effekt des IRX1 auf die HOXA-Gene aufgehoben und das wt-MLL in seiner Funktionsfähigkeit nicht beeinträchtigt wurde. Die Relevanz des IRX1 im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde somit aufgeklärt und ein neuer Krankheits-mechanismus der HOXAlow-Patientenkohorte definiert. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Etablierung eines Transfektionsprotokolls, um eine stabile Integrationen der Sleeping Beauty-Konstrukte in t(4;11)-Suspensionszellen zu ermöglichen. Bisher war es nur über lentivirale Methoden möglich, diese Zellen genetisch zu manipulieren. Durch die hier vorgestellte Methode können nun SEM-Zellen (B-Zell-Vorläuferzellen einer ALL mit t(4;11)) über Elektroporation stabil transfiziert und anschließend über Selektion zu einer homogenen Zellpopulation positiv transfizierter Zellen herangezogen werden. Hierdurch wird eine Übertragung bisheriger Methoden in ein leukämisches Zellsystem möglich, wodurch genetische Manipulationen in einer physiologischen Umgebung getestet werden können, ohne in S2-Laboratorien arbeiten zu müssen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Inhibitoren der bakteriellen Resistenzproteine New Delhi Metallo-β-Lactamase 1 (NDM-1), die beiden Mutanten der Verona-Integron Encoded Metallo-β-Lactamase 1 und 2 (VIM-1, bzw. -2), sowie die Imipenemase 7 (IMP-7) entwickelt.
Auf Grund natürlicher Selektion, aber vor allem auch bedingt durch den unüberlegten und verschwenderischen Einsatz von β-Lactam-Antibiotika, ist eine weltweite Zunahme an multiresistenten Erregern zu beobachten. Einer der Hauptgründe dieser Resistenzen sind die Metallo- β-Lactamsen (MBL), welche vor allem in Gramnegativen Bakterien vertreten sind und für die Hydrolyse und damit der Desaktivierung der β-Lactam-Wirkstoffe verantwortlich sind. Neben der Suche nach anderweitig wirkenden Antibiotika, ist die Entwicklung von Inhibitoren der MBLs von vordringlicher Bedeutung.
Basierend auf der Grundstruktur des ACE-Hemmers Captopril, wurden trotz synthetischer Herausforderungen erfolgreich mehrere Strukturen mit inhibitorischer Aktivität gegenüber den MBLs synthetisiert. Der Prolinring von Captopril wurde in einer neuen Variante der Captopril-Synthese durch verschiedene Ring- und nicht cyclische Teilstrukturen ersetzt. Durch die Entwicklung einer Schutzgruppenstrategie, konnte die Ringstruktur durch einen Piperazin-Rest ersetzt werden. Dies erlaubt es, die Molekülstruktur auf dieser Seite zu erweitern. Des Weiteren wurde eine neue Syntheseroute etabliert, welche es auf elegante Weise ermöglicht, weitere Derivatisierungen an der Methylgruppe des Captoprils durchzuführen.
In einem proteinbasierten Testsystem wurden die synthetisierten Substanzen auf ihr inhibitorisches Potential hin untersucht. Dabei wurden IC50-Werte im niedrig einstelligen mikromolaren, für drei Verbindungen sogar im sub-mikromolaren Bereich ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden für die drei aktivsten Inhibitoren durch eine Erhöhung des Schmelzpunktes in einem TSA-Testsystem erfolgreich verifiziert. Mittels ITC-Untersuchungen konnte die unterschiedlichen Gewichtungen der entropischen und enthalpischen Beiträge zur Bindung der Inhibitoren an die untersuchten MBLs aufgezeigt werden. Hierdurch konnten die scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse der ermittelten IC50-Werte und Schmelzpunktverschiebungen für die Verbindung DBDK48 bezüglich der NDM-1 aufgeklärt werden.
Die Strukturen DB320 konnte erfolgreich mit VIM-2 co-kristallisiert werden. Dies ermöglicht eine genauere Untersuchung und qualifizierte Aussagen über die Bindungsverhältnisse zwischen Protein und Ligand.
Für zwei der synthetisierten Inhibitoren sollte untersucht werden, ob deren Aktivität in vitro auch in Bakterien erhalten bleibt. Dazu wurden pathogene klinische Isolate und Laborstämme, welche mit dem Resistenzplasmid transfiziert wurden, und gegen Imipenem resistent sind, herangezogen. Durch die Zugabe der Inhibitoren konnte die Wirksamkeit von Imipenem wiederhergestellt werden.
Es konnte eine HPLC-Methode etabliert werden, welche eine Abschätzung der Polaritäten in Abhängigkeit der Retentionszeiten erlaubt. Dadurch konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Polarität der Verbindungen und dem Grad der Wirksamkeit im MIC-Testsystem aufgezeigt werden.
Durch die Untersuchung der Inhibitoren auf die Proteine ACE und LTA4H, konnten zwei Ziel-Proteine der Captopril-Grundstruktur als unerwünschte Nebenziele ausgeschlossen werden. Des Weiteren führte die Behandlung von U937-Zellen, selbst bei einer hohen Konzentration von 100 µM, weder zu Auffälligkeiten in einem WST-1 Assay, noch zu einer erhöhten Freisetzung von LDH. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Verbindungen über keine zytotoxischen Eigenschaften verfügen.
Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
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Die chemischen und physikalischen Eigenschaften eines Festkörpers sind vom inneren Aufbau des Festkörpers abhängig. Die Methode der Wahl zur Bestimmung von Kristallstrukturen sind Beugungsexperimente. Fehlordnungen in den Kristallstrukturen werden mit Beugungsexperimenten häufig nur unzureichend ausgewertet oder ignoriert. In dieser Arbeit wurden die (möglichen) Stapelfehlordnungen der Aminosäuren DL-Norleucin und DL-Methionin, sowie von Chloro (phthalocyaninato)aluminium(III) untersucht. Dazu wurden Gitterenergieminimierungen mit Kraftfeld- und quantenchemischen Methoden an einem Satz geordneter Modellstrukturen durchgeführt.
In den Kristallstrukturen der α- und β-Phasen von DL-Norleucin ordnen sich die Moleküle in Doppelschichten an und bilden jeweils eine Schichtstruktur mit unterschiedlicher Stapelsequenz. Röntgenbeugungsexperimente an Kristallen dieser Verbindung zeigen charakteristische diffuse Streuung. Die durchgeführten Gitterenergieminimierungen reproduzieren die experimentelle Stabilitätenreihenfolge der beiden Polymorphe von DL-Norleucin. Die berechneten Gitterenergien zeigen, dass es für DL-Norleucin bevorzugte Stapelsequenzen gibt. Die Gitterenergien und Molekülstrukturen einer einzelnen Doppelschicht sind dabei von der Anordnung benachbarter Doppelschichten abhängig. Zudem wurden Strukturmodelle mit Stapelsequenzen aufgebaut, die aus kristallographischer Sicht möglich sind, jedoch experimentell nicht beobachtet wurden, und deren Gitterenergie berechnet. Diese Stapelsequenzen liefern im Vergleich zu den energetisch günstigsten Stapelsequenzen einen signifikanten Energieverlust und treten daher selten auf. Ausgehend von den Ergebnissen der Gitterenergieminimierungen mit DFT-D-Methoden wurden Stapelwahrscheinlichkeiten mit Hilfe der Boltzmann-Statistik berechnet. Es wurde ein großes geordnetes Modell mit einer Stapelsequenz gemäß der Stapelwahrscheinlichkeiten aufgebaut. Dieses Modell wurde verwendet, um Beugungsexperimente zu simulieren und mit experimentellen Daten zu vergleichen. Die theoretischen und experimentellen Beugungsdaten waren in guter Übereinstimmung.
Die Moleküle in den Kristallstrukturen der α- und β-Phasen von DL-Methionin bilden Doppelschichten. Die beiden Phasen unterscheiden sich in der Stapelung der Doppelschichten und der Molekülkonformation. Es wurden Gitterenergieminimierungen sowohl mit Kraftfeld-Methoden als auch mit DFT-DMethoden an geordneten Modellen mit unterschiedlichen Stapelsequenzendurchgeführt. Die experimentell bestimmte Stabilitätenreihenfolge der Polymorphe von DL-Methionin bei tiefen Temperaturen wurde durch die Ergebnisse der kraftfeldbasierten Rechnungen reproduziert. Die Modellstrukturen wurden während den Rechnungen moderat verzerrt. Die Bandbreite der relativen Energien aller Modelle ist relativ gering, sodass eine Stapelfehlordnung aus thermodynamischer Sicht nicht ausgeschlossen werden kann. In der Regel liefern Gitterenergieminimierungen mit DFT-D Methoden genauere Ergebnisse. Die Modellstrukturen wurden während den Rechnungen nur leicht verzerrt. Allerdings unterscheidet sich das Energieranking zwischen den Kraftfeld- und DFT-D-Methoden deutlich. Die experimentell bestimmte Stabilitätenreihenfolge der Polymorphe von DL-Methionin wurde mit DFT-D-Methoden nicht reproduziert. Die Energieunterschiede zwischen den beiden Polymorphen (ΔE = 1,60 kJ∙mol−1 (DFT-D2) bzw. ΔE = 0,83 kJ∙mol−1 (DFT-D3)) sind relativ gering und liegen im Fehlerbereich der Methode. Die Bandbreite der relativen Energien aller Strukturmodelle beträgt nur etwa 1,8 kJ∙mol−1. Auf dieser Grundlage ist eine Stapelfehlordnung in den Kristallstrukturen von DL-Methionin möglich, jedoch nicht experimentell beobachtet. Nicht nur die Kraftfeld-,sondern auch die DFT-D-Methoden scheinen für die Berechnung der Gitterenergien für das System DL-Methionin nicht genügend genau zu sein. Die erhaltenen relativen Energien sollten daher mit Vorsicht betrachtet werden.
Chloro(phthalocyaninato)aluminium(III) (AlPcCl) bildet eine Schichtstruktur, in der sich die Moleküle zu Doppelschichten zusammenlagern. Die 1984 durchgeführte Kristallstrukturbestimmung [98] lieferte auf Grund der schlechten Datenqualität nur eine ungenaue Kristallstruktur. Die asymmetrische Einheit enthält zwei Moleküle, von denen das eine Molekül geordnet, das andere fehlgeordnet ist. Die Kristallstruktur von AlPcCl ist fehlgeordnet, weil eine einzelne Doppelschicht von Molekülen eine tetragonale P4/n-Symmetrie aufweist, die vier symmetrieäquivalente Möglichkeiten bietet, eine zweite Doppelschicht auf einer ersten Doppelschicht zu platzieren. Mit Hilfe der OD-Theorie wurde ein Satz geordneter Modelle mit verschiedenen Stapelsequenzen aufgestellt und die Gitterenergie zunächst mit Kraftfeld-Methoden und anschließend mit DFT-DMethoden berechnet. Auf Grund unzureichender Parametrisierung, musste das Kraftfeld an das System AlPcCl angepasst werden. Die Modellstrukturen werden während den Kraftfeld-Rechnungen nur leicht verzerrt. Die berechneten Gitterenergien hängen allerdings stark von der verwendeten Parametrisierung und den Atomladungen ab und sollten daher mit Vorsicht betrachtet werden. Genauere Ergebnisse erzielten Gitterenergieminimierungen mit DFT-D-Methoden. Die verschiedenen Stapelsequenzen haben eine ähnliche Energie, was die Stapelfehlordnung in der Kristallstruktur von AlPcCl erklärt. Die Überlagerung der vier energetisch günstigsten geordneten Stapelsequenzen führt zu einer gemittelten Struktur, die sehr gut die fehlgeordnete experimentelle Kristallstruktur von AlPcCl erklärt.
Verschiedene physikalische Effekte erlauben es Licht so zu führen und zu verändern, dass es Einblicke in für Menschen sonst unzugängliche Bereiche gewährt. Eines von insgesamt drei Elementen dieser Dissertationsschrift ist der Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops. Dieses fortschrittliche Werkzeug erweitert das zur Verfügung stehende Instrumentarium um verschiedene Analysemethoden, allen voran die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch geringfügige Modifikationen können auch weitere Methoden, wie beispielsweise stimulierte Raman-Streuung realisiert werden.
Insbesondere die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie war für das zweite Element dieser Dissertationsschrift von großer Bedeutung. In dieser Studie wurde das Bleichverhalten von Spinach bei 2-Photonen-Absorption untersucht, sowohl an frei in Lösung befindlichen als auch auf einem Träger immobilisierten Spinach-Komplexen. Die Ergebnisse zu den frei in Lösung befindlichen Spinach-Komplexen zeigen, dass die Verstärkung der Fluoreszenz von DFHBI grundsätzlich auch im Fall der 2-Photonen-Absorption eintritt. Dabei wurde ein Ausbleichen der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz für frei in Lösung befindliche Spinach-Komplexe erst bei außerordentlich hohen Intensitäten der Anregungsstrahlung beobachtet. Dieser Befund kann zumindest teilweise auf das Eindiffundieren fluoreszenter Spinach-Komplexe in das sehr kleine Fokalvolumen innerhalb der 2-Photonen-Anregung stattfindet zurückgeführt werden. Für immobilisierte Spinach-Komplexe konnte gezeigt werden, dass eine kontinuierliche Bildaufnahme gegenüber einer Bildaufnahme in Intervallen mit jeweils zusätzlichen Dunkelphasen zur Erholung des reversiblen Bleichens der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz, sowie der generelle Verzicht auf spezielle Belichtungsschemata und Methoden der Datenakquise mit keinen besonderen Nachteilen verbunden ist. Abschließend betrachtet erweist sich Spinach bei 2-Photonen-Anregung als ausgesprochen resistent gegenüber einem irreversiblem Ausbleichen des Fluoreszenzsignals.
Als drittes Element dieser Dissertationsschrift wurde die Dynamik von Chrimson, einem Kanalrhodopsin mit rot-verschobener Absorption mittels zeitaufgelöster Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Sowohl die Anregungswellenlänge als auch der pH-Wert bzw. der Protonierungszustand des Gegenions haben einen messbaren Einfluss auf die Primärreaktion. Diese verlangsamt sich, sobald der pH-Wert abgesenkt oder die Anregungswellenlänge rot-verschoben wird. Darüber hinaus führt eine Rot-Verschiebung der Anregungswellenlänge zu einer geringeren Effizienz der Isomerisation des Retinal-Chromophors. Die Primärreaktion von Chrimson entspricht dabei einem Reaktionsmodell mit einer Verzweigung des Reaktionspfades auf der Energiehyperfläche des angeregten Zustandes. Ein Reaktionspfad führt dabei durch ein lokales Minimum, welches in seiner Ausprägung stark von der elektrostatischen Umgebung des Retinal-Chromophors abhängt. Je nach ursprünglichem Protonierungszustand des Gegenions der Retinal-Schiff-Base wurden große Unterschiede hinsichtlich der beobachteten transienten Absorptionsmuster für den im Anschluss von Chrimson durchlaufenen Photozyklus gefunden. Bei pH 6,0 weist der Photozyklus von Chrimson eine insgesamt deutlich schnellere Kinetik auf, als es für den Photozyklus bei pH 9,5 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, dass in elektrophysiologischen Messungen für beide Photozyklen eine Öffnung des Ionenkanals gefunden wurde. Die Kanalfunktion von Chrimson ist somit grundsätzlich nicht vom Protonierungszustand des Gegenions abhängig, wenngleich die Kinetik des Ionenkanals durchaus davon beeinflusst wird. Dies deutet auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen dem Ionenkanal und dem Gegenion der Retinal-Schiff-Base hin.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Dynamik zweier grundlegend verschiedener, deaktivierender Mechanismen von Retinalproteinen untersucht. In einem dritten Projekt wurde die Photodynamik einer Dreifachmutante von visuellem Rhodopsin erforscht, von der eine Mutation zu kongenitaler (angeborener) Nachtblindheit führt und zwei andere Mutationen das Protein über eine Disulfidbrücke stabilisieren. Die Ergebnisse dieser drei Projekte sind im Folgenden zusammengefasst.
Die Aktivität des mikrobiellen Proteorhodopsins als lichtgetriebene Protonenpumpe kann photoinduziert unterbunden werden. Dies erfolgt durch die Absorption von blauem Licht durch das Retinal bei deprotonierter Schiff‘schen Base. Vor dieser Arbeit war allerdings nur wenig über den Mechanismus und die Kinetik dieses Effekts bekannt. Das einzige Retinalprotein, an dem diese Deaktivierungsdynamik auf molekularer Ebene zeitaufgelöst untersucht wurde, ist Bakteriorhodopsin. Doch auch an diesem System wurde die ultraschnelle Primärreaktion in der photoinduzierten Deaktivierungsdynamik - die Photoisomerisierung des 13-cis-Retinals - bisher nicht zeitaufgelöst gemessen.
In dieser Arbeit wurde ein Weg gefunden, diesen Prozess auf einer Sub-Pikosekundenzeitskala zu detektieren. Dazu wurde eine Proteorhodopsinmutante genutzt, in der der primäre Protonendonor E108 durch Glutamin ersetzt ist. Diese Mutante weist eine signifikante Erhöhung der Lebensdauer des M-Intermediats auf. Im photostationären Gleichgewicht führt diese veränderte Kinetik zu einer erheblich erhöhten Akkumulation des Proteins im M-Zustand, die ausreicht, um photoinduzierte Absorptionsänderungen der Deaktivierungsdynamik sowohl im sichtbaren als auch im mittleren Infrarotbereich auf ultrakurzer Zeitskala zu detektieren. Dieses Projekt erfolgte in Kooperation mit dem Arbeitskreis Glaubitz (Goethe-Universität Frankfurt am Main).
Es zeigte sich, dass die Anregung des Retinals von Proteorhodopsin im M-Zustand zur Isomerisierung von 13-cis zu all-trans führt, die nach wenigen Pikosekunden abgeschlossen ist. Der zweite und abschließende Schritt ist die Reprotonierung der Schiff'schen Base. Es stellte sich heraus, dass dieser Prozess auf einer Nanosekundenzeitskala abläuft und über einen Protonentransfer vom primären Protonenakzeptor D97 zur Schiff'schen Base ermöglicht ist.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik zur Untersuchung der deaktivierenden Photodynamik von Proteorhodopsin auf ultraschneller Zeitskala, könnte in Zukunft auf weitere mikrobielle Rhodopsine angewandt werden. So ist die Studie der Deaktivierungsdynamik von Channelrhodopsinen von großem Interesse für optogenetische Anwendungen. Eine lichtgesteuerte Kontrolle der Ionenkanalöffnung und -schließung sollte die Präzision in der Regulierung ionischer Permeation erheblich verbessern.
Die Proteorhodopsinmutante E108Q wurde außerdem in ihrer primären Photodynamik sowohl bei grünem als auch blauem Anregungslicht untersucht. Es zeigte sich in beiden Fällen eine Dynamik, die der des Wildtyps sehr ähnlich ist. Eine Beobachtung unterscheidet sich jedoch wesentlich vom Wildtyp. Das K-Intermediat der E108Q-Mutante scheint nach einigen hundert Pikosekunden zumindest partiell zu zerfallen, woraufhin sich eine Signatur im blauen Spektralbereich bildet. Blitzlichtphotolysemessungen lassen vermuten, dass diese blau absorbierende Species im zwei- bis dreistelligen Nanosekundenbereich wieder zerfallen sein muss.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Photozerfall von visuellem Rhodopsin. Es ist bekannt, dass die Signaltransduktion durch Wechselwirkung zwischen aktiviertem Rhodopsin und Arrestin unterbunden wird. Im ersten Abschnitt wurde der Einfluss der Arrestin-1-Variante p44 auf die Photodynamik visuellen, bovinen Rhodopsins untersucht. In einer Kooperation mit dem Arbeitskreis Schwalbe (Goethe-Universität Frankfurt am Main) konnte gezeigt werden, dass Arrestin erheblichen Einfluss auf die Zerfallsdynamik von Meta II und Meta III hat. Es wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung von p44 mit photoaktiviertem Rhodopsin eine erhöhte Population des Intermediats Meta III bewirkt, mit der Folge einer zweifach langsameren Freisetzungskinetik des all-trans-Retinals. Diese Beobachtung weist auf eine physiologische Rolle des Zustands Meta III in der Retinalhomöostase hin.
Gegenstand einer zweiten Studie mit dem Arbeitskreis Schwalbe ist zum einen die Rhodopsinmutation G90D, die mit kongenitaler (angeborener) stationärer Nachtblindheit zusammenhängt, und zum anderen die Doppelmutation N2C und D282C, die zur Ausbildung einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den im extrazellulären Bereich eingeführten Cysteinen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Photodynamik des Wildtyps, der Doppelmutante und der stabilisierten G90D-Mutante (Mutationen G90D, N2C und D282C) sowohl auf einer ultrakurzen Zeitskala als auch auf einer Minutenskala untersucht.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
Entwicklung von Immunisierungsstrategien zur Induktion hoher funktionaler Antikörperantworten
(2018)
Neuartige Viren und Erreger, die sich antigenetisch tiefgreifend von bekannten Varianten unterscheiden, können verheerende Epidemien auslösen, da weder gegen diese Erreger eine Immunität in der Bevölkerung besteht, noch prophylaktische oder therapeutische Maßnahmen verfügbar sind. Eine prophylaktisch vermittelte Immunität durch Impfung stellt die bei Weitem effektivste Methode zur Vorbeugung viraler Infektionen dar, jedoch sind die Entwicklungs- und Herstellungszeiten eines neuen Impfstoffs in der Regel mit der Ausbruchsdynamik nicht kompatibel. Inzwischen steht zwar eine überschaubare Anzahl antiviraler Medikamente zur Verfügung, doch ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass diese meist hoch spezifischen Wirkstoffe gegen neu auftretende Viren aktiv sind. Das beispiellose Ausmaß der Ebola-Epidemie 2014 führte zum Einsatz experimenteller antikörperbasierter Therapien, welche das Potential der passiven Vermittlung von temporärem Immunschutz naiver Personen verdeutlicht. Für viele neuartige Viren ist die Entwicklung von Therapieansätzen allerdings noch nicht entsprechend weit fortgeschritten. Zudem bedingt eine Verwendung des eigentlichen Erregers oft hohe Sicherheitsmaßnahmen, was die Arbeit erschwert. Aus diesem Grund werden Notfalltherapien benötigt, die schnell in klinisch relevanter Qualität und Quantität unter niedrigen biologischen Sicherheitsmaßnahmen produziert werden können.
Diese Arbeit basiert auf der zentralen Hypothese, dass die Induktion von hohen Titern funktioneller Antikörperantworten die Basis für einen breiteren Schutz gegen antigenetisch entferntere Virusstämme sowie für die schnelle Produktion von therapeutischen Antiseren darstellt.
Um diese Hypothese zu testen und Einblicke in verschiedene Aspekte dieses Prozesses zu bekommen, wurde zunächst die Nutzung von Adjuvanzien als Zusätze für Impfstoffe am Beispiel des pandemischen A(H1N1)pdm09-Impfstoffs untersucht. Neben den alljährlichen Epidemien, die von saisonalen Influenza-A-Viren der Subtypen H1N1 oder H2N3 verursacht werden, können neuartige Subtypen zu weltweiten Pandemien führen. Während die saisonalen Influenza-Impfstoffe in der Regel keine Adjuvanzien enthalten, wurden einige pandemische H1N1-Impfstoffe aus 2009 mit einem reduzierten Antigengehalt formuliert und mit squalenbasierten Adjuvanzien kombiniert, um eine ausreichende Wirksamkeit bei größerer Verfügbarkeit zu gewährleisten. Zur Charakterisierung des Effekts dieser Adjuvanzien auf die Immunantworten wurden Frettchen mit 2 µg des kommerziellen H1N1pmd09-Impfstoffes alleine sowie in Kombination mit verschiedenen Adjuvanzien immunisiert, die Antikörpertiter gegen homologe und heterologe Influenzastämme untersucht und mit dem Schutz vor einer Infektion korreliert. Dabei zeigte sich, dass die Verwendung squalenbasierter Adjuvanzien die funktionalen Antikörperantworten um das 100-fache erhöhte und zu einer signifikant reduzierten Viruslast nach der Infektion mit dem homologen pandemischen Virus führte. Während in keiner Gruppe Antikörper gegen die heterologen Hämagglutinin-(HA-)Proteine H3, H5, H7 und H9 nachweisbar waren, induzierten mit squalenbasierten Adjuvanzien kombinierte Impfstoffe subtypenspezifische Antikörper gegen das N1 Neuraminidase-(NA-)Protein einschließlich H5N1. Darüber hinaus führte die Immunisierung mit squalenbasierten Adjuvanzien zu einer besseren Kontrolle der Influenzavirus-Replikation in den oberen Atemwegen.
Anschließend wurde im zweiten Teil dieser Arbeit unter Einbeziehung der gewonnenen Erkenntnisse eine Immunisierungsstrategie zur schnellen Produktion therapeutischer Hyper-immunseren entwickelt, wobei unterschiedliche Antigenexpressionssysteme miteinander verglichen wurden. Während in den frühen Stadien eines Ausbruchs Rekonvaleszenzseren nicht ohne weiteres verfügbar sind, können Antiseren tierischen Ursprungs innerhalb eines kurzen Zeitraums hergestellt werden. Die Herausforderung liegt in der schnellen Induktion einer schützenden Immunität, wobei die effiziente Produktion und Reinigung von Hyperimmunserum in klinisch relevanten Mengen ebenso essenziell ist wie die Anpassungsfähigkeit der Immunisierungsstrategie an neue oder hinsichtlich ihrer Antigenizität veränderte Viren. Hierzu wurden verschiedene Immunisierungsstrategien in Mäusen und Kaninchen verglichen, die unterschiedliche Expressionssysteme für das Modellantigen Ebolavirus-Glykoprotein (EBOV-GP) verwenden: (i) Ebolavirus-ähnliche Partikel (VLP), (ii) das rekombinante modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) sowie (iii) das rekombinante Virus der vesikulären Stomatitis (VSV). Im Ergebnis induzierte eine dreimalige Immunisierung mit VLPs in Kombination mit squalenhaltigem Adjuvans neutralisierende Antikörpertiter, die vergleichbar mit der Immunisierung mit replikationskompetentem VSVΔG/EBOV-GP waren. Dies deutet darauf hin, dass nicht die De-novo-Antigenexpression, sondern vielmehr die mehrfache Präsentation des Antigens in nativer Konformation für die Produktion von neutralisierenden Antikörpern essenziell ist. Darüber hinaus waren die funktionalen Antikörpertiter aller Kaninchenseren in der In-vitro-Analyse gegen das Wildtypvirus 10- bis 100-fach höher als der Durchschnitt, der in mit VSVΔG/EBOV-GP geimpften Probanden beobachtet wurde. Die Etablierung eines optimierten mehrstufigen Reinigungsverfahrens unter Verwendung einer zweistufigen Ammoniumsulfat-Präzipitation, gefolgt von einer Protein-A-Affinitätschromatographie, führte zu aufgereinigten IgG-Präparationen mit nahezu unveränderter neutralisierender Aktivität, die über neun Tage im xenogenen In-vivo-Modell stabil waren. Die signifikante Erhöhung von totalen und funktionalen Antikörpertitern in Kombination mit einer größeren Breite der Antikörperantwort im Kontext von squalenbasierten Adjuvanzien stützt die Hypothese dieser Arbeit. Adjuvantierte Immunisierungsstrategien sind damit ein vielversprechender Ansatz nicht nur zur Wirksamkeitssteigerung von Subunit- und Proteinimpfstoffen, sondern auch zur schnellen Herstellung von therapeutischen Antiseren.
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid, RNA) wirkt bei der Proteinbiosynthese nicht nur als Informationsüberträger, sondern kann auch beispielsweise durch sogenannten Riboschalter (auch Riboswitches) regulatorische Funktionen übernehmen. Riboschalter sind komplett aus RNA aufgebaut und man kann sie sich als molekulare Schalter vorstellen, die die Genexpression kontrollieren. Konzeptionell besteht ein Riboswitch aus zwei Untereinheiten, dem Aptamer und der Expressionsplattform. Das Aptamer bindet, üblicherweise sehr spezifisch, kleine organische Moleküle, aber auch Ionen. Diese Ligandenbindung induziert Änderungen in der Struktur des Riboswitches, welche wiederum die Expressionsplattform beeinflussen. Je nach Riboswitch ermöglicht oder verhindert dies schließlich die Genexpression. Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Etablierung von Methoden der optischen Spektroskopie zur Aufklärung von RNA-Dynamiken und -Strukturen im Allgemeinen und der Erforschung von Aptamerbindungsmechanismen im Besonderen.
Eine der dazu verwendetet Methoden ist die FTIR-Spektroskopie. Hierfür wurden zunächst kritische Parameter wie verschiedenste Messeinstellungen oder die Probenpräparation ausgiebig an RNA-Modellsträngen getestet. Dabei war es möglich, eine kleine Spektrenbibliothek als internen Standard aufzubauen. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass kleinere RNA-Oligonukleotide (< ca. 20 Nukleobasen) gut mittels FTIR-Methoden untersucht werden können. Anschließend wurde eine statische Bindungsstudie am adenosin- sowie am guanosinbindenden Aptamer vorgenommen.
Die zweite hier vorgestellte Methode zur Untersuchung von RNA-Molekülen ist die Fluoreszenzspektroskopie. Im Gegensatz zur FTIR-Spektroskopie ist dazu allerdings eine Modifizierung der RNA durch ein Fluoreszenzlabel nötig. Deshalb beschäftigt sich der Hauptteil dieser Doktorarbeit mit der Charakterisierung und der Anwendung des quasi bifunktionellen RNA-Markers (auch RNA-Labels) Çmf. So wurden zunächst die photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften des Markers untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Çmf sich als lokale Sonde eignet, da es empfindlich auf Änderungen der Mikroumgebung in Lösung reagiert. Durch direkten Vergleich der optischen Eigenschaften von Çmf mit den entsprechenden Eigenschaften des Spinlabels Çm war es möglich, den starken Fluoreszenzlöschungseffekt (sog. quenching) des Çm aufzuklären. So kann davon ausgegangen werden, dass die Fluoreszenz des Çm durch eine sehr schnelle interne Konversion (IC) in einen dunklen Dublettzustand (D1) gelöscht wird.
Im nächsten Schritt wurde Çmf in RNA-Modellstränge eingebaut, um den Einfluss der RNA auf die Photochemie des Markers zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich dessen Fluoreszenzsignal abhängig von den direkten Nachbarbasen sowie abhängig vom Hybridisierungszustand signifikant ändert. Gleichzeitig konnte keine deutliche Veränderung der Stabilität der Modellstränge festgestellt werden. So konnte also nachgewiesen werden, dass sich Çmf sehr gut als lokale Sonde in RNA eignet. Im Speziellen wurde aus den Ergebnissen geschlossen, dass der Fluorophor für Ligandenbindungsstudien herangezogen werden kann.
Deshalb wurde Çmf schließlich an mehreren verschiedenen Stellen in das neomycinbindende Aptamer (N1) eingebaut, um dessen Bindungskinetik zu untersuchen. Mittels Stopped-Flow-Messungen war es möglich, die Bindungsdynamik des Aptamers zu beobachten. Anhand dieser transienten Daten konnte ein Zweischrittbindungsmodell abgeleitet werden. Dabei bindet Neomycin zunächst unspezifisch an das weitgehend vorgeformte Aptamer. Anschließend kommt es durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu einer spezifischen Bindung des Liganden am Aptamer.
Im dritten Teil dieser Arbeit geht es ebenfalls um die Entwicklung und Etablierung eines spektroskopischen Werkzeuges. Dabei stehen allerdings Rhodopsine im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit. Hierbei handelt es sich um Membrantransportproteine, die nach optischer Anregung einen sehr schnellen Photozyklus mit mehreren Intermediaten durchlaufen. Es ist möglich, diese Intermediate dank transienter Absorptionsmessungen mit sehr guter zeitlicher und spektraler Auflösung zu beobachten. Allerdings besteht der Bedarf, diese Intermediate statisch zu präparieren, um sie näher charakterisieren und mit anderen Methoden, wie z.B. der Festkörper-NMR, vergleichen zu können.
Ein spektroskopisches Werkzeug zum Präparieren von frühen Photointermediaten ist kryogenes Einfangen (sog. Cryotrapping) dieser Intermediate. Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Cryotrapping und die anschließende statische UV/vis-Absorptionsspektroskopie der fixierten (getrappten) Zustände optimiert und an einer Reihe von Rhodopsinen (ChR2, GPR) demonstriert.
Zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen besteht nach wie vor ein dringendes medizinisches Bedürfnis, da die bisher eingesetzten Medikamente gerade in der Langzeittherapie zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können. Um chronisch entzündliche Erkrankungen in Zukunft adäquat therapieren zu können, sind bereits verschiedene neuartige Ansätze in klinischer bzw. präklinischer Entwicklung. Ein möglicher Ansatz besteht in einer dualen Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) von zwei verschiedenen Leitstrukturen an der 5 LO und der mPGES 1 untersucht. Die erste Leitstruktur entstammt aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Sulfonamidstruktur. In dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine gezielte Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen, die Leitstruktur I an der 5 LO und der mPGES-1 in ihrer Potenz zu optimieren. Die Leitstruktur (IC50: 5-LO (zellfrei) = 5.7 µM, IC50: 5 LO (PMNL) = 3.7 µM, IC50: mPGES-1 = 4.5 µM) konnte durch Variation in allen drei Positionen modifiziert werden, so dass die optimierte Struktur 170 (IC50: 5-LO (zellfrei) = 2.3 µM, IC50: 5-LO (PMNL) = 0.4 µM, IC50: mPGES-1 = 0.7 µM) entstanden ist. Für die Verbindung 170 wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie Löslichkeit und metabolische Stabilität, sowie der Wirkmechanismus auf molekularer Ebene bestimmt. Ebenso konnte für Verbindung 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden.
Die zweite Leitstruktur stammt ebenfalls aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Mercaptobenzothiazol-Grundstruktur. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den bekannten Pirinixinsäurederivaten wurde auch hier für die Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zunächst eine Kettenverlängerung an der Alkylkette vorgenommen. Es ließ sich auch hier durch eine gezielte SAR, die Leitstruktur bis hin zum submikromolaren Bereich in Verbindung 219 optimieren. Gleichzeitig ist es gelungen in Verbindung 219 einer der am potentesten dual ausgeglichensten dualen 5 LO/mPGES-1 Inhibitoren zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit es gelungen ist durch gezielte Untersuchungen der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei verschiedene Substanzklassen zu dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren zu optimieren. Ebenso konnte für Substanz 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das therapeutische Potential von dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren als anti-entzündliche Wirkstoffe in Zukunft besser einschätzen zu können.
Der ligandaktivierte Transkriptionsfaktor Farnesoid X Rezeptor (FXR) ist neben seiner Funktion als Regulator des Gallensäurehaushaltes auch in vielen anderen metabolischen Prozessen wie Glukose- und Lipidhomöostase involviert und besitzt antiinflammatorische Eigenschaften. Gerade bei hepatischen, gastrointestinalen und systemischen Erkrankungen erscheint FXR daher als interessante Zielstruktur zur Behandlung metabolischer Erkrankungen. Basierend auf den natürlichen Liganden von FXR, den Gallensäuren, wurde Obeticholsäure (OCA) als seminsynthetisches Derivat der endogenen Chenodesoxycholsäure zu einem potenten FXR-Agonisten entwickelt. OCA wurde in mehreren Studien auf seine therapeutische Wirkung bei hepatisch-entzündlichen Krankheitsbildern wie der primären biliären Cholangitis (PBC), der nicht-alkoholischen Fettleber (engl: non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) und der daraus folgenden nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) getestet. Mittlerweile ist OCA als Zweitlinientherapie der PBC auf dem Arzneimittelmarkt zuge-lassen. Neben OCA gibt es noch eine große Anzahl an weiteren FXR-Liganden, deren strukturelle Diversität von Steroiden bis nicht-steroidalen kleinen Molekülen (engl: small molecules) reicht. Trotz dieser Erfolge muss das Therapiepotential von FXR noch weiter ausgebaut werden. Die meisten verfügbaren Liganden besitzen in vitro zwar eine hohe Potenz, können in ihrem pharmakokinetischen Profil oder ihrer Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren aber nicht überzeugen.
Die hier vorliegende Arbeit hat sich mit der Entwicklung unterschiedlicher Liganden für FXR beschäftigt und diese in vitro und teilweise auch in vivo charakterisiert, um sie entsprechend ihrer Wirkungsweise einzuordnen und ein besseres Verständnis der regulatorischen Funktion von FXR zu erlangen.
Modulation von FXR bezieht sich nicht nur auf die agonistische Aktivierung, sondern setzt sich auch mit Antagonismus auseinander. Neben einigen Krankheitsbildern, die aus einer Überexpression von FXR resultieren, werden Antagonisten als Werkzeug (engl: tool compound) zur Aufklärung von konformellen Veränderungen von FXR und deren Auswirkung auf bestimmte Signalwege benötigt. Für die Erforschung solcher FXR-Antagonisten sollte das Potential nicht-steroidaler Antirheumatika (engl: non-steroidal anti-rheumatic drugs, NSAIDs) als etwaige Leitstrukturen untersucht werden, da in einer Veröffentlichung von Lu et al. ein FXR-Antagonismus durch NSAIDs postuliert wurde. Beim Versuch der Reproduktion der Ergebnisse von Lu et al. mit den drei NSAIDs Ibuprofen, Indometacin und Diclofenac wurde festgestellt, dass die Effekte auf den ersten Blick antagonistisch erscheinen, aber bei genaueren biochemischen Untersuchungen zweifelsfrei als Zytotoxizität identifiziert wurden.
FXR-Antagonisten wie Guggulsteron oder Gly-MCA sind auf ihre therapeutische Wirksamkeit unter-sucht worden, aber die genaue Wirkweise ist noch nicht aufgeklärt. Aufgrund ihrer steroidalen Grundstruktur ist ihre Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren fraglich. Die überschaubare Anzahl an publizierten nicht-steroidalen FXR-Antagonisten besitzt zwar moderate IC50-Werte, ihre strukturelle Diversität und Selektivität ist aber limitiert. Zur Entwicklung neuer potenter FXR-Antagonisten, die aus kleinen Molekülen (engl: small molecules) aufgebaut sind, wurde eine N-Phenylbenzamid-Leitstruktur ausgewählt. Diese Leitstruktur wurde im Rahmen der SAR-Unter-suchungen zur Entwicklung von Anthranilsäurederivaten als FXR-Partialagonisten innerhalb des Arbeitskreises entdeckt. Ausgehend von dieser Leitstruktur wurde eine mehrstufige, systematische SAR-Untersuchung durchgeführt, wodurch ein sehr potenter FXR-Antagonist entwickelt werden konnte, der anschließend umfangreich biochemisch auf FXR-Modulation, Selektivität, Löslichkeit, Toxizität und metabolische Stabilität charakterisiert wurde.
Neben dem Verständnis eines Modulationsmechanismus ist die konkrete Anwendung eines FXR-Liganden zu therapeutischen Zwecken von großem Interesse. Die Beteiligung von FXR in unterschiedlichen metabolischen Prozessen macht den Rezeptor zu einem begehrten Ansatzpunkt für die Wirkstoffentwicklung. Doch die Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes (z.B. metabolisches Syndrom, NASH) sollte sich nicht nur auf einen der gestörten Signalwege beziehen, da diese Erkrankungen durch mehrere Faktoren ausgelöst oder beeinflusst werden. Der semisynthetische FXR-Agonist OCA zeigte innerhalb der FLINT-Studie sowohl antientzündliche und antifibrotische Effekte, als auch eine Verbesserung der metabolischen Parameter mit Blick auf NAFLD und NASH. Die lösliche Epoxidhydrolase (engl: soluble epoxidhydrolase, sEH) besitzt nachweislich anti-inflammatorische und antisteatotische Effekte in der Leber. Aus diesem Grund wurde eine Leitstruktur entwickelt, die eine duale Modulation aus FXR-Aktivierung und sEH-Inhibition erzeugt. Dafür wurden die Pharmakophore eines im Arbeitskreis entwickelten FXR-Partialagonisten sowie eines potenten sEH-Inhibitors miteinander verknüpft. Zur Weiterentwicklung einer ausgewogenen hohen Potenz beider Modulationsfaktoren wurden mehrere unterschiedliche SAR-Untersuchungen als translationales Projekt in mehreren Arbeiten durchgeführt. In der hier vorliegenden Arbeit konnten dieses SAR-Untersuchungen zusammengeführt und weiterentwickelt werden. Dabei wurde ein ausgewogener und hochpotenter dualer Modulator erhalten, der umfassend in vitro und in vivo charakterisiert wurde. Die gezielte duale Aktivität, die mit dieser Substanz erreicht wurde, führt in einem Krankheitsbild zu synergistischer Ergänzung zweier Therapieoptionen. Jedoch kann eine unerwünschte Promiskuität über verwandten nukleären Faktoren zu Nebenwirkungen führen. Die Ursache dafür kann eine saure Funktion darstellen. Ein sehr potenter nicht-azider FXR-Agonist mit einem subnanomolaren EC50-Wert konnte im Arbeitskreis entwickelt werden. Diese Verbindung ist FXR-selektiv, hat keinen toxischen Effekt auf HepG2-Zellen und eine moderate metabolische Halbwertszeit. Die qRT-PCR-Untersuchung direkter und indirekter FXR-Zielgene zeigte eine verstärkte Expression nach der Inkubation mit der nicht-aziden Substanz. Dadurch lässt sich das Prinzip der Nebenwirkungsminderung durch nicht-azide Verbindungen beweisen.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, wie vielfältig und vielversprechend eine FXR-Modulation aufgebaut sein kann. Zum einen konnte über eine ausgeprägte biochemische Evaluation eine Differenzierung zwischen FXR-Antagonismus und Zelltoxizität bewiesen werden, worauf sich aufbauend eine genaue in vitro-Charakterisierung von neuen N-phenylbenzamidbasierten FXR-Antagonisten durchführen ließ, die ausgehend von einer moderat potenten Leitstruktur zu einer sehr potenten optimierten Substanz entwickelt wurden. FXR-Antagonismus und die dazu passenden tool compounds sind nicht nur von Bedeutung zum besseren Verständnis der unterschiedlichen Bindungsmodi des FXR, sondern auch potentielle Therapieansätze zur Behandlung von Krankheiten, in denen eine FXR-Überexpression stattfindet. Die agonistische Modulation von FXR wurde genauer betrachtet in der in vitro-Untersuchung nicht-azider FXR-Agonisten, die durch das Fehlen einer sauren Funktion ein hohes Maß an Selektivität und dabei eine geringe Toxizität aufwiesen. Synergistische Effekte zur Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes durch die Kombination von FXR-Partialagonismus und sEH-Inhibition konnte durch die Entwicklung der potenten und balancierten Substanz sowohl in vitro als auch in vivo bewiesen werden, wodurch diese Verbindung ein vielversprechender Kandidat für weitere klinische Entwicklung ist.
In dieser Arbeit soll identifiziert werden, welcher der zahlreichen Vertreter einer Arzneistoffklasse sich letztlich auf dem Markt durchsetzen kann und ob bestimmte pharmakokinetische, pharmakodynamische, klinische oder praktische Substanzeigenschaften retrospektiv für den Markterfolg einer Substanz verantwortlich gemacht werden können. Zudem stellt sich die Frage, ob und in wie fern Analogpräparate einen Nutzen in der Arzneimitteltherapie mit sich bringen, obwohl ihnen zum Zeitpunkt ihrer Markteinführung nur ein geringer Innovationsgrad zugebilligt wurde. Um derartige Rückschlüsse ziehen zu können wurden exemplarisch folgende fünf Arzneistoffklassen untersucht, die sich durch eine Vielzahl an Vertretern auszeichnen: Arsphenamine, Sulfonamide, Benzodiazepine, Glucocorticoide sowie Betablocker. Der Untersuchungszeitraum bemisst sich folglich vom Anfang des 20. Jahrhunderts, als industriell gefertigte, chemisch definierte hochpotente Wirkstoffe die Therapie zu bestimmen begannen, bis etwa zum letzten Drittel des 20. Jahrhunderts als Preise und Kostenerstattungsfragen zusätzlich zu Substanzeigenschaften für den Markterfolg mitbestimmend wurden.
Massenspektrometrie-basierte Proteomuntersuchungen erfolgen auch heute überwiegend nach dem sogenannten Bottom-Up-Ansatz, d.h. die Identifizierung von Proteinen erfolgt auf der Basis von Peptiden, die chromatographisch gut voneinander getrennt werden können und massenspektrometrisch leichter zu analysieren sind als Proteine. Nach Identifikation der Peptide kann rekonstruiert werden, welche Proteine ursprünglich in der Probe vorgelegen haben. Zentraler Arbeitsschritt der Probenvorbereitung ist daher die Zerlegung des Proteins, die entweder chemisch oder - wie in den meisten Fällen – enzymatisch erfolgt. Trypsin ist das mit Abstand am häufigsten genutzte Enzym, da es eine hohe Schnittspezifität aufweist und sehr effizient ist. Der Trypsin-Verdau ist darüber hinaus sehr robust, d.h. er zeigt eine hohe Toleranz gegenüber Verunreinigungen, und zudem werden Peptide erzeugt, die sowohl gute Ionisations- als auch gute Fragmentierungseigenschafen aufweisen. Die durch Trypsin gebildeten Peptide enthalten neben dem basischen N-Terminus eine weitere basische Aminosäure am C-Terminus, so dass sie leicht zumindest doppelt-geladene Ionen bilden können und sehr häufig aussagekräftige C-terminale Fragmentioneserien liefern.
Neben den zahlreichen Vorteilen gibt es allerdings auch Nachteile. So können nach einem tryptischen Verdau in Abhängigkeit von der Verteilung der Schnittstellen Peptide entstehen, die entweder zu klein sind, um eine verlässliche Zuordnung zu einem Protein zu erlauben oder die zu groß sind für den Massenbereich des gewählten Massenanalysators. Eine vielversprechende Alternative zu Trypsin wäre ArgC, welches C-Terminal zu Argininen schneidet und somit im Durchschnitt größere Peptide mit Ionisations- und Fragmentierungseigenschaften ähnlich zu tryptischen Peptiden erzeugt. Das Enzym ArgC weist jedoch nur eine geringe Schnittspezifität auf und sein Trypsin-ähnliches Verhalten – also das Schneiden auch hinter Lysin - wurde öfters beobachtet und wird auch vom Hersteller angegeben. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Verdaumethode, die Peptide erzeugt, die ausschließlich auf Argininen enden.
Das Resultat der zu entwickelnden Verdaumethode sollte somit dem eines idealen enzymatichen ArgC-Verdaues entsprechen. Realisiert wurde der ArgC-ähnliche-Verdau durch den Einsatz von Trypsin, dessen enzymatischer Schnitt durch die chemische Derivatizierung der Substrat-Lysine auf Arginine reduziert wurde. Neben dem weiteren Einsatz von Trypsin sollte dieser "Quasi-Arg-C-Verdau" weitere systematische Vorteile für Proteomanalysen realisieren: Zum Ersten sollte die Anzahl von Fehlschnitt-Peptiden, die sich bei Trypsin insbesondere an Lysinen mit saurer chemischer Umgebung ergeben, reduziert werden, zum Zweiten sollten die Arg-C-Peptide sowohl durch ihre gewachsende Größe, als auch durch das mit dem C-terminalen Arginin verbesserte Fragmentierungsverhalten höhere Score-Werte bei der bioninformatischen Auswertung der MS-Daten ergeben.
Im ersten Teil wurden zunächst bioinformatische Werkzeuge entwickelt, die MALDI-MS-Dateien automatisiert prozessierten. Die entwickelten Programme umfassen die Identifizierung und relative Quantifizierung von Proteinen aus diesen Dateien. Des Weiteren wurde ein Programm zur Analyse von MALDI-ISD-Dateien entwickelt. Automatisierte Auswertungen gelangen durch die Erstellung von Workflows in der Datenanalyseplattform KNIME. Diese Workflows kombinieren in Python geschriebene Skripte und Funktionalitäten frei verfügbarer Programme wie "MSConvert" und "mMass".
Nach Erstellung der bioinformatischen Werkzeuge wurde die Methodenentwicklung zur Modifizierung der Lysine für verschiedene Reagenzien durchgeführt. Die Auswahl fiel auf vier Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie unter milden Reaktionsbedingung im quantitativen Ausmaß mit Aminogruppen reagieren. Diese waren Sulfo-NHS-Acetat, Propionsäureanhydrid, Diethylpyrocarbonat und die reduktive Methylierung mit Formaldehyd und Picolin-Boran. Die Reaktionsbedingungen mussten zunächst für Proteine optimiert werden, da die publizierten Protokolle hauptsächlich zur Derivatizierung von Peptiden verwendet worden waren. Anschließend wurden die optimierten Protokolle für eine Protein- und Proteomprobe eingesetzt und die Resultate miteinander verglichen. Die Untersuchungen führten zu dem Ergebnis, dass sowohl auf Protein- als auch auf Proteomebene die Propionylierung des Lysins die besten Resultaten zeigte. Insbesondere ist hervorzuheben, dass alle ArgC-ähnlichen Ansätze unabhängig vom eingesetzten Reagenz zu besseren Ergebnissen in jeder der Untersuchungen führte als der klassische enzymatische ArgC-Verdau.
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Licht ist ein wertvolles Werkzeug zur Regulation biochemischer Reaktionsabläufe. Denn die Applikation von Licht erlaubt eine sehr präzise Einflussnahme auf den Ort und den Startzeitpunkt der zu untersuchenden Reaktionen. Als nichtinvasives Medium bietet die Lichtkontrolle bei der Wahl einer geeigneten Anregungswellenlänge den Vorteil nur minimal in einen lebenden Organismus einzugreifen. Um eine solche lichtbasierte Kontrolle für biologische Anwendungen zu realisieren, ist die Anwesenheit einer lichtsensitiven Verbindung nötig. Ein Konzept der lichtsensitiven Verbindungen ist die sogenannte photolabile Schutzgruppe. Im Allgemeinen handelt es sich hierbei um einen Chromophor der temporär an ein Biomolekül angebracht wurde, um dessen biologische Aktivität zu unterdrücken.
In dieser Arbeit wurde dieses Konzept auf das Antibiotikum Puromycin angewendet, welches durch das synthetische Anbringen der Cumarin-Schutzgruppe DEACM in seiner biologischen Aktivität behindert und durch einen Lichtpuls wieder freigesetzt wurde. DEACM st eine photolabile Schutzgruppe mit breitem Anwendungsspektrum, da es im Vergleich zu anderen Cumarin-Derivaten vorteilhafte photophysikalische Eigenschaften aufweist. Zum einen ist durch den 7-Diethylamino-Substituenten das Absorptionsmaximum dieser Verbindung um etwa 20 nm bathochrom verschoben. Zum anderen zeichnet sich dieses Derivat durch einen erheblich erhöhten Extinktionskoeffizienten aus, sodass eine Freisetzungsreaktion mit einer geringeren Lichtdosis induziert werden kann, was weniger Stress für die Zellen in lebenden Systemen bedeutet.
Die antibiotische Wirkung von Puromycin beruht auf der strukturellen Ähnlichkeit zum5'-Ende von Tyrosyl-tRNA, wodurch sich das Antibiotikum kondonunspezifisch während der Translation der Proteinsynthese an das Ribosom anlagern kann. Anschließend wird die naszierende Polypeptidkette auf das Puromycin transferiert. Da diese neue Bindung unter biologischen Bedingungen nicht spaltbar ist, führt dies zu einer verfrühten Freisetzung des Polypeptid-Puromycin-Fragments. Schließlich ist die Proteinsynthese vollständig abgebrochen.
Die Motivation zur photoinduzierten Kontrolle von Puromycin besteht in der Vielzahl an biologischen Applikationsmöglichkeiten, da die lichtregulierte Freisetzung der biologischen Aktivität als Trigger für sich anschließende biochemische Abläufe verwendet werden kann. Durch das hier gezeigte System kann in Kombination mit anderen Techniken (z.B. NMR) die posttranslationale Proteinfaltung beobachtet werden, welche als hochgradig komplexer Prozess bisher nicht verstanden ist. Eine weitere Motivationsgrundlage ist die Anwendung von DEACM-puromycin in Nervenzellen. Hier kann durch die Photofreisetzung die Proteinsynthese in den Dendriten der Neuronen beobachtet werden, wodurch Rückschlüsse auf neurodegenerative Krankheiten möglich sein sollten, wie z.B. Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit konnte in-vitro nachgewiesen werden, dass die antibiotische Wirkung von Puromycin mittels Licht kontrollierbar ist. Aus der photophysikalischen Grundcharakterisierung ging hervor, dass DEACM-puromycin einen hohen Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen größer als 380 nm aufweist. Folglich kann zur Induktion der Photolyse eine geringere Lichtdosis mit energiearmer Strahlung als bei dem Vorläufersystem NVOC-puromycin verwendet werden, angesichts dessen ist das hier vorgestellte DEACM-puromycin für Anwendungen in Zellen zu empfehlen.
Über die Kombination von quantenchemischen Rechnungen und spektroskopischen Methoden konnten die frühen Schritte der Freisetzungsreaktion bestimmt und quantifiziert werden. Zudem zeigte sich ein Einfluss der Lösungsmittelzusammensetzung auf die Uncaging-Schritte. In Gegenwart eines protischen Lösungsmittels wird der zum Uncaging in Konkurrenz stehende Prozess der Fluoreszenz unterdrückt, wodurch die Freisetzungsschritte effektiver werden. Zudem führt die Präsenz von Protonen zu einer Stabilisierung des ionischen Intermediates, sodass die Bildung dessen beschleunigt ablaufen kann. Die Spaltung der photolabilen Schutzgruppen vom Puromycin findet mit einer Rate von 0,71*10^8 s-1 statt, welche im Vergleich zu Vorgängersystem um eine Größenordnung größer ist. Die Wiederherstellung der biologischen Aktivität resultiert aber erst nach einem anschließenden Decarboxylierungsschritt. Mithilfe von IR-Messungen konnte die Decarboxylierung beobachtet und daraus die Quantenausbeute zu 2,5% determiniert werden. Die so bestimmte Quantenausbeute entspricht etwa dem Zweifachen von NVOC-puromycin, sodass die hier untersuchte Verbindung eindeutig als das effizientere System zu betrachten ist. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass DEACM-puromycin vorteilhafte photophysikalische Eigenschafen aufweist, die diese Verbindung zu einem wertvollen Hilfsmittel für eine Vielzahl von lichtkontrollierten Untersuchungen in biologischer Umgebung macht. Zudem wurden Einblicke in den Reaktionsmechanismus gegeben, die das Verständnis der photolytischen Spaltung von Carbamat-geschützten Cumarinen erstmals auf der ultrakurzen Zeitskala ermöglicht.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide nicht nur eine strukturgebende Funktion in der Plasmamembran aufweisen, sondern ebenfalls als Botenstoffe intra- und extrazellulär aktiv sind. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) bildet dabei einen Schlüssel-Metaboliten, da es verschiedene Zellfunktionen wie Wachstum und Zelltod beeinflusst. Es wird durch zwei Isoformen der Sphingosinkinasen, SK1 und SK2, gebildet. Die SK1 wurde bereits gut untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle beim Zellwachstum einnimmt und einen entscheidender Regulator bei inflammatorischen Erkrankungen und Krebs darstellt. Über die SK2 ist soweit wenig bekannt und die Ergebnisse sind zum Teil kontrovers. Sowohl pro-proliferative als auch anti-proliferative Funktionen der SK2 wurden beschrieben. Andererseits handelt meine Arbeit von Nierenfibrose, da beschrieben wurde, dass Sphingolipide einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen nehmen. Nierenfibrose stellt das Endstadium chronischer Nierenerkrankungen dar und führt zu einer Akkumulation der Extrazellulärmatrix, Organvernarbung und zum Verlust der Nierenfunktion. Die SK1 spielt dabei eine protektive Rolle bei der Entstehung von Nierenfibrose. Deshalb sollte in dieser Arbeit die Rolle der Sk2 bei der Entstehung von Nierenfibrose untersucht werden.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde das Mausmodell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) verwendet, welches zur Entwicklung einer tubulointerstitiellen Nephritits und nachfolgender Fibrose führt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass sowohl die Protein-Expression als auch die Aktivität der SK2 im fibrotischen Nierengewebe gesteigert wurden. Allgemein wiesen die SK2-/--Mäuse eine verminderte Fibrose in Folge des UUO auf im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Dies wurde bestätigt durch eine reduzierte Kollagenakkumulation, sowie eine verminderte Protein-Expression von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, connective tissue growth factor (CTGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1 (PAI-1). Diese Effekte gingen einher mit einer gesteigerten Protein-Expression des inhibitorischen Smad7 und erhöhten Sphingosin-Spiegeln in SK2-/--UUO-Nieren. Auf mechanistischer Ebene vermindern die erhöhten Sphingosin-Spiegel die durch transforming growth factor-β (TGFβ) induzierte Kollagenakkumulation, die PAI-1- und CTGF-Expression, aber induzieren die Smad7-Expression in primären Nierenfibroblasten. In einem komplementären Versuch mit hSK2 tg-Mäusen wurde eine verstärkte Entstehung von Nierenfibrose mit erhöhter Kollagenakkumulation, sowie erhöhte Protein-Expressionen von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, CTGF und PAI-1 festgestellt. Die Smad7-Expression dagegen war vermindert.
Im zweiten Teil meiner Arbeit stand der glomeruläre Teil der Niere im Fokus und es wurde untersucht, ob die Überexpression der SK2 zu einer phänotypischen Veränderung der glomerulären Mesangiumzellen führt. Mesangiumzellen wurden dazu aus den hSK2 tg-Mäuse isoliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass hSK2 und mSK2 in den transgenen Zellen hauptsächlich in der zytosolischen Fraktion lokalisiert sind, während S1P ausschließlich im Kern akkumulierte. Weiterhin konnte eine verminderte Proliferation unter normalen Wachstumsbedingungen der hSK2 tg-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen beobachtet werden. Die Zellen reagierten auch sensitiver auf Stress-induzierte Apoptose. Auf molekularer Ebene konnte dies durch eine reduzierte ERK- und Akt/PKB-Aktivierung erklärt werden. Nach Staurosporin-Behandlung wurde Apoptose durch den intrinsischen, mitochondrialen Apoptosesignalweg induziert. Dabei konnte eine reduzierte anti-apoptotische Bcl-xL-Expression und vermehrte Prozessierung von Caspase-9 und Caspase-3 und PARP beobachtet werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine verminderte tubulointerstitielle Fibrose-Entstehung durch die Deletion der SK2, sowie anti-proliferative und Apoptose-induzierende Effekte durch die SK2 in Mesangiumzellen nachgewiesen werden konnten. Somit könnten SK2-Inhibitoren die Entstehung tubulointerstitieller Fibrose und mit Proliferation assoziierte Erkrankungen wie mesangioproliferative Glomerulonephritis positiv beeinflussen.
Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von SLC-Transportern in eukaryotischen Systemen
(2018)
Die evolutionäre Voraussetzung für die Entwicklung komplexer, differenzierter Organismen bildet die Separierung der Zelle in Reaktionsräume, die so genannte Kompartimentierung. Das Prinzip der Kompartimentierung ermöglicht zahlreiche lebensnotwendige, biochemische Prozesse, wie die Konservierung von Energie durch Protonengradienten in der Atmungskette oder parallele, gegenläufige Stoffwechselwege. Zelluläre Kompartimente werden häufig durch Biomembranen gebildet, welche aus einer zweilagigen Lipidschicht bestehen. Lipidmoleküle in einer Zelle sind meistens amphipathisch, das bedeutet, sie bestehen aus einer polaren, hydrophilen Kopfgruppe und einem unpolaren, hydrophopen Ende (Abbildung 1). Die Lipidzusammensetzung in einer Biomembran ist sehr divers und unterscheidet sich in verschiedenen Organismen und Organellen. Phosphoglyceride bilden den Hauptbestandteil der Lipidschicht. Phosphoglyceride besteht aus einem Glycerin Rückgrat, welches an dem C1- und C2-Atom mit zwei Fettsäuren verestert und an dem C3-Atom mit einem Phosphorsäurediester verbunden ist. ...
Quantenchemische Untersuchungen zu Reaktionsmechanismen reaktiver Carben- und Silylenverbindungen
(2018)
In dieser Arbeit werden Reaktionsmechanismen verschiedener Carben- und Silylenverbindungen mit quantenchemischen Methoden untersucht: Die Zerfallsreaktion acylischer Diaminocarbene, die Reaktion verschiedener Diaminocarbene mit CO, die C-C Kupplung von Benzophenon mit SiCl2, die Reaktion von NHC mit Si2Br6 und die Reaktion von Dimethyltitanocen mit neo-Si5H12
Das Zusammenspiel von experimentellen mit quantenchemischen Methoden ermoeglicht eine detaillierte Untersuchung der ablaufenden Mechanismen einer chemischen Reaktion auf molekularer Ebene. Insbesondere für quantenchemische Rechnungen zu molekularen Uebergangsmetall-Verbindungen haben sich die Methoden der Dichtefunktionaltheorie (DFT) als aeusserst leistungsfaehiges Forschungswerkzeug herausgestellt. Im Rahmen der DFT fehlt es allerdings prinzipiell an der Möglichkeit zur systematischen Verbesserung der erzielten Ergebnisse und DFT-Rechnungen zeigen eine hohe Abhängigkeit von der Natur der untersuchten molekularen Verbindungsklasse. Daher muss vor jeder mechanistischen Untersuchung ein jeweils optimaler DFT-Ansatz durch Vergleich mit hochgenauen Referenzrechnungen oder mit experimentellen Referenzdaten für relevante Vergleichssysteme identifiziert und gegebenenfalls kalibriert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden quantenchemische Rechnungen zur Reaktivität von Übergangsmetall-Verbindungen anhand von fünf Forschungsprojekten vorgestellt. Im ersten Kapitel werden die Ergebnisse für die Aktivierung kleiner Moleküle (Alkohole, Sauerstoff und Stickstoff) durch bifunktionelle Übergangsmetall-Pincer-Komplexe dargestellt. Das zweite Kapitel befasst sich mit der bioanorganischen Chemie von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen. Die Auswahl einer geeigneten DFT-Methodik erfolgte in allen Fällen durch den Vergleich zu experimentellen Referenzdaten.
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe Schneider wurden Eisen-Komplexe für die katalytische (De)hydrogenierung von Alkoholen entwickelt, eine wichtige Reaktion zur Funktionalisierung von Alkoholen zu Carbonylverbindungen. Durch DFT-Rechnungen konnte der ablaufende Katalysezyklus der (De)hydrogenierung des Modell-Substrats Methanol aufgeklärt und der geschwindigkeitsbestimmende Schritt identifiziert werden. Ebenfalls in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Schneider wurde die selektive Reduktion von Sauerstoff zu Wasser, vermittelt durch einen dihydridischen Iridium-Komplex, untersucht. Da durch die beiden Hydrid-Liganden insgesamt vier Elektronen für die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser bereitgestellt werden, sollte prinzipiell ein monomolekularer Reaktionsverlauf möglich sein. Detaillierte DFT-Rechnungen in Kombination mit experimentellen Kinetikmessungen ergeben starke Hinweise auf einen derartigen Reaktionspfad mit geschwindigkeitsbestimmender Sauerstoff-Aktivierung. Zuletzt wird ein weiteres Kooperationsprojekt mit derselben Arbeitsgruppe vorgestellt. Die protoneninduzierte
übergangsmetallvermittelte Spaltung von Stickstoff in zwei Metall-Nitrid-Komplexe stellt ein neuartiges synthetisches Konzept dar. Durch die Protonierung eines dinuklearen Molybdän-Stickstoff-Komplexes erfolgt die Spaltung in die entsprechenden Mo-Nitrid-Komplexe. Der Grund für die ungewöhnliche Änderung der Spin-Multiplizität bei der Protonierung der Molybdän-Komplexe konnte durch detaillierte quantenchemische Analysen identifiziert werden.
Im zweiten Kapitel werden Untersuchungen zur bioanorganischen Chemie von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen vorgestellt. In der Natur werden viele (bio)chemisch relevante Prozesse durch übergangsmetallhaltige Enzyme unter moderaten Reaktionsbedingungen vermittelt. Kupferhaltige Enzyme sind unter Anderem für die hochselektive Oxidation organischer Substrate zuständig. Der Ansatz der Bioanorganik befasst sich mit der Übertragung der enzymatischen Struktur und/oder Funktion auf synthetische Modell-Verbindungen. Da die akkurate Beschreibung der Energien von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen höchste Anforderungen an die angewandten quantenchemischen Methoden stellt, wurde eine geeignete DFT-Methode in aufwändigen Voruntersuchungen durch den Vergleich mit experimentellen Ergebnissen identifiziert. Mit Hilfe des so kalibrierten BLYP-D3-Ansatzes wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Meyer ein neuartiges Konzept für die baseninduzierte Isomerisierung des reaktiven Kerns etabliert. In einer weiteren Arbeit wurde die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von nicht-aktivierten aliphatischen C-H-Bindungen in Steroid-Substraten mit Hilfe von mechanistischen DFT-Rechnungen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die stereochemische Anordnung des Liganden um den reaktiven Kupfer-Sauerstoff-Kern die Selektivität der Hydroxylierung bestimmt.
Die moderne Hauptgruppenchemie ermöglicht es Siliciumverbindungen in unterschiedlichen Oxidationsstufen und mit ungewöhnlichen Koordinations- umgebungen zu realisieren: Silane, Silylene, Disilene, Disiline und molekularer Sand (SiO2) können soweit stabilisiert werden, dass eine Charakterisierung gelingt. Ein Verständnis für die Eigenschaften und Reaktivitäten dieser Verbindungen eröffnet Perspektiven zur gezielten Synthese verschiedener Siliciumverbindungen. Industriell sind im wesentlichen zwei Substanzklassen interessant: Perchlorierte Silane, die als Vorstufen für die Abscheidung elementaren Siliciums als Halbleitermaterial Verwendung finden und Organo(Chlor)silane, die wichtige Bausteine für den Aufbau von Silikonen und für Hydrosilylierungsreaktionen darstellen. Im Rahmen dieser Dissertationsschrift wurden mittels quantenchemischer Rechnungen Schlüssel-intermediate für den Aufbau solcher Verbindungen identifiziert und durch Einblicke in den Reaktionsmechanismus das Fundament für ein tiefergehendes Verständnis der dynamischen kovalenten Chemie der Oligosilane gelegt. Dies geschah in enger Zusammenarbeit mit den experimentellen Arbeitsgruppen von Prof. Wagner und Prof. Auner.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Hochtemperatur-Komproportionierungsreaktion von gasförmigem Siliciumtetrachlorid und elementarem Silicium untersucht (Chem. Eur. J. 2017, 23, 12399). In einer Gasphasenreaktion entsteht dabei ein perchloriertes Polysilan (PCS) unbekannter Zusammensetzung. Im Ergebnis konnten wir zeigen, dass PCS eine komplexe Mischung verschiedener molekularer perchlorierter Silane darstellt, von denen lediglich cyc-Si5Cl10 experimentell eindeutig charakterisiert werden kann. Ausgehend von Dichlorsilylen als reaktive Spezies in der Gasphase zeigten DFT-Berechnungen, dass durch Silylendimerisierung, Silyleninsertion und eine Reihe von Isomerisierungsreaktionen der Aufbau cyclischer Perchlorsilane mit unterschiedlichem Silylierungsgrad gegenüber dem entsprechenden Aufbau acyclischer Perchlorsilane aus nicht umgesetzten Siliciumtetrachlorid bevorzugt stattfindet. PCS liefert ein 29Si-NMR- Spektrum mit einer verwirrenden Vielzahl verschiedener Signale, die auch anhand quantenchemisch berechneter 29Si-NMR-chemischer Verschiebungen nicht eindeutig zugeordnet werden konnten. Dennoch war eine Einteilung der berechneten Verschiebungen in Bereiche möglich, in denen Verschiebungen für Siliciumatome cyclischer und acyclischer Perchlorsilane mit einer bestimmten formalen Oxidationsstufe zu erwarten sind.
Weiterhin wurde der Chlorid-induzierte Aufbau perchlorierter Silane aus Si2Cl6 untersucht: Der Bildungsmechanismus für die durch Tillmann röntgen- kristallographisch charakterisierten perchlorierten Silikate und dianionischen (silylsubstituierten) Cyclohexasilane wurde in einer DFT-Studie untersucht und Schlüsselintermediate sowie stabile Zwischenstufen identifiziert (Chem. Eur. J. 2014, 20, 9234). Wir konnten zeigen, dass SiCl3– als reaktives Intermediat für die Si–Si Bindungsknüpfung verantwortlich ist. Die experimentell nachgewiesenen Silikate sind, mit einer Ausnahme für die ein anderes Konformer gefunden wurde, identisch mit den theoretisch vorhergesagten lokalen Minima. Sie entstehen durch eine Reihe von reversiblen Additions- und Isomerisierungsreaktionen. Dabei sind die acyclischen Silikate über Gleichgewichtsreaktionen miteinander verknüpft, wobei die berechneten Aktivierungsbarrieren für die Rückreaktion immer etwas höher sind als die Barrieren für den nächsten Aufbauschritt. Im Rahmen dieser Gleichgewichtsreaktionen entsteht nicht nur SiCl3–, sondern es können auch höhere Silanide eliminiert werden, die ab einer Größe von drei Siliciumatomen zu Cyclohexasilanen dimerisieren. Mit der head- to-tail Dimerisierung des bevorzugt gebildeten Silanids erklärt sich zwanglos das Substitutionsmuster aller röntgenkristallographisch charakterisierten zweifach silylsubstituierten Cyclohexasilane. Weiterhin ist es gelungen, den Reaktions- mechanismus für den Chlorid-induzierten Aufbau des dianionischen inversen Sandwichkomplexes [Si6Cl12*2Cl]2– aus HSiCl3 aufzuklären, in dem ebenfalls SiCl3– das Schlüsselintermediat darstellt. Letzteres entsteht durch die Eliminierung von HCl aus dem Chloridaddukt von HSiCl3. Der Reaktionsmechanismus beinhaltet Chlorid- abstraktionen, Hydridabstraktionen, Deprotonierungen, Silanid-Additionen, sowie Silanid-Eliminierungen, die nahezu gleichberechtigt nebeneinander vorkommen. Alle identifizierten Reaktionsschritte münden immer wieder in die Pfade, die bereits für den Aufbau aus Si2Cl6 gefunden wurden.
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Die eingereichte Dissertation liefert fundamentale Erkenntnisse zur Chemie nucleophiler Borzentren, die unter B•B-, B–B- und B=B-Bindungsbildungen reagieren. Zusammen mit den aufgedeckten Prinzipien zu (e–)-induzierten Umlagerungen des 9-Borafluorengrundgerüsts und Übertragungen von Hydridionen liegt nun ein umfassendes mechanistisches Wissen vor, das die effiziente Synthese neuartiger Moleküle ermöglicht. Im Folgenden ist eine Übersicht über bearbeitete Teilprojekte gegeben.
Durch Reduktion des Bis(9-borafluorenyl)methans 7 wurde über [7•]– (B•B-Einelektron-Zweizentrenbindung) und [7]2– (B–B-Zweielektronen-Zweizentrenbindung) das Tetraanion [7]4– dargestellt, das bei Zugabe von Elektrophilen unter Oxidation reagiert.
Die Injektion von Elektronen in das B(µ-H)2B dotierte Dibenzo[g,p]chrysen 12 führt in Abhängigkeit der Natur und der Stöchiometrie des eingesetzten Reduktionsmittels zu unterschiedlichen Hauptprodukten (bordotierte Dibenzo[g,p]chrysen- oder 9,9‘-Bifluorenylgrundkörper) mit verschiedenen Bindungsmodi (B–B-, B=B- oder (µ-H)B-B-Bindungen), deren Entstehung mechanistisch über Gerüstumlagerungen und Hydridübertragungen dargelegt wurde.
Durch die Zugabe etherischer HCl kann die B=B-Bindung in [37]2– quantitativ zu [116]– [(µ-H)B–B] oder 12 (B(µ-H)2B) protoniert werden. Umgekehrt lässt sich das scheinbar hydridische Diboran 12 durch sterisch anspruchsvolle Basen selektiv zu [116]– deprotonieren. Die kleine Base H3CLi führt neben der Deprotonierung von 12 auch zu einem Bis(9-borafluorenyl)methan, das ein verbrückendes Hydridion trägt ([125]–). Der Mechanismus wurde detailliert untersucht (z. B. wurde eine C–H-Aktivierung aufgeklärt), was u. a. genutzt werden konnte, um einen atomökonomischen Pfad von [37]2– zu [125]– zu etablieren.
Die Intermediate [132Cn,X]– (formale Addukte eines 9-Borafluorenyl-Anions an borständig substituierte 9-Borafluorene), gebildet durch die Zugabe von Halogenalkanen zu [37]2–, reagieren in Abhängigkeit der borständigen Alkylkette unter: (i) intramolekularer C–H-Aktivierung, (ii) intramolekularer Substitutionen oder (iii) intermolekularer Substitution.
Die Reduktion des 9-Borafluorens 6∙THF mit Lithium erzeugt das B=B-gebundene Dibenzo[g,p]chrysen-Dianion [37]2–, das 9-Borafluoren-Dianion [6]2–, das 9,9-Dihydroboratafluoren [34]– und das tetraanionische Bis(9-borafluorenyl) [146]4–.
Das 9-Borafluoren-Dianion [6]2–, das durch Reduktion von 6∙THF bei –78 °C mit Alkalimetallen selektiv dargestellt wurde, reagiert als formales Nucleophil. Über eine Reaktionskaskade gelang die selektive Synthese unterschiedlicher Produkte, die bei der literaturbekannten Reduktion des unsymmetrischen 9-Borafluoren-Dimers (6)2 mit Lithium in Toluol in Gegenwart von Et3SiBr beschrieben wurden. Hierüber konnte u. a. die Bildung eines organischen Derivats von [B3H8]– erklärt werden.
EBV Infektionen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation sind neben dem Rezidiv eine häufige Komplikation und verbleiben ein häufiger Grund der Morbidität. Langanhaltende Immunsuppression oder die verspätete T-Zell Recovery können EBV Infektionen nach Transplantation begünstigen, welche unter diesen Umständen zu lebensbedrohlichen lymphoproliferativen Erkrankungen (PTLD) führen können. Für die optimale Behandlung der PTLD gibt es keinen Konsens. Adoptive Immuntherapien mit sowohl anti-Tumor Kapazität als auch wiederhergestellter virus-spezifischer zellulärer Immunität könnten, vor allem im Bezug einer PTLD, eine optimale Behandlungs-Option darstellen.
Zytokin-induzierte Killer (CIK)-Zellen repräsentieren einen neuen immuntherapeutischen Ansatz, da sie trotz hoher Mengen an T-Zellen nur ein geringes alloreaktives Potential besitzen und selbst im haploidenten Setting nur ein geringes Risiko zur Induktion einer GvHD besitzen. Der Graft versus Leukämie/Tumor-Effekt nach allogener SZT wird durch die Zellen verstärkt. Durch das dual spezifische zytotoxische Potential der CIK-Zellen über den nicht-MHC restringierten NKG2D Killing-Mechanismus und den MHC restringierten Mechanismus über den T-Zell Rezeptor können sowohl virusinfizierte als auch transformierte Zellen bekämpft werden. In der Literatur gibt es bisher nur eine Arbeit (aus unserer Arbeitsgruppe), in der CIK-Zellen mit spezifischen viralen Antigenen für eine antileukämische und potentielle anti-virale Aktivität stimuliert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde sowohl in prä-klinischen als auch in einem klinischen Ansatz die Durchführbarkeit, Anwendbarkeit, Effektivität und Sicherheit von EBV-spezifischen CIK-Zellen untersucht. Dazu wurde in einem ersten Schritt untersucht, ob sich durch die Modifizierung des konventionellen Herstellungsprotokolls EBV-spezifische CIK-Zellen generieren lassen.
Im präklinischen in vitro Setting wurde eine Modifizierung im CIK Herstellungsprotokoll vorgenommen um EBV-spezifische CIK-Zellen zu generieren, die sowohl ein anti-leukämisches als auch ein spezifisches anti-virales (EBV) Potential besitzen. Die Generierung erfolgte aus peripheren, mononukleären Zellen EBV-seropositiver Spender. Zusätzlich zu den CIK-Stimulanzien wurden die Zellen zweimal mit dem EBV Consensus Peptid Pool stimuliert, der Peptidsequenzen von verschiedenen latenten und lytischen EBV-Proteinen enthält. Durch die Modifikation konnte eine Ko-Expansion an EBV-spezifischen Zellen innerhalb des CD3+CD8+ Kompartiments der CIK-Zellen von bis zu 8% erreicht werden. In Zytotoxizitätsanalysen wurde das effektorische Potential der generierten Zellen überprüft. Gegenüber EBV peptidbeladenen Zielzellen zeigten die zusätzlich mit EBV-Peptid stimulierten CIK-Zellen in allen E:T Ratios (40:1, 20:1 und 5:1) eine signifikant höhere lytische Aktivität im Vergleich zur Aktivität konventioneller CIK-Zellen. Durch Blocking des NKG2D Rezeptors wurde die TCR-vermittelte lytische Aktivität in Bezug auf ein virales Ziel weiter gezeigt. Das anti-leukämische Killing Potential über den nicht-MHC restringierten NKG2D Rezeptor blieb zeitgleich erhalten, was sich in spezifischen Lysen gegenüber K562 und THP-1 Zellen von bis zu knapp 60% wiederspiegelt. Die durchflusszytometrische immunphänotypische Charakterisierung der EBV-stimulierten CIK-Zellen mittels 10-Farb Panel ergab keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Phänotyp und Rezeptor-Repertoire im Vergleich zu den konventionellen CIK-Zellen. Die Zytokin- und Chemokin Analysen der EBV-spezifischen CIK-Zellen spiegelten ein CD8+ TH1 Profil wieder und reflektierten den zytotoxischen Charakter der Zellen. Mit dem modifizierten Protokoll war es möglich für eine Patientin GMP-konforme CIK-Zellen mit EBV-Spezifität zu generieren, die 9,6 x 103 EBV-spezifische T-Zellen/kg Körpergewicht enthielten. Die Infusion der EBV-spezifischen CIK-Zellen resultierte in einer rapiden Beseitigung der Plasma EBV DNA und langanhaltendem Verschwinden des großen (27 cm3) PTLD-malignen Lymphoms. Während des anschließenden Immun-Monitorings der Patientin konnten CD4+ und CD8+ EBV-spezifische CIK-Zellen mittels der Dextramer Technologie in vivo im Blut der Patientin über einen Zeitraum von 32 Tagen nachgewiesen werden. Weitere FACS Analysen ergaben, dass sich im CD8+ Kompartiment der Patientin neben den CD8bright T-Zellen eine wachsende Population an CD8dim Zellen nachweisen ließ. Diese bestand zu einem bemerkenswerten Prozentsatz von bis zu 95% aus TEMRA Zellen, die auf virusspezifische T-Zellen hinweisen. Die Infusion der Zellen induzierte weder ein CRS noch andere Toxizitäten. Zytokin-Analysen aus dem Serum der Patientin reflektierten ein zytotoxisches und anti-virales Potential der infundierten Zellen. In vitro zeigten die unter GMP generierten Zellen im E:T Verhältnis von 40:1 und 20:1 ein 2-fach höheres zytotoxisches Potential gegenüber peptidbeladenen T2 Zellen im Vergleich gegenüber WT T2 Zellen. Der anti-leukämische Effekt gegen K562 Zellen blieb auch hier erhalten. 2 Jahre nach Behandlung ist die Patientin immer noch in Remission.
Die in dieser Arbeit erzielten prä-klinischen und klinischen Ergebnisse zeigen, dass virusspezifische CIK-Zellen eine neue, potentielle Immuntherapie darstellen, da die Zellen eine wirksame anti-leukämische Immunität mit antiviraler Immunrekonstitution vereinen. EBV-spezifische CIK-Zellen erwiesen sich als ein vielversprechender Ansatz für die Prävention von malignen Erkrankungen sowie in der Behandlung von EBV-Komplikationen nach allogener SZT.
Viele Studien konnten in den letzten Jahren aufzeigen, dass Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaling eine wichtige Rolle in der Verarbeitung chronischer Schmerzprozesse einnimmt. Bei Verletzung peripherer Nerven oder Entzündung im Gewebe wird NO gebildet, das durch Stimulation der NO-sensitiven Guanylatzyklase (NO-GC) die cGMP-Bildung katalysiert. Seit einigen Jahren ist bekannt, dass zwei Isoformen dieses Enzyms existieren, NO-GC1 und NO-GC2. Das Expressionsmuster der beiden Isoformen im nozizeptiven System und der jeweilige Einfluss auf die Schmerzverarbeitung ist jedoch bisher völlig unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Expression der NO-GC1 und NO-GC2 in den Spinalganglien (DRGs) und im Rückenmark von Mäusen charakterisiert und das Verhalten von NO-GC1 und NO-GC2 Knockout (KO)-Mäusen in verschiedenen Schmerzmodellen untersucht. Mit Immunfluoreszenzfärbungen und In-situ-Hybridisierungen wurde in dieser Arbeit dargestellt, dass die zwei Isoformen in Interneuronen des Rückenmarks lokalisiert sind, wobei die NO-GC1 vorwiegend in inhibitorischen Interneuronen exprimiert wird. In den DRGs konnte die Expression in nicht-neuronalen Zellen nachgewiesen werden, wobei nur die NO-GC2 in Satellitenzellen detektiert werden konnte. Die NO-GC1 KO-Mäuse zeigten eine verringerte mechanische Hypersensitivität in neuropathischen Schmerzmodellen, aber ein normales Verhalten in Modellen inflammatorischer Schmerzen. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen zeigten die NO-GC2 KO-Mäuse ein erhöhtes Schmerzverhalten in Entzündungsmodellen, aber kein verändertes Verhalten in Modellen neuropathischer Schmerzen. Die gezielte Deletion der NO-GC1 und NO-GC2 in Interneuronen des Rückenmarks führte in den entsprechenden Tieren zu Verhaltensänderungen in der Schmerzwahrnehmung, die den Phänotypen der globalen NO-GC KO-Tieren in Schmerzmodellen ähnelte. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass die NO-GC1- oder NO-GC2-vermittelte cGMP-Produktion in Interneuronen des Rückenmarks sehr wichtige, und teilweise gegensätzliche Funktionen bei der Verarbeitung chronischer Schmerzsignale einnimmt.
Auswirkung der Chemisorption von Organothiolaten auf den elektrischen Widerstand dünner Goldfilme
(2018)
Hochgeordnete Monolagen von Organothiolaten auf Goldoberflächen bilden sich bei Kontakt einer Goldoberfläche mit einer Lösung eines Thiols oder Thioacetats spontan aus. Die Adsorption auf dünnen Metallfilmen mit Schichtdicken im Bereich von 25 - 100 nm führt zu einer Änderung des elektrischen Widerstandes des Films, die an Goldfilmen mit Schichtdicken von 25 - 40 nm über eine einfache Zweipunktmessung verfolgt wurde. Die Proportionalität der Widerstandsänderung mit der Menge an adsorbiertem Material konnte für die in dieser Arbeit verwendeten Dünnschichtsensoren bestätigt werden. Zu diesem Zweck wurden gleichzeitig Widerstands- und Oberflächenplasmonenresonanzmessungen an 40 nm starken Goldfilmen durchgeführt. In diesen Experimenten zeigt sich die Widerstandsmessung zur Beobachtung der Adsorptionskinetik als die überlegene Technologie.
Die durch Mikrokontaktdrucken und Freiätzen der gedruckten Strukturen hergestellten Sensoren zeigen eine individuelle Signalintensität. Die Normierung auf die maximale, durch Belegung mit Hexadecanthiol (HDT) oder Dodecanthiol erreichte, Signalstärke ermöglichte den Vergleich der maximalen Signalstärke von Thiolatmonolagen, die durch Belegung mit n-Alkanthiolen (CH_3(CH_2)_(n-1)-SH mit n = 12, 16, 19, 22 und 33, Cn), 11-Mercaptoundecyl-hexaethylenglycol (HSC11EG6OH), Adamantan-1-thiol (AdaSH), Triptycenthiol (TrpSH), Anthracen-2-thiol (Ant-0SH), Anthracen-2-alkanthiolen (Ant-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 5 und 10, Ant-nSH), p-Terphenyl-4-thiol (TP0SH), p-Terphenyl-4-alkanthiolen (TP-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 4, TPnSH) und p-Terphenyl-4-ethanthioacetat (TP2SAc) erzeugt wurden. Die Größe der Widerstandsänderung zeigt eine deutliche Abhängigkeit vom organischen Rest des Oberflächenadsorbats. Für die Verstärkung des Signals wurde die folgende Reihenfolge gefunden: Trp > Ada > Ant-0 > Ant-1 > TP0 > TP1 > Ant-2 > TP2 > Cn (n = 12 - 33) = C11EG6OH = Ant-n (n = 3 - 11) = TPn (n = 3, 4). Bei bekannter Verstärkung des Signals durch ein Adsorbat kann unabhängig von der Oberflächenrauigkeit die Oberflächenbedeckung durch Chemisorbate in einer Güte bestimmt werden, die der durch STM- und TEM-Messungen erreichten vergleichbar ist. Die Methode wurde angewendet, um Schichten von TP2SH und TP2SAc, die bei 20 und 60 °C aus ethanolischer Lösung abgeschieden wurden, zu vergleichen. Die Unterschiede in der Oberflächendichte, die durch eine Erhöhung der Abscheidungstemperatur zu beobachten sind, können durch eine Beschleunigung der Reaktion nach Arrhenius erklärt werden. Auch die Temperaturabhängigkeit der Abscheidungsgeschwindigkeit von HDT aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen, die in einem Bereich von -10 °C bis +30 °C betrachtet wurde, ist mit dem Arrhenius'schen Ansatz konform. Die Aktivierungsenergie der Adsorption von HDT auf Gold wurde auf E_a = 23 +-6 kJ/mol bestimmt.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Abscheidung aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen wurde für HDT, AdaSH, TP2SH und TP2SAc untersucht. Um eine Präadsorption der Thiole vor dem eigentlichen Start der Messung zu verhindern, wurde eine Apparatur mit einem Diaphragma aus Aluminium entwickelt, das beim Start der Messung mit dem Sensor durchstoßen wird. Mit Ausnahme von TP2SH zeigen alle Adsorptive ein Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht. Die Adsorptionsisothermen bei 20 °C lassen sich am besten durch die Freundlich-Isotherme beschreiben. Während die Reaktionsordnung im Adsorbat für die Adsorption der Thiole nahe an 1 liegt, hat sie für die Adsorption von TP2SAc einen Wert von ca. 1/4. Damit ergibt sich für die Geschwindigkeitskonstante der Adsorption k_a(HDT) = (2,3 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(AdaSH) = (6,1 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(TP2SH) = (7,3 +-0,4) 10^3 L/(mol s) und k_a(TP2SAc) = (8 +-3) 10^-2 L^(1/4)/(mol^(1/4) s). Die Adsorptionskurven der Thiole weisen bei Konzentrationen unterhalb von 5 10^-5 mol/L einen linearen Bereich auf, der einer zwischenzeitlichen Diffusionskontrolle zugeordnet wird.
An die aufgenommenen Adsorptionskurven der Thiole wurden literaturbekannte Modelle numerisch angepasst und teilweise weiterentwickelt. Die Anpassung konnte durch die Einführung einer vor der Oberfläche gelagerten Diffusionsgrenzschicht, in welcher der zeitabhängige Verlauf der Analytkonzentration in einem System von 10 Schichten berechnet wurde, deutlich verbessert werden. Von allen getesteten Modellen zeigt nur die Adsorption mit Ausschlussmuster keine Konzentrationsabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante der Desorption. Dieses Modell bezieht den Verlust von Adsorptionsplätzen mit ein, die einem besetzten Adsorptionsplatz benachbart sind und durch das adsorbierte Teilchen verdeckt werden. Der daraus resultierende Zusammenhang zwischen der Konzentration freier Adsorptionsplätze und dem Bedeckungsgrad der Oberfläche Theta_F(Theta) ist abhängig vom Verhältnis der Stoßfrequenz zwischen den Teilchen und der Oberfläche zur Platzwechselfrequenz der Teilchen auf der Oberfläche. Zur Bestimmung von Theta_F(Theta) für die numerische Anpassung der Adsorptionskurven von HDT und TP2SH wurde die Oberflächenbesetzung in einem Monte-Carlo-Verfahren für eine Konzentrationsreihe in Zehnerpotenzschritten simuliert.
Nukleinsäuren besitzen neben der Speicherung und Übertragung der genetischen Information weitere vielfältige Funktionen in einem komplexen und dynamischen Netzwerk von gleichzeitig ablaufenden Prozessen in der Zelle. Die gezielte Kontrolle bestimmter Nukleinsäuren kann helfen, die jeweiligen Prozesse zu studieren oder auch zu manipulieren. Photoaktive Verbindungen, wie photolabile Schutzgruppen oder Photoschalter, sind ideal dazu geeignet die Struktur und Funktion von Nukleinsäuren zu studieren. Photolabile Schutzgruppen werden dazu meistens auf die Nukleobase installiert und stören die Watson-Crick Basenpaarung. Dies verhindert die Ausbildung einer Sekundärstruktur oder die Möglichkeit einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Licht ist ein nicht-invasives Trigger-signal und kann mit hoher Orts- und Zeitauflösung angewendet werden, um selektiv die temporär geschützten Nukleinsäuren in der Zelle zu aktivieren.
Das erste Projekt dieser Arbeit ist eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Erin Schuman (MPI für Hirnforschung) und beschäftigt sich mit der lichtgesteuerten Regulation der miR-181a Aktivität in hippocampalen Neuronen von Ratten. Die Langzeitpotenzierung (LTP) ist der primäre Mechanismus von synaptischer Plastizität und somit essentiell für Lernen und Gedächtnis. Die langfristige Aufrechterhaltung von LTP erfordert eine gesteigerte (lokale) Proteinbiosynthese, ein Prozess, der noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Die miR-181a reguliert die Genexpression von zwei für synaptische Plastizität wichtigen Proteinen, GluA2 und CaMKIIα. Mit einem lichtaktivierbaren AntimiR sollte der Einfluss der miR-181a auf die lokale Proteinsynthese von CaMKIIα und GluA2 untersucht werden. Photolabile Schutzgruppen sollen eine ortsaufgelöste Aktivierung des AntimiRs in den Dendriten ermöglichen. Ein Tracking-Fluorophor sollte die Lokalisierung des AntimiRs und eine gezielte Lichtaktivierung ermöglichen. Die Bindung der miRNA sollte fluoreszent visualisiert werden können, um eine Korrelation zwischen der inhibierten Menge an miR-181a und den neu synthetisierten CaMKIIα-Molekülen zu untersuchen. In diesem Projekt wurden drei Konzepte zur Synthese von lichtregulierbaren AntimiR-Sonden verglichen: Das erste Konzept verwendete eine Thiazolorange-basierte Hybridisierungssonde nach Seitz et al. Allerdings war mit diesem Konzept der Fluoreszenzanstieg zur Visualisierung der Hybridisierung zu gering. Im zweiten Konzept wurde ein dual-Fluorophor markierter Molecular Beacon entwickelt, bei dem die photolabilen Schutzgruppen in der Schleifen-Region die Hybridisierung der miR-181a vor Belichtung verhinderten. Nach Optimierung der Stammlänge, Anzahl und Position der photolabilen Schutzgruppen, sowie Auswahl des idealen Fluorophor-Quencher Paars, konnte nach UV-Bestrahlung in Anwesenheit der miR-181a ein signifikanter Anstieg des Hybridisierungsreporter-Fluorophors gemessen werden. Das dritte Konzept untersuchte lichtaktivierbare Hairpin-Sonden, bei denen ein Gegenstrang (Blockierstrang) über einen photospaltbaren Linker mit dem AntimiR verknüpft wurde. Dabei musste die optimale Länge des Blockierstrangs und die Anzahl der photo-spaltbaren Linker im Blockierstrang ermittelt werden, sodass die miR-181a erst nach Photoaktivierung das AntimiR binden und den Quencher-markierten Strang verdrängen konnte. Die in vitro Experimente vom Arbeitskreis Schuman waren zu dem Zeitpunkt des Einreichens dieser Arbeit noch nicht abgeschlossen. Erste Ergebnisse zeigten, dass der mRNA und Protein-Level von CaMKIIα eines gesamten hippocampalen Neurons durch ein nicht-lichtaktivierbare AntimiR um den Faktor ~1,5 gesteigert werden konnte. Zudem konnte durch die lokale Bestrahlung einer lichtaktivierbaren Hairpin-Sonde die lokale Gen-expression von CaMKIIα in einem Dendriten deutlich gesteigert werden.
Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der reversiblen Lichtregulation von DNA und RNA durch Azobenzol Photoschalter. Azobenzole eignen sich ideal für die Regulation der Duplexstabilität, denn das planare trans-Azobenzol kann zwischen die Basen interkalieren und somit einen Doppelstrang stabilisieren. UV-Licht überführt das trans-Isomer in das cis-Isomer. Dies ist gewinkelt, benötigt mehr Platz und stört dadurch die Stabilität eines Nukleinsäuredoppelstrangs. Entscheidend für die Effizienz der Regulation der Duplexstabilität ist der Linker, der das Azobenzol mit der Nukleinsäure verknüpft. Während vorangegange Studien von Asanuma et al. unnatürliche Linker (D-Threoninol, tAzo) verwendeten, wurde in dieser Studie das Azobenzol mit der C1‘-Position von (Desoxy-)Ribose C-Nukleoside verknüpft, um Azobenzol (pAzo und mAzo) zu erhalten. Der Riboselinker sollte die helikale Natur der Nukleinsäure optimal nachahmen und möglichst wenig Störung des Ribose-Phosphat-Rückgrats bewirken. Thermische Stabilitätsstudien zeigten, dass UV-Licht induzierte trans-zu-cis Isomerisierung den Schmelzpunkt eines RNA- und DNA-Duplexes um 5,9 und 4,6 °C erniedrigte. Dabei führte der Austausch eines Nukleotids gegen pAzo oder mAzo zu einer effektiveren Regulation der Duplexstabilität als der zusätzliche Einbau eines Azobenzol C-Nukleosids in die Sequenz. Ein Vergleich mit dem in der Literatur etablierten System, tAzo, zeigte, dass pAzo und mAzo teilweise einen stärkeren Duplexdestabilisierungseffekt nach UV-Bestrahlung bewirkten.
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Biologischen Systemen liegen Mechanismen zugrunde, die bis heute nicht vollständig aufgeklärt sind. Für die Untersuchung eignen sich externe Trigger, die eine Regulation von außen auf das System erlauben und Prozesse gezielt steuerbar machen. Eine Möglichkeit ist das System unter optische Kontrolle zu bringen, d.h. durch Licht eine externe Steuerung zu implementieren, was von einem internen Chromophor aufgenommen wird. In der vorliegenden Dissertation werden drei individuelle Projekte vorgestellt, die alle dieses Prinzip auf unterschiedliche Weise anwenden.
RNAs haben eine Vielzahl an verschiedenen Funktionen in der Zelle, die von der Proteinsynthese bis zur Genregulation variieren. Im ersten Projekt wurde der Photoschalter Spiropyran im Kontext von RNA eingesetzt. Mit dem Ziel das Derivat PyBIPS kovalent an ein Oligonukleotid zu binden und damit die Hybridisierung eines Duplexes zu steuern, wurden Strukturmotive gesucht, an die der Photoschalter postsynthetisch gebunden werden kann. Dabei soll die sterisch anspruchsvolle Spiropyran-Form die Watson-Crick-Basenpaarung stören und die planare, konjugierte Merocyanin-Form in den Duplex, zur zusätzlichen Stabilisierung, interkalieren. In Vorarbeiten von Clara Brieke wurde festgestellt, dass erstens nur PyBIPS, nach kovalenter Verknüpfung, noch vollständig photochemisch aktiv ist und zweitens eine Herstellung über Festphasensynthese nur in schlechter Ausbeute realisierbar ist. Ausgehend davon wurde PyBIPS an die drei nicht-nukleosidischen Linker, Aminoglykol, D-Threoninol und Serinol, postsynthetisch über eine Amidbindung angebracht, die zuvor über Oligonukleotidfestphasensynthese in 2´-OMe-RNA eingebaut wurden.
In der photochemischen Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass PyBIPS, gebunden an alle drei Motive, noch photochemisch aktiv ist und im Vergleich zu ungebundenem PyBIPS stabiler ist gegenüber Photolyse. In Untersuchungen im Doppelstrang im Wedge Motiv, d.h. im Gegenstrang befindet sich kein Nukleotid gegenüber dem Photoschalter, wurde ein ähnliches Verhalten festgestellt. Zusätzlich zur charakteristischen Merocyanin-Bande bei 550 nm ist ein zweites, rotverschobenes Absorptionsmaximum entstanden, das die gleichen Eigenschaften besitzt. In Schaltzyklen wurde festgestellt, dass eine Isomerisierung bis 660 nm möglich ist, was eine Anwendung im therapeutischen Fenster zwischen ca. 600 und 1000 nm von Blut ermöglichen würde. Das Auftreten der zweiten Bande hängt stark vom Linker und dem Baustein im gegenüberliegenden Strang ab. Es wird vermutet, dass sich das, sonst nicht-bevorzugte, TTT-Isomer der Merocyanin-Form, durch Stabilisierung durch die Umgebung im Oligonukleotid ausbildet.
Zur Untersuchung, inwiefern die Isomerisierung des Photoschalters die Duplexstruktur beeinflusst, wurden Schmelzpunktstudien und Fluoreszenzmessungen zur KD-Bestimmung durchgeführt, ohne dass eine Veränderung zu erkennen war. In einer größeren NMR-Studie, in Kooperation mit Tom Landgraf (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Harald Schwalbe) wurde der Fokus darauf-gelegt mehr Informationen über die strukturelle Integrität zu erhalten. Es findet eine Störung der benachbarten Basenpaarungen durch den Photoschalter statt, jedoch kann die Kraft der Isomerisierung des Photoschalters nicht übertragen warden. Der Einfluss war zunächst geringer als erwartet, was in anderen Anwendungen überprüft warden muss.
Im zweiten Projekt steht das Membranprotein OmpG aus E. Coli K12 im Fokus. Proteine besitzen viele verschiedene funktionelle Gruppen, die für selektive Biokonjugation genutzt werden können in einer Reihe von Anwendungen. OmpG gehört zur Gruppe der Porine, die in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien sitzen und die seltene ß-Fassstruktur ausbilden. Die Pore besitzt einen großen Innendurchmesser ohne Selektivität. Das Molekül wurde bereits intensiv auf seine Struktur, insbesondere Loop 6, der pH-abhängig die Pore verschließt, untersucht. In Vorarbeiten von Grosse et al. wurde der Loop entfernt, sodass ein ruhiger Kanal entstanden ist, der ein optimales Modellsystem darstellt. Außerdem wurden in der Pore zwei Cysteine, die auf gegenüberliegenden Seiten auf halber Höhe des Kanals sitzen, eingeführt. An die Thiolgruppen wurden photolabile Schutzgruppen angebracht, die erst den Kanal blockieren und nach Abspaltung durch Licht wieder freigeben. Dazu wurde jeweils ein 7-Diethylaminocumarin (DEACM) postsynthetisch angebracht.
Der Linker am Cumarin-Alkohol stellt dabei einen Kompromiss dar, da er zum einen selektiv mit der Thiolgruppe des Cysteins reagieren soll, gleichzeitig aber noch photo-induziert wieder abspalten muss. Durch Belichtung findet eine Hydrolyse des Esters unter Abspaltung des Alkohols statt, der einen Carbonsäurerest am Thiol in der Pore zurück lässt. In spannungsabhängigen Einzelkanal-messungen, durchgeführt von Dr. Philipp Reiß (Universität Marburg), konnte gezeigt werden, dass die zwei DEACM Modifikationen eine Reduktion der Leitfähigkeit bewirkten und durch Licht abgespalten und aus dem Kanal entfernt werden konnten. Dabei war außerdem zu erkennen, dass die Leitfähigkeit aufgrund der Carboxylreste über das Niveau von unmodifiziertem OmpG steigt.
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Im Rahmen dieser Arbeit sollte der tonische BZR-Signalweg im Burkitt Lymphom näher untersucht werden. Ziel war die Identifizierung von Zielstrukturen, die für die Zellen essentiell für die Aufrechterhaltung des tonischen Signalwegs sind und gleichzeitig die Viabilität der Zellen fördern. Durch die Identifizierung noch unbekannter Zielstrukturen wäre man in der Lage, neue Behandlungsstrategien zu entwickeln oder bereits bestehende zu optimieren. Des Weiteren sollte die Signaltransduktion in der B-ALL, die über einen Vorläufer des BZRs, dem prä-BZR vermittelt wird, hinsichtlich eines tonischen Überlebenssignals untersucht werden.
Durch massenspektrometrische Analysen der tonischen BZR-Signaltransduktion im Burkitt Lymphom, die für die Viabilität der Zellen essentiell ist und die Ergebnisse eines Inhibitorscreens konnte HSP90 als potenzielle neue Zielstruktur im Burkitt Lymphom identifiziert werden.
So konnte gezeigt werden, dass Burkitt-Lymphom-Zellen nach Inhibition der Chaperonfunktion von HSP90 durch zwei auf dem Markt bereits verfügbare Inhibitoren einen Zellzyklusarrest erfahren, der letztlich zur Apoptose der Zellen führt. Dieser Effekt wurde auf einen Verlust des (tonischen) BZR-Signals zurückgeführt, der überwiegend durch den aktiven lysosomalen Abbau von SYK nach HSP90-Inhibition zustande kommt. Demnach führte die Überexpression einer HSP90-resistenten Variante von SYK (TEL-SYK) zu einer Aufhebung der apoptotischen Effekte nach HSP90-Inhibition. Zudem wurde SYK als Interaktionspartner von HSP90 (HSP90-Klientprotein) im Burkitt Lymphom und die für die Interaktion essentielle Phosphorylierungsstelle (pY197 in HSP90α bzw. pY192 in HSP90β) identifiziert bzw. validiert.
Das therapeutische Potenzial der HSP90-Inhibitoren im Burkitt Lymphom offenbarte sich ferner durch den Vergleich der Wirkungseffektivität in gesunden B-Zellen mit der in Tumorzellen. So zeigten HSP90-Inhibitoren eine erhöhte Affinität zu Tumorzellen. Bei verwendeten Konzentrationen der Inhibitoren, die bereits eine apoptotische Wirkung in Tumorzellen hervorriefen, waren gesunde B-Zellen resistent.
In der B-ALL konnte durch den Knockdown von CD79a und der Inhibition von SYK eine tonische Antigenrezeptor-Signalleitung identifiziert werden, die wie im Burkitt Lymphom über den PI3K/AKT-Signalweg vermittelt wird. Durch die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse und weiterführende Analysen (wie zum Beispiel durch Inhibitor- oder CRISPR/Cas-Screens) kann so eine Identifizierung von potenziellen Zielstrukturen mit therapeutischem Nutzen in der B-ALL erfolgen.
FPP und GGPP sind Intermediate des Mevalonat-Weges und fungieren als post-translationale Modifikation kleiner GTPasen. Die Prenylierung kleiner GTPasen erfolgt katalysiert von spezifischen Prenyltransferasen und ist notwendig um die kleinen GTPasen in Membranen zu verankern, wo ihre Aktivierung stattfindet. Zu den intrazellulären Funktionen der GTPasen gehören unter anderem der Aufbau des Cytoskeletts, das neuronale Zellwachstum, die Leitung und Ausläuferbildung von Axonen, das Dendritenwachstum, die Synapsenformation, die synaptische Plastizität und die Apoptose. Diese Funktionen spielen in der Gehirnalterung sowie in neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer Demenz (AD) und auch bei der Glioblastoma multiforme (GBM) eine wichtige Rolle.
Im Zuge einer in vivo Studie an C57BL/6 Mäusen konnten in der vorliegenden Arbeit altersbedingte Veränderungen der Lokalisation verschiedener Rho- und Rab-GTPasen in Membran- und Cytosol-Präparationen sowie der GGTase-I in Gehirnen gealterter Tiere gezeigt werden. Die zelluläre Lokalisation der Rho GTPasen Rac1, RhoA und Cdc42 verschiebt sich im Alter zu reduzierten Membran-gebundenen und erhöhten cytosolischen Gehalten. Dies ist mit einer Reduktion der Protein- und mRNA- Gehalte des Enzyms GGTase-Iβ assoziiert, der Untereinheit der GGTase-I, die die Bindung des Isoprenoids GGPP an die Rho-GTPasen reguliert. Diese wiederum korrelieren direkt mit der altersbedingten Reduktion der relativen GGTase-Aktivität. Die in vitro Inhibition der GGTase-I mittels GGTI-2133 an SH-SY5Y Zellen erwies sich als Modell, welches die gleichen Effekte wie die gealterten Gehirne in vivo zeigt.
7, 8-Dihydroxyflavon (7, 8-DHF) ist ein natürlich vorkommendes Flavon, welches als hoch affiner selektiver TrkB-Rezeptor-Agonist fungiert und hierdurch wie das Neurotrophin BDNF das Überleben von Neuronen, deren Differenzierung, synaptische Plastizität und Neurogenese vermittelt. In vivo verursacht die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in Gehirnen alter Tiere eine Abnahme des Isoprenoids GGPP, die Zunahme der prenylierten Membran-gebundenen GTPase Rac1 und eine Reduktion des Gehaltes an Membran-gebundenem Rab3A auf das Niveau der Gehalte in den Gehirnen der jungen Kontroll-Tiere. Das Neurotrophin BDNF interagiert mit dem TrkB-Rezeptor und ist in der Lage direkt an den Rac1-spezifischen GEF Tiam1 zu binden, wodurch dieser aktiviert wird und Veränderungen der zellulären Morphologie der betroffenen Neurone induziert. Während das Alter und die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in vivo keine Effekte auf die Proteingehalte von BDNF und TrkB in der Tierstudie aufzeigten, konnte eine alterbedingte Reduktion von Tiam1 im Hirngewebe detektiert werden, die wiederum durch 7, 8-Dihydroxyflavon aufgehoben werden konnte.
Die Isoprenoide FPP und GGPP, sowie die Regulation kleiner GTPasen spielen auch eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit Veränderungen der APP-Prozessierung in der molekularen Pathogenese der AD. Bei der APP-Prozessierung sind die beiden Sekretasen β- und γ-Sekretase für die Bildung des β-Amyloid-Peptids verantwortlich. In vitro Studien mit dem β-Sekretase-Inhibitor IV und dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT an untransfizierten und APP-transfizierten HEK293 Zellen (HEK293-APP695wt und HEK293-APPsw Zellen) konnten zeigen, dass sowohl die β- als auch die γ-Sekretase an der Regulation der Isoprenoide FPP und GGPP beteiligt sind. FPP und GGPP liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen erhöht vor. Die Inhibition der β-Sekretase führt zur Reduktion von FPP und GGPP. Durch die Inhibition der γ-Sekretase wird ausschließlich FPP reduziert. Weiterhin liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen die Membran-gebundenen prenylierten Rho-GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA erhöht vor. Das Membran-gebundene prenylierte H-Ras kommt jedoch in APP-transfizierten Zellen im Vergleich zu untransfizierten HEK293 Zellen in deutlich niedrigeren Mengen vor. Die Inhibition der β-Sekretase bedingt die Reduktion von Membran-gebundenem prenylierten Rac1 und auch von Membran-gebundenem H-Ras in HEK293-APPsw Zellen.
Veränderungen von Signaltransduktionswegen, die durch kleine GTPasen vermittelt werden, haben sich auch bei der GBM als zentraler Teil der molekularen Pathogenese herausgestellt. Hierbei ist die Prenylierung durch FPP und GGPP die Voraussetzung für die Membran-Insertion und onkogenen Funktion der Ras- und Rho-Proteine über die Stimulierung des Ras-Raf-MEK-ERK Signalweges. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der HMG-CoA-Reduktase Inhibitor Lovastatin die Bildung der beiden Isoprenoide FPP und GGPP in U87 und U343 Glioblastoma Zellen verringert und hierdurch die Isoprenylierung von H-Ras und Rac1 reduziert. Das natürlich vorkommende Monoterpen Perrilylalkohol hingegen inhibiert die Prenyltransferasen FTase und GGTase und verändert dadurch die post-translationale Prenylierung der GTPasen Rac1 und H-Ras in U87 und U343 Zellen ohne die Isoprenoide FPP und GGPP signifikant zu beeinflussen. Jedoch bewirkt Perillylalkohol in U343 Zellen eine Erhöhung des GGPPs. Beide Substanzen bewirkten die Reduktion der ERK-Phosphorylierung und der Migration, Invasion und Proliferation der untersuchten U87 und U343 Glioblastoma Zellen.
Im ersten Projekt der vorliegenden Arbeit wurden CD - 1 Mäuse mit drei unterschiedlichen Diäten für zwei Wochen ad libitum gefüttert. Die Diäten bestanden aus zwei kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten und einer Standard Haltungsdiät. Die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten enthielten entweder Triheptanoin (dreifach mit Heptanoat verestertes Glycerol) oder Soja - Öl als Fettkomponente (jeweils 35 % der Gesamtkalorien). Nach zwei Wochen wurde ein ischämischer Schlaganfall für 90 min. mithilfe eines Silikonfadens induziert. Die Leber, das Blut und das Gehirn wurden nach dem Schlaganfall entnommen und die Konzentrationen der Metabolite β - Hydroxybutyrat, Glukose, Laktat und Citrat wurden mit der zuvor etablierten GC - MS-Methode ermittelt. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Mikrodialysestudie durchgeführt.
Bei den Tieren, die die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten erhielten, konnte in den Leber - und Hirnhomogenaten, im Plasma sowie im Mikrodialysat eine Ketose festgestellt werden. Die BHB Konzentrationen durch eine Soja Diät erreichten im Leberhomogenat bis zu 4 mM, im Plasma bis zu 1,5 mM, im Hirnhomogenat bis zu 1,5 mM und im Mikrodialysat bis zu 30 µM. Um eine Aussage treffen zu können, ob das Gehirn die von der Leber produzierten Ketonkörper als Energiesubstrate nutzen kann, wurde eine Folgestudie (unter gleichen Bedingungen) durchgeführt. Bei dieser Studie wurde der Zeitpunkt der Gewebeentnahme 60 min. nach Entfernen des Fadens (Reperfusion) gewählt. In den Leber – und Hirnhomogenaten konnten erniedrigte Konzentrationen des Ketonkörpers BHB nachgewiesen werden. Die nicht operierten Tiere, die eine fettreiche Diät erhielten, hatten erhöhte Konzentrationen an Citrat in den genannten Geweben. Durch den Abbau des Ketonkörpers BHB können bei Verstoffwechslung in Geweben außerhalb der Leber, zwei Moleküle Acetyl - CoA gebildet werden. Diese gebildeten Acetyl - CoA Moleküle können in den Citratzyklus eingespeist werden.
Um diesen Befund mechanistisch besser verstehen zu können, wurde den Mäusen Propranolol (ein unselektiver β - Blocker) verabreicht, und zwar kurz nachdem der Faden die mittlere Zerebralarterie verschlossen hatte. Als Folge blieb bei den fettreich gefütterten Tieren die zuvor beobachtete Ketose, aus. Daraus wurde geschlossen, dass die auftretende Ketose bei den fettreich gefütterten Tieren durch adrenerge β - Rezeptoren vermittelt wurde. Zusammengefasst kann eine fettreiche bzw. ketogene Ernährung im Falle einer Ischämie die Versorgung des Gehirns durch die Bildung von Ketonkörper gewährleisten.
Die zu beobachtende hepatische Ketogenese aus dem ersten Projekt hat die Frage entstehen lassen, ob eine akute Gabe von β - Hydroxybutyrat (BHB) bei Entfernen des Fadens schützende Effekte auf das Verhalten bzw. die Mitochondrien als Kraftwerke der Zelle hat. Hierzu wurde BHB bei Reperfusion gegeben und die Wirkungen dieser Einmalgabe nach 24 h untersucht. Als erster Schritt wurde der Nachweis erbracht, dass eine exogene Gabe von BHB das Gehirn erreicht. Im zweiten Schritt wurde das Verhalten der Mäuse nach 24 h untersucht. Hierbei erbrachte die Gabe von BHB eine signifikante Verbesserung der sensorischen und motorischen Fähigkeiten der Mäuse. Die metabolischen Veränderungen nach 24 h wurden erneut in Leberhomogenaten und Plasma vermessen. Eine Einzelgabe von BHB bewirkte eine milde Ketose auch 24 h nach Reperfusion der mittleren Zerebralarterie. Um eine detailliertere Erkenntnis über die Wirkung von BHB zu erlangen, wurden die Mitochondrien als potentielles Ziel für BHB in den Fokus genommen. Die Einmalgabe von BHB verhinderte ein Absinken der Komplex – II Aktivität. Außerdem kann die Aktivität der Citratsynthase unter der Gabe von BHB erhalten werden, sodass die Mitochondrien vor allem im wichtigen Zeitraum nach der Reperfusion geschützt werden. Im Rahmen der Untersuchungen der Mitochondrien wurden unterschiedliche Substrateinflüsse auf die Respiration der isolierten Mitochondrien getestet. Bei Zugabe von BHB, Oxalacetat + Acetat oder Citrat zu dem Respirationsmedium stieg die Respiration der Mitochondrien an. Im Falle von Glukose, Propranolol oder Acetat wird die Respiration verringert. Bei Zugabe von Laktat, verbleibt die Respiration auf Ausgangsniveau. Abschließend ist festzustellen, dass die Einzelgabe von BHB nach 24 h das Verhalten der Mäuse verbessert, eine milde Ketose induziert, sowie Mitochondrien und die Citratsynthase gegen ischämische Ereignisse schützt.
Um die in dieser Arbeit gezeigten Daten über metabolische Veränderungen zeigen zu können, musste eine vorherige Etablierung der GC – MS Analytik vollzogen werden. Auf der einen Seite musste die Probenvorbereitung, aber auch die gesamte Vermessung der Proben aufgebaut werden. Es wurden insgesamt 11 Analyte in vier unterschiedlichen Kompartimenten quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei diesen 11 Analyten bei 0,01 - 1 ng/µl, was einer umgerechneten Stoffmengenkonzentration von 0,5 - 10 µM entspricht. Mithilfe dieser Methode können optional weitere Substanzen aus verschiedenen Geweben zugänglich gemacht werden. Diese Arbeit bietet hierzu eine Anleitung, wie die Etablierung erfolgen kann. Im Rahmen der Probenvorbereitung wurden alle Schritte systematisch verbessert. Dazu wurden Wiederholungsmessungen für unterschiedliche Modalitäten vollzogen. Die Abundance und die Zeitbeständigkeit waren die wesentlichen Beurteilungskriterien. So wurden die Daten für die Extraktionseffektivität, die Lösungsmittelabhängigkeit der Silylierung, der Zusatz von Hünig - Base sowie die Temperatur und Zeitabhängigkeit der Silylierung in dieser Arbeit erarbeitet. Die Quantifizierung wurde anhand von internen Standardverbindungen durchgeführt. Die jeweiligen Response – Faktoren blieben über die gesamte Zeit nach der Etablierung konstant und erlaubten die Quantifizierung mit geringen Fehlern. Die Beurteilung der ermittelten Daten über die Validierung wurden anhand von geltenden Regelwerken der pharmazeutischen Industrie entschieden. Es wurde ein Protokoll entwickelt, das im Rahmen der universitären Forschung eine vertrauenswürdige Aussage über Veränderungen von Metabolitenspiegeln in vielen Geweben der Maus und der Ratte geben kann.
Um molekulare Mechanismen in biologischen Prozessen zu verstehen, ist es unerlässlich biologisch aktive Verbindungen zu kontrollieren. Dabei spielt besonders die Aktivierung bzw. Desaktivierung von Genabschnitten eine zentrale Rolle in der gegenwärtigen chemischen, biologischen und medizinischen Forschung. Nukleinsäuren sind dabei offenkundige Zielmoleküle, da sie die Genexpression auf unterster Ebene regulieren und auf vielfältige Art und Weise an biologischen Prozessen beteiligt sind. Um solch eine genaue Steuerung zu erreichen, werden Nukleinsäuren häufig photolabil modifiziert und unter die Kontrolle von Licht gebracht. Da hochentwickelte Technologien es erlauben Photonen bestimmter Energie unter präziser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu dosieren, ist Licht als nicht invasives Triggersignal ein besonders geeignetes Werkzeug um molekulare Prozesse zu kontrollieren.
Die Verwendung photolabiler Schutzgruppen („cage“) ermöglicht es, diese lichtaktivierbaren Nukleinsäuren („caged compound“) herzustellen. Üblicherweise werden Oligonukleotide damit an funktionsbestimmenden Stellen versehen, woraufhin die Funktion der Oligonukleotide unterdrückt wird. Die biologische Aktivität kann durch Bestrahlung mit Licht wieder hergestellt werden, da die photolabile Schutzgruppe durch den Lichtimpuls abgespalten wird. Neben der zeitweiligen Maskierung der Nukleinsäureaktivität existiert auch eine Methode, die als „photoaktivierbarer Strangbruch“ (‘‘caged strand break‘‘) bezeichnet wird. Dabei werden mit Hilfe von photolabilen Linkern (‘‘Verknüpfer‘‘) lichtinduzierte Strangbrüche in Oligonukleotiden ausgelöst, um so beispielsweise die Struktur eines Nukleinsäurestrangs zu zerstören. Die Idee der photoaktivierbaren Strangbrüche ist nicht neu, dennoch werden photolabile Schutzgruppen überwiegend nach der erstgenannten Strategie verwendet. Im Rahmen dieses Promotionsvorhabens wurden neue photosensitive Linkerbausteine für Oligonukleotide entwickelt und hergestellt, welche sich vor allem im Hinblick auf die Anwendbarkeit in lebenden biologischen Systemen von den bisherigen photolabilen Linkern unterscheiden.
Im ersten Projekt wurde ein nicht-nukleosidischer, photolabiler Linker, basierend auf dem Cumaringrundgerüst, entwickelt. Das Ziel war hier, vor allem, einen zweiphotonenaktiven Linker für biologische Anwendungen und Zweiphotonen-Fragestellungen nutzbar zu machen. Bisherige Zweiphotonen-Linker konnten hauptsächlich nur für Proteinverknüpfungen bzw. Neurotransmitter verwendet werden oder mussten chemisch umständlich (z.B. Click-Chemie) und postsynthetisch in Oligonukleotide eingeführt werden. Der neu entwickelte Zweiphotonen-Linker wurde als Phosphoramiditbaustein für die Oligonukelotid-Festphasensynthese synthetisiert, was einen problemlosen und automatisierten Einbau garantiert. Mit einem modifizierten Oligonukleotid konnten die photochemischen Eigenschaften des Linkers bestimmt und mit Hilfe eines fluoreszenzbasierten Verdrängungsassays und Lasertechniken der Zweiphotonen-Effekt visualisiert werden. Dazu wurde ein Hairpin-DNA-Strang hergestellt, welcher eine Linkermodifikation im Bereich der Loopregion enthält. Durch eine Thiolmodifikation am 5‘-Ende des Oligonukleotidstranges war es möglich, diesen in einem Maleimid-funktionalisierten Hydrogel zu fixieren. Ein DNA-Duplex mit einem Fluorophor/Quencherpaar und einer korrespondierenden Sequenz zum modifizierten Hairpin-Strang wurde ebenfalls dem System zugegeben, allerdings wurde dieser nicht fixiert, um Diffusion zu ermöglichen. Durch die räumliche Nähe des Fluorophors zum Quencher konnte im unbelichteten Zustand zunächst keine Fluoreszenz gemessen werden. Mit einem (Femtosekunden-)gepulsten Laser und dem damit verbundenen Bindungsbruch im Hairpin-Strang durch Zweiphotonen-Effekte wurde es dem fluoreszierenden Strang des DNA-Duplex ermöglicht, sich vom Quencher-Strang zu lösen und an den fixierten Strang zu hybridisieren. Das Photolyse-Ereignis konnte so in ein lokales Fluoreszenzsignal übersetzt und detektiert werden.
Der eindeutige Beweis, dass es sich tatsächlich um ein Zweiphotonen-induziertes Ereignis handelt, konnte durch die dreidimensional aufgelöste Photolyse und über die quadratische Anhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der eingestrahlten Laserleistung erbracht werden.
Die generelle Kompatibilität des Cumarin-Linkers mit biologischen Systemen konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden. Dazu wurde eine Transkriptionsfaktor-DNA Decoy-Strategie entwickelt, in der Linker-modifizierte DNA Decoys an regulatorische Transkriptionsfaktoren binden und diese aber auch photochemisch wieder freisetzen können („catch and release-Strategie“). Zellkulturexperimente, um mit dieser Methode das Transkriptionsfaktor-gesteuerte und endogene Gen für Cyclooxygenase-2 (COX2) zu regulieren, lieferten keine aussagekräftigen Ergebnisse. Daher wurden die verwendeten Zellen dahingehend manipuliert, sodass sie das Protein GFP (grün fluoreszierendes Protein) in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Transkriptionsfaktors exprimieren. Das so durch die Zellen verursachte Fluoreszenzsignal steht in direkter Abhängigkeit zur Decoy-Aktivität. Mit Hilfe modifizierter GFP-Decoys konnte hierbei eine Regulation auf Transkriptionsebene in biologischen Organismen erreicht werden. Mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), einer molekularbiologischen in vitro-Analysetechnik, wurden die Interaktionen zwischen modifizierten Decoys und dem Transkriptionsfaktor untersucht.
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Die CXCR4-CXCL12-Signalachse gilt als eines der bislang am besten studierten Signalsysteme in der Hämatopoese. Allerdings stammt unser Wissen über diesen kritischen Signalweg maßgeblich aus subtraktiven Studien, wie z.B. knock-out Modellen oder pharmakologischer Inaktivierung. Zwar können aus diesen Modellen wichtige Erkenntnisse über die physiologische Rolle dieses Signalwegs abgeleitet werden, aber dennoch bleiben einige Phänomene ungeklärt. So konnte gezeigt werden, dass es sowohl bei CXCR4-Defizienz als auch bei Patienten mit dem WHIM-Syndrom (ausgelöst durch eine überaktive CXCR4-Mutante) zu einer ausgeprägten B-Zellaplasie kommt. Dies scheint intuitiv nicht vereinbar. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein Modell mit einer überaktiven CXCR4- Mutante (CXCR41013/1013) hinsichtlich der (un)reifen Hämatopoese systematisch untersucht.
Zunächst wurden hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) hinsichtlich der aberranten CXCR4-Signalweiterleitung ex vivo analysiert. Die CXCR4-Überaktivierung konnte sowohl in frühen Effekten nach Aktivierung des Rezeptors (F-Aktinpolymerisierung, Aktivierung des MAPK- Signalweges), als auch in späten, zellfunktionellen Effekten (Migrationsassay) nachgewiesen werden. Die veränderte CXCR4 Signalintegration hatte auch bereits in der Homöostase organismische Konsequenzen im Mausmodell. So konnte eine massiv vergrößerte HSPC-Population in der Milz von CXCR41013/1013-Tieren detektiert werden, im Sinne einer extramedullären Hämatopoese. Knochenmarks-HSPC aus CXCR41013/1013-Tiere zeigten ein massiv eingeschränktes (serielles) Repopulationspotenzial. Kombiniert mit der oben genannten ausgeprägten extramedullären Hämatopoese in diesen Tiere interpretieren wir diese Beobachtung als starken Hinweis auf eine dysfunktionelle Interaktion der Stammzellen mit der hämatopoetischen Stammzellnische im Knochenmark. In diesem Zusammenhang besonders interessant ist die Tatsache, dass auch ein Kompetitorknochenmark das Überleben einer Sekundärtransplantation nicht sichert. Dabei ist zu diskutieren, ob dieser Effekt durch eine effizientere Besetzung von Stammzellnischen durch CXCR41013/1013-Zellen, eine Akkumulation von CXCL12 in der Knochenmarkflüssigkeit (siehe unten) oder eventuell sogar ein vesikelabhänginger Transport von mutiertem CXCR4 in Kompetitorzellen ausgelöst wird. Ein weiteres Merkmal dieser Dysfunktion könnte ebenfalls die gezeigte Akkumulation von CXCL12 in der Knochenmarkflüssigkeit von CXCR41013/1013-Tiere darstellen. Diese Akkumulation könnte die Suppression co-transplantierter wildtypischer Hämatopoese sowie die verminderte Effizienz der G-CSF-induzierten Stammzellmobilisierung funktionell erklären. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Mobilisierung von Stammzellen aus dem Knochenmark durch einen CXCR4- Inhibitor in CXCR41013/1013-Tieren ebenfalls erheblich hinter der in Wildtypmäusen zurückbleibt.
Analog zu Patienten mit WHIM-Syndrom zeichnen sich CXCR41013/1013-Mäuse weiterhin durch eine ausgeprägte Leukopenie, insbesondere durch einen schweren B-Zell-Mangel, aus. Aus diesem Grund wurde die B-Lymphopoese und humorale Immunfunktion genauer analysiert. Eine grundsätzliche humorale Immunkompetenz von CXCR41013/1013-Tieren konnte nachgewiesen werden, jedoch ist die B-Memory-Funktion erheblich eingeschränkt. Durchflusszytometrisch und funktionell konnte eine reduzierte preB/pro-B Population im Knochenmark bei einer gleichzeitig vergrößerten preB/pro-B Population in der Milz (vgl. extramedulläre Hämatopoese) nachgewiesen werden. Ebenfalls konnten wir in dieser Zellpopulation eine stark erhöhte CXCR4-Oberflächenexpression im Vergleich zu wildtypischen Zellen nachweisen. Da diese unreifen B-Zellen keine verstärke Apoptoserate aufweisen, gehen wir derzeit davon aus, dass der Differenzierungsstopp nicht durch selektiven Zelltod, sondern durch aberrante Retention der preB/proB-Zellen in einer primitiven B-Vorläufer- Nische im Knochenmark zustande kommt, beziehungsweise durch eine gestörte Migration in differenzierende Nischen im Knochenmark. Alternativ könnte die Überdosis CXCR4-Signal differenzierenden Signalen entgegenstehen. Beide Hypothesen können das eingangs erwähnte Paradoxon bezüglich einer B-Zellaplasie in CXCR4-defizienten und CXCR4-überaktiven Zellen hinreichend erklären.
Eukaryotische Zellen sind durch, aus Lipiddoppelschichten bestehenden, Membranen in Kompartimente mit unterschiedlichen Funktionen eingeteilt. Um einen Transport von Molekülen über die Membranen hinweg zu gewährleisten, werden Kanälen und Transporter benötigt. Eine Familie von Transportern sind die ATP-binding cassette (ABC) Transporter, die in allen Lebewesen, von Bakterien bis zum Menschen, vorkommen. Ein Mitglied dieser Familie ist der transporter associated with antigen processing-like (TAPL oder ABCB9). TAPL ist ein lysosomaler Polypeptidtransporter der per ATP-Hydrolyse Peptide von 6 – 59 Aminosäuren Länge vom Zytosol in das Lumen der Lysosomen transportiert. Hierbei kann TAPL, das ein Homodimer ist, in zwei funktionale Domänen geteilt werden. Der Teil des Komplexes, der für den Transport zuständig ist, wird als coreTAPL bezeichnet. Dieser beinhaltet die zytosolischen nucleotide binding domains (NBDs), die ATP binden und hydrolysieren können, und die Transmembrandomänen (TMDs), die Peptide binden und sie durch konformationelle Änderungen auf der anderen Membranseite freilassen. Die zweite Domäne ist eine N-terminale TMD, die als TMD0 bezeichnet wird. Dieser, aus vier Transmembranhelices (TMHs) bestehende Teil des Proteins, ist für die Lokalisation von TAPL in der lysosomalen Membran verantwortlich, sowie für die Interaktion mit den dort lokalisierten Membranproteinen LAMP-1 und LAMP-2. CoreTAPL ohne die TMD0s erreicht nicht die Lysosomen, sondern liegt in der Plasmamembran (PM) der Zelle vor. Die TMD0 hingegen benötigt coreTAPL nicht um korrekt in der lysosomalen Membran lokalisiert zu sein.
Die korrekte Lokalisation in der Zelle ist ein kritischer Punkt für ein Protein, um seine Funktion ausüben zu können. Die Transportprozesse vom Ort der Synthese des Proteins, dem Endoplasmatischem Reticulum (ER), zum Organell wo es seine Funktion ausüben soll, umfassen dutzende Proteine und Proteinkomplexe und ein komplexes Zusammenspiel zwischen Proteinen und den einzigartigen Lipidzusammensetzungen der Membranen verschiedener Organellen. Auf das Einfachste heruntergebrochen benötigt ein Transmembranprotein eine kurze Aminosäuresequenz auf der zytosolischen Seite, die Signalsequenz. Diese Sequenz wird von sogenannten Adapterproteinen erkannt, die wiederum andere Bestandteile der zellulären Maschinerie rekrutieren, die letztlich Vesikelbildung, Transport und Fusion mit der Zielorganelle vermitteln. Allerdings weisen nicht alle lysosomalen Transmembranproteine eine solche Signalsequenz auf, sondern besitzen unkonventionelle Zieldeterminanten, wie posttranslationale Modifikationen, oder sie interagieren mit anderen Proteinen, die wiederum die Interaktion mit den Adapterproteinen vermitteln.
Lange ging man davon aus, dass die Physiologie der Thyroidhormone weitestgehend erforscht ist und nahm an, dass sämtliche Thyroidhormon-Wirkungen auf einer Bildung von L-Thyroxin (T4) und einer anschließenden Deiodierung zu Triiodthyronin (T3) beruhen, welches an die nukleären Thyroidhormon Rezeptoren (THRs) bindet. Über die THRs werden genomische Signalwege vermittelt, die während der Wachstums- und Entwicklungsphase essentiell sind. Beim Erwachsenen werden zudem vorwiegend katabole Stoffwechsel-Prozesse induziert. Jedoch zeigte sich in den letzten 20 Jahren, dass die Signalwege der Thyroidhormone komplexer sind als bisher angenommen. Vor allem die Metabolite des in der Schilddrüse gebildeten T4s, zeigen ein breites Interaktions-Profil mit anderen molekularen Zielstrukturen. Thyronamine, die decarboxylierten Thyroidhormon-Metabolite, binden beispielsweise den G-Protein-gekoppelten Trace Amine Associated Receptor 1 (TAAR1). Wird dieser Rezeptor aktiviert, kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einem rapiden Abfall der Köpertemperatur, sowie zu einer akuten Bradykardie. Die durch oxidative Deaminierung gebildeten Iodthyroacetate Tetraiodthyroacetat (TETRAC) und Triiodthyroacetat (TRIAC) sind Antagonisten des Membran-Rezeptors Integrin αVβ3 und besitzen antiproliferative und pro-apoptotische Eigenschaften.
In dieser Arbeit sollte die Hypothese untersucht werden, ob Thyroidhormone neben diesen neuen zumeist nicht-genomischen Signalwegen, auch THR-unabhängige genomische Wirkmechanismen besitzen.
Mit Hilfe eines Gal4-Luciferase-Reportergen-Assays wurde in einem Screening die Aktivität einiger Thyroidhormone und Thyroidhormon-Metabolite an elf THR-ähnlichen Rezeptoren und den drei Retinoid X Rezeptor (RXR)-Subtypen untersucht. Es konnte detektiert werden, dass Thyroidhormone, vor allem TETRAC, potente Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR)γ-Agonisten sind, die zum Teil zusätzlich dessen Heterodimer-Partner RXR aktivieren können. Diese PPARγ- und RXR-Aktivität wurde zunächst mit Hilfe eines Coaktivator-Rekrutierungs-Assays, einer Isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) und einer Kristallstrukturanalyse genauer charakterisiert. Zum einen konnte nachgewiesen werden, dass sowohl PPARγ, als auch RXR in artifizielleren Testsystemen durch Thyroidhormone aktiviert werden. Zum anderen konnte die für permissive Heterodimere, wie das PPARγ/RXR-Heterodimer, typische additive Transaktivierungs-Effizienz nach Bindung beider Heterodimer-Partner bestätigt werden. Außerdem zeigte die Untersuchung der Kristallstruktur von TETRAC und PPARγ, dass Thyroidhormone einen abweichenden Bindungsmodus im Vergleich zu anderen PPARγ Agonisten, wie den Glitazonen und entsprechende Fettsäuren oder Fettsäuremimetika, besitzen.
Die Evaluation der biologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Heterodimer-Aktivierung ergab zudem, dass TETRAC, als potentester PPARγ-Agonist, in der Lage ist die Differenzierung von Präadipocyten zu Adipocyten zu induzieren. Außerdem wurde die mRNA-Expression wichtiger PPARγ-regulierter Gene in Hepatozyten trotz knockdown beider THR-Isoformen signifikant durch Thyroidhormone induziert.
Für eine erste Abschätzung einer möglichen physiologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Aktivierung durch Thyroidhormone, wurde die Bildung von TETRAC nach Inkubation von Hepatozyten mit T4 quantifiziert. Es konnte festgestellt werden, dass ausreichend TETRAC in den Hepatozyten gebildet werden kann, um PPARγ zu aktivieren. Auch in einem in vivo-Experiment, bei dem Mäusen ein mit Brom substituiertes T4-Analog (Br-T4) appliziert wurde, um Interferenzen mit der endogenen Thyroidhormon-Produktion zu verhindern, konnte gezeigt werden, dass die PPARγ-regulierte Genexpression in den Lebern der Tiere induziert wurde. Dies deutete auf eine physiologisch relevante Bildung von Br-TETRAC hin, da Br-TETRAC analog zu TETRAC eine hohe Bindungs-Aktivität an PPARγ besaß, während Br-T4 keine Aktivität an diesem Rezeptor aufwies.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Thyroidhormone neben den THR-vermittelten Effekten auch andere genomische Wirkmechanismen besitzen, indem sie das PPARγ/RXR-Heterodimer aktivieren. Diese biologische Aktivität könnte sowohl eine physiologische als auch eine pharmakologische Relevanz besitzen. Die beiden T4-Metabolite T3 und TETRAC sind in der Lage komplementäre Signalwege zu induzieren. Wird T4 deiodiert kommt es zur Bildung von T3, welches den THR aktiviert. Durch oxidative Deaminierung des T4s bildet sich TETRAC, das wiederum PPARγ bindet und aktiviert. Durch die vermehrte Bildung von TETRAC und anschließende Aktivierung von PPARγ könnte die katabole Wirkung der THR-Signalwege abgeschwächt werden und so eine Art negative Rückkopplung gewährleistet werden. Die physiologische Bedeutung der Interaktion von Thyroidhormonen mit PPARγ/RXR muss jedoch noch genauer untersucht werden.
Aber auch pharmakologisch könnte die Iodthyroacetat-Aktivität an PPARγ eine Rolle spielen. TETRAC könnte durch seinen individuellen Bindungsmodus als Leitstruktur für neue PPARγ-Partialagonisten mit verbessertem Nebenwirkungs-Profil dienen. Außerdem wird das Thyroidhormon-Derivat TRIAC schon jetzt als Leitstruktur für die Entwicklung von Thyroidhormon-Analoga mit THRβ-Selektivität verwendet. Durch die zusätzliche PPARγ-Aktivität könnte zukünftig ein dualer THRβ/PPARγ-Agonist bei Erkrankungen, die mit einer Insulinresistenz einhergehen, Verwendung finden.
Zusammenfassend stellt die Entdeckung der Aktivität von Thyroidhormonen an PPARγ und RXR einen weiteren Baustein im komplexen System der Thyroidhormone dar.
Die Kenntnis der Struktur von Biomolekülen und der biologischen Abläufe, in welche diese involviert sind, ist grundlegend für die Entwicklung von medizinischen Behandlungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Systeme zur Untersuchung von Biomolekülen, insbesondere Proteinen, hergestellt. Im Mittelpunkt stand die Entwicklung von Materialien, welche neue Möglichkeiten zur Präparation von Proteinen zur Untersuchung derer Struktur mittels Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) eröffnen. In zwei weiteren Projekten wurden biomimetische Systeme aufgebaut, welche die Oberfläche eines Biomoleküls oder biologischen Ensembles nachahmen und hierdurch deren Untersuchung ermöglichen. Hier wurden Systeme zur einfachen Nachbildung biologischer Membranen oder Proteinoberflächen betrachtet.
Eine wichtige Methode zur Untersuchung der dreidimensionalen Struktur von Biomolekülen ist die Kryo-TEM. Zur Mikroskopie werden die Biomoleküle in wenige Mikrometer großen Löchern eines amorphen Kohlenstofflochfilms mittels einer wenige Nanometer dicken Schicht aus amorphem Eis fixiert. Hierfür wird ein dünner Film einer wässrigen Probe auf den Kohlenstofflochfilm aufgebracht und gefroren. Insbesondere für Membranproteine ist die Herstellung derartiger Proben schwierig, da die Proteinpartikel zur Aggregation und Adsorption an dem Kohlenstofflochfilm neigen, wodurch keine Partikel in den Löchern des Kohlenstofffilmes auftreten, welche mikroskopiert werden können.
In dieser Arbeit wurden Materialien zur Verbesserung der Präparation von Proteinen für die Kryo-TEM entwickelt. Es wurden hierfür verschiedene biorepulsive Materialien, auch solche, welche eine spezifische Anbindung der Biomoleküle erlauben, untersucht. Da in der TEM die Probe durchstrahlt wird, eignen sich Nanometer dünne Membranen dieser Materialien als Trägermaterial für die Biomoleküle, da sie nur zu einem geringen Hintergrund führen. Zum einen wurden Nanomembranen durch die chemische Quervernetzung von Nanometer dicken Hydrogelfilmen mit verschiedenen quervernetzenden Molekülen hergestellt. Zum anderen wurden Trägerfilme, wie amorphe Kohlenstofffilme oder Kohlenstoffnanomembranen (engl. carbon nanomembranes, CNM) biorepulsiv funktionalisiert. Darüber hinaus wurde eine Nitrilotriessigsäure(NTA)-funktionalisierte Hydrogel-beschichtete Nanomembran entwickelt, welche markierte Proteine selektiv über einen His-Tag bindet.
Neben der Entwicklung von Materialien zur Untersuchung von Proteinen mittels Kryo-TEM wurden Beschichtungen hergestellt, welche die Oberfläche eines Biomoleküls oder eines Ensembles von Biomolekülen nachahmen. Diese Modelloberflächen sollten ebenfalls die Untersuchung von Eigenschaften der biologischen Systeme ermöglichen. Biologische Membranen bestehen aus einem Ensemble von Biomolekülen. Eine Vielzahl verschiedener Biomolekülen tritt in einer komplexen Anordnung in diesen dünnen Membranen auf. Es wurde versucht, strukturierte Membranen mit lokalen Variationen der physikalischen und chemischen Eigenschaften, jedoch weitaus weniger komplexen Aufbau, herzustellen. Die hergestellten Membranen mit biologisch relevanten Strukturen im Mikrometer- bis Zentimeterbereich, können nach weiterer Forschung als einfache Modellsysteme zur Nachahmung ihrer komplexen biologischen Vorbilder dienen.
In einem weiteren Projekt wurde eine Modelloberfläche für die Bindungstasche des Proteins FimH, welches eine wichtige Rolle in der bakteriellen Adhäsion spielt, entwickelt. In dem Kooperationsprojekt mit der Arbeitsgruppe Lindhorst wurde ein Modellsystem entwickelt, welches dazu dient, herauszufinden, inwiefern eine Funktionalisierung einer Aminosäurevon FimH über eine vorgeschlagenen Ligationsstrategie möglich ist. Das Modellsystem besteht aus einer biorepulsiven Hydrogel-Matrix, aus welcher die Seitenkette der Aminosäure Tyrosin in die Lösung exponiert ist. Die Substrat-katalysierte Reaktion der Aminosäuren-Seitenkette mit dem Photoschalter wurde mithilfe eines Bakterienadhäsionstests untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich die vorgeschlagene Ligationsstrategie unter Berücksichtigung von Nebenreaktionen zur Modifizierung des Proteins eignet.
Es konnten vier neuartige Systeme, welche die Probenpräparation zur Untersuchung von Proteinen mittels Kryo-TEM vereinfachen, entwickelt werden. Die Ergebnisse sind von wissenschaftlicher Relevanz, da sie die Strukturbestimmung vieler Proteine deutlich vereinfachen und hierdurch beschleunigen können. Außerdem wurden biomimetische Beschichtungen entwickelt, welche entweder Proteinoberflächen oder Biomembranen nachahmen. Die entwickelten Modellsysteme erweitern das Spektrum an Möglichkeiten, Biomoleküle oder biologische Ensembles zu untersuchen.
Die vorliegende Dissertation gliedert sich in 2 Abschnitte: Im 1. Abschnitt wurden die Auswirkungen des Naturstoffs Phytol auf den Krankheitsverlauf des murinen EAE-Modells charakterisiert, während im 2. Abschnitt die immunmodulierenden Eigenschaften der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o untersucht wurden.
Vorarbeiten zeigten einen positiven Einfluss von Phytol auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell für Multiple Sklerose, eine verringerte Proliferationsfähigkeit von Splenozyten sowie eine Regulation der NOX2 mRNA-Expression (Blum et al., 2018b).
In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Gabe von Phytol den Prozess der Demyelinisierung im lumbalen Rückenmark deutlich reduzierte und die Anzahl der Immunzellen in den inguinalen Lymphknoten sowie im lumbalen Rückenmark signifikant verringerte. Weiterhin konnte eine Regulation der spezifischen T-Zell Transkriptionsfaktoren T Bet sowie Foxp3 nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass Phytansäure, nicht jedoch Pristansäure, die beiden Metaboliten von Phytol, die Proliferationsfähigkeit der T-Zellen signifikant verringerte. Beide Metaboliten zeigten zusätzlich unterschiedlichen Einfluss auf die T-Zell Subtypen. Hultqvist et al. konnten eine verstärkte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Phytol nachweisen (Hultqvist et al., 2006). Vorarbeiten zeigten eine Steigerung der mRNA-Expression des ROS-produzierenden Enzymkomplex NOX2 im Verlauf des EAE-Modells sowie eine Regulation der NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark und in den inguinalen Lymphknoten durch Phytol (Blum et al., 2018b). Deshalb wurde die Rolle von NOX2 an den Phytol-vermittelten Effekten weiter charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die gesteigerte NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark auf die eingewanderten Immunzellen zurückzuführen war. Die von NOX2 im zentralen Nervensystem (ZNS) gebildeten ROS, welche zur Schädigung der Myelinschicht beitragen können, wurden durch die Gabe von Phytol im lumbalen Rückenmark verringert. Untersuchungen in NOX2KO-Mäusen zeigten, dass die beobachteten ex vivo Effekte von Phytol sowie dessen Metaboliten nur teilweise NOX2-abhängig waren. Im murinen EAE-Modell mit NOX2KO-Mäusen zeigte Phytol weiterhin einen positiven Einfluss auf die klinischen Symptome. Auffällig war dabei, dass NOX2KO-Tiere grundsätzlich weniger klinische Scores zeigten als Wildtyp Tiere. In NOX2-Chimären hatte Phytol keinen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Grund dafür könnte eine Beschädigung der Blut-Hirn-Schranke bei der Generierung der Chimären und eine damit verbundene verstärkte Infiltration von Immunzellen in das ZNS gewesen sein. Weiterhin konnte Phytol möglicherweise über die geschädigte Blut-Hirn-Schranke verstärkt in das ZNS eindringen und dort über eine gesteigerte ROS-Produktion zu schädigenden Effekten führen.
Die in vivo Daten weisen auf einen überwiegend NOX2-unabhängigen Wirkmechanismus von Phytol hin. Dennoch scheint NOX2 bei einigen Effekten zumindest beteiligt zu sein. Zusammenfassend zeigte die Gabe von Phytol einen überwiegend positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell, dennoch ist die Phytol-vermittelte Induktion von NOX2 und die Bildung von ROS kritisch zu sehen, da diese sowohl positive als auch negative Effekte vermitteln und stark von der Quantität sowie der Lokalisation der Bildung abhängig sind.
Im 2. Teilprojekt wurden die immunmodulierenden Auswirkungen der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o charakterisiert. Der anti-viral wirksame Naturstoff Silvestrol zeigte dabei diverse Auswirkungen auf die Differenzierung sowie Polarisierung von humanen Makrophagen. Während der Differenzierung inhibierte Silvestrol das anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Potential der Makrophagen durch eine Reduktion der resolutionsfördernden Oberflächenmarker CD206 und TREM2. Weiterhin wurde die Sezernierung der anti-inflammatorischen Zyto- bzw. Chemokine IL-10 und CCL18 verringert. Der pro-inflammatorische Phänotyp von M1-Makrophagen wurde weiterhin durch die vermehrte Bildung von TNF-α unterstützt, während bei M2-Makrophagen der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp verstärkt wurde. In Dendritischen Zellen schien Silvestrol sowohl die Differenzierung als auch die Aktivierung zu inhibieren, da zahlreiche Oberflächenmarker und sezernierte Zytokine signifikant verringert wurden. Die Stoffwechselwege der oxidativen Phosphorylierung und der Glykolyse wurden sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen signifikant reduziert. Demnach ist unklar, ob in der Summe die pro- oder anti-inflammatorischen Aspekte von Silvestrol überwiegen und ob der Einfluss auf den Stoffwechsel die Immunantwort beeinträchtigt.
Der anti-parasitäre Wirkstoff Steroid Substanz 1o zeigte keinen negativen Einfluss auf die Viabilität in primären humanen Immunzellen bis zu einer Konzentration von 50 µM und verstärkte das pro-inflammatorische Profil von M1-Makrophagen. Weiterhin wurde der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp von M2-Makrophagen unterdrückt und stattdessen die pro-inflammatorischen Aspekte verstärkt. Diese Beobachtungen der veränderten Oberflächenmarker sowie der sezernierten Zytokine wurden weiterhin durch die Veränderung des zellulären Stoffwechsels gestützt. Dabei steigerte Steroid Substanz 1o die Glykolyse in M2-Makrophagen, welche eigentlich für M1-Makrophagen charakteristisch ist. Dadurch kann die Verschiebung der M2-Makrophagen zu einem M1-Phänotyp erklärt werden. Weiterhin beeinträchtigte Steroid Substanz 1o die Differenzierung und Aktivierung von Dendritischen Zellen. Zusammenfassend verstärkte Steroid Substanz 1o überwiegend die pro-inflammatorischen Aspekte der Immunreaktion durch eine Aktivierung der M1-Makrophagen. Bei der möglichen Anwendung als Therapeutikum für Malaria sowie Schistosomiasis kann somit das Immunsystem bei der initialen Abwehr der Parasiten unterstützt werden.