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The mammalian retina contains around 30 morphological varieties of amacrine cell types. These interneurons receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells and provide GABA- and glycinergic inhibition to other cells in the retina. Amacrine cells exhibit widely varying light evoked responses, in large part defined by their presynaptic partners. We wondered whether amacrine functional diversity is based on a differential expression of glutamate receptors among cell populations and types. In whole cell patch-clamp experiments on mouse retinal slices, we used selective agonists and antagonists to discriminate responses mediated by NMDA/ non-NMDA (NBQX) and AMPA/ KA receptors (cyclothiazide, GYKI 52466, GYKI 53655, SYM 2081). We sampled a large variety of individual cell types, which were classified by their dendritic field size into either narrow-field or wide-field cells after filling with Lucifer yellow or neurobiotin. In addition, we used transgenic GlyT2-EGFP mice, whose glycinergic neurons express EGFP. This allowed us to classify amacrines on basis of their neurotransmitter into either glycinergic or GABAergic cells. All cells (n = 300) had good responses to non-NMDA agonists. Specific AMPA receptor responses could be obtained from almost all cells recorded: 94% of the AII (n = 17), 87% of the narrow-field (n = 45), 81% of the wide-field (n = 21), 85% of the glycinergic (n = 20) and 78% of the GABAergic cells (n = 9). KA receptor selective drugs were also effective on the majority of the AII (79%, n = 14), narrow-field (93%, n = 43), wide-field (85%, n = 26), glycinergic (94%, n = 16) and GABAergic amacrine cells (100%, n = 6). Among the cells tested for the two receptors (n = 65), we encountered both exclusive expression of AMPA or KA receptors and co-expression of the two types. Most narrow-field (70%, n = 27), glycinergic (81%, n = 16) and GABAergic cells (67%, n = 6) were found to have both AMPA and KA receptors. In contrast, only less than half of the wide-field cells (43%, n = 14) were found to co-express AMPA and KA receptors, most of them expressing exclusively AMPA (36%) or KA receptors (21%). We could elicit small NMDA responses from most of the wide-field (75%, n = 13) and GABAergic cells (67%, n = 3), whereas only 47% of the narrow-field (n = 15), 14% of the AII (n = 22) and no glycinergic cell (n = 2) reacted to NMDA. Abstract 83 Our data suggest that AMPA, KA and NMDA receptors are differentially expressed among different types of amacrine cells rather than among populations with different neurotransmitters or different dendritic coverage of the retina. Selective expression of kinetically different glutamate receptors among amacrine types may be involved in generating transient and sustained inhibitory pathways in the retina. Since AMPA and KA receptors are not generally clustered at the same postsynaptic sites, a single amacrine cell expressing both AMPA and KA receptors may provide inhibition with different temporal characteristics to individual synaptic partners.
Cancer has become one of the most fatal diseases. The Heidelberg Heavy Ion Cancer Therapy (HICAT) has the potential to become an important and efficient treatment method because of its excellent “Bragg peak” characteristics and on-line irradiation control by the PET diagnostics. The dedicated Heidelberg Heavy Ion Cancer Therapy Project includes two ECR ion sources, a RF linear injector, a synchrotron and three treatment rooms. It will deliver 4*10 high 10 protons, or 1*10 high 10 He, or 1*10 high 9 Carbons, or 5*10 high 8 Oxygens per synchrotron cycle with the beam energy 50-430AMeV for the treatments. The RF linear injector consists of a 400AkeV RFQ and of a very compact 7AMeV IH-DTL accelerator operated at 216.816MHz. The development of the IH-DTL within the HICAT project is a great challenge with respect to the present state of the DTL art because of the following reasons: • The highest operating frequency (216.816MHz) of all IH-DTL cavities; • Extremely large cavity length to diameter ratio of about 11; • IH-DTL with three internal triplets; • The highest effective voltage gain per meter (5.5MV/m); • Very short MEBT design for the beam matching. The following achievements have been reached during the development of the IH-DTL injector for HICAT : The KONUS beam dynamics design with LORASR code fulfills the beam requirement of the HICAT synchrotron at the injection point. The simulations for the IH-DTL injector have been performed not only with a homogeneous input beam, but also with the actual particle distribution from the exit of the HICAT RFQ accelerator as delivered by the PARMTEQ code. The output longitudinal normalized emittance for 95% of all particles is 2.00AkeVns, the emittance growth is less than 24%, while the X-X’ and Y-Y’ normalized emittance are 0.77mmmrad and 0.62mmmrad, respectively. The emittance growth in X-X’ is less than 18%, and the emittance growth in Y-Y’ is less than 5%. Based on the transverse envelopes of the transported particles, the redesign of the buncher drift tubes at the RFQ high energy end has been made to get a higher transit time factor for this novel RFQ internal buncher. An optimized effective buncher gap voltage of 45.4KV has been calculated to deliver a minimized longitudinal beam emittance, while the influence of the effective buncher voltage on the transverse emittance can be neglected. Six different tuning concepts were investigated in detail while tuning the 1:2 scaled HICAT IH model cavity. ‘Volume Tuning’ by a variation of the cavity cross sectional area can compensate the unbalanced capacitance distribution in case of an extreme beta-lambda-variation along an IH cavity. ‘Additional Capacitance Plates’ or copper sheets clamped on drift tube stems are a fast way for checking the tuning sensitivity, but they will be replaced by massive copper blocks mounted on the drift tube girders finally. ‘Lens Coupling’ is an important tuning to stabilize the operation mode and to increase or decrease the coupling between neighboring sections. ‘Tube Tuning’ is the fine tuning concept and also the standard tuning method to reach the needed field distributions as well as the gap voltage distributions. ‘Undercut Tuning’ is a very sensitive tuning for the end sections and with respect to the voltage distribution balance along the structure. The different types of ‘plungers’ in the 3rd and 4th sections have different effects on the resonance frequency and on the field distribution. The different triplet stems and the geometry of the cavity end have been also investigated to reach the design field and voltage distributions. Finally, the needed uniform field distribution along the IH-DTL cavity and the corresponding effective voltage distribution were realized, the remaining maximum gap voltage difference was less than 5% for the model cavity. The several important higher order modes were also measured. The RF tuning of the IH-DTL model cavity delivers the final geometry parameters of the IH-DTL power cavity. A rectangular cavity cross section was adopted for the first time for this IH-DTL cavity. This eases the realization of the volume tuning concept in the 1st and 2nd sections. Lens coupling determines the final distance between the triplet and the girder. The triplets are mounted on the lower cavity half shell. The Microwave Studio simulations have been carried out not only for the HICAT model cavity, but also for the final geometry of the IH-DTL power cavity. The field distribution for the operation mode H110 fits to the model cavity measurement as well as the Higher Order Modes. The simulations prove the IH-DTL geometrical design. On the other hand, the precision of one simulation with 2.3 million mesh points for full cross section area and the CPU time more than 15hours on a DELL PC with Intel Pentium 4 of 2.4GHz and 2.096GRAM were exploited to their limit when calculating the real parameters for the two final machining iterations during production. The shunt impedance of the IH-DTL power cavity is estimated by comparison with the existing tanks to about 195.8MOmega/m, which fits to the simulation result of 200.3MOmega/m with reducing the conductivity to the 5.0*10 high 7 Omega-1m-1. The effective shunt impedance is 153 MOmega/m. The needed RF power is 755kW. The expected quality factor of the IH-DTL cavity is about 15600. The IH-DTL power cavity tuning measurements before cavity copper plating have been performed. The results are within the specifications. There is no doubt that the needed accuracy of the voltage distribution will be reached with the foreseen fine tuning concepts in the last steps.
Here I analyse 23 populations of D. galeata, a large-lake cladoceran, distributed mainly across the Palaearctic. I detected high levels of clonal diversity and population differentiation using variation at six microsatellite loci across Europe. Most populations were characterised by deviations from H-W equilibrium and significant heterozygote deficiencies. Observed heterozygote deficiencies might be a consequence of simultaneous hatching of individuals produced during different times of the year or of the coexistence of ecologically and genetically differentiated subpopulations. A significant isolation by distance was only found over large geographic distances (> 700 km). This pattern is mainly due to the high genetic differentiation among neighbouring populations. My results suggest that historic populations of Daphnia were once interconnected by gene flow but current populations are now largely isolated. Thus local ecological conditions which determine the level of biparental sexual reproduction and local adaptation are the main factors mediating population structure of D. galeata. The population genetic structure and diversity in D. galeata was investigated at a European scale using six microsatellite loci and 12S rDNA sequence data to infer and compare historical and contemporary patterns of gene flow. D. galeata has the potential for long-distance dispersal via ephippial resting eggs by wind and other dispersing vectors (waterfowl), but shows in general strong population differentiation even among neighbouring populations. A total of 427 individuals were analysed for microsatellite and 85 individuals for mitochondrial (mtDNA) sequence data from 12 populations across Europe. I detected genetic differentiation among populations across Europe and locations within sampling regions for both genetic marker systems (average values: mtDNA FST = 0.574; microsatellite FST = 0.389), resulting in a lack of isolation by distance. Furthermore, several microsatellite alleles and one haplotype were shared across populations. Partitioning of molecular variance was inconsistant for both marker systems. Microsatellite variation was higher within than among populations, whereas mtDNA data yielded an inverse pattern. Relative high levels of nuclear DNA diversity were found across Europe. The amount of mitochondrial diversity was low in Spain, Hungary and Denmark. Gene flow analysis at a European scale did not reveal typical pattern of population recolonization in the light of postglacial colonization hypotheses. Populations, which recently experienced an expansion or population-bottleneck were observed both in middle and northern Europe. Since these populations revealed high genetic diversity in both marker systems, I suggest these areas to represent postglacial zones of secondary contact among divergent lineages of D. galeata. In order to reveal the relationship between population genetic structure of D. galeata and the relative contribution of environmental factors, I used a statistical framework based on canonical correspondence analysis. Although I detected no single ecological gradient mediating the genetic differentiation in either lake regions, it is noteworthy that the same ecological factors were significantly correlated with intra- and interspecific genetic variation of D. galeata. For example, I found a relationship between genetic variation of D. galeata and differentiation with higher and lower trophic levels (phytoplankton, submerged macrophytes and fish) and a relationship between clonal variation and species diversity within Cladocera. Variance partitioning had only a minor contribution of each environmental category (abiotic, biomass/density and diversity) to genetic diversity of D. galeata, while the largest proportion of variation was explained by shared components. My work illustrates the important role of ecological differentiation and adaptation in structuring genetic variation, and it highlights the need for approaches incorporating a landscape context for population divergence.
After a brief introduction on QCD and effective models in the first chapter, I analyze the dependence of the QCD transition temperature on the quark (or pion) mass in the second chapter. I found that a linear sigma model, which links the transition to chiral symmetry restoration, predicts a much stronger dependence of T_c on m_pi than seen in present lattice data for m_pi >~ 0.4 GeV. On the other hand, an effective Lagrangian for the Polyakov loop requires only small explicit symmetry breaking to describe T_c(m_pi) in the above mass range. In the third and fourth chapter, I study the linear sigma model with O(N) symmetry at nonzero temperature in the framework of the Cornwall-Jackiw-Tomboulis formalism. Extending the set of two-particle irreducible diagrams by adding sunset diagrams to the usual Hartree-Fock (or Hartree) contributions, I derive a new approximation scheme which extends the standard Hartree-Fock (or Hartree) approximation by the inclusion of nonzero decay widths.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des ALTRO Chips (ALICE TPC Readout), der ein integraler und wichtiger Bestandteil der Auslesekette des TPC (Time Projection Chamber) Detektors von ALICE (A Large Ion Collider Experiment) ist. ALICE ist ein Experiment am noch im Bau befindlichen LHC (Large Hadron Collider) am CERN mit der zentralen Ausrichtung, Schwerionenkollisionen zu untersuchen. Diese sind von besonderem Interesse, da durch sie ein experimenteller Zugriff zu dem QGP (Quark Gluon Plasma) existiert, dem einzigen vom Standardmodell vorhergesagten Phasenübergang, der unter Laborbedingungen erreichbar ist. Im Jahr 2004 wurden Messungen an einem Teststrahl am CERN PS (Proton Synchrotron) durchgeführt. Der Prototyp wurde voll mit FECs bestückt, was 5400 Kanälen entspricht und einer anderen Gasmixtur (Ne/N2/CO2 90%/5%/5%) befüllt. Für das optimale Leistungsverhalten der ALICE TPC muß der Digitalprozessor im ALTRO, bestehend aus vier Berechnungseinheiten, mit den passenden Werten konfiguriert werden. Der Datenfluss beginnt mit dem BCS1 (Baseline Correction and Subtraction 1) Modul, das systematische Störungen und die Grundlinie entfernt. Da der ALTRO kontinuierlich das anliegende Signal abtastet, entfernt es automatisch langsame Grundlinienveränderungen, die Beispielsweise durch Temperaturänderungen auftreten können. Gefolgt von dem TCF (Tail Cancellation Filter), der den Schweif des langsam fallenden, vom PASA generierten Signals entfernt. Um die nichtsystematischen Störungen der Grundlinie zu entfernen, folgt die BCS2 (Baseline Correction and Subtraction 2), die auf einer gleitenden Mittelwertsberechnung mit Ausschluß von Detektorsignalen über einen doppelten Schwellenwert basiert. Die finale Einheit für die Signalverarbeitung ist die ZSU (Zero Suppression Unit), die Meßpunkte unterhalb eines definierten Schwellwertes entfernt. Hier wird der weg beschrieben die TCF und BCS1 Parameter aus vorhandenen Detektordaten zu extrahieren. Während der Analyse der Daten von kosmischen Teilchen fiel bei Signalen mit hoher Amplitude (>700 ADC) eine zusätzliche Struktur in dem Schweif auf. Der Monitor wurde deswegen mit einem gleitenden Mittelwertfilter erweitert, worauf sich diese Struktur auch in kleineren Signalen (> 200 ADC) zeigte. Dieses Signal wird von Ionen erzeugt, die zur Kathode oder zu den Pads driften, bisher ist jedoch weder die Streuung der Elektronenlawine an der Anode, noch die Variationsbreite in den erzeugten Elektronlawinen verstanden oder gemessen worden. Eine erfolgreiche Messung, sowie Charakterisierung wird in dieser Arbeit beschrieben. Im Jahr 2005 im Sommer beginnt der Einbau der Gaskammern der TPC in ALICE, die Elektronik folgt am Ende dieses Jahres. Parallel hierzu wurde der Prototyp der TPC wieder in Betrieb genommen und im Frühling wird ein kompletter Sektor mit der Detektorelektronik ausgestattet. An diesen zwei Aufbauten wird die ALTRO Charakterisierung fortgeführt, verfeinert und komplettiert.
The thesis entitled „Investigations on the significance of nucleo-cytoplasmic transport for the biological function of cellular proteins" aimed to unreveal molecular mechanisms in order to improve our understanding of the impact of nucleo-cytoplasmic transport on cellular functions. Within the scope of this work, it could be shown that regulated nucleo-cytoplasmic transport of a subfamily of homeobox transcription factors controlled their intra- and intercellular transport, and thereby influencing also their transcriptional activity. This study describes a novel regulatory mechanism, which could in general play an important role for the ordered differentiation of complex organisms. Besides cis-active transport Signals, also post-translational modifications can influence the localization and biological activity of proteins in trans. In addition to the known impact of phosphorylation on the transport and activity of STAT1, experimental evidence was provided demonstrating that acetylation affected the interaction of STAT1 with NF-kB p65, and subsequently modulated the expression of apoptosis-inducing NF-kB target genes. The impact of nucleo-cytoplasmic transport on the regulation of apoptosis was underlined by showing that the evolutionary conservation of a NES within the anti-apoptotic protein survivin plays an essential role for its dual function in the inhibition of apoptosis and ordered cell division. Since survivin is considered a bona fide cancer therapy target, these results strongly encourage future work to identify molecular decoys that specifically inhibit the nuclear export of survivin as novel therapeutics. In order to further dissect the regulation of nuclear transport and to efficiently identify transport inhibitors, cell-based assays are urgently required. Therefore, the cellular assay Systems developed in this work may not only serve to identify synthetic nuclear export and Import inhibitors but may also be applied in systematic RNAi-screening approaches to identify novel components of the transport machinery. In addition, the translocation based protease- and protein-interaction biosensors can be applied in various biological Systems, in particular to identify protein-protein interaction inhibitors of cancer relevant proteins. In summary, this work does not only underline the general significance of nucleo-cytoplasmic transport for cell biology, but also demonstrates its potential for the development of novel therapies against diseases like cancer and viral infections.
The quinol:fumarate reductase (QFR) is the terminal reductase of anaerobic fumarate respiration, the most commonly occurring type of anaerobic respiration. This membrane protein complex couples the oxidation of menaquinol to menaquinone to the reduction of fumarate to succinate. The three-dimensional crystal structure of the QFR from Wolinella succinogenes has previoulsy been solved at 2.2 Å resolution. Although the diheme-containing QFR from W. succinogenes is known to catalyze an electroneutral process, structural and functional characterization of parental and variant enzymes has revealed active site locations which indicate electrogenic catalysis across the membrane. A solution to this apparent controversy was proposed with the so-called “Epathway hypothesis”. According to this, transmembrane electron transfer via the heme groups is strictly coupled to a parallel, compensatory transfer of protons via a transiently established pathway, which is inactive in the oxidized state of the enzyme. Proposed constituents of the E-pathway are the side chain of Glu C180, and the ring C propionate of the distal heme. Previous experimental evidence strongly supports such a role for the former constituent. One aim of this thesis is to investigate by a combination of specific 13C-heme propionate labeling and FTIR difference spectroscopy whether the ring C propionate of the distal heme is involved in redox-coupled proton transfer in the QFR from W. succinogenes. In addition to W. succinogenes, the primary structures of the QFR enzymes of two other e- proteobacteria are known. These are Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori, which unlike W. succinogenes are human pathogens. The QFR from H. pylori has previously been established to be a potential drug target, and the same is likely for the QFR from C. jejuni. The two pathogenic species colonize mucosal surfaces causing several diseases. The possibility of studying these QFRs from these bacteria and creating more efficient drugs specifically active for this enzyme depends substantially on the availability of large amounts of high-quality protein. Further, biochemical and structural studies on QFR enzymes from e- proteobacteria species other than W. succinogenes can be valuable to enlighten new aspects or corroborate the current understanding of this class of membrane proteins.
Virtual screening of potential bioactive substances using the support vector machine approach
(2005)
Die vorliegende Dissertation stellt eine kumulative Arbeit dar, die in insgesamt acht wissenschaftlichen Publikationen (fünf publiziert, zwei eingerichtet und eine in Vorbereitung) dargelegt ist. In diesem Forschungsprojekt wurden Anwendungen von maschinellem Lernen für das virtuelle Screening von Moleküldatenbanken durchgeführt. Das Ziel war primär die Einführung und Überprüfung des Support-Vector-Machine (SVM) Ansatzes für das virtuelle Screening nach potentiellen Wirkstoffkandidaten. In der Einleitung der Arbeit ist die Rolle des virtuellen Screenings im Wirkstoffdesign beschrieben. Methoden des virtuellen Screenings können fast in jedem Bereich der gesamten pharmazeutischen Forschung angewendet werden. Maschinelles Lernen kann einen Einsatz finden von der Auswahl der ersten Moleküle, der Optimierung der Leitstrukturen bis hin zur Vorhersage von ADMET (Absorption, Distribution, Metabolism, Toxicity) Eigenschaften. In Abschnitt 4.2 werden möglichen Verfahren dargestellt, die zur Beschreibung von chemischen Strukturen eingesetzt werden können, um diese Strukturen in ein Format zu bringen (Deskriptoren), das man als Eingabe für maschinelle Lernverfahren wie Neuronale Netze oder SVM nutzen kann. Der Fokus ist dabei auf diejenigen Verfahren gerichtet, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden. Die meisten Methoden berechnen Deskriptoren, die nur auf der zweidimensionalen (2D) Struktur basieren. Standard-Beispiele hierfür sind physikochemische Eigenschaften, Atom- und Bindungsanzahl etc. (Abschnitt 4.2.1). CATS Deskriptoren, ein topologisches Pharmakophorkonzept, sind ebenfalls 2D-basiert (Abschnitt 4.2.2). Ein anderer Typ von Deskriptoren beschreibt Eigenschaften, die aus einem dreidimensionalen (3D) Molekülmodell abgeleitet werden. Der Erfolg dieser Beschreibung hangt sehr stark davon ab, wie repräsentativ die 3D-Konformation ist, die für die Berechnung des Deskriptors angewendet wurde. Eine weitere Beschreibung, die wir in unserer Arbeit eingesetzt haben, waren Fingerprints. In unserem Fall waren die verwendeten Fingerprints ungeeignet zum Trainieren von Neuronale Netzen, da der Fingerprintvektor zu viele Dimensionen (~ 10 hoch 5) hatte. Im Gegensatz dazu hat das Training von SVM mit Fingerprints funktioniert. SVM hat den Vorteil im Vergleich zu anderen Methoden, dass sie in sehr hochdimensionalen Räumen gut klassifizieren kann. Dieser Zusammenhang zwischen SVM und Fingerprints war eine Neuheit, und wurde von uns erstmalig in die Chemieinformatik eingeführt. In Abschnitt 4.3 fokussiere ich mich auf die SVM-Methode. Für fast alle Klassifikationsaufgaben in dieser Arbeit wurde der SVM-Ansatz verwendet. Ein Schwerpunkt der Dissertation lag auf der SVM-Methode. Wegen Platzbeschränkungen wurde in den beigefügten Veröffentlichungen auf eine detaillierte Beschreibung der SVM verzichtet. Aus diesem Grund wird in Abschnitt 4.3 eine vollständige Einführung in SVM gegeben. Darin enthalten ist eine vollständige Diskussion der SVM Theorie: optimale Hyperfläche, Soft-Margin-Hyperfläche, quadratische Programmierung als Technik, um diese optimale Hyperfläche zu finden. Abschnitt 4.3 enthält auch eine Diskussion von Kernel-Funktionen, welche die genaue Form der optimalen Hyperfläche bestimmen. In Abschnitt 4.4 ist eine Einleitung in verschiede Methoden gegeben, die wir für die Auswahl von Deskriptoren genutzt haben. In diesem Abschnitt wird der Unterschied zwischen einer „Filter“- und der „Wrapper“-basierten Auswahl von Deskriptoren herausgearbeitet. In Veröffentlichung 3 (Abschnitt 7.3) haben wir die Vorteile und Nachteile von Filter- und Wrapper-basierten Methoden im virtuellen Screening vergleichend dargestellt. Abschnitt 7 besteht aus den Publikationen, die unsere Forschungsergebnisse enthalten. Unsere erste Publikation (Veröffentlichung 1) war ein Übersichtsartikel (Abschnitt 7.1). In diesem Artikel haben wir einen Gesamtüberblick der Anwendungen von SVM in der Bio- und Chemieinformatik gegeben. Wir diskutieren Anwendungen von SVM für die Gen-Chip-Analyse, die DNASequenzanalyse und die Vorhersage von Proteinstrukturen und Proteininteraktionen. Wir haben auch Beispiele beschrieben, wo SVM für die Vorhersage der Lokalisation von Proteinen in der Zelle genutzt wurden. Es wird dabei deutlich, dass SVM im Bereich des virtuellen Screenings noch nicht verbreitet war. Um den Einsatz von SVM als Hauptmethode unserer Forschung zu begründen, haben wir in unserer nächsten Publikation (Veröffentlichung 2) (Abschnitt 7.2) einen detaillierten Vergleich zwischen SVM und verschiedenen neuronalen Netzen, die sich als eine Standardmethode im virtuellen Screening etabliert haben, durchgeführt. Verglichen wurde die Trennung von wirstoffartigen und nicht-wirkstoffartigen Molekülen („Druglikeness“-Vorhersage). Die SVM konnte 82% aller Moleküle richtig klassifizieren. Die Klassifizierung war zudem robuster als mit dreilagigen feedforward-ANN bei der Verwendung verschiedener Anzahlen an Hidden-Neuronen. In diesem Projekt haben wir verschiedene Deskriptoren zur Beschreibung der Moleküle berechnet: Ghose-Crippen Fragmentdeskriptoren [86], physikochemische Eigenschaften [9] und topologische Pharmacophore (CATS) [10]. Die Entwicklung von weiteren Verfahren, die auf dem SVM-Konzept aufbauen, haben wir in den Publikationen in den Abschnitten 7.3 und 7.8 beschrieben. Veröffentlichung 3 stellt die Entwicklung einer neuen SVM-basierten Methode zur Auswahl von relevanten Deskriptoren für eine bestimmte Aktivität dar. Eingesetzt wurden die gleichen Deskriptoren wie in dem oben beschriebenen Projekt. Als charakteristische Molekülgruppen haben wir verschiedene Untermengen der COBRA Datenbank ausgewählt: 195 Thrombin Inhibitoren, 226 Kinase Inhibitoren und 227 Faktor Xa Inhibitoren. Es ist uns gelungen, die Anzahl der Deskriptoren von ursprünglich 407 auf ungefähr 50 zu verringern ohne signifikant an Klassifizierungsgenauigkeit zu verlieren. Unsere Methode haben wir mit einer Standardmethode für diese Anwendung verglichen, der Kolmogorov-Smirnov Statistik. Die SVM-basierte Methode erwies sich hierbei in jedem betrachteten Fall als besser als die Vergleichsmethoden hinsichtlich der Vorhersagegenauigkeit bei der gleichen Anzahl an Deskriptoren. Eine ausführliche Beschreibung ist in Abschnitt 4.4 gegeben. Dort sind auch verschiedene „Wrapper“ für die Deskriptoren-Auswahl beschrieben. Veröffentlichung 8 beschreibt die Anwendung von aktivem Lernen mit SVM. Die Idee des aktiven Lernens liegt in der Auswahl von Molekülen für das Lernverfahren aus dem Bereich an der Grenze der verschiedenen zu unterscheidenden Molekülklassen. Auf diese Weise kann die lokale Klassifikation verbessert werden. Die folgenden Gruppen von Moleküle wurden genutzt: ACE (Angiotensin converting enzyme), COX2 (Cyclooxygenase 2), CRF (Corticotropin releasing factor) Antagonisten, DPP (Dipeptidylpeptidase) IV, HIV (Human immunodeficiency virus) protease, Nuclear Receptors, NK (Neurokinin receptors), PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), Thrombin, GPCR und Matrix Metalloproteinasen. Aktives Lernen konnte die Leistungsfähigkeit des virtuellen Screenings verbessern, wie sich in dieser retrospektiven Studie zeigte. Es bleibt abzuwarten, ob sich das Verfahren durchsetzen wird, denn trotzt des Gewinns an Vorhersagegenauigkeit ist es aufgrund des mehrfachen SVMTrainings aufwändig. Die Publikationen aus den Abschnitten 7.5, 7.6 und 7.7 (Veröffentlichungen 5-7) zeigen praktische Anwendungen unserer SVM-Methoden im Wirkstoffdesign in Kombination mit anderen Verfahren, wie der Ähnlichkeitssuche und neuronalen Netzen zur Eigenschaftsvorhersage. In zwei Fällen haben wir mit dem Verfahren neuartige Liganden für COX-2 (cyclooxygenase 2) und dopamine D3/D2 Rezeptoren gefunden. Wir konnten somit klar zeigen, dass SVM-Methoden für das virtuelle Screening von Substanzdatensammlungen sinnvoll eingesetzt werden können. Es wurde im Rahmen der Arbeit auch ein schnelles Verfahren zur Erzeugung großer kombinatorischer Molekülbibliotheken entwickelt, welches auf der SMILES Notation aufbaut. Im frühen Stadium des Wirstoffdesigns ist es wichtig, eine möglichst „diverse“ Gruppe von Molekülen zu testen. Es gibt verschiedene etablierte Methoden, die eine solche Untermenge auswählen können. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die genauer als die bekannte MaxMin-Methode sein sollte. Als erster Schritt wurde die „Probability Density Estimation“ (PDE) für die verfügbaren Moleküle berechnet. [78] Dafür haben wir jedes Molekül mit Deskriptoren beschrieben und die PDE im N-dimensionalen Deskriptorraum berechnet. Die Moleküle wurde mit dem Metropolis Algorithmus ausgewählt. [87] Die Idee liegt darin, wenige Moleküle aus den Bereichen mit hoher Dichte auszuwählen und mehr Moleküle aus den Bereichen mit niedriger Dichte. Die erhaltenen Ergebnisse wiesen jedoch auf zwei Nachteile hin. Erstens wurden Moleküle mit unrealistischen Deskriptorwerten ausgewählt und zweitens war unser Algorithmus zu langsam. Dieser Aspekt der Arbeit wurde daher nicht weiter verfolgt. In Veröffentlichung 6 (Abschnitt 7.6) haben wir in Zusammenarbeit mit der Molecular-Modeling Gruppe von Aventis-Pharma Deutschland (Frankfurt) einen SVM-basierten ADME Filter zur Früherkennung von CYP 2C9 Liganden entwickelt. Dieser nichtlineare SVM-Filter erreichte eine signifikant höhere Vorhersagegenauigkeit (q2 = 0.48) als ein auf den gleichen Daten entwickelten PLS-Modell (q2 = 0.34). Es wurden hierbei Dreipunkt-Pharmakophordeskriptoren eingesetzt, die auf einem dreidimensionalen Molekülmodell aufbauen. Eines der wichtigen Probleme im computerbasierten Wirkstoffdesign ist die Auswahl einer geeigneten Konformation für ein Molekül. Wir haben versucht, SVM auf dieses Problem anzuwenden. Der Trainingdatensatz wurde dazu mit jeweils mehreren Konformationen pro Molekül angereichert und ein SVM Modell gerechnet. Es wurden anschließend die Konformationen mit den am schlechtesten vorhergesagten IC50 Wert aussortiert. Die verbliebenen gemäß dem SVM-Modell bevorzugten Konformationen waren jedoch unrealistisch. Dieses Ergebnis zeigt Grenzen des SVM-Ansatzes auf. Wir glauben jedoch, dass weitere Forschung auf diesem Gebiet zu besseren Ergebnissen führen kann.
Drug target 5-lipoxygenase : a link between cellular enzyme regulation and molecular pharmacology
(2005)
Leukotriene (LT) sind bioaktive Lipidmediatoren, die in einer Vielzahl von Entzündungskrankheiten wie z.B. Asthma, Psoriasis, Arthritis oder allergische Rhinitis involviert sind. Des Weiteren spielen LT in der Pathogenese von Erkrankungen wie Krebs, Osteoarthritis oder Atherosklerose eine Rolle. Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Enzym, das für die Bildung von LT verantwortlich ist. Aufgrund der physiologischen Eigenschaften der LT, ist die Entwicklung von potentiellen Arzneistoffen, welche die 5-LO als Zielstruktur besitzen, von erheblichem Interesse. Die Aktivität der 5-LO wird in vitro durch Ca2+, ATP, Phosphatidylcholin und Lipidhydroperoxide (LOOH) und durch die p38-abhängige MK-2/3 5-LO bestimmt. Inhibitorstudien weisen darauf hin, dass der MEK1/2-Signalweg ebenfalls in vivo an der 5-LO Aktivierung beteiligt ist. Hauptziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, welche Rolle der MEK1/2-Signalweg bei der Aktivierung der 5-LO besitzt und welchen Einfluss der 5-LO Aktivierungsweg auf die Wirksamkeit potentieller Inhibitoren hat. „In gel kinase“ und „In vitro kinase“ Untersuchungen zeigten, dass die 5-LO ein Substrat für die Extracellular signal-regulated kinase (ERK) und MK-2/3 darstellt. Der Zusatz von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (UFA), wie AA oder Ölsäure, verstärkte den Phosphorylierungsgrad der 5-LO sowohl durch ERK1/2 als auch durch MK-2/3. Die genannten Kinasen sind demnach auch für die 5-LO Aktivierung durch natürliche Stimuli verantwortlich, die den zellulären Ca2+-Spiegel kaum beeinflussen. Daraus ist ersichtlich, dass die Phosphorylierung der 5-LO durch ERK1/2 und/oder MK-2/3 einen alternativen Aktivierungsmechanismus neben Ca2+ darstellt. Ursprünglich wurden Nonredox-5-LO-Inhibitoren als kompetitive Wirkstoffe entwickelt, die mit AA um die Bindung an die katalytische Domäne der 5-LO konkurrieren. Vertreter dieser Inhibitoren, wie ZM230487 und L-739,010, zeigen eine potente Hemmung der LT-Biosynthese in verschiedenen Testsystemen. Sie scheiterten jedoch in klinischen Studien. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass die Wirksamkeit dieser Inhibitoren vom Aktivierungsweg der 5-LO abhängig ist. Verglichen mit 5-LO Aktivität, die durch den unphysiologischen Stimulus Ca2+-Ionophor induziert wird, erfordert die Hemmung zellstress-induzierter Aktivität eine 10- bis 100-fach höhere Konzentration der Nonredox-5-LO-Inhibitoren. Die nicht-phosphorylierbare 5-LO Mutante (Ser271Ala/Ser663Ala) war wesentlich sensitiver gegenüber Nonredox-Inhibitoren als der Wildtyp, wenn das Enzym durch 5-LO Kinasen aktiviert wurde. Somit zeigen diese Ergebnisse, dass, im Gegensatz zu Ca2+, die 5-LO Aktivierung mittels Phosphorylierung die Wirksamkeit der Nonredox-Inhibitoren deutlich verringert. Des Weiteren wurde das pharmakologische Profil des neuen 5-LO Inhibitors CJ-13,610 mittels verschiedener in vitro-Testsysteme charakterisiert. In intakten PMNL, die durch Ca2+-Ionophor stimuliert wurden, hemmte die Substanz die 5-LO Produktbildung mit einem IC50 von 70 nM. Durch Zugabe von exogener AA, wird die Wirkung vermindert und der IC50 des Inhibitors steigt an. Dies deutet auf eine kompetitive Wirkweise hin. Wie die bekannten Nonredox-Inhibitoren, verliert auch CJ-13,610 seine Wirkung bei erhöhtem zellulärem Peroxidspiegel. Der Inhibitor CJ-13,610 zeigt jedoch keine Abhängigkeit vom Aktivierungsweg der 5-LO. Grundsätzlich ist es also von fundamentaler Bedeutung bei der Entwicklung von neuen Arzneistoffen, die zellulären Zusammenhänge, insbesondere die Regulierung der Aktivität von Enzymen, zu kennen. Wie in dieser Arbeit gezeigt, hat die Phosphorylierung der 5-LO einen starken Einfluss auf die Regulation der 5-LO Aktivität und eine elementare Wirkung auf die Hemmung des Enzyms durch verschiedene Wirkstoffe.