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Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex aus Paracoccus denitrificans
(2005)
Cytochrom bc-Komplexe sind zentrale Enzyme energietransduzierender Elektronen-transportketten. Anerkanntes Funktionsprinzip ist der Q-Zyklus; mechanistische Details insbesondere der Chinoloxidation am Qo-Zentrum sind noch unklar. Ein Verständnis des Qo-Zentrums ist auch von Interesse, da hier Inhibitoren in Form von Fungiziden und Malariatherapeutika wichtige Anwendung finden. In den vergangenen Jahren wurde eine Reihe mitochondrialer Komplexe kristallographisch charakterisiert, die Struktur eines bakteriellen Enzyms steht jedoch aus. Hauptziel dieser Arbeit war es, Ansätze zur Strukturaufklärung des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans (P.d.) zu finden, der als homologes Enzym mitochondrialer Komplexe bei einfacher genetischer Zugänglichkeit ein wichtiges Modellsystem darstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Kristallisation des bc1-Komplexes aus S. cerevisiae aufgebaut, die mit Hilfe monoklonaler Antikörperfragmente (Fv) gegen die Rieske-Untereinheit (ISP) erreicht wurde; die Fv-Fragmente erleichtern die Ausbildung von Kristallkontakten. Die Epitopregion des Hefeenzyms wurde genetisch auf den bakteriellen Komplex übertragen, um dessen Ko-Kristallisation mit dem bereits verfügbaren Fv zu ermöglichen. Punktuelle Anpassungen führten zu keiner signifikanten Bindung, ein weitergehender Austausch des entsprechenden ISP-Bereichs verbesserte die Bindung hingegen deutlich. Die besten Ergebnisse konnten mit chimären Enzymen erzielt werden, bei denen die gesamte ISP-Ektodomäne durch das Hefe-Homologe ersetzt wurde. Aufbauend auf dieser Arbeit scheint die Fv-vermittelte Kristallisation des Enzyms ein greifbares Ziel. Eine komplementäre Strategie zielte auf die strukturelle Charakterisierung der Rieske-Ektodomäne (ISF). Das klonierte ISF wurde in E. coli überexprimiert, lag jedoch fast vollständig in inclusion bodies vor. Das ISF konnte in eine lösliche Form rückgefaltet werden, die anschließende chemische Rekonstitution zum Holo-Protein gelang jedoch nur mit einer Ausbeute von ~ 1 %. Die geringe Menge an löslichem ISF, die sich nach Expression in E. coli isolieren lässt, trägt kein [2Fe-2S]-Zentrum. Durch Koexpression der für die Biogenese von Eisen-Schwefel-Zentren relevanten Gencluster konnte die lösliche ISF-Fraktion in vivo in die Holo-Form konvertiert werden. Auch hier war aber die Gesamtausbeute für strukturelle Untersuchungen zu gering. Eine homologe Expression in P.d. war nur für das komplette ISP nachweisbar, nicht für das verkürzte ISF. Durch gerichtete Mutagenese konnte hier erstmals gezeigt werden, dass das bakterielle Rieske-Protein über den Tat-Translokationsweg in die Membran inseriert. Die Kristallstrukturen mitochondrialer bc1-Komplexe zeigen ein dimeres Enzym. Die Assoziation des bakteriellen Komplexes wurde in dieser Arbeit mit der analytischen Ultrazentrifugation untersucht, und auch hier wurde eindeutig ein Dimer nachgewiesen. Dynamische Messverfahren deuteten jedoch auf einen höheren Assoziationszustand hin. Es bleibt unklar, ob diese Diskrepanz durch Formparameter oder die Detergenzbindung begründet ist oder ob unter bestimmten Versuchsbedingungen möglicherweise Tetramere vorliegen. In situ ist der bc1-Komplex strukturell mit den Komplexen I und IV sowie dem Elektronenüberträger Cyt c552 assoziiert. Die Analyse verschiedener Deletionsstämme zeigte, dass Komplex I der Atmungskette durch diesen Superkomplex stabilisiert wird. Dieser Befund konnte kürzlich in anderen Arbeiten auch an menschlichen Mitochondrien bestätigt werden. Neben strukturellen Aspekten wurden am bc1-Komplex auch die H+-Translokation und die Chinonbindung untersucht. Da chemische Modifikationsexperimente zeigen, dass ein saurer Rest im ISP eine kritische Rolle für die Kopplung von H+-Translokation und Elektronentransport spielt, wurden durch gerichtete Mutagenese kombinatorisch saure Reste gegen entsprechende Säureamide ersetzt. Die biochemische Charakterisierung wurde nur für eine Fünffach-Mutante durchgeführt; diese erwies sich jedoch als zu instabil, um verlässliche Daten aus H+-Pumpexperimenten zu gewinnen. Die Charakterisierung der übrigen Mutanten scheint lohnenswert, da der relevante Aminosäurerest auch in anderen Arbeiten noch nicht identifiziert werden konnte. Der Gehalt des aufgereinigten Enzyms an spezifisch gebundenem Chinon wurde FTIR-spektroskopisch quantifiziert. Eine Stöchiometrie von ~ 3 Chinonmolekülen/Monomer stützt das double occupancy-Modell, demzufolge zwei Substratmoleküle am Qo-Zentrum binden; das dritte Chinon bindet am Qi-Zentrum. Partielle Extraktion des Chinons und Messungen bei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Substratbindung mit Protonierung eines sauren Rests einhergeht. Möglicherweise handelt es sich dabei um Glu295 des Cytochrom b, das auf Basis der Kristallstrukturen als primärer H+-Akzeptor am Qo-Zentrum diskutiert wird. Aufbauend auf dieser Arbeit können die an der Chinonbindung beteiligten Reste durch Mutagenese identifiziert werden.
In den letzten zwei Dekaden wurde die Rolle der RNA in biologischen Prozessen intensiv untersucht. Man erkannte immer deutlicher, dass ihre Funktion über die einfache Vermittlung von Information von der DNA hin zum Protein weit hinausgeht. So spielt sie eine entscheidende Rolle bei der Genexpression und besitzt darüber hinaus auch katalytische Eigenschaften. Die Entdeckung der reversen Transcriptase beim HI-Virus konnte zeigen, dass genetische Informationen nicht nur in Richtung von DNA zu RNA, sondern auch in Entgegengesetzter Richtung übertragen werden kann. Diese Schlüsselrolle in vielen wichtigen biochemischen Prozessen macht die RNA zu einem viel versprechenden Ziel für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, um in diese Prozesse eingreifen zu können. RNA bildet eine Vielzahl von stabilen Sekundär- und Tertiärstrukturen aus, die es Proteinen und Antibiotika ermöglicht, sie zu adressieren. Die bis heute wohl mit Ausnahme des Ribosoms und der tRNAs am besten aufgeklärte Struktur einer RNA ist die der HIV TAR-RNA (transaktivierende Region). Ein essentieller Bestandteil für die virale Genexpression ist die so genannte TAR-RNA. Diese befindet sich am 5-Ende aller viraler Transcripte und bildet eine aus 59 Basen bestehende stem-bulge-loop hairpin Struktur. Diese tritt in Wechselwirkung mit dem tat-Protein. Die Grundlage für die Erkennung des hierbei entstehenden Komplexes ist eine Wechselwirkung von tat mit der bulge- und loop-Region von TAR. Durch Interaktion mit der loop- Region kommt es zur Ausbildung eines CyclinT1/tat Komplexes, der im weiteren dafür verantwortlich ist, dass sich die Rate der Transkription um das mehrere hundertfache erhöht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Liganden zu synthetisieren, die spezifische Bindungen mit der TAR-RNA aus HIV-1 eingehen. Durch eine solche Bindung ist es möglich, den viralen Replikationszyklus zu unterbrechen. Ausgehend von einem relativ rudimentären Design, basierend auf dem Arginin-Fork-Model von Frankel, gelang es, mit Triaminopyrazol und verschiedenen seiner Derivaten dieses Ziel zu erreichen. Nach erfolgreicher Synthese der Zielstrukturen wurden diese in einem FRET-Assay im Hinblick auf ihre Affinität zu der TAR-RNA getestet. 3,4,5-Triaminopyrazol übertraf trotz seiner geringen Größe und Ladung mit einem IC50-Wert von 30 µM die Werte vieler tetrakationischer Tripeptide (FRET). Nach erfolgreicher Bestimmung der TAR-Affinität von Triaminopyrazol wurde seine Wirkung auf HIV-infizierte Hela P4-Zellen untersucht, die ein Tat-TAR-kontrolliertes Reportergen exprimierten. Dabei zeigte Triaminopyrazol eine Inhibierung mit IC50 = 50 µM. Bis zu einer Konzentration von 500 µM traten hierbei keine toxischen Effekte auf. Dies legt die Vermutung nahe, dass es sich bei Triaminopyrazol tatsächlich um einen tat- Antagonisten handelt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von Triaminopyrazol nicht die eines Entryinhibitors ist, sondern dass die Verbindung in der Lage ist, die Zellmembran zu durchdringen.
Virtual screening of potential bioactive substances using the support vector machine approach
(2005)
Die vorliegende Dissertation stellt eine kumulative Arbeit dar, die in insgesamt acht wissenschaftlichen Publikationen (fünf publiziert, zwei eingerichtet und eine in Vorbereitung) dargelegt ist. In diesem Forschungsprojekt wurden Anwendungen von maschinellem Lernen für das virtuelle Screening von Moleküldatenbanken durchgeführt. Das Ziel war primär die Einführung und Überprüfung des Support-Vector-Machine (SVM) Ansatzes für das virtuelle Screening nach potentiellen Wirkstoffkandidaten. In der Einleitung der Arbeit ist die Rolle des virtuellen Screenings im Wirkstoffdesign beschrieben. Methoden des virtuellen Screenings können fast in jedem Bereich der gesamten pharmazeutischen Forschung angewendet werden. Maschinelles Lernen kann einen Einsatz finden von der Auswahl der ersten Moleküle, der Optimierung der Leitstrukturen bis hin zur Vorhersage von ADMET (Absorption, Distribution, Metabolism, Toxicity) Eigenschaften. In Abschnitt 4.2 werden möglichen Verfahren dargestellt, die zur Beschreibung von chemischen Strukturen eingesetzt werden können, um diese Strukturen in ein Format zu bringen (Deskriptoren), das man als Eingabe für maschinelle Lernverfahren wie Neuronale Netze oder SVM nutzen kann. Der Fokus ist dabei auf diejenigen Verfahren gerichtet, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden. Die meisten Methoden berechnen Deskriptoren, die nur auf der zweidimensionalen (2D) Struktur basieren. Standard-Beispiele hierfür sind physikochemische Eigenschaften, Atom- und Bindungsanzahl etc. (Abschnitt 4.2.1). CATS Deskriptoren, ein topologisches Pharmakophorkonzept, sind ebenfalls 2D-basiert (Abschnitt 4.2.2). Ein anderer Typ von Deskriptoren beschreibt Eigenschaften, die aus einem dreidimensionalen (3D) Molekülmodell abgeleitet werden. Der Erfolg dieser Beschreibung hangt sehr stark davon ab, wie repräsentativ die 3D-Konformation ist, die für die Berechnung des Deskriptors angewendet wurde. Eine weitere Beschreibung, die wir in unserer Arbeit eingesetzt haben, waren Fingerprints. In unserem Fall waren die verwendeten Fingerprints ungeeignet zum Trainieren von Neuronale Netzen, da der Fingerprintvektor zu viele Dimensionen (~ 10 hoch 5) hatte. Im Gegensatz dazu hat das Training von SVM mit Fingerprints funktioniert. SVM hat den Vorteil im Vergleich zu anderen Methoden, dass sie in sehr hochdimensionalen Räumen gut klassifizieren kann. Dieser Zusammenhang zwischen SVM und Fingerprints war eine Neuheit, und wurde von uns erstmalig in die Chemieinformatik eingeführt. In Abschnitt 4.3 fokussiere ich mich auf die SVM-Methode. Für fast alle Klassifikationsaufgaben in dieser Arbeit wurde der SVM-Ansatz verwendet. Ein Schwerpunkt der Dissertation lag auf der SVM-Methode. Wegen Platzbeschränkungen wurde in den beigefügten Veröffentlichungen auf eine detaillierte Beschreibung der SVM verzichtet. Aus diesem Grund wird in Abschnitt 4.3 eine vollständige Einführung in SVM gegeben. Darin enthalten ist eine vollständige Diskussion der SVM Theorie: optimale Hyperfläche, Soft-Margin-Hyperfläche, quadratische Programmierung als Technik, um diese optimale Hyperfläche zu finden. Abschnitt 4.3 enthält auch eine Diskussion von Kernel-Funktionen, welche die genaue Form der optimalen Hyperfläche bestimmen. In Abschnitt 4.4 ist eine Einleitung in verschiede Methoden gegeben, die wir für die Auswahl von Deskriptoren genutzt haben. In diesem Abschnitt wird der Unterschied zwischen einer „Filter“- und der „Wrapper“-basierten Auswahl von Deskriptoren herausgearbeitet. In Veröffentlichung 3 (Abschnitt 7.3) haben wir die Vorteile und Nachteile von Filter- und Wrapper-basierten Methoden im virtuellen Screening vergleichend dargestellt. Abschnitt 7 besteht aus den Publikationen, die unsere Forschungsergebnisse enthalten. Unsere erste Publikation (Veröffentlichung 1) war ein Übersichtsartikel (Abschnitt 7.1). In diesem Artikel haben wir einen Gesamtüberblick der Anwendungen von SVM in der Bio- und Chemieinformatik gegeben. Wir diskutieren Anwendungen von SVM für die Gen-Chip-Analyse, die DNASequenzanalyse und die Vorhersage von Proteinstrukturen und Proteininteraktionen. Wir haben auch Beispiele beschrieben, wo SVM für die Vorhersage der Lokalisation von Proteinen in der Zelle genutzt wurden. Es wird dabei deutlich, dass SVM im Bereich des virtuellen Screenings noch nicht verbreitet war. Um den Einsatz von SVM als Hauptmethode unserer Forschung zu begründen, haben wir in unserer nächsten Publikation (Veröffentlichung 2) (Abschnitt 7.2) einen detaillierten Vergleich zwischen SVM und verschiedenen neuronalen Netzen, die sich als eine Standardmethode im virtuellen Screening etabliert haben, durchgeführt. Verglichen wurde die Trennung von wirstoffartigen und nicht-wirkstoffartigen Molekülen („Druglikeness“-Vorhersage). Die SVM konnte 82% aller Moleküle richtig klassifizieren. Die Klassifizierung war zudem robuster als mit dreilagigen feedforward-ANN bei der Verwendung verschiedener Anzahlen an Hidden-Neuronen. In diesem Projekt haben wir verschiedene Deskriptoren zur Beschreibung der Moleküle berechnet: Ghose-Crippen Fragmentdeskriptoren [86], physikochemische Eigenschaften [9] und topologische Pharmacophore (CATS) [10]. Die Entwicklung von weiteren Verfahren, die auf dem SVM-Konzept aufbauen, haben wir in den Publikationen in den Abschnitten 7.3 und 7.8 beschrieben. Veröffentlichung 3 stellt die Entwicklung einer neuen SVM-basierten Methode zur Auswahl von relevanten Deskriptoren für eine bestimmte Aktivität dar. Eingesetzt wurden die gleichen Deskriptoren wie in dem oben beschriebenen Projekt. Als charakteristische Molekülgruppen haben wir verschiedene Untermengen der COBRA Datenbank ausgewählt: 195 Thrombin Inhibitoren, 226 Kinase Inhibitoren und 227 Faktor Xa Inhibitoren. Es ist uns gelungen, die Anzahl der Deskriptoren von ursprünglich 407 auf ungefähr 50 zu verringern ohne signifikant an Klassifizierungsgenauigkeit zu verlieren. Unsere Methode haben wir mit einer Standardmethode für diese Anwendung verglichen, der Kolmogorov-Smirnov Statistik. Die SVM-basierte Methode erwies sich hierbei in jedem betrachteten Fall als besser als die Vergleichsmethoden hinsichtlich der Vorhersagegenauigkeit bei der gleichen Anzahl an Deskriptoren. Eine ausführliche Beschreibung ist in Abschnitt 4.4 gegeben. Dort sind auch verschiedene „Wrapper“ für die Deskriptoren-Auswahl beschrieben. Veröffentlichung 8 beschreibt die Anwendung von aktivem Lernen mit SVM. Die Idee des aktiven Lernens liegt in der Auswahl von Molekülen für das Lernverfahren aus dem Bereich an der Grenze der verschiedenen zu unterscheidenden Molekülklassen. Auf diese Weise kann die lokale Klassifikation verbessert werden. Die folgenden Gruppen von Moleküle wurden genutzt: ACE (Angiotensin converting enzyme), COX2 (Cyclooxygenase 2), CRF (Corticotropin releasing factor) Antagonisten, DPP (Dipeptidylpeptidase) IV, HIV (Human immunodeficiency virus) protease, Nuclear Receptors, NK (Neurokinin receptors), PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), Thrombin, GPCR und Matrix Metalloproteinasen. Aktives Lernen konnte die Leistungsfähigkeit des virtuellen Screenings verbessern, wie sich in dieser retrospektiven Studie zeigte. Es bleibt abzuwarten, ob sich das Verfahren durchsetzen wird, denn trotzt des Gewinns an Vorhersagegenauigkeit ist es aufgrund des mehrfachen SVMTrainings aufwändig. Die Publikationen aus den Abschnitten 7.5, 7.6 und 7.7 (Veröffentlichungen 5-7) zeigen praktische Anwendungen unserer SVM-Methoden im Wirkstoffdesign in Kombination mit anderen Verfahren, wie der Ähnlichkeitssuche und neuronalen Netzen zur Eigenschaftsvorhersage. In zwei Fällen haben wir mit dem Verfahren neuartige Liganden für COX-2 (cyclooxygenase 2) und dopamine D3/D2 Rezeptoren gefunden. Wir konnten somit klar zeigen, dass SVM-Methoden für das virtuelle Screening von Substanzdatensammlungen sinnvoll eingesetzt werden können. Es wurde im Rahmen der Arbeit auch ein schnelles Verfahren zur Erzeugung großer kombinatorischer Molekülbibliotheken entwickelt, welches auf der SMILES Notation aufbaut. Im frühen Stadium des Wirstoffdesigns ist es wichtig, eine möglichst „diverse“ Gruppe von Molekülen zu testen. Es gibt verschiedene etablierte Methoden, die eine solche Untermenge auswählen können. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die genauer als die bekannte MaxMin-Methode sein sollte. Als erster Schritt wurde die „Probability Density Estimation“ (PDE) für die verfügbaren Moleküle berechnet. [78] Dafür haben wir jedes Molekül mit Deskriptoren beschrieben und die PDE im N-dimensionalen Deskriptorraum berechnet. Die Moleküle wurde mit dem Metropolis Algorithmus ausgewählt. [87] Die Idee liegt darin, wenige Moleküle aus den Bereichen mit hoher Dichte auszuwählen und mehr Moleküle aus den Bereichen mit niedriger Dichte. Die erhaltenen Ergebnisse wiesen jedoch auf zwei Nachteile hin. Erstens wurden Moleküle mit unrealistischen Deskriptorwerten ausgewählt und zweitens war unser Algorithmus zu langsam. Dieser Aspekt der Arbeit wurde daher nicht weiter verfolgt. In Veröffentlichung 6 (Abschnitt 7.6) haben wir in Zusammenarbeit mit der Molecular-Modeling Gruppe von Aventis-Pharma Deutschland (Frankfurt) einen SVM-basierten ADME Filter zur Früherkennung von CYP 2C9 Liganden entwickelt. Dieser nichtlineare SVM-Filter erreichte eine signifikant höhere Vorhersagegenauigkeit (q2 = 0.48) als ein auf den gleichen Daten entwickelten PLS-Modell (q2 = 0.34). Es wurden hierbei Dreipunkt-Pharmakophordeskriptoren eingesetzt, die auf einem dreidimensionalen Molekülmodell aufbauen. Eines der wichtigen Probleme im computerbasierten Wirkstoffdesign ist die Auswahl einer geeigneten Konformation für ein Molekül. Wir haben versucht, SVM auf dieses Problem anzuwenden. Der Trainingdatensatz wurde dazu mit jeweils mehreren Konformationen pro Molekül angereichert und ein SVM Modell gerechnet. Es wurden anschließend die Konformationen mit den am schlechtesten vorhergesagten IC50 Wert aussortiert. Die verbliebenen gemäß dem SVM-Modell bevorzugten Konformationen waren jedoch unrealistisch. Dieses Ergebnis zeigt Grenzen des SVM-Ansatzes auf. Wir glauben jedoch, dass weitere Forschung auf diesem Gebiet zu besseren Ergebnissen führen kann.
Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
Die Aggregation von Thrombocyten ist ein wichtiger physiologischer Schutzmechanismus zur primären Blutstillung nach Gefäßverletzungen. Dieser Vorgang kann jedoch unter pathologischen Bedingungen zu Herzinfarkten und Schlaganfällen führen. Der Aggregationsprozeß ist durch Ausbildung sogenannter "Fibrinogenbrücken" zwischen verschiedenen Thrombocyten gekennzeichnet. Dies wird durch Bindung von Fibrinogen an das aktivierte Integrin alphaIIbbeta3 auf der Thrombocytenoberfläche ausgelöst. Das kleine G-Protein Rap1B aus der Ras-Superfamilie reguliert den Aktivitätszustand von Integrinen und besitzt damit eine zentrale Rolle bei der Aggregation von Thrombocyten. Die Aktivierung von Rap1B wird durch eine Vielzahl von Plättchenagonisten innerhalb von wenigen Sekunden ausgelöst. Der von Thrombocyten und Gefäßendothelzellen gebildete Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) kann die Thrombocytenaggregation über den NO/cGMP-Signalweg hemmen. Das Signalmolekül NO aktiviert in Thrombocyten die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (sGC), hierdurch wird die Synthese des sekundären Botenstoffes cGMP angeregt. Das cGMP-Molekül aktiviert nachfolgend die cGMP-abhängige Proteinkinase-Ibeta (cGK-Ibeta), welche die aggregationshemmende NO-Wirkung vermittelt. Die verantwortlichen Zielproteine der cGK-Ibeta wurden bis heute jedoch nicht hinreichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit sollten verschiedene Aspekte der NO-induzierten Hemmung der Thrombocytenaggregation untersucht werden. Dabei wurden neue Mechanismen dieser Inhibition identifiziert. Zum einen konnte eine kinetisch schnelle Hemmung der Rap1B-Aktivierung in Thrombocyten nachgewiesen werden. Zum anderen konnten einer cGK-Ibeta-vermittelten, kinetisch langsamen Rap1B-Phosphorylierung hemmende Effekte auf die Membranlokalisation von Rap1B in MDCK-Zellen und auf die Zellausbreitung von Hela-Zellen zugeordnet werden. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Proteininteraktion zwischen dem mitochondrialen CGI-51-Protein und Rap1B identifiziert und verifiziert. Zur Aufklärung eines Einflusses des NO/cGMP-Signalweges auf die Aktivierung von Rap1B in Thrombocyten wurde die NO/sGC/cGMP/cGK-Ibeta-Signalkaskade auf verschiedenen Stufen aktiviert oder gehemmt, bevor anschließend die Rap1GTPBildung mit verschiedenen Plättchenagonisten induziert wurde. Das aktive Rap1B wurde unter Verwendung eines Rap1GTP-bindenden Fusionsproteins präzipitiert und nachgewiesen. Durch NO-freisetzende Substanzen konnte eine Hemmung der Rap1BAktivierung erreicht werden. Auch die Aktivierung der sGC mit einem spezifischen Aktivator führte zur Inhibition von Rap1B. Die direkte Aktivierung der cGK-Ibeta konnte Rap1B ebenfalls hemmen, während eine Blockade der cGK-Ibeta die NO-induzierte Hemmung der Rap1-Aktivierung verhinderte. Die genannten Effekte des NO/cGMP-Signalwegs waren unabhängig vom Stimulus, der zur Rap1B-Aktivierung genutzt wurde, sowohl die Aktivierung über verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als auch die Aktivierung über Tyrosin-Kinasen wurden gehemmt. Eine detailliertere Untersuchung ergab, daß cGK-Ibeta die Ca2+-unabhängige Aktivierung von Rap1B hemmen konnte. Die Rolle der cGK-Ibeta wurde abschließend im unabhängigen Zellsystem der Megakaryocyten abgesichert. Die Hemmung der Rap1B-Aktivierung durch den NO/cGMP-Signalweg stellt einen schnellen Regulationsmechanismus zur Inhibition der Thrombocytenaggregation dar. Aus der Literatur ist eine kinetisch langsame Phosphorylierung von Rap1B an Serin-179 durch cGK-Ibeta bekannt. Zur Ermittlung ihrer Funktion wurden mikroskopische Untersuchungen der subzellulären Rap1B-Lokalisation in lebenden MDCK-Zellen durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, daß eine nicht-phosphorylierbare Rap1BMutante eine ausgeprägte Membranlokalisation aufweist, während eine phosphomimetische Rap1B-Mutante bevorzugt cytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer weiterführenden Studie wurde der Effekt dieser Rap1B-Mutanten auf das Zellausbreitungsverhalten von Hela-Zellen analysiert. Die Expression der nichtphosphorylierbaren Rap1B-Mutante führte dabei zu einer signifikant gesteigerten Zellausbreitung, welche hingegen durch eine phosphomimetische Rap1B-Mutante deutlich abgeschwächt war. Dies impliziert einen zusätzlichen Mechanismus, über den der NO/cGMP-Signalweg die Adhäsion bzw. die Aggregation von Thrombocyten regulieren kann. Zur Identifizierung von neuen Interaktionspartnern, die spezifisch an phosphoryliertes Rap1B binden und dessen subzelluläre Verteilung oder Aktivität regulieren, wurde das Yeast-Two-Hybrid-System eingesetzt. Hierbei konnte das mitochondriale CGI-51-Protein als neuer Bindepartner von Rap1B identifiziert und in Säugerzellen verifiziert werden. Eine phosphospezifische Interaktion konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. Das CGI-51-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Proteinsortierung in der äußeren Mitochondrienmembran. Die Funktion der Interaktion von CGI-51-Protein mit Rap1B wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß in der vorliegenden Arbeit erstmalig neue Erkenntnisse zur Regulation des kleinen G-Proteins Rap1B durch den NO/cGMP-Signalweg dargestellt sind. Dieser Regelmechanismus besitzt eine physioplogische Bedeutung bei der Inhibition der Thrombocytenaggregation.
The NO/cGMP pathway inhibits Rap1 activation in human platelets via cGMP-dependent protein kinase I
(2005)
The NO/cGMP signalling pathway strongly inhibits agonist-induced platelet aggregation. However, the molecular mechanisms involved are not completely defined.We have studied NO/cGMP effects on the activity of Rap1, an abundant guanine-nucleotidebinding protein in platelets. Rap1-GTP levels were reduced by NO-donors and activators of NO-sensitive soluble guanylyl cyclase. Four lines of evidence suggest that NO/cGMP effects are mediated by cGMP-dependent protein kinase (cGKI): (i) Rap1 inhibition correlated with cGKI activity as measured by the phosphorylation state ofVASP, an established substrate of cGKI, (ii) 8-pCPT-cGMP, a membrane permeable cGMP-analog and activator of cGKI, completely blocked Rap1 activation, (iii) Rp- 8pCPT-cGMPS, a cGKI inhibitor, reversed NO effects and (iv) expression of cGKI in cGKI-deficient megakaryocytes inhibited Rap1 activation. NO/cGMP/cGKI effects were independent of the type of stimulus used for Rap1 activation.Thrombin-,ADPand collagen-induced formation of Rap1-GTP in platelets as well as turbulence-induced Rap1 activation in megakaryocytes were inhibited. Furthermore, cGKI inhibited ADP-induced Rap1 activation induced by the G a i -coupled P2Y12 receptor alone, i.e. independently of effects on Ca2+-signalling. From these studies we conclude that NO/cGMP inhibit Rap1 activation in human platelets and that this effect is mediated by cGKI. Since Rap1 controls the function of integrin a IIbß 3 , we propose that Rap1 inhibition might play a central role in the anti-aggregatory actions of NO/cGMP.
In der Arbeit wurden neue Komplexbildner für die nasschemische, alkalische Reinigung von Siliciumhalbleiteroberflächen vorgestellt. Dabei handelte es sich neben kommerziell verfügbaren Verbindungen, wie beispielsweise Tiron, um den Chelatbildner Pyrinan und die vielversprechende Gruppe der 3-Hydroxypyridin-4(1H)-on-Komplexbildner („Pyridinone“). Insbesondere Letztere sind als effiziente Eisenkomplexbildner von präklinischen Untersuchungen zur Therapie von Eisenstoffwechselerkrankungen bekannt und haben deshalb großes Interesse hervorgerufen. Die Darstellung von Pyrinan und der Pyridinone war in befriedigenden bis guten Ausbeuten mit herkömmlichen Syntheseschritten möglich. Die Synthese konnte somit die im Abschnitt 1.2.1 erwähnten Anforderungen an die Komplexbildner befriedigen. Hinsichtlich der an die Strukturierung von Halbleitermaterialen geknüpften, jedoch bei der Präparation der Komplexbildner nicht realisierten Reinheitsbedingungen, wiesen diese einen teilweise erheblichen Kontaminationsgrad durch Metalle auf. Demzufolge hätten die Komplexbildner als potentielle Kontaminationsquellen bei der SC1-Reinigung von Siliciumsubstraten wirken können. Letzteres konnte jedoch im Rahmen der zehnminütigen Immersionsdauer in ¼/20 SC1 bei 70 °C weitgehend ausgeschlossen werden. Der Trend bei der nasschemischen Reinigung von Halbleitersubstraten mit immer stärker verdünnten Reinigunslösungen und reduzierten Reinigungsbadtemperaturen zu arbeiten, sollten dieses und die folgend zusammengefassten Ergebnisse noch weiter begünstigen. Es wurden Reinigungsexperimente mit Siliciumsubstraten und mit den Reinigungslösungen absichtlich zugesetzten Kontaminanten durchgeführt, um die Wirkungen der einzelnen Verbindungen besser studieren zu können. Es wurden die Metalle Al, Fe, Zn, Cu, Ni und Cr, die in der Halbleiterproduktion als gängige Kontaminanten auftreten, untersucht. Die Metalle Zn, Ni und Cu spielen in der SC1-Lösung, mit abnehmender Gewichtung in der genannten Reihenfolge, aufgrund deren Amminkomplexbildung keine nennenswerten Rolle als Oberflächenkontaminanten. Cr(III) wird in der SC1-Lösung zu Chromat oxidiert und kontaminiert aus diesem Grund die Oberfläche ebenfalls nicht. Dem gegenüber sind Al und Fe unter den gewählten Bedingungen sehr starke Oberflächenkontaminanten. Prinzipiell eignen sich fast alle untersuchten Komplexbildner, die Siliciumoberfläche vor der Kontamination durch Fe aus SC1 zu schützen. Hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegenüber Al und Zn wurden sie jedoch deutlich diskriminiert. Daraus schlussfolgernd ist der Einsatz mehrerer Komplexbildnern erforderlich, um die Kontaminationsgefahr der Siliciumoberfläche durch alle genannten Metalle gezielt kontrollieren und über einen gewissen Schwellenwert vermeiden zu können. Die Wirkung von Pyrinan und der Pyridinone ist vergleichbar, meistens jedoch deutlich besser, als die herkömmlicher Poly(alpha-aminomethylencarbonsäuren) (z. B. EDTA, Untersuchungen von IMEC). Sie erzielen Oberflächenkonzentrationen kritischer Kontaminanten (z. B. Fe) in der Größenordnung, die für die Prozessierung aktueller und künftiger Generationen von Bauelementen erforderlich sind. Konsequenterweise sind deshalb sowohl Pyrinan als auch die Pyridinonkomplexbildner und deren Verwendungszweck zum Patent angemeldet worden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Eignung der Komplexbildner bestimmt, hochkonzentrierte, den Halbleiterspezifikationen entsprechende Lösungen von H2O2 stabilisieren zu können. Die Stabilität wurde in Abhängigkeit von drei vorgegebenen Lagerungstemperaturen verfolgt. Sowohl die vorgestellten Verbindungen als auch die als Referenzsubstanz mituntersuchte Verbindung Dequest® 2060s konnten die an einen geeigneten Stabilisator gestellten Bedingungen nicht befriedigen. Lediglich die nicht stabilisierte Lösung von H2O2, die Referenzprobe, besaß eine, über den gesamten Beobachtungszeitraum ausreichende Stabilität. Das mangelhafte Abschneiden der vorgestellten Verbindungen als potentielle Stabilisatoren wird deren partieller bzw. vollständiger Oxidation durch H2O2 zugeordnet und ist am Beispiel von Dequest® 2060s weiter diskutiert worden. Im Zuge der Oxidation werden die intrinsischen Metallkontaminationen der Komplexbildner freigesetzt, wodurch die Kontaminanten in die Lage versetzt werden können, in das Reaktionsgeschehen katalytisch einzugreifen und die Zersetzung der Proben zu beschleunigen. Die Lagerung der Komplexbildner in konzentriertem NH3 stellt die Alternative zur Lagerung in H2O2 dar, wenn man zu einem fertig einsetzbaren, industriellen Produkt für die nasschemische Reinigung von Halbleiteroberflächen gelangen möchte, welches eine einstufige alkalische Reinigung (APM+®) ermöglicht. Hier konnten bis auf die Proben, welche Tiron als Komplexbildner enthielten, keine Besonderheiten festgestellt werden. Die mit Tiron versetzten Proben führen bereits nach sehr kurzer Lagerungsdauer zu einer intensiv rot gefärbten Lösung, die der im Alkalischen und durch Luftsauerstoff erfolgenden Oxidation von Tiron durch Luftsauerstoff zugerechnet wird. Eine, die Reinigungsexperimente ergänzende und wichtige Information, stellt die Stabilität der Komplexbildner und durch diese bedingt die der gesamten Reinigungslösung dar. Letztere wurde durch die titrimetrische Bestimmung der Konzentration von H2O2 ausgesuchter Reinigungslösungen bestimmt. Die Stabilität des Komplexbildners DEHP wurde stellvertretend für die ganze Gruppe (der einfachen Pyridinone) in verschiedenen, in der Halbleiterfertigung üblichen, alkalischen, H2O2 enthaltenden Reinigungslösungen untersucht. Die Stabilitätsbestimmungen von DEHP, ausgedrückt in Form dessen Halbwertszeit der Zersetzung in den Reinigungslösungen, wurden mit Hilfe der UV/Vis-Spektralphotometrie durchgeführt. Im Zuge der Stabilitätsbestimmungen wurde festgestellt, dass der Komplexbildner DEHP die Reinigungslösungen zwischen drei (im Fall von 1,65/1/5 TPM) bis vier (im Fall von ¼/20 SC1 und von 1,65/1/5 NC) Halbwertszeiten zu stabilisieren vermag. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass DEHP die niedrigste Halbwertszeit in Reinigungslösungen mit TMAH als Base und die höchste in solchen mit Cholin besitzt. Die in den ¼/20-SC1-Lösungen, also mit NH3 als Base, nimmt die mittlere Stellung der drei untersuchten Typen von Reinigungslösungen ein. Diese Abstufung der Stabilitäten wird einerseits dem individuellen komplexierenden Potential der einzelnen Basen als auch der von Cholin vermuteten Rolle, in der Reinigungslösung als Opferreduktionsmittel zu wirken und damit die Lebensdauer (Halbwertszeit) des Komplexbildners zu fördern, zugeordnet. Die UV/Vis-Spektralphotometrie hat sich darüber hinaus bei den Untersuchungen als einfach handhabbares und möglicherweise auch leicht automatisierbares Quantifizierungsverfahren zur Implementierung in bereits bestehende Reinigungsanlagen erwiesen.
Tumorerkrankungen, insbesondere solche im metastasierenden Stadium, erfordern effiziente Therapien. Krebstherapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie wirken über die Induktion von Apoptose. Resistenz gegen diese Behandlungsansätze geht einher mit der Blockierung relevanter apoptotischer Signalwege. Dennoch haben Tumorzellen nicht grundsätzlich die Fähigkeit verloren, apoptotischen Zelltod zu sterben, d. h. mit einem geeigneten Stimulus kann in jeder Tumorzelle Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit wurden Proteine entwickelt, die Enzyme apoptotischer Signalkaskaden selektiv in Tumorzellen einschleusen. Um Spezifität für transformierte Zellen zu erlangen, wurden diese Proteine mit Zellbindungsdomänen gekoppelt, die an tumorassoziierte Antigene binden. Als Zielstrukturen auf der Oberfläche von Krebszellen dienten die Rezeptoren der ErbB Familie „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und ErbB2. Überexpression dieser Rezeptoren wird auf einer Vielzahl von Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet und ist ursächlich beteiligt an der malignen Transformation. Als Apoptoseinduktoren wurden die Serinprotease Granzym B (GrB) sowie das Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) eingesetzt. GrB induziert Apoptose durch direkte Aktivierung von Caspasen und Spaltung zentraler Caspasen-Substrate. Damit greift die Protease am unteren Effektorende apoptotischer Signalwege ein und umgeht so die meisten Resistenzmechanismen transformierter Zellen. Um GrB in Tumorzellen einzuschleusen, wurde die Protease mit dem ErbB2 spezifischen Antikörperfragment scFv(FRP5) gekoppelt. Zunächst wurde eine biotinylierte Variante der Protease (bGrB) über die hochaffine Streptavidin/ Biotin Interaktion mit einem Fusionsprotein komplexiert, das aus dem scFv(FRP5) und Streptavidin besteht (SA-5). Komplexe aus enzymatisch aktivem bGrB und SA-5 wiesen selektive cytotoxische Aktivität gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen auf, die allerdings von der Präsenz des endosomolytischen Reagenz Chloroquin abhing. Dies zeigt die Notwendigkeit einer Translokation vom endosomalen Kompartiment, um internalisiertem GrB Zugang zu seinen cytosolischen Substraten zu ermöglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen, die grundsätzlich nachweisen, daß das Einbringen von GrB in Tumorzellen ausreichend ist, um in diesen Zellen Apoptose zu induzieren, wurden Fusionsproteine abgeleitet, in denen GrB direkt mit Zellbindungsdomänen fusioniert ist. Neben dem scFv(FRP5) wurde auch der EGFR-Ligand TGFalpha eingesetzt. Fusionsproteine bestehend aus reifem GrB und scFv(FRP5) (GrB-5) bzw. TGFalpha (GrB-T) wurden in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und mit hohen Ausbeuten gereinigt. GrB-5 und GrB-T zeigten enzymatische Aktivität und wiesen Affinität zu ErbB2 bzw. EGFR auf. In Gegenwart von Chloroquin zeigten GrB-5 und GrB-T selektive cytotoxische Aktivität gegenüber Zellen, die den jeweiligen Zielrezeptor exprimieren. Die IC50 Werte der Proteine lagen im pico- bis nanomolaren Bereich und sind damit vergleichbar mit denen rekombinanter Immun- bzw. Wachstumsfaktortoxine, die Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa als Effektor nutzen. Induktion von Apoptose erfolgte durch GrB-5 und GrB-T allerdings deutlich schneller (3 h) als durch ETA Fusionsproteine (72 h), da GrB im Gegensatz zu ETA direkt in apoptotische Signalkaskaden eingreift. Um die weitere Charakterisierung von GrB-5 und GrB-T zu erleichtern, wurden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten für eine Optimierung der Expression dieser Fusionsproteine in Hefe untersucht. Dazu wurde eine Strategie entwickelt, die auf der Beobachtung beruht, daß die Löslichkeit und Stabilität von Proteinen durch Fusion mit solchen Domänen erhöht werden kann, die selbst eine hohe Löslichkeit und Stabilität besitzen. Ein Protein mit diesen Eigenschaften ist das Maltose Bindungsprotein (MBP) aus E. coli. In dieser Arbeit wurde MBP bei der Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris eingesetzt, um die Ausbeute löslicher Proteine zu steigern. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, MBP posttranslational in vivo vom Fusionspartner zu trennen. Hierzu wurde eine Erkennungssequenz der Protease Furin (furS) zwischen MBP und Fusionspartner eingefügt. Zunächst wurde untersucht, ob GrB als MBP Fusionsprotein in enzymatisch aktiver Form exprimiert werden kann, was eine Grundvoraussetzung für die Expression tumorspezifischer GrB Fusionsproteine in diesem System darstellt. Die Ausbeute von GrB konnte durch diese Strategie erheblich gesteigert werden. Daneben war eine vollständige Prozessierung der Fusionsproteine innerhalb der Furin-Erkennungssequenz nachweisbar. Als MBP Fusionsprotein exprimiertes GrB wies allerdings keine enzymatische Aktivität auf. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das terminale Serin der furS-Sequenz, das nach Spaltung durch Furin am N-Terminus von GrB zurückbleibt, die enzymatische Aktivität der Serinprotease inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nicht weiter versucht, die Ausbeute an tumorspezifischen GrB Fusionsproteinen durch Fusion mit löslichen Proteindomänen zu erhöhen. Für Proteine, die ein N-terminales Serin tolerieren, stellt das hier entwickelte System allerdings eine neuartige Strategie dar, um die Ausbeute in P. pastoris um ein Vielfaches zu steigern. Dies wurde anhand von rekombinantem ErbB2 als Modellprotein bestätigt. Als alternativer Effektor in tumorspezifischen Fusionsproteinen wurde AIF als caspasenunabhängig agierendes proapoptotisches Signalmolekül eingesetzt. In apoptotischen Zellen bewirkt die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum die nachfolgende Translokation des Proteins in den Zellkern, woraufhin DNA-Fragmentierung induziert wird. Zum Einschleusen von AIF in Tumorzellen wurde das Flavoprotein mit dem scFv(FRP5) fusioniert (5-AIF). Um eine cytosolische Translokation von AIF zu erreichen, wurde ein Konstrukt abgeleitet, das zusätzlich die Translokationsdomäne von Exotoxin A enthält (5-E-AIF). Diese Domäne ist beim Wildtyp-Toxin notwendig für dessen retrograden Transport vom Endosom über den Golgi Apparat und das ER in das Cytosol. Innerhalb der Translokationsdomäne findet zudem eine Prozessierung durch die endosomale Protease Furin statt. AIF Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und renaturiert. Die Proteine wiesen Affinität für ErbB2 auf und interagierten mit DNA, eine Eigenschaft, die essentiell für die proapoptotische Aktivität von AIF ist. 5-E-AIF zeigte gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen cytotoxische Aktivität, die vergleichbar mit der des Immuntoxins scFv(FRP5)-ETA war. Diese Aktivität war allerdings nur in Gegenwart von Chloroquin gegeben. Das Protein 5-AIF, in dem die Translokationsdomäne fehlt, zeigte auch in Kombination mit Chloroquin keine Cytotoxizität. Eine mögliche Folgerung hieraus ist, daß die N-terminale Antikörperdomäne der Fusionsproteine die proapoptotische Aktivität der AIF Domäne blockiert. 5-E-A wird sehr wahrscheinlich durch die endosomale Protease Furin „aktiviert“, die den scFv(FRP5) durch proteolytische Spaltung innerhalb der ETA-Domäne entfernt haben könnte. Für die eigentliche Translokation reicht der ETA-Anteil allerdings nicht aus, wahrscheinlich, weil in dem hier abgeleiteten Konstrukt ein für die Funktionsweise des Wildtyp-Toxins essentielles ER Retentionssignal fehlte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß durch Einsatz apoptotischer Signalmoleküle in tumorzellspezifischen Fusionsproteinen hohe und selektive cytotoxische Aktivitäten erzielt werden können. Eine weitere Entwicklung dieser Proteine als mögliche Tumortherapeutika erscheint daher sinnvoll.