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Tumor hypoxia and nutrient starvation are common phenomena in cancerous tissue. Cells that resist this hostile environment are selected for a more aggressive phenotype, usually accompanied by therapy resistance. The hypoxia inducible factors HIF-1a and HIF-2a play a key role in the adaptive homeostatic responses to these challenging conditions inducing a number of target genes that are involved in the regulation of a variety of cellular processes such as angiogenesis, proliferation, metabolism, self-renewal and cell death/cycle arrest. Thus, the HIF pathway encompasses opposing adaptive responses on tumor growthgrowth promoting abilities on the one hand and growth inhibiting on the other. A recent study in our lab uncovered that this switch between cell death and cell survival critically depends on HIF-2a protein levels. Since PHDs (HIF prolyl hydroxylases) are the main regulators of HIF protein abundance and hypoxia drives the malignant phenotype of tumors, we wanted to characterize HIF regulatory functions of PHDs under hypoxic conditions. Our intention was to reveal the importance of PHD contribution to the opposing functions of HIFs under hypoxia. Characterization of PHD1-4 mRNA and protein expression levels under normoxic and hypoxic conditions in glioblastoma cell lines led to the identification of PHD2 and PHD3 as hypoxia inducible PHD isoforms and highlighted their predominant function under hypoxia. Mechanistically, we demonstrated that HIF mediates the hypoxic induction of PHD2 and 3 within a negative feedback loop, promoting its own degradation during prolonged hypoxia. The functional impact of PHD2 and 3 abundance on cell viability under hypoxic conditions was analyzed by disrupting PHD2 and PHD3 function either through a siRNA mediated approach or by application of the PHD inhibitor DMOG. These experiments uncovered that PHD2 and 3 are protective under hypoxic conditions and that PHD inhibition expedites cell death. Combined HIF and PHD suppression under hypoxic conditions abrogated this increased susceptibility to cell death, clearly showing that PHD2 and 3 act in a negative feedback regulatory loop to limit the HIF response under prolonged hypoxia. With respect to possible future therapeutical applications we co-treated cells with a PHD inhibitor and pro-apoptotic agents staurosporine or TRAIL. Co-challenging tumor cells even potentiated the cell death response, indicating a more widespread protective function of PHD. Taken together PHD2 and 3 protect tumor cells from cell death induction, functioning in a negative feedback regulatory loop to constrain the HIF dependent cell death responses under hypoxia. Interestingly, however, when assessing the role of PHD2 and PHD3 in in vivo tumor growth using an intracranial tumor model, we identified an exclusive tumor suppressor function for PHD3. Loss of PHD3 function enhanced tumor growth whereas increased PHD3 expression diminished the tumor burden. The accelerated tumor growth following PHD3 loss could be attributed to a decrease in the induction of apoptosis and an increase in proliferation. Tumor cells are frequently exposed to temporary and spatial depletion of nutrients. Interestingly, PHD3 loss conferred a growth advantage under growth factor deprivation. The growth regulatory function of PHD3 was isoform specific, HIF independent and importantly, did not require the hydroxylase function of PHD3. Previous reports have uncovered a regulatory function of the PHD system in NF-kB signaling. However, our results demonstrated that NF- kB signaling remained unaffected by alteration in the PHD3 status of the cell. Additionally, the PHD3 tumor suppressor function proved to be independent of two putative PHD3 downstream effectors, ATF4 and KIF1Bb. Mechanistically, PHD3 suppression reduced EGFR internalization, enhancing the amount of EGFR expressed on the cell surface. We further showed that the impaired EGFR internalization during PHD3 loss resulted in receptor hyperactivation under stimulated and growth factor deprived conditions. Importantly, PHD3 physcially associated with the EGFR complex as evidenced by co-immunoprecpitation. Consequently, this extended EGFR activation in PHD3 deficient cells resulted in enhanced downstream activation of EGFR signaling and increased proliferation. Consistent with the interpretation that PHD3 loss is beneficial for tumor growth, we found PHD3 promoter methylation in glioblastoma cell lines, hinting at a epigenetic mechanism to finetune PHD3 expression on top of the hypoxic driven gene regulation. Finally, we demonstrated that PHD3 tumor suppressor function is not restricted to glioblastomas since PHD3 suppression in lung adenocarcinoma accelerated subcutaneous tumor growth. With these findings, we expand the knowledge of PHD3 action from its oxygen sensing role to a regulatory function in growth factor signaling. This clearly discriminates PHD3 from the other isoforms and supports the exclusive tumor suppressor function in glioblastoma. Taken together our results identify a complex role of PHD signaling in cancer and delineate HIF dependent and HIF independent functions of the PHD system. We think that the HIF dependent protective effect of PHD2 and 3 and the HIF independent PHD3 tumor suppressor function are not mutually exclusive, but might be activated according to the heterogeneous intra-tumoral conditions. However, PHD3 hydroxylase activity is dispensable for its HIFindependent tumor suppressor function in glioma. This uncouples PHD3 function from co-factor and co-substrate requirements and allows it to act over a broader physiological range, since its influence on cellular processes is not constrained by the availability of rate limiting factors. It might explain, why the enzymatic independent functions of PHD3 predominate in vivo. Thus, therapeutic modulation of the PHD system to inhibit tumor growth has to be based on these contrasting functions of the PHD system. However, their differential dependence on the hydroxylase activity may facilitate a therapeutic strategy to specifically inhibit or promote the protective versus suppressive functions of the PHD system.
Primäre Hirntumore des Zentralen Nervensystems (gehen aus Nervenzellen, Gliazellen, Hirnhäute (Meningen) und auch Hirngefäße aus. Das anaplastische Astrozytom, Oligodendrogliom und Oligoastrozytom (WHO-Grad III) und auch die bösartigste Form, das Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV) bilden den wesentlichen Anteil der astrozytären Tumoren. Bedingt durch die ungünstige Prognose für Patienten mit Glioblastomen bedarf es einer Optimierung der therapeutischen Maßnahmen. Die momentane Therapie besteht nach Konstitution des Patienten und der Lokalisation des Tumors meist aus der Operation mit angeschlossener Strahlen- und eventueller adjuvanten Chemotherapie. Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Faktoren, wie der Ausbreitung und der Lokalisation des Tumors und hat sich in den letzten Jahren leider nur unwesentlich verbessert, da immer noch von einer medianen Überlebenszeit des Patienten zwischen 8 und 15 Monaten im Falle eines Glioblastoms ausgegangen werden kann. Die Entstehung und Progression von malignen Tumorerkrankungen sind eng mit Störungen und Defekten in Signalwegen, die das Zellüberleben und den Zelltod regulieren, verknüpft. Aberrationen, wie die Blockade von Tumorsuppressorgenen, oder die Aktivierung bzw. Überexpression von Onkogenen, führen zur veränderten Expression von Zelltod-inhibitorischen Genen wie den anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedern, und letztendlich zu Abweichungen der normalen zellulären Homöostase. Veränderungen dieser Art bewirken, dass Tumorzellen die Fähigkeit erhalten, unkontrolliert zu proliferieren, infiltrativ zu wachsen und eine eigene Vaskularisierung zu initiieren. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Apoptose- und Zelltodresistenz, die maßgeblich durch die stark erhöhte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit stand daher die Fragestellung im Mittelpunkt, inwieweit anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie zur Resistenz von malignen Gliomzellen gegen die Apoptose und den autophagischen Zelltod beitragen und wie diese Mechanismen gezielt überwunden werden können. Die Blockade der vier Familienmitglieder der Bcl-2-Subfamilie (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w) wurde über den Einsatz von spezifischen Inhibitoren, den sogenannten BH3-Mimetika, vermittelt. BH3-Mimetika besitzen eine hohe Affinität zur Bindungstasche der Bcl-2-Proteine, wobei durch die Bindung eine Blockade des Proteins hervorgerufen wird. Die eingesetzten BH3-Mimetika haben unterschiedliche Bindungsprofile und können daher ein, zwei oder mehrere Proteine der Bcl-2-Familie inhibieren. Die verwendeten Inhibitoren BH3I-2, HA14-1 und ABT-737, die nur eine limitierte Wirkung auf den Zelltod von Gliomzellen entfalteten, sind allesamt nicht in der Lage, Mcl-1 zu blockieren. Deshalb wurde zusätzlich ein Pan-Bcl-2-Inhibitor, das (-)-Gossypol, verwendet. Dieser Inhibitor hemmt alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, und steigerte über die Inhibition und Degradation von Mcl-1 effizient den Zelltod von Gliomzellen. Dagegen zeigte die (-)-Gossypol-Behandlung in nicht transformierte Astrozytenkulturen keine zytotoxischen Effekte. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass durch das BH3-Mimetikum (-)-Gossypol ein autophagischer Zelltod induziert wird. Unter der Verwendung eines charakteristischen Markerproteins, dem LC3-Protein, konnte nach Induktion des nicht-apoptotischen, autophagischen Zelltodes durch (-)-Gossypol eine Translokation von GFP-LC3 in die Autophagosomen und Autolysosomen festgestellt werden. Viele Gliome weisen eine Methylierung des MGMT-Promotors auf, die es den Zellen erschwert, schnell DNA-Schäden zu reparieren. Aufgrund dieser Methylierung sind diese Tumoren sensitiv für eine Behandlung mit alkylierenden Substanzen (Temozolomid). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden die kombinatorischen Effekte von BH3 Mimetika und Temozolomid in MGMT-positiven (U87) und MGMT-negativen (U343) Gliomzelllinien verglichen, wobei sich lediglich in MGMT-negativen U343-Gliomzellen signifikante, kombinierte Effekte ergaben. Dieser Zelltod war mit einer Potenzierung der Autophagie assoziiert, nicht jedoch mit einer Aktivierung von Caspasen und einer lysosomalen Dysfunktion. Die Depletion des endogenen Autophagieinhibitors mTOR bewirkte nach den Behandlungen mit (-)-Gossyol und TMZ einen zusätzlichen zytotoxischen Effekt. Im Gegensatz dazu wurde durch lentivirale RNA-Interferenz gegen die Autophagiegene ATG5 und Beclin1 eine potente Reduktion der zellulären Autophagie und des autophagischen Zelltodes erreicht. Insgesamt unterstreichen diese Daten die zentrale Rolle von Bcl-2 Proteinen für die Regulation der Autophagie und legen nahe, dass durch (-)-Gossypol und (-)-Gossypol in Kombination mit Temozlomid in Gliomzellen zytotoxische Autophagie induziert wird.
Wastewater treatment plants (WWTPs) do not eliminate micropollutants completely and are thus important point sources for these substances. In particular, concerns about en-docrine disrupting compounds in WWTP effluents give rise to the implementation of advanced treatment steps for the elimination of trace organic contaminants. The present study investigated ozonation (O3) and activated carbon treatment (AC) at two WWTPs. For an ecotoxicological assessment at WWTP Regensdorf, conventionally treated wastewater, wastewater after ozonation, and ozonated wastewater after sand filtration were evaluated in parallel via the fish early life stage toxicity test (FELST) using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Additionally, a comparative toxicity evalu-ation of ozonated and activated carbon treated effluents was performed at the pilot scale treatment plant in Neuss (WWTP Neuss). For this purpose, four invertebrate tests and one higher plant toxicity test were selected to assess potential biological effects on or-ganisms [Lemna minor growth inhibition test, chironomid toxicity test with Chironomus riparius, Lumbriculus variegatus toxicity test, comet assay with haemolymph of the zebra mussel (Dreissena polymorpha), reproduction test with Potamopyrgus antipo-darum]. All in vivo assays were performed on site at the treatment plants in flow-through test systems. Furthermore, the present study investigated the effects of ozona-tion and activated carbon treatment on endocrine activities [estrogenicity, anti-estrogenicity, androgenicity, anti-androgenicity, aryl-hydrocarbon receptor (AhR) agonistic activity] with yeast based bioassays using solid phase extracted water samples. To evaluate the removal of in vitro non-specific toxicity, a cytotoxicity assay using a rat cell line was applied. The FELST at WWTP Regensdorf revealed a considerable developmental retardation of test organisms exposed to ozonated WW. This was accompanied by a significant decrease in body weight and length compared to reference water, to the conventionally treated WW, and to the ozonated water after sand filtration. Hence sand filtration obvi-ously prevents from adverse ecotoxicological effects of ozonation. An additional test – starting with yolk-sac larvae – resulted in a significant reduction of vitellogenin levels in fish exposed to ozonated wastewater compared to fish reared in conventionally treat-ed wastewater. This demonstrates the effective removal of estrogenic activity by ozonation. At WWTP Neuss, the reproduction test with the mudsnail P. antipodarum exhibited a decreased reproductive output after advanced treatment compared to conventional treatment. This indicates an effective estrogenicity removal by ozonation and activated carbon treatment and is confirmed by results of the yeast estrogen screen with a reduc-tion of in vitro estrogenic activity by > 75%. The L. variegatus test revealed a signifi-cantly enhanced toxicity after ozonation compared to conventional treatment, whereas this effect was reduced following subsequent sand filtration. When ozonation was applied, a significantly increased genotoxicity was observed, detected with the comet assay using haemolymph of the zebra mussel. Again, this effect was removed by subsequent sand filtration to the level of conventional treatment. Activated carbon treatment even resulted in a significant reduction of genotoxicity. At both treatment plants, adverse effects after ozonation may have been a result of the formation of toxic oxidation by-products. However, sand filtration reduced toxication effects, indicating that these oxidation by-products are readily degradable or adsorbable. The results point out that, in any case, ozonation should not be applied without subsequent biologically active post treatment appropriate for oxidation by-products removal (e.g. sand filtration). However, only activated carbon achieved a toxicity reduction compared to the conventional treated wastewater. Thus, it cannot be excluded that po-tential beneficial effects due to ozonation might be masked by residual toxic oxidation by-products passing the sand filter or ozonation is not as effective in toxicity removal as PAC treatment. The yeast based assays with solid phase extracted samples revealed an effective endo-crine activity removal during ozonation and activated carbon filtration (estrogenicity: 77 – 99%, anti-androgenicity: 63 – 96%, AhR agonistic activity: 79 – 82%). The cyto-toxicity assay exhibited a 32% removal of non-specific toxicity after ozonation com-pared to conventional treatment. Ozonation in combination with sand filtration reduced cytotoxic effects by 49%, indicating that sand filtration contributes to the removal of toxicants. Activated carbon treatment was the most effective technology for cytotoxici-ty removal (61%). Sample evaporation reduced cytotoxic effects by 52% (after activated carbon treatment) to 73% (after ozonation), demonstrating that volatile substances contribute considerably to toxic effects, particularly after ozone treatment. These results confirm an effective removal or transformation of toxicants with receptor mediated mode of action and non-specific toxicants during both investigated treatment steps. However, due to the limited extractability, polar ozonation by-products were neglected for toxicity analysis, and hence non-specific toxicity after O3 is underestimated. In the long run, only on-site comparisons at WW receiving water bodies (e.g. communi-ty analysis of fish, macroinvertebrates, plants, microorganisms) – before and after up-grading WWTPs – allow drawing environmentally relevant conclusions regarding bene-fits and risks of advanced WW treatment methods. Conclusively, the benefits and possible negative impacts have to be carefully evaluated to prove that not more environmental impact will be induced than removed by advanced treatment technologies as each additional treatment requires considerable amounts of energy, resources, and infrastructure facilities. Accordingly, comprehensive sustainable approaches for pollution prevention and wastewater treatment (e.g. source control and source separation) are preferable compared to end-of-pipe treatment systems.
Feral cats (Felis catus), introduced into Australia with European settlers in the 19th century, colonized the entire Australian continent in less than 100 years, including the Australian arid zone which covers more than 70% of the continent. Feral cats are responsible for the decline and extinction of a number of native species and the failure of a number of reintroduction attempts, especially in the arid zone. Many ecological studies on feral cats have been conducted on home range size and movement patterns in different environments, abundance and diet, with the aim of gaining a better understanding about their successful invasion of the Australian continent. There are no physiological studies on the feral cat to date. However, there is evidence that there is a strong interrelation between physiology and abiotic factors such as climate. Thus, distribution, habitat, and dispersal of species can not fully be understood without background knowledge of physiology. This PhD aims to contribute to a better understanding of three physiological parameters: metabolism, body mass and body temperature patterns. These parameters may possibly identify physiological adaptation to different climate zones, seasonal conditions and island isolation.
Die Bedeutung verschiedener CRASP-Proteine für die Komplementresistenz von Borrelia burgdorferi s.s.
(2010)
Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Immunevasion von B. burgdorferi s.s., insbesondere der Bedeutung einzelner CRASP-Proteine für die Komplementresistenz. Sie trägt dazu bei, die Relevanz dieser Proteine für die Pathogenese dieses Erregers zu untermauern. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, verschiedene Vektoren mit den ursprünglichen oder mutierten CRASP-kodierenden Genen cspA, cspZ, erpP und erpA aus B. burgdorferi s.s. zu generieren und diese in das CRASP-negative Isolat B. garinii G1 zu transformieren. Die Expression der speziesfremden Gene als auch der Transport der CRASP-Moleküle auf die Zelloberfläche von B. garinii G1 konnten nachgewiesen werden. Für die konstitutiv CRASP-1- oder CRASP-2-produzierenden Borrelienzellen konnte gezeigt werden, dass diese, auf der Zelloberfläche lokalisierten CRASP-Moleküle mit Faktor H und FHL-1 interagieren, die gebundenen Komplementregulatoren ihre funktionelle Aktivität zur C3b-Inaktivierung aufrechterhalten und die Zellen in Gegenwart von Komplement überleben. Damit wurde erstmals der Nachweis erbracht, dass beide CRASP-Moleküle unabhängig voneinander Schutz vor komplementvermittelter Lyse verleihen. Untersuchungen mit den veränderten CRASP-1-Molekülen ergaben, dass die Transformante G1/pCRASP-1 E147K eine verringerte Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, welche sich jedoch nicht auf die Komplementresistenz der Zellen auswirkte. Im Gegensatz dazu führte eine Aminosäuresubstitution im C-Terminus des CRASP-1-Moleküls an Position 240 zum Verlust der Bindung von Faktor H und einer stark verminderten Bindung von FHL-1, so dass auch keine Kofaktoraktivität nachgewiesen werden konnte. Trotz des Bindungsverlustes beider Komplementregulatoren zeigte die Transformante G1/pCRASP-1 Y240A nur geringe Ablagerungen des lytischen, terminalen Komplementkomplexes (TCC) auf der Zelloberfläche und Wachstum in Gegenwart von aktiven Komplement. Mittels eines Hämolyse-Assays wurde schließlich festgestellt, dass CRASP-1 direkt mit Komponenten des Komplementsystems interagiert und dadurch die Assemblierung des TCC verhindert. Die Bedeutung der Aminosäuren an den Positionen 81, 139, 207 und 211 im CRASP-2-Molekül für die Faktor H / FHL-1-Bindung und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Komplementresistenz der Borrelien wurde gleichfalls nachgewiesen. Dabei wies insbesondere die Transformante G1/pCRASP-2 Y211A ein inhibiertes Wachstum in Humanserum und verstärkt Komplementablagerungen auf der Zelloberfläche auf, was auf den Verlust bzw. der sehr schwachen Bindung von FHL-1 und Faktor H zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Transformanten, welche ein CRASP-2-Molekül mit nur einem Aminosäureaustausch produzierten, zeigten die Transformanten, deren CRASP-2-Molekül zwei Aminosäuresubstitutionen aufwies (G1/pCRASP-2 R139A-Y207A, G1/pCRASP-2 R139A-Y211A, G1/pCRASP-2 Y207A-Y211A) keine Bindung der beiden Regulatorproteine und keinen Schutz der Zellen vor der lytischen Wirkung von Komplement. Neue, unerwartete Erkenntnisse ergaben sich aus den Untersuchungen mit Borrelienzellen, welche das CRASP-3- oder CRASP-5-kodierende erpP- bzw. erpA-Gen enthielten. Obwohl gereinigtes als auch denaturiertes CRASP-3 und RASP-5 in der Lage war, Faktor H zu binden, wiesen die vitalen Zellen der Transformanten G1/pCRASP-3 und G1/pCRASP-5 keine Bindung von Faktor H und keinen Schutz der Zellen vor komplementvermittelter Lyse auf. Aus den durchgeführten Untersuchungen konnten für gereinigtes CRASP-3 und CRASP-5 als auch für die CRASP-3- und CRASP-5-produzierenden Transformanten neue Liganden, nämlich CFHR-2 und CFHR-5, aus Humanserum identifiziert werden. Zusammenfassend lassen sich folgende Aussagen hinsichtlich des molekularen Mechanismus der Komplementresistenz bei B. burgdorferi s.s. aus den erhobenen Daten dieser Arbeit mit transformierten Borrelienzellen formulieren: *Die Komplementresistenz der Borrelien wird durch die Faktor H- und FHL-1-bindenden Proteine CRASP-1 und CRASP-2, jedoch nicht durch CRASP-3 und CRASP-5 determiniert, *CRASP-1 als multifunktionelles Protein ist zusätzlich in der Lage, direkt mit Komplement zu interagieren, *Die C-terminalen Domänen von CRASP-1 und CRASP-2 sind für die Bindung der beiden Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 relevant, *CRASP-3 und CRASP-5 auf der Borrelienoberfläche lokalisiert, interagieren mit CFHR-1, CFHR-2 und CFHR-5, aber nicht mit Faktor H.
Therapy of hemorrhagic shock with following resuscitation-induced liver injury : in vivo study
(2010)
Shock resulting from life-threatening blood-loss (hemorrhagic shock) represents the most frequent injury pattern after a traumatic insult. Hemorrhagic shock induces inflammatory changes, characterized by highly complex pathophysiological pathways often resulting in death. In this study, we establish an experimental in vivo model of H/R in rats and study the mechanisms which determine the hepatic injury after H/R. Furthermore, we show that hemorrhagic shock with following resuscitation is accompanied with release of systemic and local pro-inflammatory mediators, increased infiltration of hepatic neutrophils in the liver, increased oxidative and nitrosative stress, enhanced cell death of both types, apoptosis and necrosis, conspicuous cytoskeletal rearrangements, loss of hepatic integrity and finally high general mortality rates, up to 80%. In addition, the effects of two potential therapeutic interventions to prevent the H/R induced liver injury are explored in a model of H/R in rats. First, the role of JNK and its inhibition by D-JNKI-1 in preservation of hepatic integrity following H/R was analyzed. Second, we investigated the potential of simvastatin to prevent the disturbed inflammatory response and hepatic injury after H/R. The effects of both therapeutic interventions were studied by looking at several inflammatory parameters, markers of oxidative and nitrosative stress, cytoskeleton integrity, microcirculatory parameters, underlying signaling cascades, liver damage and mortality. Highly specific blockade of JNK with the potent, inhibitory peptide D-JNKI-1 revealed the crucial role of the JNK signaling pathway in the H/R induced pathophysiology and strong protective effects of DJNKI- 1 in H/R induced liver injury, when the peptide was applied before and even after hemorrhagic shock. The other therapeutic intervention tested in this study was the use of simvastatin which also revealed protective effects after H/R and even a remarkable improvement in survival after H/R. We show that H/R induced release of pro-inflammatory cytokines, hepatic PMNL infiltration, increased oxidative and nitrosative stress, apoptosis and necrosis can be diminished by treatment with D-JNKI-1 but also with simvastatin in vivo. Furthermore, simvastatin reduces H/R induced cytoskelatal rearrangements, loss of liver integrity and the mortality rate after H/R. The key pathway which underlies these beneficial effects of simvastatin is the Rho kinase pathway. Identification of both mechanisms as well as the effectiveness of both substances provide new insights in the close interaction between hypoxia and the immune system and present a promising basis for the anti-inflammatory, hepatoprotective treatment after H/R.
Iron uptake is an essential process in all Gram-negative bacteria including cyanobacteria and therefore different transport systems evolved during evolution. In cyanobacteria, however, the iron demand is higher than in proteobacteria due to the function of iron as cofactor in e.g. photosynthesis and nitrogen fixation. Most of the transport systems depend on outer membrane localized TonB-dependent transporters (TBDTs), a periplasma-facing TonB protein and a plasma membrane localized machinery (ExbBD). So far, iron chelators (siderophores), oligosaccharides and polypeptides have been identified as substrates of TBDTs. However, in proteobacteria TonB-dependent outer membrane transporter represent a well-explored subject whereas for cyanobacteria almost nothing is known about possible TonB-dependent uptake systems for iron or other substrates. The heterocyst-forming filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 is known to secrete the siderophore schizokinen, but its transport system has remained unidentified. For Anabaena sp. PCC 7120 22 genes were identified as putative TBDTs covering almost all known TBDT subclasses. This is a high number of TBDTs compared to other cyanobacteria. The expression of the 22 putative TBDTs individually depends on the presence of iron, copper or nitrogen. The atypical dependence of TBDT gene expression on different nutrition points to a yet unknown regulatory mechanism. In addition, the hypothesis of the absence of TonB in Anabaena sp. PCC 7120 was clarified by the identification of an according sequence, all5036. Inspection of the genome of Anabaena sp. PCC 7120 shows that only one gene encoding a putative TonB-dependent iron transporter, namely alr0397, is positioned close to genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of a hydroxamate siderophore. The expression of alr0397 was elevated under iron-limited conditions. Inactivation of this gene caused a moderate phenotype of iron starvation in the mutant cells. The characterization of the mutant strain showed that Alr0397 is a TonB-dependent schizokinen transporter (SchT) of the outer membrane and that alr0397 expression and schizokinen production are regulated by the iron homeostasis of the cell. Additional two genes of Anabaena sp. PCC 7120 involved in this process were identified. SchE encoded by all4025 is a putative cytoplasmic membrane-localized transporter involved in TolC-dependent siderophore secretion. The mutation of schE resulted in an enhanced sensitivity to high metal concentrations and in drastically reduction of secretion of hydroxamate-type siderophores. IacT coded by all4026 is a predicted outer membrane-localized TonB-dependent iron transporter. Inactivation of iacT resulted in reduced sensitivity to elevated iron and copper levels, whereas decoupling the expression from putative regulation by exchange of the promoter resulted in sensitization against tested metals. Further analysis showed that iron and copper effects are synergistic because decrease of iron induced a significant decrease of copper levels in the iacT insertion mutant but an increase of those levels in Anabaena sp. PCC 7120 where expression of all4026 is under the trc-promoter. In consequence, the results unravel a link between iron and copper homeostasis.
Die Gattung Palaua gehört zur Tribus der Malveae (Malvaceae, Malvoideae). Sie umfasst fünfzehn einjährige oder ausdauernde krautige Arten, die für die Nebeloasen („Lomas“, „Desierto Florido“) der Küstenwüste Perus und Chiles endemisch sind. Abweichend von den meisten anderen Gattungen der Malveae besitzt Palaua (mit Ausnahme von P. sandemanii) unregelmäßig übereinander angeordnete Merikapien. Dieses Merkmal ist ansonsten nur von den beiden altweltlichen Gattungen Kitaibela und Malope bekannt, weshalb diese früher mit Palaua in der Tribus Malopeae vereint wurden. Palynologische, cytogenetische und molekulare Analysen zeigten jedoch, dass die Malopeae eine polyphyletische Gruppe bilden und dass die in Südamerika verbreiteten Gattungen Fuertesimalva und Urocarpidium die nächsten Verwandten von Palaua sind. Ebenso wie im Aufbau des Gynözeums unterscheidet sich Palaua auch durch das Fehlen eines Epicalyx vom Großteil der Malveae, einschließlich ihrer Schwestertaxa. Seit der Erstbeschreibung der Gattung durch Cavanilles im Jahr 1785 sind nur zwei detaillierte Bearbeitungen der Gattung Palaua veröffentlicht worden. Die umfassendste davon stammt von Ulbrich (1909). Auf der Grundlage der umfangreichen Aufsammlungen von August Weberbauer beschrieb er mehrere neue Arten in seinem Werk „Malvaceae austro-americanae imprimis andinae“, das er in nachfolgenden Jahren (1916, 1932) vervollständigte. Die zweite bedeutsame Bearbeitung ist die Revision der Gattung durch Macbride (1956) in der „Flora of Peru“. Seit den 50er Jahren des vorherigen Jahrhunderts kamen jedoch zahlreiche Aufsammlungen hinzu, insbesondere durch den peruanischen Botaniker Ramón A. Ferreyra (1912-2005), sowie durch Ernesto Günther (1870-?) zusammen mit Otto Buchtien (1859-1946), Gerd K. Müller (1929-) und Michael O. Dillon (1947-), so dass eine Neubearbeitung von Palaua erforderlich wurde. Darin bestand das Hauptziel der hier vorgestellten Dissertation. Für die Revision der Gattung wurden 618 Herbarbelege der wichtigsten Herbarien morphologisch untersucht. In den Jahren 2002 und 2003 wurden während mehrmonatiger Geländearbeiten in den Lomas-Standorten Perus und Chiles eigene botanische Aufsammlungen durchgeführt sowie Daten zur Verbreitung der Arten und ihrer Ökologie erfasst. Des Weiteren wurde aus dem mitgebrachten Samenmaterial eine mehrere Arten einschließende Lebendsammlung angelegt, mit deren Hilfe detaillierte Untersuchungen zur Blütenmorphologie und Karyologie realisiert werden konnten. Besonders schwierig gestaltete sich die Bearbeitung nomenklatorischer Fragestellungen, da viele der in Berlin (B) aufbewahrten Typusbelege von Weberbauer im Zweiten Weltkrieg zerstört wurden und somit eine Identifizierung vieler Arten problematisch war. Auch die Ermittlung des Typusbelegs der Gattung, den Cavanilles für seine Beschreibung vorliegen hatte, war mühsam. Neben dem Studium der Originalbelege und Protologe mussten auch die historischen Begebenheiten rekonstruiert und Reiseberichte zu den Aufsammlungen durchgesehen werden, um unter anderem den Holotypus der Gattung identifizieren zu können. Die eigenen taxonomischen Studien führten zur Festlegung von insgesamt 8 Lectotypen, 3 Epitypen and 2 Ikonotypen. Im Rahmen der morphologischen Untersuchungen wurden sämtliche taxonomisch relevanten Merkmale detailliert erfasst, einschließlich der verschiedenen Behaarungstypen. Neben den für die Malvaceen bekannten Sternhaaren, sind hier auch Drüsenhaare für Palaua beschrieben und charakterisiert worden. Die anatomischen Studien konzentrierten sich auf Blatt- und Samenmerkmale. Zusätzlich zu den morphologisch-anatomischen Studien wurden molekularsystematische Analysen durchgeführt. Zwei Methoden kamen dabei zur Anwendung: DNA-Sequenzierung und Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Letztere wurde eingesetzt, um insbesondere die Verwandtschaftsverhältnisse junger Taxa, die sich mit DNA-Sequenzdaten kaum auflösen lassen, zu rekonstruieren. In umfangreichen Versuchen stellte sich jedoch heraus, dass diese Methode keine reproduzierbaren Ergebnisse hervorbrachte, vermutlich bedingt durch den sehr hohen Polysaccharidgehalt der DNA-Template, wie es von Malvaceen her bekannt ist. Selbst die Erprobung zahlreicher Reinigungsschritte und –methoden ergab kein zufriedenstellendes Resultat. Für die phylogenetische Rekonstruktion wurden daher ausschließlich DNA-Daten verwendet, und zwar Kern-DNA (Internal Transcribed Spacer, ITS) und Plastiden-DNA (psbAtrnH Intergenic Spacer). Andere getestete Marker, wie z.B. die trnL-F-Region, wiesen zu wenig phylogenetisch informative Merkmale auf. Die morphologischen Analysen ergaben, dass Merkmale wie die Behaarung der Kelch- und Laubblätter, die Blattform und die Größe der Blüten besonders hilfreich für die Abgrenzung der Arten sind. Im Gegensatz zu anderen nah verwandten Gattungen ist die Form der Merikarpien in Palaua relativ uniform und daher als diakritisches Merkmal ungeeignet. Die Größe der Blüte nimmt in der Regel mit der Anzahl der Staubgefäße und Merikarpien zu. Die Palaua-Arten zeigen einige Anpassungen an ihren extrem trockenen Lebensraum. Die meisten Arten sind Annuelle und vollziehen eine rasche Entwicklung während der kurzen Zeit, in der ausreichend Feuchtigkeit verfügbar ist. Bei solchen Pflanzen findet man als Anpassung häufig eine Tendenz zur vermehrten Samenproduktion. In diesem Zusammenhang ließe sich auch die innerhalb des Verwandtschaftskreises ungewöhnliche Stellung der Merikarpien bei Palaua interpretieren, mit der es den Arten gelingt, mehr Samen als bei Arten mit einreihiger Merikarpienanordnung zu produzieren. Als weitere Anpassung findet man bei den ausdauernden Arten größtenteils eine sehr dichte Behaarung, wobei die Sternhaare mehrjähriger Arten wesentlich mehr Strahlen besitzen als die bei den einjährigen Arten. In der hier vorgestellten Revision der Gattung werden 15 Arten anerkannt: P. camanensis, P. dissecta, P. guentheri, P. inconspicua, P. malvifolia, P. modesta, P. mollendoensis, P. moschata, P. rhombifolia, P. sandemanii, P. tomentosa, P. trisepala, P. velutina, P. weberbaueri sowie die neu zu beschreibende P. spec. nov. Die morphologisch abweichende P. sandemanii wird aufgrund der molekularen Analysen ebenfalls zu Palaua gestellt. Die auch in der jüngeren Literatur meist als getrennte Arten aufgefassten P. concinna und P. moschata lassen sich nach Durchsicht des umfangreichen Materials nicht mehr als eigenständige Arten aufrechterhalten. Die vormals als chilenischer Endemit behandelte P. concinna wird hier in die Synonymie von P. moschata gestellt. Auch die peruanische P. micrantha var. hirsuta wurde in die Synonymie der zuvor rein chilenischen P. modesta verwiesen, was bedeutet, dass sich das Vorkommen von P. modesta nun auch auf Peru ausdehnt. Auf infraspezifischem Niveau wurden einige Varietäten und eine Form neu beschrieben, um die im Sammlungsmaterial vorhandene morphologische Variabilität besser zu gliedern. Das ist der Fall bei P. dissecta (2 Varietäten), P. tomentosa (1 Varietät), P. weberbaueri (1 Varietät) und P. mollendoensis (1 Form). Die neuen Taxa werden an anderer Stelle gültig publiziert. Die von Baker (1890) and Ulbrich (1909) gewählte infragenerische Klassifikation mit der Einteilung in die Sektionen Annuae (einjährige Arten) und Perennes (mehrjährige Arten) erweist sich als nicht haltbar. Weder die morphologischen noch die molekularen Daten bieten hierfür Unterstützung. Auch die von Hochreutiner (1956) vorgeschlagene Ausgliederung von P. trisepala als eigene Untergattung Rauhia, aufgrund des Vorkommens von lediglich drei statt fünf Kelchblättern, erscheint nicht sinnvoll. Abgesehen von ihrer reduzierten Kelchblattzahl (3 statt 5 Kelchblätter) ist diese Art morphologisch P. moschata und P. velutina sehr ähnlich. Die Aufstellung einer eigenen Untergattung würde die tatsächlichen Verwandtschaftsverhältnisse verwischen und vermutlich eine paraphyletische Einheit schaffen. Im Vergleich zur Anzahl der Kelchblätter sind Merkmale wie der Aufbau der Infloreszenzen, die Blütengröße und -farbe, sowie die Blattmorphologie (geteilte vs. ungeteilte Blätter) nützlicher für eine infragenerische Unterteilung. Die Form der Stipeln, die von Ulbrich (1909) für eine weitere Unterteilung seiner Sektionen verwendet wurde, ist weniger für eine infragenerische Gliederung als für die Abgrenzung mancher Arten geeignet. Formell wurde in der hiesigen Arbeit auf eine infragenerische Unterteilung verzichtet, da zunächst abgewartet werden soll, ob weiterführende molekularsystematische Untersuchungen nicht doch zu einer besseren Auflösung und auch Unterstützung der basalen Knoten der Palaua-Phylogenie führen. Andernfalls steht zu befürchten, dass wiederum künstliche Sippen geschaffen werden. Nichtsdestotrotz, sprechen die eigenen morphologischen und zum Teil auch die molekularen Daten für eine Gliederung der Gattung in drei taxonomische Einheiten (siehe unten). Die Ergebnisse der molekularen Analysen (kombinierte Analyse von ITS- und psbA-trnHSequenzen) ergaben drei mehr oder weniger gut gestützte Kladen innerhalb einer sehr gut gestützten monophyletischen Palaua. Interessanterweise bildeten die Arten P. inconspicua und P. modesta eine Klade (88% Jackknife-Unterstützung, JK), die die Schwestergruppe zu den restlichen Arten der Gattung darstellt. Beide Arten haben eine von der restlichen Gattung abweichende Blütenmorphologie (kleine Petalen, weniger Merikarpien) und die razemösen Infloreszenzen enthalten neben Einzelblüten in den Achseln der Trägblätter auch 2-4-blütige Teilinfloreszenzen, an denen die Blüten kein Tragblatt aufweisen. Die zweite Klade (JK 97%) beinhaltet die Arten des P. dissecta-Komplexes, dessen Arten sich durch tief geteilte Blätter und große, auffällig rosarot bis violett gefärbte Blüten mit zahlreichen Merikarpien auszeichnen. In der dritten Klade (JK 73%) bildet P. guentheri die Schwestergruppe zu den restlichen Arten. Die hier vereinten Arten sind durch den Besitz ungeteilter Blätter und meist großer, auffällig rosarot bis violett gefärbter Blüten mit zahlreichen Merikarpien gekennzeichnet. Eine Ausnahme bildet P. guentheri, die geteilte Blätter hat und von daher Übereinstimmungen mit den Arten um P. dissecta aufweist. Sie weicht jedoch von den Arten des P. dissecta-Komplexes aufgrund ihrer geringeren Blütengröße und der geringeren Merikarpienanzahl ab. Außerdem sind die Blätter meist stärker reduziert und weniger regelmäßig geteilt als jene. Allerdings bedarf die Stellung von P. guentheri innerhalb der Gattung noch einer eingehenderen Überprüfung mit zusätzlichen (molekularen) Daten, da die Unterstützung für diese Klade vergleichsweise moderat ausfällt. Interessanterweise schließt diese Klade auch die aberrante P. sandemanii ein. Eine phylogenetische Rekonstruktion der Karpellanordnung ergab, dass die einreihige Anordnung der Karpelle in P. sandemanii vermutlich sekundär in Palaua entstanden ist. Allerdings zeigten Hypothesentests (Templeton-Test, Shimodaira-Hasegawa-Test), dass die Datengrundlage nicht ausreichend robust ist, um auch die Alternativhypothese einer sekundären Entstehung der unregelmäßig übereinander angeordneten Karpelle, wie sie die restlichen Arten der Gattung kennzeichnen, zu verwerfen. Innerhalb der Integrifolia-Klade lassen sich außerdem zwei Gruppen von Arten morphologisch deutlich unterscheiden. Die erste Gruppe besteht aus den einjährigen P. malvifolia und P. rhombifolia, die sich durch ihr fast kahles Indumentum auszeichnen und in Nord- bis Zentral-Peru vorkommen. Die zweite Gruppe, gebildet von den ausdauernden P. moschata, P. trisepala und P. velutina, ist durch ein samtiges Indumentum gekennzeichnet. Während sich P. moschata über das gesamte Verbreitungsgebiet der Gattung erstreckt, kommen die anderen Arten nur in Südperu vor. Die Chromosomenzahl von Palaua ist ein wichtiges Merkmal und diente Bates (1968) für deren Zuordnung zur Sphaeralcea-Allianz. Bis dato sind Chromosomenzählungen nur für zwei Arten bekannt gewesen: P. rhombifolia und P. moschata (beide mit 2n = 10 Chromosomen). In dieser Arbeit wurden weitere Zählungen durchgeführt und es wurde bestätigt, dass es neben diploiden auch tetraploide Arten mit 2n = 20 Chromosomen gibt. Polyploidie scheint dabei auf die ausdauernden Arten beschränkt zu sein. In manchen Arten, insbesondere in denjenigen des P. dissecta-Komplexes und in P. tomentosa, findet man eine ausgeprägte phänotypische Variabilität, die die Abgrenzung derselben stark erschwert. Ohne die Ursachen abschließend klären zu können, erscheint diese Variabilität zumindest teilweise als Ergebnis von Hybridisierung, Introgression und Polyploidisierung zu sein. In Bezug auf die Biogeographie der Gattung, zeigt sich, dass 11 Palaua-Arten endemisch für Peru sind und 4 Arten auch in Chile vorkommen. Das Verbreitungszentrum von Palaua ist das Gebiet der Lomas im Süden Perus (Departments Arequipa, Moquegua, Tacna), in dem 12 der 15 Arten auftreten. Die Blütezeit der Palaua-Arten variiert von Jahr zu Jahr, abhängig davon, wie viel Nebelfeuchtigkeit in der südhemisphärischen Winter-/Frühlingszeit für die Pflanzen zur Verfügung steht. Die Entstehung der Nebel variiert außerdem von Norden nach Süden, so dass sich die Blühphasen entlang dieses Gradienten verschieben. So liegt die Blütezeit in Nordperu zwischen Juli und August, in Zentral-Peru zwischen August und September und in Südperu und Chile zwischen Oktober und November. Abweichungen von diesem Schema entstehen vor allem in El Niño-Jahren, in denen auch während des südhemisphärischen Sommers die Lomaspflanzen blühen. Die Lomasvegetation ist eine bedrohte Pflanzenformation, deren Artenvielfalt bisher aber nur in Form eines recht kleinen Naturreservats geschützt wird. Da sich viele Lomasstandorte in der Nähe von Siedlungen befinden, sind etliche der lokal nur begrenzt vorkommenden Arten in ihrem Bestand bedroht. Dies betrifft insbesondere P. rhombifolia und P. malvifolia, deren Verbreitungszentrum im Gebiet der Hauptstadt Lima liegt. Eigene Beobachtungen am Standort haben zudem bestätigt, dass einige Populationen dieser Arten durch von Käfern verursachter Herbivorie nahezu vollständig zerstört werden. Weitere Schutzmaßnahmen zum Erhalt der Palaua-Arten (wie auch der anderen Lomas-Arten) wären daher dringend geboten.
Im ersten Teil der Arbeit wurde eine genetische Disposition für Vorhofflimmern (VHF) untersucht. Der Einzelnukleotidpolymorphismus ("single nucleotide polymorphism", SNP) 38G/S befindet sich im N-Terminus der ß-Untereinheit KCNE1. Diese ß-Untereinheit konstituiert gemeinsam mit der alpha-Untereinheit KCNQ1 die langsame Komponente des verzögerten Gleichrichterstromes, IKs. Die ß-Untereinheit hat hierbei eine modulierende Funktion. Frühere Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit der transmembranären Domäne und dem C-Terminus. Über die Rolle des N-Terminus war bislang wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Aufgabe des N-Terminus bei der Modulation der alpha-Untereinheit zu identifizieren. Außerdem sollte festgestellt werden, welche Aminosäuren hierbei besonders von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden diverse Konstrukte synthetisiert. Für das Konstrukt delta1-38’ wurden die Aminosäuren 1-38 und damit der Großteil des N-Terminus entfernt. Das Konstrukt "linker" enthält anstelle des Glyzins oder Serins an Position 38 fünf Alanine. In der Nähe der von dem SNP betroffenen Aminosäure befinden sich des Weiteren drei Arginine, die mit jeweils einem Alanin substituiert wurden. Für alle Versuche diente die nicht VHF-assoziierte Variante des SNPs als Kontrolle. Alle Konstrukte konnten erfolgreich heterolog exprimiert werden und gleichermaßen mit der alpha-Untereinheit immunopräzipitiert werden. Die aus der Co-Transfektion von KCNQ1 und KCNE1 resultierende Stromdichte wurde mittels "Patch-clamp"-Technik untersucht. Im Vergleich zum Kontrollstrom (KCNQ1 + KCNE1-38S) waren die Ströme aller anderen Gruppen während De- und Repolarisation signifikant kleiner. Zellfraktionierung und konfokale Mikroskopie zeigten, dass im Vergleich zur Kontrolle alle anderen Konstrukte eine verminderte Plasmamembranlokalisation aufwiesen. Die Aufgabe des N-Terminus liegt offensichtlich im Transport beider Untereinheiten an die Plasmamembran und/oder der Verankerung dort. Sowohl die Aminosäure in Position 38 als auch die drei N-terminalen Arginine in der Nähe scheinen für den hier gesuchten Mechanismus von Bedeutung zu sein. Zukünftige Experimente könnten beispielsweise 3D-Simulationen der Proteinfaltung beinhalten, um die potentielle Membranverankerung weiter zu untersuchen. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte erworbene elektrophysiologische Veränderungen im Rahmen von VHF am Beispiel der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IKACh. Es sollten die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen für die Heraufregulierung von IK1 und IKACh bei VHF untersucht werden. Alle Experimente wurden an humanem Gewebe des linken Vorhofs durchgeführt. Das Gewebe stammt von VHF-Patienten, die sich einer Mitralklappen-Operation unterzogen. Als Kontrolle wurde Gewebe von Patienten im Sinusrhythmus (SR) verwendet. Zunächst wurde untersucht, ob transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Veränderungen oder funktionelle Effekte der Heraufregulierung der Ströme zugrunde liegen. Entsprechend wurde die Proteinexpression mittels Western Blot quantifiziert. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte per Realtime-PCR. Veränderungen für IK1 konnten sowohl auf mRNA- als auch auf translationaler Ebene beobachtet werden. Protein- und mRNA-Expression von Kir2.1, der zugrunde liegenden Proteinuntereinheit, waren bei VHF signifikant erhöht; die Expression der inhibitorischen miR-1 war reduziert. Die Bestimmung der Protein- und mRNA-Expression der zugrunde liegenden Proteinuntereinheiten für den Strom IKACh zeigte dagegen keinen Unterschied zwischen Gewebe von Patienten mit VHF und SR. Eine funktionelle Regulierung schien daher möglich. Die Expression der IKACh modulierenden Proteine Calmodulin und G alpha i-3 unter VHF zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der SR-Gruppe. Es war eine Tendenz zur Reduktion des inhibierenden G alpha i-3 zu beobachten. Die Regulierung von IKACh,c bei VHF bleibt in zukünftigen Arbeiten zu untersuchen. Ein möglicher Versuch wäre, therapeutisch in die Regulation der Kir-Untereinheiten einzugreifen, um das VHF-unterstützende, elektrische "Remodeling" des IK1 zu verhindern.