Refine
Year of publication
- 2011 (69) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (33)
- Article (29)
- Book (5)
- diplomthesis (1)
- Review (1)
Has Fulltext
- yes (69)
Is part of the Bibliography
- no (69)
Keywords
- Podospora anserina (2)
- 5-Lipoxygenase (1)
- 5-lipoxygenase (1)
- Acetobacterium (1)
- Aptamer (1)
- Bacterial Metabolism (1)
- Bioenergetics (1)
- Caffeate Respiration (1)
- Capoeta damascina (1)
- Cyclooxygenase-2 (1)
Institute
- Biowissenschaften (69) (remove)
Capoeta damascina (Teleostei: Cyprinidae) is one of the most common freshwater fish species, found throughout the Levant, Mesopotamia, Turkey and Iran. According to the state of knowledge prior to this study, C. damascina, which is distributed over a wide range of isolated water bodies, was not a well-defined species. It was questionable whether it represents a single species or a complex of closely related species with high intraspecific and comparatively low interspecific variability. The goal of this study was to investigate the taxonomy, systematic position of the C. damascina species complex and the phylogenetic relationships among its members, based on morphological features as well as molecular phylogeny. Samples obtained from throughout the geographic range of this species complex were subjected to comparative morphological analyses in order to define, properly diagnose and separate species within the C. damascina complex. To elucidate phylogenetic relationships among members of the C. damascina species complex, samples were subjected to genetic analyses, using two molecular markers targeting the mitochondrial cytochrome oxidase I (COI, n = 103) and the two adjacent divergence regions (D1-D2) of the nuclear 28S rRNA genes (LSU, n = 65). Based on morphological and molecular genetic data, six closely related species were recognized within the C. damascina complex: C. buhsei, C. caelestis, C. damascina, C. saadii, C. umbla and an undescribed species, Capoeta sp.1. Analyses of the morphometric and meristic data obtained in this study revealed phenotypic variability among the various populations within a species and among the different species. Such differences in morphological characters reflect genetic differences, environmentally induced phenotypic variation or both, as the meristic phenotype of fish is sometimes a consequence of environmental parameters acting on the genotype. Based on phylogenetic analyses, two main lineages were identified within the C. damascina species complex: a western lineage represented by C. caelestis, C. damascina and C. umbla and an eastern lineage represented by C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1. The close phylogenetic relationships between C. damascina and C. umbla and the sharing of same haplotypes between one specimen of C. damascina from Euphrates and another of C. umbla from Tigris reflect one of three possibilites: recent speciation, mitochondrial introgression or a combination of both. The results obtained in this study indicate that speciation of the above-mentioned six taxa is quite recent and that their dispersal and present-day distribution can be related to Pleistocene events. The drying out of the Persian Gulf, probably during one of the first glacials of the Pleistocene, led the ancestor of the C. damascina species complex in Mesopotamia to reach the rivers of the Gulf and of Hormuz basins and differentiate there, giving rise to the eastern lineage (ancestor of C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1). As connections presumably existed among the different river drainages and basins in Iran during the wet periods of the Pleistocene, the ancestor of C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1 was subsequently able to colonize the various Iranian drainages and differentiate there, giving rise to C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1. After the separation from the eastern lineage, the western lineage, represented by the ancestor of C. damascina, C. umbla and C. caelestis, most likely reached the Levant from the Tigris-Euphrates system during the Pleistocene glacials, when river connections existed in the regions of the upper courses of Ceyhan Nehri (southern Turkey) and some western affluents to the Euphrates. From Ceyhan Nehri, it dispersed into other rivers in southern Turkey during Pleistocene periods of low sea levels until it reached Göksu Nehri and evolved into C. caelestis. The sister population differentiated into C. damascina and C. umbla. Based on the results obtained in this study, it is likely that C. damascina colonized the Levant and southern Turkey during the Pleistocene glacials. This is well supported by the low genetic variability among the C. damascina populations. Direct connections existed among the river drainages in the Levant during the Pleistocene periods of low sea level, thus serving as a pathway for the dispersal of C. damascina. The results of this study provide a coherent picture of the taxonomic position, phylogenetic relationships and evolutionary history of the C. damascina species complex and explain present patterns of distribution considering paleogeographic events.
Die Diatomee C. meneghiniana reagiert sowohl auf Veränderung der Lichtintensität während des Wachstums, als auch auf Veränderungen der Eisenkonzentration im Medium. Die Erhöhung der Lichtintensität respektive die Erniedrigung der Eisenkonzentration im Medium wurden als Stresssituationen für C. meneghiniana definiert. Unter Stressbedingungen findet zunächst eine generelle Erhöhung der Zellzahl statt, wobei das Volumen der einzelnen Zellen unter Eisenmangelbedingungen stark reduziert wird. Aus diesem Grund findet man schließlich unabhängig von der Lichtintensität in den Eisenmangelkulturen niedrigere Werte für die Biovolumina als in den Kulturen mit Eisensättigung.
Es konnten je nach Kulturbedingung kleine Unterschiede in der äußeren Morphologie der Silikatschalen festgestellt werden, die sich jedoch im Rahmen der normalen Variationsbreite bewegen und daher nicht signifikant sind. In allen Kulturen konnten auf Grund der schonenden Präparationsmethode die für C. meneghiniana als typisch beschriebenen Schwebfäden aus Chitin beobachtet werden.
Die Größe der Phäoplasten ist in den Eisenmangelkulturen und in de Starklichtkulturen deutlich geringer, weshalb auch die Anzahl der Thylakoidbänder sinkt. Die für Diatomeen typische Dreifachbänderung der Thylakoide bleibt jedoch immer erhalten. Zudem zeigen die Phäoplasten der LL 12 – und HL 12 – Zellen Ansammlungen eines Stoffs, der zwar nicht näher identifiziert wurde, wobei es sich aber höchstwahrscheinlich weder um Lipid-Globuli noch um das als Speicherstoff bei Diatomeen vorkommende -1,3-Glucan Chrysolaminarin handelt.
Die Färbung der Kulturen zeigt bereits eine Veränderung in der Pigmentierung der Zellen in Abhängigkeit von der Kulturbedingung. Der Chlorophyllgehalt pro Zellen wird vor allem unter Eisenmangel reduziert, während es in Zellen der HL – Kulturen zu einer Verdoppellung des Gehalts an XC – Pigmenten kommt. Die Kombination beider Effekte führt dazu, dass die HL 12 und der LL 1 – Kultur gleichermaßen hellbraun gefärbt sind, die Färbung der HL 1 – Kultur jedoch beinahe gelb ist. Die hellere Färbung der Eisenmangelkulturen ist wahrscheinlich als Chlorose anzusehen und eine klassische Folge von Eisenmangel bei Diatomeen. Die zugehörigen DEORs der ganzen Zellen sind in den HL – Kulturen anfangs sehr hoch und sinken später.
Die Ursache ist vermutlich in der hohen Lichtintensität und der durch Erhöhung der Zellzahl im Verlauf der Anzucht entstehenden gegenseitigen Beschattung der Zellen zu sehen. Hierfür spricht auch die parallel stattfindende Abnahme der XC – Pigmente – Konzentration.
Die Ermittlung der PS I : PS II – Stöchiometrien zeigt, dass sich offenbar auch die innere Architektur der Thylakoidmembran verändert. So liegt das relative, berechnete Verhältnis von PS II zu PS I nur in der LL 12 – und der HL 1 – Kultur bei 2 : 1. Dieses Verhältnis wird üblicherweise für küstennahe unter den den Anzuchtbedingungen vergleichbaren Lichtverhältnissen lebende Spezies angenommen. Die HL 12 - und die LL 1 – Zellen hingegen weisen ein Verhältnis von 1 : 1 auf. Da es nicht möglich ist, die Veränderung in beiden Kulturen entweder mit Eisenmangel oder Starklichtstress zu erklären, muss hier von unterschiedlichen Ursachen ausgegangen werden.
Die Reoxidationskinetiken weisen darauf hin, dass die Übertragung der Energie von QA an QB je nach Kultur unterschiedlich schnellen Kinetiken folgt. Dies ist wiederum durch die Bindungsart des QB, bzw. seine Verfügbarkeit als Akzeptor bedingt.
In den O-J-I-P-Messungen zeigt sich zunächst, dass die F0 – Werte der Eisenmangelkulturen niedriger liegen. Als Ursache hierfür wird eine Verkleinerung der Antenne des PS II, die sich durch den unter Eisenmangel deutlich erniedrigten Chlorophyllgehalt pro Zelle erklären lässt, und die dadurch bedingte Verringerung der Fluoreszenz angenommen. Deutlich ist zudem, dass die Energie in den HL – Kulturen deutlich schlechter von QA an QB weitergegeben wird, weshalb auch die daraus resultierenden Fv/FM – Werte deutlich niedriger sind. Als Erklärung hierfür kommt der unter HL stark erhöhte XC – Pool in Frage, der bekanntermaßen am nichtphotochemischen Quenching beteiligt ist, das wiederum vor allem unter Lichtstress auftritt.
Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm –Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm – Absorption bei, Fraktion II und IV mit der Auswertung der Slotblotsignale für die Photosysteme korreliert.
Die endgültige Aufreinigung der FCPs wurde letztlich mit diskontinuierlichen Saccharosegradienten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass alle FCP – Fraktionen nach der Anionenaustauscherchromatografie einen mehr oder weniger großen Anteil an Verunreinigungen durch Photosysteme enthalten, die auf diese Weise abgetrennt werden konnten.
Die Kulturbedingungen haben zwar keinen Einfluss auf den Oligomerisierungsgrad von FCPa, bzw. FCPb, allerdings konnten Unterschiede in der Stabilität der Komplexe festgestellt werden. FCPa scheint unter LL weniger stabil zu sein, während der FCPb unter Eisenmangelbedingungen einen Teil seiner Stabilität einbüßt. Weiterhin kann in der Gelfiltration des FCPa kann nur eine Schulter beobachtet werden und im FCPb sieht man teilweise sogar zwei Schultern. Da sich die Schulter mit der längeren Retentionszeit auf Höhe der Monomerschulter des FCPa befindet, und die Retentionszeit der anderen Schulter beinahe der des FCPa-Trimers entspricht, könnte dies die Hypothese unterstützen, dass der FCPb ebenfalls aus Trimeren aufgebaut ist. Kleine Verschiebungen in der Retentionszeit wären durch das unterschiedliche Molekulargewicht der Monomere erklärbar.
Die SDS – PAGE zeigt zunächst keine Veränderungen in der Zusammensetzung der FCPs unterschiedlicher Kulturbedingungen. Einzig die beiden HL –FCPb – Proben weisen eine hochmolekulare Bande bei ca. 62 kDa auf, die nicht näher identifiziert werden konnte. Auf Grund der Größe kann jedoch ausgeschlossen werden, dass es sich um Kopurifikation des unter Eisenstress bei Diatomeen häufig als Ersatz für Ferredoxin vorkommenden Flavodoxins oder einen Eisentransporter handelt. Die Inkubation mit spezifischen Antikörpern gegen einzelne fcp – Proteine zeigt, dass die 18 kDa – Bande des FCPa fcp2 enthält und die 19 kDa – Bande fcp6. Die 19 kDa – Bande des FCPb reagiert jedoch nicht mit dem fcp6 – Antikörper. Da aus C. cryptica nur noch zwei weitere fcp – Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 19 kDa bekannt sind und fcp7 auf Aminosäureniveau eine sehr hohe Ähnlichkeit mit dem fcp6 aufweist, kann man vermuten, dass es das entsprechende Protein im FCPb der fcp5 ist.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
This thesis is based on the following publications (in chronological order): 1. Biegel, E., S. Schmidt & V. Müller (2009) Genetic, immunological and biochemical evidence for a Rnf complex in the acetogen Acetobacterium woodii. Environ. Microbiol. 11: 1438-1443. My contribution: Amplification, sequence determination and analysis of Rnf homologues, enrichment of the Rnf complex 2. Biegel, E. & V. Müller (2010) Bacterial Na+-translocating ferredoxin:NAD+ oxidoreductase. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 107: 18138-18142. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data. 3. Biegel, E., S. Schmidt, J. Gonzáles & V. Müller (2010) Biochemistry, evolution and physiological function of the Rnf complex, a novel ion-motive electron transport complex in prokaryotes. Cell. Mol. Life Sci., in press. DOI: 10.1007/s00018-010-0555-8. My contribution: I was involved in writing all chapters except chapters: „phylogenetic analyses of rnf genes“ and „distribution of rnf genes“. 4. Biegel, E. & V. Müller (2010) A Na+-translocating pyrophosphatase in the acetogenic bacterium Acetobacterium woodii. J. Biol. Chem., in press. DOI: 10.1074/jbc.M110.192823. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data.
The anaerobic acetogenic bacterium Acetobacterium woodii employs a novel type of Na+-motive anaerobic respiration, caffeate respiration. However, this respiration is at the thermodynamic limit of energy conservation, and even worse, in the first step, caffeate is activated by caffeyl-CoA synthetase, which hydrolyzes ATP to AMP and pyrophosphate. Here, we have addressed whether or not the energy stored in the anhydride bond of pyrophosphate is conserved by A. woodii. Inverted membrane vesicles of A. woodii have a membrane-bound pyrophosphatase that catalyzes pyrophosphate hydrolysis at a rate of 70–120 milliunits/mg of protein. Pyrophosphatase activity was dependent on the divalent cation Mg2+. In addition, activity was strictly dependent on Na+ with a Km of 1.1 mm. Hydrolysis of pyrophosphate was accompanied by 22Na+ transport into the lumen of the inverted membrane vesicles. Inhibitor studies revealed that 22Na+ transport was primary and electrogenic. Next to the Na+-motive ferredoxin:NAD+ oxidoreductase (Fno or Rnf), the Na+-pyrophosphatase is the second primary Na+-translocating enzyme in A. woodii.
Conclusion: Proteins containing a Jumonji C (JmjC) domain appear in almost all living organisms and catalyze a variety of oxidation reactions. Therefore, they are important regulators in many biological processes such as proliferation and differentiation. They act either as protein hydroxylases, histone demethylases or by regulate mRNA splicing. Given the fact that some of the JmjC domain-containing proteins are shown to be upregulated in response to hypoxia as well as the dependency of JmjC domain catalytic activity on oxygen led to the assumption of an involvement in angiogenesis. For Jmjd6, a member of the JmjC domain-containing protein family, a regulatory involvement in mRNA splicing has been shown. The Jmjd6-/- mouse dies perinatally due to several severe organ malformations, especially in the heart. Despite the pale appearance, the growth retardation and the cardiac defects, it is unclear whether these mice exhibit defects of cells comprising the vasculature. Therefore, the involvement of Jmjd6 in angiogenesis was examined in vitro using angiogenesis assays as well as in vivo using the Jmjd6+/- mouse. An siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs significantly impaired the formation of capillary-like networks in the tube formation assay as well as sprouting in the spheroid assay. Moreover, after siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs cell migration was significantly reduced. These findings were confirmed in the matrigel plug assay in vivo. Implanted matrigel plugs of Jmjd6+/- mice exhibited significantly less perfused vessels compared to wildtype littermates. Furthermore, cultured lung ECs from Jmjd6+/- mice exhibited impaired network forming activity ex vivo compared to cells isolated from wildtype littermates. To elucidate the mechanisms underlying the requirement of Jmjd6 in angiogenesis, an Affymetrix exon-array was performed, which allows detection of changes in gene expression as well as splicing. The siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 altered the expression of genes known to play a role in vascular biology. The bioinformatic assessment of alternative splice variants revealed that Jmjd6 silencing affects the splicing of the VEGF receptor 1 (Flt1). Differential splicing of Flt1 was shown to generate a short and soluble form of Flt1 (sFlt1), which sequestrates VEGF and PlGF, and thereby inhibits angiogenesis. In particular, a significant increase in sFlt1 expression was observed. Jmjd6 was recently reported to hydroxylate the splicing factor U2AF65. Therefore, we investigated whether U2AF65 might mediate Flt1 splicing and binds to Flt1 mRNA. Indeed, U2AF65 co-immunoprecipitated with Jmjd6 in ECs, while an interaction of U2AF65 with sFlt1 was demonstrated. Moreover, inhibition of Jmjd6 catalytic function by reduced oxygen concentration altered splicing of Flt1 resulted in an increase of the sFlt1 splice variant. Finally, saturating concentrations of VEGF or PlGF or neutralizing antibodies against sFlt1 significantly reduced the inhibition of sprouting caused by Jmjd6 knockdown in vitro.
Collectively, our results indicate that Jmjd6 has an essential role in the oxygen-dependent regulation of angiogenesis by controlling the splicing of Flt1 mRNA, thereby adjusting the generation of the anti-angiogenic short splice variant sFlt1. Several publications demonstrated a major importance for sFlt1 as a biomarker for many severe human diseases such as preeclampsia, sepsis, cancer, myocardial infarction as well as chronic heart failure. Therefore, the identification of the molecular mechanism behind the generation of sFlt1 might enable the development of new or more precise clinical markers for the diagnosis of the corresponding diseases. Furthermore, the discovery of the enzymes involved in the generation of sFlt1 provides further possibilities to modulate sFlt1 levels and thereby may potentially gives rise to the development of new therapies.
Integrin a2ß1 ist ein Adhäsionsrezeptor, der verschiedene Kollagentypen bindet. Als solcher spielt es eine bedeutende Rolle für Zellfunktionen wie Migration und die Regulation des Zytoskeletts, Zellteilung, Apoptose und Differenzierung. Integrin a2ß1 übernimmt deshalb eine tragende Funktion in Prozessen wie Wundheilung, Angiogenese und der Progression und Metastasierung von Krebs. Rhodocetin ist ein Antagonist des Integrins a2ß1. Es ist ein C-Typ-Lektin-artiges Protein das im Schlangengift der Malaiischen Grubenotter (Calloselasma rhodostoma) entdeckt wurde. Rhodocetin besteht aus vier Untereinheiten a, ß, ? und d, die zwei Dimere formen (aß und ?d), welche wiederum eine kreuzförmige heterotetramere Quartiärstruktur bilden, die bislang nur für Rhodocetin beschrieben wurde. Rhodocetin bindet an die Integrin-a2A-Domäne der a-Untereinheit des Integrins a2ß1. Rhodocetin unterbindet damit die Bindung von Kollagen und die Aktivierung des Integrins. Der genaue Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne ist noch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Hybridomtechnik monoklonale Antikörper gegen Rhodocetin generiert. Es wurden sechs Fusionen von Lymphozyten mit Myelomazellen durchgeführt, für die sowohl Mäuse als auch Ratten mit Rhodocetin immunisiert wurden. Die erzeugten Hybridomaklone wurden zunächst im ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, Rhodocetin zu binden. Positiv getestete Klone wurden selektiert und die monoklonalen Antikörper aus den Zellüberständen aufgereinigt. Es konnten 14 monoklonale Antikörper etabliert werden. Die Antikörper wurden zunächst in ihren Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurden verschiedene ELISAs, Immunblot und Immunpräzipitation genutzt. In der Duchflusszytometrie wurde getestet, ob die Antikörper an Integrin a2ß1 gebundenes Rhodocetin detektieren. Die Antikörper lassen sich hinsichtlich ihr Bindungseigenschaften und der Lage ihrer Bindungsepitope auf den verschiedenen Rhodocetin-Heterodimeren in unterschiedliche Klassen unterteilen. Es wurde nachgewiesen, dass Rhodocetin Konformationsänderungen unterliegt, die durch die Bindung einiger der generierten Antikörper induziert werden. Um den Einfluss divalenter Kationen auf die Konformation von Rhodocetin sowie den Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne zu untersuchen, wurde die analytische Gelfiltrationschromatographie genutzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung divalenter Kationen die Konformation von Rhodocetin beeinflusst. Um die Interaktionsstudien von Rhodocetin mit der a2A-Domäne auszuwerten wurde ein Sandwich-ELISA etabliert. Dieser ermöglichte es, im Anschluss an die Gelfiltration, die beiden Rhodocetin-Heterodimere unabhängig voneinander im Eluat nachzuweisen und zu quantifizieren. Es wurde nachgewiesen, dass das Rhodocetin-Heterotetramer während der Interaktion mit der Integrin-a2A-Domäne dissoziiert und nur das ?d-Dimer einen stabilen Komplex mit der a2A-Domäne bildet, während das aß-Dimer freigesetzt und unabhängig von diesem Komplex eluiert wird. Die pharmakologischen Eigenschaften von Rhodocetin wurden in einem Tumor-Xenograft-Modell untersucht, für das immundefizienten Mäusen HT1080 Fibrosarkomzellen implantiert wurden. Rhodocetin wurde den Mäusen intravenös appliziert und die Auswirkungen auf die Tumoren sowie der Verbleib von Rhodocetin im Körper analysiert. Die Entwicklung der Serumkonzentration von Rhodocetin wurde mit dem etablierten Sandwich-ELISA untersucht, welches hierzu mit einer Standardreihe kalibriert wurde. Die Elimination von Rhodocetin folgt einer Kinetik erster Ordnung. Die Exkretion von Rhodocetin erfolgt über die Niere. Es zeigte sich, dass etwa zwei Drittel des applizierten Rhodocetins unmittelbar nach Injektion von Integrin a2ß1-exprimierenden Zellen des Blutes gebunden werden. Die immunhistologische Auswertung von Tumoren und Kontrollgeweben ergab, dass Rhodocetin an Endothelzellen innerhalb der Nierenglomeruli sowie der Leber bindet. Rhodocetin konnte auch auf Endothelzellen der Tumorvaskulatur nachgewiesen werden. Innerhalb der Tumoren wurde Rhodocetin auch außerhalb von Blutgefäßen gefunden, wo es an HT1080 Tumorzellen bindet. Die Behandlung mit Rhodocetin beeinträchtigte die Integrität der Blutgefäße innerhalb der Tumoren und führte zu Hämorrhagien. Um die Auswirkungen von Rhodocetin auf die Tumoren genauer zu untersuchen und zu quantifizieren, wurde dynamische Magnetresonanztomographie genutzt. Es zeigte sich, dass Rhodocetin die Durchlässigkeit der Blutgefäße in Tumoren signifikant erhöht.
Eine verzögerte und mitunter unvollständige Immunrekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) birgt ein erhöhtes Risiko für Infektionen und das Auftreten eines Rezidivs. Adoptive Immuntherapien können dazu beitragen, die Immunrekonstitution zu beschleunigen. Die Indikation hierzu ist jedoch streng geregelt, da eine zusätzliche Immuntherapie mit Risiken, wie z.B. dem Auftreten einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD), verbunden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf das Auftreten von Komplikationen und das Überleben nach SZT. Dazu wurde ein multivariates Normwertmodell entwickelt, das die Beurteilung der Rekonstitution verschiedener Leukozytensubpopulationen ermöglicht. Der Einfluss der Regeneration spezifischer Immunzellen wie Cytomegalievirus-spezifischer T-Zellen (CMV-CTLs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs) auf den Verlauf nach SZT wurde insbesondere hinsichtlich CMV-bedingter Komplikationen, GvHD und Rezidiv untersucht.