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Synthese und Optimierung von Nitroxyl-Spin-Labeln zur Analyse von Nukleinsäuren mittels EPR und NMR
(2010)
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Einsatz der Nitroxyl-Spin-Markierung für die Strukturaufklärung von Oligonukleotiden getestet. Dafür wurden im Vorfeld verschiedene Spin-Label synthetisiert und charakterisiert. Bei den Nitroxiden handelt es sich hierbei um das Spin-Label TPA (2,2,5,5-Tetramethyl-pyrrolin-1-oxyl-3-acetylene) und TEMPA (2,2,6,6-Tetramethyl-3,4-dehydro-piperidin-N-oxyl-4-acetylene). Beide Spin-Label wurden auch als deuteriert und 15N-markiert synthetisiert. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen auf dem Gebiet der Modell-Systeme und Modell-RNAs wurden biologisch relevante und strukturell anspruchsvolle Oligonukleinsäuren untersucht. Dabei konnten DNA-RNA-Hybride, die HCV-IRES Domain II, ein Tetra-Loop, das Neomycin-B Aptamer, das Diels-Alder Ribozym und ein Nep1-RNA-Komplex charakterisiert werden. Die Einführung des Spin-Labels erfolgte noch auf der Festphase mittels der Sonogashira-Kreuz-Kupplungs Reaktion.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde eine wirksame synthetische und spektroskopische Methode entwickelt, um Abstände in DNA- und RNA-Duplexen mittels Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) zu messen und um in Zukunft die dreidimensionale Struktur biologisch relevanter RNAs bestimmen zu können. Die Synthese von iodierten Nukleotid-Bausteinen für die Oligonukleotidsynthese, an denen mit Hilfe der Palladium katalysierten Sonogashira-Kreuzkupplung sich EPR-aktive Nitroxid-Acetylene einführen lassen, wurde erfolgreich durchgeführt. Diese Phosphoramidite sollten die folgenden Kriterien erfüllen: Alle vier Basen (A, C, G und U) sollten modifiziert werden und das eingeführte Spinlabel 2,2,5,5- Tetramethyl-3-ethinyl-pyrrolin-N-oxyl (TPA) sollte entweder in die minor oder die major groove hineinragen. Im Falle der Pyrimidine (U und C) war nur die Orientierung in die major groove möglich, da das Iodid nur am C5 eingeführt werden kann. Obwohl 5-Iodo-desoxyuridin- und 5-Iodo-uridin-phosphoramidit käuflich sind, wurden diese Bausteine selber hergestellt, wobei die iodierten Bausteine mit hohen Ausbeuten erhalten wurden. Die Synthese von 5-Iodo-cytidin erfolgte aus Cytidin, insbesondere durch die Iodierung mit Iod, Iodsäure in Essigsäure und Tetrachlorkohlenstoff. Die einzige Möglichkeit, dass das Nitroxid eine Orientierung innerhalb der minor groove annimmt, war die Derivatisierung am C2 der Purine. Der Austausch von Iodo gegen eine Aminofunktion für Guanosin war wegen des Verschwindens einer potentiellen Wasserstoffbrücke ungünstig, im Gegensatz zu Adenosin. Die Synthese von 2-Iodo-adenosin-phosphoramidit wurde durchgeführt, wobei die Amino-Gruppe am C2 eines modifizierten Guanosins durch Iod mittels einer radikalischen Reaktion mit Iod, Iodmethan und Kupferiodid substituiert wurde. Die Synthese von 7-Deaza-adenosin (7-Iodo-tubercidin) und von 7-Deaza-guanosin wurde durch eine Lewissäure katalysierte Vorbrüggen-Glykosylierung zwischen der geschützen Nukleobase und der acetylierten Ribofuranose erzielt. Die Iodierung erfolgte für das geschützte Tubercidin mit N-Iodsuccinimid, während sie für Guanosin trotz zahlreicher Versuche leider scheiterte. Da natürlich vorkommende DNA und RNA nicht paramagnetisch sind, müssen sie durch die Einführung eines Spinlabels EPR-fähig gemacht werden. Dafür wurde das Spinlabel TPA ausgewählt, da es sich mit einer hohen Stabilität und Starrheit auszeichnet. Dafür wurde zuerst die Palladium(II) katalysierte Sonogashira-Kupplung in DNA-Strängen wärend der Oligonukleotidsynthese für 5-Iodo-desoxy-uridin optimiert: Sehr reine Proben mit einem oder zwei Spinlabels in einem Strang konnten hergestellt werden. Diese Methode wurde anschließend erfolgreich auf RNA mit geringfügigen Änderungen für U, C und A übertragen, um die Ausbeute der Kupplung zu verbessern. Die benutzte Chemie hat sich als entscheidend erwiesen, da es zu berücksichtigen gilt, wie sich die Reagenzien, die bei der RNA-Festphasensynthese eingesetzt werden, auf das Spinlabel auswirken. Es wurde festgestellt, dass die Oxidationsstufe des klassischen TBDMS-Festphasenzyklus mit Iod, Pyridin und Wasser für die Reduktion eines beträchtlichen Teils des Nitroxids verantwortlich ist, insbesondere im Falle von 2-Iodo-adenosin. Deshalb wurde beschlossen, die patentierte ACE-Chemie zu verwenden, in der das Phosphor-Atom während des Festphasenzyklus mit tert-Butylperoxid in Toluol oxidiert wird. Die Synthese der geeigneten Bausteine wurde hierfür durchgeführt, 5-Iodo-uridin-phosphoramidit ist bei Dharmacon kommerziell erhältlich. Leider scheiterte die Synthese von 7-Iodo-tubercidin-phosphoramidit auf der Stufe der Einführung des Orthoesters. Auf diese Weise wurden sehr reine doppelgelabelte DNA und RNA Duplexe erhalten, deren Stabilität durch UV-Spektroskopie überprüft wurde. Der Unterschied in den Tm-Werten überstieg nicht 3,2°C für DNA und 5,1°C für RNA im Vergleich zu den unmodifizierten Duplexen. CD-Spektren wurden ebenso aufgenommen und zeigten, dass die B- bzw. A-Form erhalten blieb. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Prisner wurden die Abstände zwischen den zwei Nitroxiden in den synthetisierten fünf DNA- und sechs RNA-Duplexen mit Puls-Elektron-Doppel-Resonanz (PELDOR) gemessen. Diese experimentellen Werte wurden mit den theoretischen Werten verglichen, die mit Molecular Dynamics Simulationen erhalten wurden (Arbeitskreis Stock). Die mit beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse stimmen überein. Erfolgreich wurde auch die Synthese von reinen spingelabelten biologisch relevanten RNAs wie TAR-RNA, der vier-Wege Kreuzung IIIa,b,c des Hepatitis C Virus und dem U4-U6 Komplex des Spleißosoms im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt. Die größte synthetisierte RNA betrug 65 Nukleobasen. Leider konnten wegen zu hoher Flexibilität oder nicht richtiger Faltung der RNA keine definierten Abstände gefunden werden.
This thesis demonstrates the advancement of PELDOR spectroscopy beyond its original design of distance measurements in order to disentangle a maximum amount of information additionally encoded in the PELDOR data. In particular, the successful synthesis of novel polynitroxide radicals is described as well as the extraction of the relative orientation of spin labels, conformational flexibility and the separation of dipolar and exchange coupling via orientation selective PELDOR measurements in combination with PESIM based simulations. Moreover, the method of PELDOR "Spin Counting" was experimentally validated.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) is a well established method concerning nanometer distance measurements involving two nitroxide spin-labels. In this thesis the applicability of this method to count the number of spins is tested. Furthermore, this work explored the limits, up to which PELDOR data obtained on copper(II)-nitroxide complexes can be quantitatively interpreted. Spin counting provides access to oligomerization studies – monitoring the assembly of homo- or hetero-oligomers from singly labeled compounds. The experimental calibration was performed using model systems, which contain one to four nitroxide radicals. The results show that monomers, dimers, trimers, and tetramers can be distinguished within an error of 5% in the number of spins. Moreover, a detailed analysis of the distance distributions in model complexes revealed that more than one distance can be extracted from complexes bearing several spins, as for example three different distances were resolved in a model tetramer – the other three possible distances being symmetry related. Furthermore, systems exhibiting mixtures of oligomeric states complicate the analysis of the data, because the average number of spin centers contributes nonlinearly to the signal and different relaxation behavior of the oligomers has to be treated explicitly. Experiments solving these problems are proposed in the thesis. Thus, for the first time spin counting has been experimentally calibrated using fully characterized test systems bearing up to four spins. Moreover, the behavior of mixtures was quantitatively interpreted. In addition, it has been shown that several spin-spin distances within a molecule can be extracted from a single dataset. In the second part of the thesis PELDOR experiments on a spin-labeled copper(II)-porphyrin have been quantitatively analyzed. Metal-nitroxide distance measurements are a valuable tool for the triangulation of paramagnetic metal ions. Therefore, X-band PELDOR experiments at different frequencies have been performed. The data exhibits only weak orientation selection, but a fast damping of the oscillation. The experimental data has been interpreted based upon quantitative simulations. The influence of orientation selection, conformational flexibility, spin-density distribution, exchange interaction J, as well as anisotropy and strains of the g-tensor has been examined. An estimate of the spin-density delocalization has been obtained by density functional theory calculations. The dipolar interaction tensor was calculated from the point-charge model, the extension of the point-dipole approximation to several spin bearing centers. Even assuming asymmetric spin distributions induced by an ensemble of asymmetrically distorted porphyrins the effect of delocalization on the PELDOR time trace is weak. The observed damping of dipolar oscillations has been only reproduced by simulations, if a small distribution in J was assumed. It has been shown that the experimental damping of dipolar modulations is not solely due to conformational heterogeneity. In conclusion the quantitative interpretation of PELDOR data is extended to copper-nitroxide- and multi-spin-systems. The influence of the mean distance, of the number of coupled spins, of the conformational flexibility, of spin-density distribution and of the electronic structure of the spin centers has been analyzed using model systems. The insights on model compounds mimicking spin-labeled biomacromolecules – in oligomeric or metal bound states – calibrate the method with respect to the information that can be deduced from the experimental data. The resulting in-depth understanding allows correlating experimental results (from for example biological systems) with models of structure and dynamics. It also opens new fields for PELDOR as for example triangulation of metal centers and oligomerization studies. In general, this thesis has demonstrated that modern pulsed electron paramagnetic resonance techniques in combination with quantitative data analysis can contribute to a detailed insight into molecular structure and dynamics.