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W2NCl7 has been prepared by the reaction of tungsten pentachloride with the bromide of Millon's base, [Hg2N]Br, in boiling CCl4. The product forms a dark brown, moisture sensitive crystal powder (μeff = 0.7 B.M. at 21 °C). With phosphoryl chloride, the complex W2NCl7·2 POCl3 is formed. The reaction with chlorine leads to the mixed-valenced W(V)/W(VI) complex W2NCl8 (μeff = 0.5 B.M. at 22 °C), which reacts with tetraphenylphosphonium chloride in CH2Cl2 to form (PPh4)2[W2NCl10] ·2CH2Cl2. The reactions of W2NCl7 with PPh4Cl in molar ratios in CH2Cl2 solution lead to several complexes; one of them was identified bv X-ray diffraction methods to be (PPh4)2[W3Cl9(μ3-N)(0)(μ2-NCl)]2 ·1,5 CH2Cl2, which forms black crystals. The compound crystallizes monoclinically in the space group P21/n with two formula units per unit cell (7318 observed, independent reflexions, R = 0.083). The lattice dimensions are (20 °C): a = 994.4; b = 2673; c = 1518.2 pm; β = 101.00°. The compound consists of PPh4⊕ cations and centrosymmetric anions [W3Cl9(μ3-N)(O)(μ2-NCl)]22⊕. The tungsten atoms form a scalene triangle with WW bond lengths of 282 and 278 pm, respectively. The hypothenuse of this triangle is a nearly linear W - N -W bridge with WN distances of 199 and 182 pm. One of the WW edges is bridged by a μ-NCI group with WN bond lengths of 196 und 189 pm. respectively.
Glutamat ist der häufigste Neurotransmitter im menschlichen Hirn. Die Konzentration des Glutamats in der extrazellulären Flüssigkeit wird durch Glutamat-Transporter (Sekundärtransporter) kontrolliert. Liegt es in zu hoher Konzentration im synaptischen Spalt vor, kommt es zur Schädigung von Nervenzellen, ein Prozess, der als Exzitotoxizität bezeichnet wird. Eine Fehlfunktion oder fehlerhafte Produktion der Glutamat-Transporter im zentralen Nervensystem wird bei verschiedenen Krankheiten, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der Ischämie, der Epilepsie, der Schizophrenie und der Alzheimer-Krankheit vermutet. Ziel dieser Arbeit war die Funktions- und Strukturanalyse der Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus und GltP aus E. coli, um die Familie der Glutamat-Transporter und die Entstehung der mit diesen Transportern in Verbindung gebrachten Krankheiten besser zu verstehen. Um die für diese Analysen gebrauchten Mengen an Protein herzustellen, mussten die Proteine heterolog produziert werden, da sie in natürlichen Geweben nicht in ausreichender Menge vorkommen. In dieser Arbeit wurde Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus funktional mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem überproduziert. Dazu wurden verschiedene Vektorkonstrukte hergestellt. Die routinemäßige Überproduktion des Transporters wurde im 8 l - Maßstab durchgeführt. In Zellen, die für die Produktion von GLT-1 mit rekombinanten, aktiven SF-Viren infiziert wurden, konnte eine sehr hohe Aktivität des Glutamat-Transporters nachgewiesen werden. Die Menge des hergestellten GLT-1 wurde in Bindungsexperimenten mit (2S,4R)-4-Methylglutamat quantifiziert: jede Zelle enthielt 3,5 x 106 Transporter: 61,04 pmol GLT-1/mg Gesamtprotein. Das entspricht einer Ausbeute von etwa 2-3 mg/8 l Zellkultur. Die hier durchgeführte Überproduktion des GLT-1-Glutamat-Transporters ist die erste Überproduktion eines eukaryotischen Sekundärtransporters mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem, bei dem große Mengen an aktivem Protein hergestellt werden konnten. Zudem ist die Ausbeute an funktionalem GLT-1 mit 61 pmol/mg Gesamtprotein verglichen mit den in der Literatur vorliegenden Daten zur Überproduktion eukaryotischer sekundärer Transporter mit anderen Expressionssystemen die höchste, die bis dato erreicht werden konnte. Der größte Anteil des heterolog produzierten GLT-1 war glykosyliert. Die gelelektrophoretische Analyse des aufgereinigten Transporters ergab zwei Banden, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 70-75 kDa und etwa 53-58 kDa hatten. In einer Western-Blot-Analyse konnten beide Banden des GLT-1-Transporters mit einem anti-His-Antikörper und einem anti-GLT-1-Antikörper nachgewiesen werden. Durch Deglykosylierung mit PNGase F und einer Trennung beider Banden durch Lektin-Affinitätschromatographie konnte gezeigt werden, dass es sich bei der 70-75 kDa-Bande um die glykosylierte Form und bei der 53-58 kDa-Bande um die nicht glykosylierte Form des Glutamat-Transporters handelte. Es wurde gezeigt, dass zwischen der Aktivität des GLT-1 und dessen Glykosylierung kein Zusammenhang besteht. Denn beide Formen lagen als vollständige, funktionale Transporter vor und transportierten nach Rekonstitution in Liposomen Glutamat. Der prokaryotische Glutamat-Transporter GltP aus E. coli wurde in dem E. coli-Stamm C43 (DE3) überproduziert. Die Ausbeute war etwa 2 mg pro Liter Kultur. Die Funktionalität des Transporters nach Rekonstitution in Lipidvesikel wurde durch spezifische Aufnahme von Glutamat gezeigt. Für die Solubilisierung beider Transporter aus den Zellmembranen wurden verschiedene Detergentien getestet. GltP ließ sich am besten mit DM oder DDM aus der Membran extrahieren, für die Solubilisierung des GLT-1 wurde mit großer Effizienz DDM oder CYMAL-7 eingesetzt. GltP und GLT-1 wurden mit einer Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie in großer Menge und hoher Reinheit angereichert werden. Die Aufreinigungsprozedur beeinträchtigte nicht die Funktionalität des prokaryotischen GltP. Bei dem eukaryotischen Transporter GLT-1 war nach der Ni2+-NTA-Säule keine Transportaktivität mehr messbar. Durch Zusatz von Asolectin in den Wasch- und Elutionspuffern während der Aufreinigung konnte die Funktionalität des Transporters jedoch erhalten werden. Aufreinigungen mit anderen Lipiden unter anderem in Kombination mit Cholesterin lieferten einen Glutamat-Transporter, der in seiner Konformation stabilisiert, jedoch nach Rekonstitution nicht aktiv war. Eine weitere Steigerung der Ausbeute an aktivem GLT-1 konnte durch den Einsatz von Reduktionsmitteln, wie DTT oder b-Mercaptoethanol, die die Aggregation des Transporters verhinderten, erreicht werden. GltP katalysiert den elektrogenen Transport von Glutamat bzw. Aspartat unter Symport von mindestens zwei Protonen. GLT-1 transportiert ein Molekül Glutamat zusammen mit drei Na+-Ionen und einem Proton im Austausch gegen ein K+-Ion. Durch Transportmessungen konnte der hochspezifische Glutamat-Transport der aufgereinigten Transporter belegt werden. Der Glutamat-Transport des in Liposomen rekonstituierten GltP zeigte eine klare Abhängigkeit von einem anliegenden Protonengradienten. Aufgereinigtes und rekonstituiertes GLT-1 transportierte nur Aspartat bzw. Glutamat, wenn ein Na+ und ein K+-Gradient vorhanden waren. Die Aspartat- bzw. Glutamat-Aufnahme konnte bei beiden Transportern durch den kompetitiven nichttransportablen Inhibitor (2S,4R)-4-Methylglutamat blockiert werden. Der Assoziationsgrad der Glutamat-Transporter GltP und GLT-1 und das Gleichwicht zwischen den verschiedenen oligomeren Zuständen wurde in dieser Arbeit eingehend mit biochemischen Methoden untersucht: 1. „Cross-linking“-Studien, 2. Blaue Nativgelelektrophorese, 3. Analytische Ultrazentrifugation, 4. Laserlichtstreuung, 5. Gelfiltrationschromatographie. Die dabei erhaltenen Ergebnisse bewiesen eine tetramere Assoziierung beider Proteine. Die Gelfiltrationsexperimente zeigten, dass die Transporter in Detergenzlösung in unterschiedlichen Assoziationsgraden vorliegen. Das Gleichgewicht zwischen den oligomeren Formen war reversibel und abhängig von der Art und Konzentration des Detergenz, der Proteinkonzentration und der Temperatur. Zur Untersuchung der Struktur der Glutamat-Transporter wurden vor allem mit GltP zahlreiche 2D-Kristallisationsexperimente durchgeführt. Trotz Variation aller denkbar möglichen Parameter konnten keine Kristalle erhalten werden. Das beste Ergebnis war ein guter Einbau des Proteins in Lipidvesikel (etwa 80%). Da keine Kristalle erhalten wurden, wurde für beide Proteine eine Einzelpartikelanalyse durchgeführt. Dabei wurde nach zweidimensionaler Alignierung und Klassifizierung die „random conical tilt“-Methode angewendet. Die daraus resultierenden dreidimensionalen Dichtekarten des GltP und GLT-1 waren sehr ähnlich und wiesen vier nicht exakt symmetrische Massen in annähernd quadratischer Anordnung auf. Die Auflösung war 26 Å bzw. 36 Å. Die Größe der Einzelpartikel (für GltP: Höhe 37 Å, Breite 75 Å bzw. 86 Å, Länge 100 Å). ihre annähernd quadratische Anordnung und ihre Symmetrie lassen vermuten, dass es sich dabei um Tetramere der Glutamat-Transporter handelt, die aus zwei nicht symmetrischen Dimeren zusammengesetzt sind. Die hier präsentierten Daten sind die ersten zur dreidimensionalen Struktur von Glutamat-Transportern. Schließlich wurde nachgewiesen, dass der in BHK-Zellen heterolog exprimierte Glutamat-Transporter GLT-1 vorwiegend in „lipid rafts“ lokalisiert ist. Die Größe der „rafts“, die anhand der Größe der „Proteininseln“ in Gefrierbrüchen bestimmt wurde, war etwa 200 nm im Durchmesser. Die „GLT-1-Inseln“ bzw. „lipid rafts“ konnten durch das teilweise Entfernen von Cholesterin aus der Membran zerstört werden. Damit ging eine Reduktion der Glutamat-Transporter-Aktivität von etwa 20% einher. Es ist das erste Mal, dass „lipid rafts“ durch die natürliche Assemblierung von Proteinen mit Hilfe von Gefrierbruchanalysen und Elektronenmikroskopie beobachtet wurden.
Carbene transfer from aliphatic diazoalkanes upon coordinatively unsaturated metal centers is a general synthetic concept that provides straight-forward routes into organo-metallic hydrocarbon chemistry. A comparison focussing on several key reactions of general applicability demonstrates that mononuclear organometal substrates add carbenes that may act as bridging ligands (e.g., compound 6) if they arise from ω,ω'-bisdiazoalkanes. By way of contrast, metal-metal double bonds cleanly form dimetallacyclo-propane-type derivatives under very mild conditions (7-9). The broadest variety of structures is finally encountered with metal-metal triply bonded precursors such as the molybdenum compounds 3: here, the initial diazoalkane adducts are subject to further rearrangement processes commonly leading to metal-metal single bonds (11) or causing irreversible cleavage of the dinuclear metal systems (10).
The syntheses of the dibenzoquinolizinium-salts 3, 13, 16, 20 and 25 which are of spectroscopic interest are described. Their electronic excitation spectra will be published later by Perkampus and coworkers in this journal.
Über Reaktionen von 3-trifluormethylphenylsubstituierten silicium-und zinnorganischen Verbindungen
(1978)
Several routes were investigated for the preparation of 3-CF3C6H4N[Si(CH3)3]2 2 and 3-CF3C6H4N[Sn(CH3)3]2 3. The latter compound reacts with 3-CF3C6H4NCO to yield [3-CF3C6H4(CH3)3SnN]2CO 4. A substituted urea 5 is also formed from [(CH3)3Si]2NCH3 and 3-CF3C6H4NCO. 5 is used for the preparation of cyclic compounds, with S2Cl2 the ten-membered ring (3-CF3C6H4NCONCH3S2)2 6 is formed. 5 and HN(SO2Cl)2 yield the six-membered ring 3-CF3C6H4NCONCH3(SO2)2NH 7. SeOCl2 and 5 react under formation of a spiro compound (S-CF3C6H4NCONCH3)2Se 8. The compounds were characterized on the basis of mass and 19F NMR spectra.
Interactions of eosin with three different substrates, β-lactoglobuline, bovine serum albumin and cysteine, in aqueous solutions of pH 7 under illumination with light of wavelengths 5200—5400 Å are investigated by changes in absorption spectrum characteristics, SH-group activities and phosphorescence intensities.
Only with bovine serum albumin the major part of protein conversion, as shown by spectral changes and diminution of SH-groups due to eosin-sensitized photo-oxidation. In β-lactoglobuline an oxidizing photoreaction occurs, by which eosin is vanishing to the same degree as the protein shows loss of SH-groups and spectral alterations indicating attack on aromatic amino acid residues. There is no red shift of the eosin absorption band at 5170 Å as is observed in solutions of bovine serum albumin, where the intensity of phosphorscence is about 100 fold compared with the intensity obtained by solutions of β-lactoglobulin.
The aerobic eosin photoreaction in solutions of β-lactoglobulin is faster than aerobic photobleaching of the dye. Still faster is its bleaching photoreaction with cysteine, which is nearly independent of oxygen.
Über Natriumhexaoxometallate
(1969)