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P2X receptor subunits assemble in the ER of Xenopus oocytes to homomultimeric or heteromultimeric complexes that appear as ATP-gated cation channels at the cell surface. In this work it was intended to investigate the posttranslational modifications such as N-linked glycosylation and disulfide bond formation that is undergone by P2X1 receptors. In addition, the aim of this study was to examine the expression and the quaternary structure of selected P2X receptor isoforms in Xenopus oocytes. The investigation of the quaternary structure of the metabolically or surface labeled His-P2X2 receptor by BN-PAGE revealed that, while the protein complex is only partially assembling in oocytes, the plasma membrane form of the His-P2X2 receptor assembled into trimeric and even hexameric complex as was shown by the BN-PAGE analysis. Besides this finding, it is shown that the His-P2X5 protein that was purified from metabolically or surface labeled oocytes appeared as one single band corresponding to a trimer when analyzed by BN-PAGE. The present study signified that His-P2X6 alone does not reach a defined assembly status and possibly needs the hetero-polymerisation with other P2X subunits to assemble properly for insertion into the plasma membrane. Another finding of this study is that the P2X1 and P2X2 subunits could exist as heteromultimeric protein complexes in the plasma membrane of cells. Purification of surface expressed His-P2X2 subunit allowed the detection of co-injected P2X1 subunit and vice versa in Xenopus oocytes. Incubation with glutardialdehyde led to the cross-linking of P2X2 and P2X1 subunits to dimers and trimers. BN-PAGE analysis of the P2X2/P2X1 complex isolated under nondenaturing conditions from surface-labeled oocytes yielded one distinct band corresponding to a trimeric complex. The analysis of a C-terminally GFP tagged His-P2X1 fusion protein by confocal fluorescence microscopy revealed small clusters of the protein complexes, approximately 4-6 µm in diameter from a diffuse distribution of the protein in the plasma membranes of Xenopus oocytes. The cross-linking or BN-PAGE analysis of the fusion protein resulted in proteins that migrated quantitatively as trimers when purified in digitonin. The analysis of some chimeric constructs confirmed the results of others, which showed that desensitization can be removed from the P2X1 or P2X3 receptor by providing the N-domain from the P2X2 receptor (Werner et al., 1996) The exchange of this domain did not alter the quaternary structure of the chimeras, which showed to be present as trimers when expressed in oocytes. In addition, glycan minus mutants of His-P2X1 receptor were analyzed to examine whether carbohydrate side chains are important for P2X1 subunit assembly, surface expression, or ligand recognition. SDS-PAGE analysis of glycan minus mutants carrying Q instead of N at five individual NXT/S sequons reveals that 284N remains unused because of a proline in the 4 position. The four other sites (153Asn, 184N, 210N, and 300N) carry N-glycans, but solely 300N acquires complex-type carbohydrates. Like parent P2X1 receptor, glycan minus mutants migrate as homotrimers when resolved by blue native PAGE. Recording of ATP-gated currents revealed that elimination of 153N or 210N diminishes or increases functional expression levels, respectively. In addition, elimination of 210N causes a 3-fold reduction of the potency for ATP. If three or all four N-glycosylation sites are simultaneously eliminated, formation of P2X1 receptors is severely impaired or abolished, respectively. It is concluded that at least one N-glycan per subunit of either position is absolutely required for the formation of P2X1 receptors. The SDS-PAGE analysis of surface-labeled His-P2X2 and His-P2X5 receptors revealed that, while the His-P2X2 subunit acquires three complex-type carbohydrates, in case of His-P2X5 polypeptide, only two of the three N-glycans could obtain complex-type carbohydrates during transit of the Golgi apparatus. Furthermore, it was shown that DTT treatment blocked the appearance of newly made His-P2X1 at the plasma membranes of Xenopus oocytes. Also, it was revealed that the effects of DTT on His-P2X1 biogenesis are fully reversible. Removal of the reducing agent leads to subsequent folding and assembly into His-P2X1 receptor complex, followed by transport to the cell surface. The characterization of cysteine minus mutants by SDS PAGE and BN-PAGE demonstrated that, the cysteine substitution in the first cysteine rich domain (C1 - C6) does not have a major effect on assembly for the mutant receptors. In contrast, the replacement of the four cysteine residues (C7 - C10) from the second cysteine rich domain demonstrate a critical importance of this domain for the functional surface expression of P2X1 receptor. The investigations of several double cysteine mutants revealed that according to a similarity in the sensitivity to ATP, the C1 and C6, as well as C2 and C4 and finally C3 and C5 are pairs forming two disulfide bonds in each P2X1 subunit.
More than 70 years ago, the effects of extracellular adenosine 5'-triphosphate (ATP), a newly identified and purified biomolecule at that time (Fiske and Subbarow, 1925; Lohmann, 1929) were observed by Drury and Szent-Györgyi (1929). Since then, many pharmacological studies were carried out with extracellular adenine nucleotides in various intact organ systems, isolated tissues, and purified cell preparations. Yet it was not until 1972 that Burnstock introduced the concept of "purinergic nerves" and suggested that ATP might fulfil the criteria generally regarded as necessary for establishing a substance as a neurotransmitter, summarised by Eccles (1964):
• synthesis and storage of transmitter in nerve terminals
Strips of guinea-pig taenia coli (GPTC) were shown to take up large amounts of tritium-labelled adenosine when incubated with tritium-labelled adenosine, adenosine 5'-monophosphate (AMP), adenosine 5'-diphosphate (ADP) and ATP. The nucleoside was rapidly converted into and retained largely as [ 3 H]-ATP (Su et al., 1971).
• release of transmitter during nerve stimulation
Spontaneous relaxation of GPTC as well as relaxations induced by nerve stimulation or nicotine, respectively, in the presence of compounds which block adrenergic and cholinergic responses were accompanied by a remarkable increase in release of tritium-labelled material from taenia coli incubated in [ 3 H]-adenosine (Su et al., 1971).
• postjunctional responses to exogenous transmitters that mimic responses to nerve stimulation
Burnstock et al. (1966) characterised ATP and ADP as the most potent inhibitory purine compounds in the gut and observed that the effects of ATP mimic more closely the inhibitory response of the taenia to non-adrenergic nerve-stimulation than to adrenergic nerve stimulation (Burnstock et al., 1970).
enzymes that inactivate the transmitter and/or uptake systems for the transmitter or its breakdown products
When ATP was added to a perfusion fluid recycled through the vasculature of the stomach, very little ATP remained, but the perfusate contained substantially increased amounts of adenosine and inosine, as well as some ADP and AMP (Burnstock et al., 1970).
• drugs that can produce parallel blocking of potentiating effects on the responses of both exogenous transmitter and nerve stimulation
Tachyphylaxis to ATP produced in the rabbit ileum resulted in a consistent depression of responses to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation, whereas responses to adrenergic nerve stimulation remained unaffected (Burnstock et al., 1970). Lower concentrations of quinidine reduced and finally abolished relaxation of GPTC induced by noradrenaline (NA) and by adrenergic nerve stimulation. Using higher concentrations of the compound, relaxant responses of GPTC to ATP as well as to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation were abolished (Burnstock et al., 1970). ...
The substantia nigra is not the induction site in the brain of the neurodegenerative process that underlies Parkinson’s disease. Instead, the results of this semiquantitative study of 30 autopsy cases with incidental Lewy body pathology indicate that Parkinson’s disease in the brain commences with the formation of the very first immunoreactive Lewy neurites and Lewy bodies in noncatecholaminergic visceromotor neurons of the dorsal glossopharyngeusvagus complex, in projection neurons of the intermediate reticular zone, and in specific nerve cell types of the gain setting system (coeruleussubcoeruleus complex, caudal raphe nuclei, gigantocellular reticular nucleus), olfactory bulb, olfactory tract, and/or anterior olfactory nucleus in the absence of nigral involvement. The topographical parcellation of the nuclear grays described here is based upon known architectonic analyses of the human brain stem and takes into consideration the pigmentation properties of a few highly susceptible nerve cell types involved in Parkinson’s disease. In this sample and in all 58 ageand gendermatched controls, Lewy bodies and Lewy neurites do not occur in any of the known telencephalic Parkinson’s disease predilection sites (hippocampal formation, temporal mesocortex, proneocortical cingulate areas, amygdala, basal nucleus of Meynert, interstitial nucleus of the diagonal band of Broca, hypothalamic tuberomamillary nucleus).
One of the most species-rich ant-plant mutualisms worldwide is the palaeotropical Crematogaster-Macaranga system. The pioneer-tree genus Macaranga (Euphorbiaceae) is mainly inhabited by at least nine specific species of Crematogaster (Myrmicinae), of which eight belong to the subgenus Decacrema, as well as several species of Camponotus (Formicinae). Ant species are not randomly distributed among the Macaranga host plants but distinct patterns of associations have been found (Fiala et al., 1999 and references cited therein). The specificity of the associations is maintained in spite of common sympatric distribution of several host-plant species. Associations are, however, usually not species-specific and especially the Decacrema ants, that are the focus of this study, usually colonize several host plant species each. In this study I used a combined approach of ecological data as well as phylogenetic data based on mitochondrial DNA sequences in order to elucidate the factors determining the patterns found in the associations and the evolution of this mutualistic system between the specific Decacrema ant partners and their Macaranga host plants. Life history traits of seven different morphospecies found on the most common Macaranga host plants were compared and colony development was followed from colony founding on saplings to adult trees. Temporal variability of the associations between Decacrema ants and their respective host plants was also examined. Associations between Crematogaster ants of the subgenus Decacrema and their Macaranga host plants were found to be stable over periods of time, long enough to enable reproduction of the ant colony and (in most cases) the host plants, too. Life-expectancy of the ant colony seems to be shorter than that of the host plant in general. All adult trees still provide nesting space as well as food for the ants. Colonies from different morphospecies differed in longevity, the onset of alate production, queen number and mode of colony founding. The examined Decacrema species could be placed into two groups according to their life-history traits as well as on morphological grounds: The decamera-group and the captiosa-group, each named after one species that could be synonymized with one morphospecies included in the group. Members of the captiosa-group have larger colonies, presumably with a longer life-span, and a later onset of reproduction compared to the decamera-group. Additionally, queens of the captiosa-group found colonies on saplings as well as in the crown region of bigger trees, whereas queens of the decamera-group found colonies on saplings and small treelets only. Queens belonging to the captiosa-group are brown with relatively large eyes (= 1/3 of the head length), whereas queens from the decamera-group are smaller in size, are dark brown to black in colour and have smaller eyes (< 1/3 of the head length). On some of the host plants examined in this study lifespan of the host plant and their specific ant partners seemed to be well matched whereas on others an ontogenetic succession of specific Decacrema partner ants was found, when host plants were abandoned due to the death of comparatively short-lived ant colonies, usually from species belonging to the decamera-group. Ant-partners of saplings or young plants often differed from specific partner ants found on bigger trees. Only species belonging to the captiosa-group were found to re-colonize the crown region of adult trees, thus facilitating a change of ant species, when longlived host plant species were colonized by relatively short-lived species from the decamera-group first. When long -lived host plants were colonized by long-lived species from the captiosa-group associations were stabler: I did not find any temporal variation in ant-inhabitants then. Life-span of the ant colony as well colony founding behaviour of the different partner ant species therefore play an important role for these ontogenetic changes and the specificity of the associations over time. For the host plant the ontogenetic changes have a strong impact as uninhabited host plants that are not patrolled by workers of specific ant partners suffer higher herbivore damage. Uninhabited host plants may also be colonized by unspecific arboreal ants that only make use of the nesting space and/ or food offered by the plant but do not confer protection against herbivores. Stable associations with a specific ant partner are therefore most beneficial for the host plants. Usually ant colonies are monogynous, but changes in the colony structure were found locally in two Decacrema species. I found colonies that turned secondarily polygynous, possibly after the death of the original founding queen. Secondary polygyny therefore can prolong the life-span of the antcolony on its host plant, leading to a parallel life-history and stable association as it was the case in Macaranga bancana-Crematogaster captiosa. However, in the other association (Macaranga hypoleuca-Crematogaster cf. decamera) life-expectancy of the ant-colony is still much shorter than that of its host plant species, leading to a change in the specific ant partner at a later stage. Pleometrotic foundress associations that directly led to polygynous colonies in one species were also found locally, a phenomenon hardly ever reported from ants in general. Foundress associations were found to be more successful in establishing colonies than single queens. I found indications that this change in colony founding behaviour might be due to interspecific competition for the same host plant species with another Decacrema species specific to Macaranga. For the phylogenetic analysis partial mitochondrial cytochrome oxidase I and II were sequenced and Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood as well as Bayesian analyses were performed. The four different analyses yielded phenetic as well as phylogenetic trees that all had a similar topology. Ants of the subgenus Decacrema formed a monophyletic clade, indicating a single colonization event at the beginning of the Macaranga-Decacrema symbiotic system. In the phylogenetic analysis the decamera-group as well as the captiosa-group were confirmed and clearly separated from each other. However, two species that would have been placed into the decamera-group, due to morphological as well as life-history traits, formed a third separate clade within the Decacrema. These two species (msp. 7- group) as well as the decamera-group came out as the basal groups in the phylogenetic analysis. Thus, life -history traits of these two groups (relatively small colonies, early onset of alate production, colony founding in ground region only) would be the ancestral state for Macarangaassociated ants of the subgenus Decacrema. Changes in colony structure, like secondary polygyny, were found in the captiosa- as well as the decamera-group and are therefore independent of the affiliation within the phylogeny. I did not find evidence for strict cocladogenesis between the subgenus Decacrema and their Macaranga host-plants, although ecological interactions between the two partner groups are close and associations can be rather specific. The phylogenies presented here, along with the known association patterns indicate that host-shifting of the ants is common in some of the species, opening the possibility of sympatric speciation as a result of increased host usage. Additionally, the considerable geographic substructuring found in the phylogenetic trees suggests that allopatric speciation has played a major role in diversification of the Decacrema ants.
Zwei der wichtigsten Leistungen eines sich entwickelnden Embryos sind der Aufbau des Blutkreislauf- und des Nervensystems. Beide Systeme sind hierarchisch organisierte Strukturen, deren Verzweigungen nahezu alle Teile des Körpers erreichen. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen darauf, dass ihre Entwicklung eng miteinander verknüpft ist, nach ähnlichen Prinzipien verläuft und verwandte molekulare Mechanismen verwendet. Die Entstehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks erfordert Signale, die Prozesse wie die Lenkung und die Verzweigung von Gefäßen in den Zielgeweben kontrollieren. Ähnliche Anforderungen werden an wachsende Axone bei der Knüpfung der Verbindungen des Nervensystems während der Embryonalentwicklung gestellt. Einige der Faktoren, die die Lenkung der Axone kontrollieren, spielen auch eine ähnliche Rolle in der vaskulären Entwicklung. Lenkungsmoleküle, die eine Richtungsinformation vermitteln, sind für die Wegfindung der Axone besonders wichtig. Die größte Familie solcher Lenkungsmoleküle wird durch die Semaphorine gebildet. Semaphorine können in acht Klassen unterteilt werden, deren gemeinsames Merkmal eine konservierte Semaphorin-Domäne ist und die unterschieden werden anhand ihrer Klassen-spezifischen carboxyterminalen Domänen. Die Semaphorin-Familie umfasst sowohl sekretierte als auch membrangebundene Proteine. Die am besten charakterisierten hiervon sind die sekretierten Klasse 3 Semaphorine. Eine Kombination von in vitro und in vivo Ansätzen zeigte, dass die Klasse 3 Semaphorine an der Steuerung der Axon- und Dendritenlenkung, der Bildung von Axonbündeln und der neuronalen Migration während der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind. Sie agieren hauptsächlich als repulsiv wirkende Signale, die Axone aus Regionen ausschließen, von den Geweben weg, in denen sie exprimiert sind. Diese Wirkung wird über die Semaphorin-Domäne vermittelt. Verschiedene Hinweise deuten auf eine Beteiligung von Semaphorinen an der Entwicklung des vaskulären Systems. Sowohl homozygote Sema3a- als auch Sema3c-Mausnullmutanten sterben nach der Geburt aufgrund kardiovaskulärer Defekte. Darüber hinaus binden die Rezeptoren für die Klasse 3 Semaphorine, Neuropilin-1 (Nrp-1) und –2 (Nrp-2), einige Isoformen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Neuropilin-1 und Neuropilin-2-defiziente Mäuse und Neuropilin-1/-2-Doppelmutanten weisen Defekte des Gefäßsystems auf, wie z.B. eine Rückbildung der neuralen Vaskularisierung und Abweichungen in der Entwicklung des Herzens und der großen Gefäße. Die membrangebundenen Semaphorine sind bisher nur wenig untersucht, da zuverlässige in vitro Assays fehlen. Somit ist ein genetischer Ansatz der beste Weg, die physiologische Funktion dieser Proteine zu untersuchen. Aus diesen Gründen war die Zielsetzung dieser Arbeit, durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen eine Mauslinie herzustellen, die ein Nullallel des membrangebundenen Sema5a-Gens trägt. Für diesen Ansatz wurde ein Mitglied der Klasse 5 Semaphorine gewählt, da es nur zwei Mitglieder dieser Klasse im Mausgenom gibt, die weitgehend komplementäre Expressionsmuster aufweisen. Damit unterscheiden sie sich von den anderen Klassen der Semaphorine, deren Mitglieder stark überlappende Expressionsmuster zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer gegenseitigen funktionellen Kompensation nach Mutation eines Gens. Die Klasse 5 Semaphorine sind auch deshalb besonders interessant, da sie die einzigen sind, die sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten vertreten sind. Sie sind gekennzeichnet durch sieben carboxyterminale Typ 1-Thrombospondinmodule (TSP) in ihrer extrazellulären Domäne. TSPs wurden ursprünglich in den Proteinen Thrombospondin 1 und 2 gefunden, in denen sie das Auswachsen von Neuriten verschiedener Nervenzelltypen fördern. Dies lässt vermuten, dass Klasse 5 Semaphorine sowohl inhibierende als auch stimulierende Effekte haben könnten, in dem sie unterschiedliche Rezeptoren mit der Semaphorin-Domäne oder der TSPs aktivieren. Das Expressionsmuster von Sema5A und die bekannte Funktion von Semaphorinen in der Ausbildung neuronaler Verbindungen lassen es sinnvoll erscheinen, bei der Untersuchung der mutanten Tiere den Schwerpunkt auf die Entwicklung des Nerven- und des Gefäßsystems zu legen. Aufgrund technischer Schwierigkeiten konnte innerhalb der Bearbeitungszeit dieser Doktorarbeit nur der Phänotyp des vaskulären Systems untersucht werden. Die Inaktivierung des Sema5a-Gens wurde durch die Verwendung eines ‚Targeting’-Vektors erreicht, welcher die Exone 4 und 5 des Sema5a-Gens durch eine Neomycin-Selektionskassette ersetzte. Aus 144 untersuchten ES-Zellklonen wurden drei ES-Zellinien mit einem rekombinierten Sema5a-Locus identifiziert. Zwei der positiven Klone wurden zur Herstellung einer chimären Maus durch die Morula-Aggregationsmethode verwendet. Mit einem der Klone konnte eine männliche Chimäre erzeugt werden, die nach Kreuzung mit NMRI-Wildtyptieren die Mutation an die Nachkommen weitergab. Der Verlust der Proteinexpression in homozygoten Sema5a-Mutanten wurde durch Westernblot-Analyse von Zellmembranpräparationen homozygoter Embryonen unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytoplasmatische Ende von Sema5A bestätigt. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Deletion des vierten und fünften Exons des Sema5a-Gens ein Nullallel hervorbringt. Nach Verpaarungen heterozygoter Mutanten konnten keine Neugeborenen identifiziert werden, die homozygot für das mutierte Allel waren. Homozygte Mutanten starben zwischen E11,5 und E12,5 der Embryonalentwicklung, der Verlust von Sema5A ist also embryonal letal. Die Morphologie der homozygoten Tiere zeigte keinen offensichtlichen Unterschied zu den heterozygoten Embryonen oder zu Wildtyp-Geschwistern auf. Frühe embryonale Musterbildungsprozesse in Sema5a-Nullmutanten sind also nicht gestört. Ein Tod bei dieser Entwicklungsstufe deutet auf einen Defekt in der Entwicklung des Blutgefäßsystems hin, da die Embryonalstadien zwischen E9 und E13 besonders wichtig für die Ausbildung dieser Gefäße sind und viele Mutationen, die Herz und Blutgefäßen beeinträchtigen, den Tod der Embryonen in diesem Stadium bewirken. Das embryonale Blutgefäßsystem in E10,5 und E11,5 Embryonen wurde durch immunhistochemische Färbungen ganzer Embryonen unter Verwendung eines spezifischen gegen das Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM) gerichteten Antikörpers dargestellt, welches in vaskulären Endothelzellen exprimiert ist. Die allgemeine Architektur des Gefäßsystems war in homo- und heterozygoten Mutanten ähnlich und wies weder an E10,5 noch an E11,5 besondere Abweichungen auf. Es wurden bei der Lage und der Anzahl intersomitischer Gefäße, der Entwicklung der dorsalen Aorta oder der Vaskularisierung der Extremitätenanlagen keine Abweichungen festgestellt. Morphologische Defekte konnten jedoch bei E10,5 in den Verästelungen der Blutgefäße detektiert werden, die von den Hauptvenen der Cranialregion abzweigen. Die Verzweigungen waren geringer ausgeprägt als in heterozygoten oder Wildtyp-Vergleichstieren. Insbesondere zeigte sich eine Verringerung der Anzahl sekundärer und tertiärer Verzweigungen. In dem sich entwickelnden Embryo führt die wiederholte Verzweigung von Ästen der Hauptvenen zu einem hierarchisch gegliederten Netzwerk großer Gefäße in der Region des medialen Kopfes. Während die Ausbildung dieses Netzwerkes in den Sema5a-/--Tieren beeinträchtigt ist, erscheint die Organisation der kleinen Gefäße in den mehr dorsal und peripher gelegenen Regionen des Kopfes normal. In heterozygoten und homozygoten Mutanten bilden die kleineren Gefäße ein dicht verzweigtes Netzwerk. Die Verminderung der Komplexität der größeren Gefäße konnte in allen untersuchten Nullmutanten beobachtet werden. Es variierte jedoch die Penetranz des Phänotyps. In allen Fällen war die Anzahl primärer Verzweigungen unverändert, während die Anzahl der sekundären und der tertiären Verzweigungen zu unterschiedlichen Graden reduziert war. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Verzweigungsmuster von heterozygoten Mutanten und beim Wildtyp nur eine geringe Variabilität zwischen individuellen Embryonen. Dies belegt, dass die Verminderung des Verzweigungsgrades größerer Gefäße nicht innerhalb der normalen Variabilität liegt, sondern durch die Inaktivierung des Sema5a-Gens verursacht wird. Dieser Phänotyp ist in späteren Stadien sogar deutlicher ausgeprägt. In E11,5 Embryonen waren die Stämme der großen Blutgefäße in den Nullmutanten weniger komplex und in einigen Fällen trat sogar eine Reduzierung der Anzahl primärer Verzweigungen auf. Diese spätere Verminderung der Anzahl bereits ausgebildeter primärer Verzweigungen legt nahe, dass der Phänotyp durch eine Rückbildung von Verzweigungen aufgrund möglicher Defizite in deren Reifung und/oder Stabilisierung erfolgt. Die interessanteste Besonderheit der vaskulären Defekte in den Nullmutanten liegt in ihrer regionalen Spezifität. Bis hier ist das Netzwerk großer Gefäße, welches der anterioren Hauptvene entspringt, das einzige Gefäßsystem, in dem Abweichungen entdeckt wurden. Dieses Netzwerk wird durch die strukturelle Umbildung des primären kapillaren Plexuses gebildet. Zwischen E9,5 und E12 sprießen Zweige rostral aus der Hauptvene, um ein hierarchisch organisiertes Netzwerk von Gefäßen zu bilden. Die Umbildung des primären kapillaren Plexus in den mehr rostral und ventral gelegenen Kopfregionen führt zu der Bildung eines hochverzweigten vaskulären Netzwerkes, welches jedoch bei E10,5 noch nicht hierarchisch organisiert erscheint. Die Signale, die für diesen unterschiedlichen Ablauf der Musterbildung während der Entwicklung des Gefäßsystems des Kopfes verantwortlich sind, sind noch unbekannt. Die besonderen Defekte in der stereotypischen Organisation der cranialen Gefäße in Sema5a-Mutanten legt nahe, dass Sema5A eines dieser Signale sein könnte. Es könnte Teil eines Rezeptor/Ligandenkomplexes sein, welcher positionelle Signale für das Verzweigen und das Wachstum großer Gefäße in rostraler Richtung liefert. Sema5A könnte die Bildung von Verzweigungen durch die Regulierung der Wanderung endothelialer Zellen, ihrer Proliferation oder ihrer Interaktion mit unterstützenden Zellen oder der extrazellulären Matrix kontrollieren. Sema5A könnte Teil eines neuen Signalweges sein oder als Teil eines der bekannten Signalwegs wirken, welcher die Entwicklung des Gefäßsystems reguliert. Einer der Signalwege, die essentiell für die Gefäßbildung sind, wird durch VEGF und Angiopoietin (Ang-1) reguliert. Sowohl in VEGF-, als auch in Ang-1-Mutanten ist die Gefäßumbildung im Kopf beeinträchtigt. Insbesondere erscheint das Netzwerk kleiner Gefäße in den Ang-1 Nullmutanten als nur nur teilweise restrukturiert und die großen Gefäße als weniger komplex. Das Verzweigungsmuster der großen Gefäße in den Ang-1- Nullmutanten ähnelt auffallend dem der Sema5a-Nullmutanten. Eine zweite Ähnlichkeit in den Phänotypen von Ang-1- und Sema5a-Mutanten zeigt sich in der Reduzierung der primären Verzweigungen, welche in den Sema5a-Nullmutanten bei E11,5 beobachtet wird. Hier könnte die Verminderung aus einer Rückbildung von Gefäßen resultieren, wie sie auch typischerweise in Mutanten für Ang-1 oder dessen Rezeptor auftritt. Diese Beobachtung legt nahe, dass Sema5A ein neuer Teilnehmer innerhalb des Ang-1-Signalweges ist, welcher die Auswirkung von Ang-1 auf die endothelialen Zellen der großen Gefäße entweder vermittelt oder moduliert und dadurch das spezifische Muster der Blutgefäße des Kopfes beeinflußt. Mit dieser Doktorarbeit wird zum ersten Mal eine funktionelle Untersuchung des Klasse 5 Semaphorins Sema5A vorgestellt. Die phänotypische Untersuchung von Mäusen, die Nullallele für Sema5a-Gens tragen ergab, dass dieses membrangebundene Protein essentiell für die embryonale Entwicklung ist. Es ist an der Musterbildung des Gefäßsystems beteiligt. Seine Aufgabe besteht möglicherweise darin, die Bereitstellung positioneller Signale für die Ausbildung von Gefäßverzweigungen zu gewährleisten. Einige grundlegende Fragen werden durch diesen Phänotyp aufgeworfen. Sowohl die Ursache für die embryonale Sterblichkeit als auch die zellulären Prozesse, welche in den Sema5a-Nullmutanten beeinträchtigt sind, müssen noch beschrieben werden. Unbekannt ist ebenfalls, ob zusätzlich zu der hier beschriebenen Rolle von Sema5A in der Gefäßbildung dieses an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist. Die ersten Daten über die physiologische Rolle von Sema5A, welche mit dieser Arbeit vorgelegt werden, öffnen den Weg für weitergehende Untersuchungen über die Funktion des Proteins während der Embrionalentwicklung. Das hier erstmals vorgestellte Modellsystem ermöglicht es, Sema5A regulierte zelluläre Mechanismen zu untersuchen. Zusätzlich stellt es ein Werkzeug zur Verfügung, um die funktionelle Beziehung zwischen der Entwicklung des kardiovaskulären Systems und des Nervensystems zu untersuchen. Damit können die Aufgaben der Semaphorin-Proteinfamilie, die an diesen beiden wichtigen Prozessen beteiligt sind, näher charakterisiert werden.
Die Physik beschäftigt sich seit jeher mit der Frage nach dem Aufbau und der Struktur der Materie. Die Antworten änderten sich im Laufe der Zeit, der gegenwärtige Stand der Erkenntnis ist im sogenannten Standardmodell zusammengefasst. Dort werden die Elementarteilchen in Leptonen und Quarks unterteilt, die Wechselwirkungen zwischen ihnen beschreibt man durch vier fundamentale Kräfte: die Gravitation, die elektromagnetischen Kraft, die schwache und die starke Kernkraft. Gemäß dem Standardmodell sind Nukleonen, also Protonen und Neutronen, aus Quarks aufgebaut. Das Proton ist beispielsweise ein gebundener Zustand aus zwei up und einem down Quark. Die Nukelonen bilden ihrerseits die Atomkerne, welche die Systematik der Elemente bestimmen. Quarks treten in sechs verschiedenen Arten (flavours) auf: up, down, strange, charm, bottom und top. Freie Quarks konnten bislang nicht nachgewiesen werden, sie werden nur als Quark-Antiquark Paar (Meson) oder als Kombination aus drei Quarks (Baryon) beobachtet. Mesonen und Baryonen werden unter dem Begriff Hadronen zusammengefaßt. Die starke Kernkraft beruht letztlich auf der Wechselwirkung zwischen Quarks, diese wird durch die Quantenchromodynamik (QCD) beschrieben. Ähnlich der Glashow- Salam-Weinberg Theorie (GSW), die die elektromagnetische und die schwache Kernkraft beschreibt, ist die Quantenchromodynamik durch Austauschteilchen charakterisiert. Im Fall der GSW wurden die Photonen bzw. W± oder Z-Teilchen als Austauschteilchen identifiziert, in der QCD fungieren Gluonen als Austauschteilchen. Photonen vermitteln die elektromagnetische Kraft zwischen allen Teilchen, die elektrische Ladung tragen. Analog wirkt die Kraft, die durch den Austausch von Gluonen beschrieben wird, zwischen Teilchen, die eine Farbladung tragen. Anders als das neutrale Photon trägt das Gluon selbst Farbe und wechselwirkt daher mit anderen Teilchen, die Farbe tragen. Dieser Umstand zeigt bereits, dass in der QCD ganz andere Phänomene zu erwarten sind als in der GSW. Die Tatsache, dass Quarks nur in gebundenen Zuständen vorliegen, erschwert die direkte Beobachtung der Wechselwirkung zwischen ihnen. Ein indirekter Weg, um die Wirkungweise diese Kraft zu untersuchen, liegt in der Erzeugung hoher Kernmateriedichten und hoher Kerntemperaturen. Die Idee besteht darin, das Phasendiagramm von Kernmaterie experimentell zu bestimmen (Abbildung 1.3) und dann auf die zugrundeliegende Kraft zu schließen. Unter anderem führen die Kräfte, die zwischen den Einzelteilchen des Mediums herrschen, zu charakteristischen Phasenübergängen. Im Fall der Kernmaterie hofft man insbesondere, den Übergang von gebundenen Zuständen in eine Quark-Gluon-Plasma Phase (QGP), in der sich Quarks und Gluonen frei bewegen, zu beobachten. Zwei prominente Beispiele demonstrieren, warum die Eigenschaften dieses Materiezustandes - und ob er überhaupt existiert - auch für andere Teilgebiete der Physik von großem Interesse sind. Zum einen geht man davon aus, dass in der Frühphase des Universums, 10-12 s nach dem Urknall, die Energiedichte so hoch war, dass die Materie in einem Plasmazustand vorlag. In diesem Bild führt die Expansion des Raumes zu einer Abkühlung des Plasmas und schließlich zum Ausfrieren in Hadronen. Zum anderen zeigen viele Modellstudien, dass im Innern von Neutronensternen mit extremen Dichten zu rechnen ist. Unter Umständen werden Energiedichten erreicht, die hoch genung sind, um einen Phasenübergang in ein Quark Gluon Plasma zu erzwingen. Die Beschreibung dieser astronomischen Objekte setzt somit auch die Kenntnis der Kräfte zwischen den Quarks voraus. Der einzige Weg, dichte Kernmaterie im Labor zu erzeugen, stellen Schwerionenreaktionen dar. Wenn zwei ultrarelativistische schwere Kerne zentral kollidieren, entsteht für kurze Zeit eine Region hoher Energiedichte (Abbildung 1.1). QCD-Gitter-Rechnungen deuten darauf hin, dass die Dichte, die man in Schwerionreaktion gegenwärtig erreicht, hoch genung ist, um einen Übergang der Kernmaterie in eine Plasma-Phase zu erzwingen. Aufgrund des hohen Drucks expandiert die verdichtete, heiße Kernmaterie in longitudinaler (entlang des Strahls) und transversaler (senkrecht zum Strahl) Richtung und die Dichte nimmt ab. Vorausgesetzt am Anfang der Reaktion wurde ein Quark-Gluon-Plasma erzeugt, dann friert diese Phase in Hadronen aus (chemisches Ausfrieren), wenn Dichte und Temperatur einen kritischen Wert unterschreiten. Die erzeugten Hadronen wechselwirken zunächst noch elastisch miteinander, d.h. die Impulse der Teilchen ändern sich, die Identität der Teilchen bleibt jedoch erhalten. Schließlich enden auch diese Wechselwirkungen (thermisches Ausfrieren), und die Teilchen verlassen die Reaktionszone (Abbildung 1.4). Der Ablauf einer solchen Schwerionenreaktion dauert einige 10-23s und ihre räumliche Ausdehnung liegt in der Größenordnung von 10-15m, damit ist die Reaktion selbst nicht beobachtbar. Nur der Endzustand, also die Identitäten und Impluse der emittierten Teilchen, kann bestimmt werden. Um den Ablauf der Reaktion zu rekonstruieren, ist man daher auf Modellrechnungen angewiesen. Aufgrund dieser Modellrechnungen wurden einige Observablen vorgeschlagen, die einen Phasenübergang kennzeichnen. Neben anderen Signaturen führt ein Phasenübergang wahrscheinlich zu einer verlängerten Emissionsdauer. Dieser Effekt kann möglicherweise durch die Analyse von Zwei-Teilchen-Korrelationen sichtbar gemacht werden. Ganz allgemein stellt die Untersuchung von Teilchenkorrelationen die einzige Möglichkeit dar, die raum-zeitlichen Strukturen während des thermischen Ausfrierens experimentell zu bestimmen. Korrelationen zwischen Teilchen, die von einer hinreichend kleinen Quelle emittiert werden, haben verschiedene Ursachen. Betrachtet man beispielsweise die Häufigkeitsverteilung der Impulsdifferenz zwischen zwei elektrisch gleich geladenen Teilchen, so stellt man fest, dass Paare mit geringer Impulsdifferenz weniger häufig vorkommen, als man anhand der Ein-Teilchen Impulsverteilung vorhersagen würde. Dieser Effekt ist auf die Abstoßung zwischen zwei elektrisch gleich geladenen Teilchen zurückzuführen, die mit kleiner Impulsdifferenz emittiert wurden. Eine weniger offensichtliche Korrelation wird durch den Quantencharakter identischer Teilchen verursacht. Zwei identische Bosonen, die im Phasenraum nahe beieinander liegen, können gemäß den Prinzipien der Quantentheorie nicht unterschieden werden. Die Wellenfunktion, die diesen Zwei-Teilchen-Zustand beschreibt, muß beim Vertauschen der Teilchen erhalten bleiben. Diese Forderung führt zu einem Interferenzterm in der Zwei-Teilchen Intensitätsverteilung. Diese Verteilung ist proportional zur Wahrscheinlichkeit, ein Teilchenpaar mit der Impulsdifferenz q zu messen. Berechnet man die Impulsdifferenzverteilung von Pionenpaaren und berücksichtig nur quanten- statistische Effekte, so findet man, dass Paare mit geringem Impulsunterschied bis zu zweimal häufiger vorkommen, als man aufgrund einfacher statistischer Überlegungen erwarten würde. Um diesen Effekt experimentell sichtbar zu machen, konstruiert man die Korrelationsfunktion, die die gemessene Impulsdifferenzverteilung in Relation zu einer Untergrundverteilung setzt. Experimentell gewinnt man diese Referenzverteilung, indem Paare aus Spuren aus verschiedenen Ereignissen gebildet werden. Die Referenzverteilung entspricht damit der Verteilung, die man messen würde, wenn die Teilchen nicht der Quantenstatistik unterlägen. Die Korrelationsfunktion wird im allgemeinen durch eine Gauß-Funktion angenähert. Das Inverse der Standardabweichung dieser Funktion wird nach den Pionieren der Intensitätsinterferometrie R. Hanbury Brown und R. Twiss als HBT-Radius bezeichnet. Teilchen interferieren nur dann, wenn sie im Phasenraum nahe beieinander liegen, das heißt sowohl die Impulsdifferenz als auch der räumliche Abstand muß hinreichend klein sein. Diese Bedingung kann genutzt werden, um von der gemessenen Korrelationsfunktion, die nur auf den Impulskomponenten basiert, auf die räumliche Verteilung der Teilchenproduktion zu schließen. Eine detaillierte Betrachtung erlaubt sogar, aufgrund der gemessenen Korrelationsfunktion quantitative Aussagen über die räumlichen Aspekte der Teilchenquelle zu machen. Beispielsweise können im Rahmen eines Modells die Stärke der transversalen Expansion oder die Emissionsdauer in Relation zu den HBT-Radien gesetzt werden. In Kapitel 2 sind die Grundlagen der Teilcheninterferometrie ausführlicher dargestellt. Der eigentliche Gegenstand dieser Arbeit ist experimentelle Analyse der Zwei- Teilchen-Korrelationen in einer Schwerionenreaktion. Dazu wird zunächst in Kapitel 3 das STAR Experiment am RHIC vorgestellt, in dem die Daten aufgezeichnet wurden, die Grundlage dieser Analyse sind. Am RHIC-Beschleuniger am BNL in den USA werden AuAu Kollisionen bis zu einer Schwerpunktsenergie von Wurzel aus SNN=200 GeV erzeugt. Figur 3.1 zeigt den Beschleuniger-Ring und die vier Experimente Brahms, Phenix, Phobos und STAR. Der hier analysierte Datensatz wurde bei der Datennahme im Jahr 2000 aufgezeichnet. Zu dieser Zeit wurde am RHIC eine Schwerpunktsenergie von Wurzel aus SNN=130 GeV erreicht. Bei einer zentralen AuAu Kollision werden mehrere Tausend Teilchen produziert. Der STAR Detektor ist dafür konzipiert, hadronische Teilchen kleiner Rapidität (d.h. großer Winkel zur Strahlachse) zu messen, innerhalb der Akzeptanz werden etwa 80% der produzierten geladenen Teilchen nachgewiesen. Der schematische Aufbau des STAR Detektorsystems ist in Figur 3.2 dargestellt. Der zentrale Detektor ist eine TPC (Zeit-Projektions-Kammer). Dieser Detektor basiert darauf, dass geladene Teilchen beim Durchgang durch ein Messgas eine Spur von Ionen hinterlassen. Ein starkes elektrisches Feld driftet die Elektronen, die bei den Ionisationsprozessen freigesetzt wurden, zu einer Ausleseebene. Der Punkt, an dem die Elektronen auf der Ausleseebene ein Signal erzeugen, entspricht der Projektion des Ionisationpunktes auf die Ausleseebene. Die dritte Komponente, die den Raumpunkt der Ionisation festlegt, ist durch die Driftzeit bei bekannter Driftgeschwindigkeit gegeben. So erscheint eine Teilchenspur als eine Kette von Ionisationspunkten im Detektorgas. Ein magnetisches Feld parallel zur Strahlachse führt zu einer Ablenkung der geladenen Teilchen. Die Krümmung der Spur ist dabei umgekehrt proportional zum transversalen Impuls. Abbildung 3.6 zeigt ein typisches Ereignis mit etwa 105 Ionisationspunkten und den entsprechenden Teilchenspuren. Der spezifische Energieverlust eines Teilchens beim Durchgang durch das Messgas hängt von seinem Impuls und seiner Masse ab. Die Stärke des auf der Ausleseebene induzierten Signals erlaubt den spezifischen Energieverlust zu bestimmen. Da der Impuls durch die Krümmung der Spur bekannt ist, kann so die Masse und damit die Identität des Teilchens bestimmt werden (siehe Abbildung 3.7). In Kapitel 4 wird der Datensatz beschrieben, der als Grundlage für diese Analyse dient. Während der Datennahme werden die digitalisierten Daten der TPC auf ein Speichermedium geschrieben. Der erste Schritt bei der Rekonstruktion der Ereignisse besteht darin, die Ionisationspunkte zu lokalisieren. Dies leistet der Clusterfinder- Algorithmus, der in Kapitel 4.1.1 beschrieben ist. Die Spurpunkte werden dann durch den Tracking-Algorithmus zu Teilchenspuren verbunden. Die erreichte Effizienz, Akzeptanz und Impulsauflösung der Rekonstruktion sind in Kapitel 4.1.2 zusammengefaßt. Die Zwei-Teilchen-Korrelationen werden nur für zentrale Kollisionen betrachtet, das sind Ereignisse mit kleinem Stoßparameter. Die Multipliztät der gemessenen Spuren ist in erster Näherung ein Maß für die Zentralität des Ereignisses. Für diese Analyse werden nur die 12% zentralsten Ereignisse zugelassen. Die Selektion der Ereignisse ist in Kapitel 4.2 beschrieben. Die Auswahl der Spuren, die in der Analyse verwendet werden, ist in Kapitel 4.3 beschrieben. Es werden nur Spuren zugelassen, deren Impulse in einem Bereich hinreichend hoher Akzeptanz und Effizienz liegen. Außerdem werden die Spuren ausgewählt, die mit hoher Wahrscheinlichkeit von Pionen stammen. Eine weitere Auswahl wird auf der Paarebene getroffen. Die Korrelationsfunktion wird in einzelnen Intervallen transversalen Paarimpulses kt und Paarrapidität Yðð gebildet. Damit kann die Abhängigkeit der HBT-Radien von diesen Größen dargestellt werden. Zwei weitere Auswahlkriterien sollen die Qualität der Spurpaare garantieren. Zum einen werden solche Paare verworfen, die im Detektor zu nahe beieinander liegen. Für die HBT-Analyse sind Paare mit geringem Impulsunterschied entscheidend, ein geringer Impulsunterschied heißt notwendigerweise, dass die Spuren räumlich nicht sehr weit getrennt sind. Wenn die Spuren aber zu nahe liegen, können sie vom Detektor und von der Rekonstruktionskette nicht mehr aufgelöst werden. Damit verliert man einen Teil der Paare in der Signalverteilung, nicht aber in der Untergrundverteilung, da in diesem Fall die endliche Zwei-Spur-Auflösung keine Rolle spielt. Um die Korrelationsfunktion nicht durch einen Detektoreffekt zu verfälschen, entfernt man die Paare, die im Detektor nahe beieinander liegen, sowohl in der Signal- als auch in der Untergrundverteilung. Ein weiteres Problem stellen "gebrochene" Spuren dar. In einigen Fällen wird eine Teilchenspur von der Rekonstruktionskette nicht als Ganzes erkannt, vielmehr werden zwei Spurstücke im Dektor gefunden. Da diese Spurstücke vom selben Teilchen stammen, haben sie eine sehr geringe Impulsdifferenz. Diese Paare können anhand ihrer Topologie im Detekor erkannt werden. Wie im Fall der begrenzten Zwei-Spur-Auflösung werden sie sowohl für die Signal- als auch für die Untergrundverteilung nicht zugelassen. In Kapitel 5 werden schließlich die Ergebnisse der Korrelationsanalyse dargestellt. Die Korrelationsfunktion wird in verschiedenen Parametrisierungen betrachtet. In der einfachsten Form betrachtet man nur den Betrag des Impulsdifferenzvektors. Dieser Ansatz bedeutet aber, dass der entsprechende HBT-Radius alle Raum-Zeit Komponenten mischt und damit nur wenig Aussagekraft bezüglich der Quellfunktion besitzt. Eine differenzierte Analyse in drei unabhängigen Komponenten ermöglichen die Pratt-Bertsch (PB) und die Yano-Koonin-Podgoretskii (YKP) Parametrisierung. Die beiden Parametrisierungen unterscheiden sich in der Zerlegung des Impulsdifferenzvektors in drei unabhängige Komponenten. Im ersten Fall bezeichnet man die Komponenten als qout, qlong und qside, im zweiten Fall als qpara, qperp und q0 (Kapitel 2.7 und 2.8). Die entsprechenden Korrelationsfunktionen sind in Gleichung 2.31 bzw. 2.34 gegeben. Die jeweiligen HBT-Radien Rout, Rlong und Rside bzw. Rpara, Rperp und R0 können in Relation zu den Parametern der Quellfunktion (Gleichung 2.43) gesetzt werden. Die beiden Parametrisierungen liefern im Prinzip die gleiche Information und die beiden Sätze von HBT-Radien können in Beziehung zueinander gesetzt werden (Gleichung 2.41). Beispielsweise entspricht der HBT-Radius R0 in der YKP-Parametrisierung in erster Näherung der Emissionsdauer, während in der PB- Parametrisierung diese Größe Verhältnis von Rout zu Rside abhängt. Zusätzlich zu den Radien enthält die YKP-Parametrisierung einen Parameter ß, der erlaubt, die longitudinale Geschwindigkeit des betrachteten Quellelementes zu bestimmen. Die Abbildungen 5.7 bis 5.10 zeigen die HBT-Radien beider Parametrisierungen in Abhänigigkeit vom transversalen Paarimpuls kt und von der Paarrapidität Yðð. Die Größe der gemessenen Radien bewegt sich zwischen 3 und 7 fm. Nur der Radius R0 verschwindet in den meisten kt-Yðð Intervallen. Die anderen Radien nehmen mit steigendem kt ab und sind unabhängig von Yðð . Abbildung 5.11 demonstriert, dass die beiden Parametrisierungen -dort wo sie vergleichbar sind- konsistente Ergebnisse liefern. Eine Diskussion der Ergebnisse schließt sich in Kapitel 6 an. Die Abhänigigkeit des Parameters ß von Yðð zeigt eine starke longitudinale Expansion an. Ein ähnliches Verhalten wurde bei niedrigeren Schwerpunktsenergien beobachtet, wo man allerdings eine schwächere longitudinale Expansion erwarten würde. Die Lebensdauer der Quelle, also die Zeit vom anfänglichen Überlapp der Kerne bis zum thermischen Ausfrieren, bestimmt die kt-Abhänigigkeit des Parameters Rlong. Dieser Zusammenhang wurde von Mahklin und Sinyukow formuliert, eine Anpassung der entsprechenden Funktion an die gemessene kt Abhänigigkeit von Rlong ergibt eine Lebensdauer von etwa 8 fm/c bei einer Ausfriertemperatur von etwa 126 MeV. Entsprechende Messungen bei niedrigeren Kollisionsenergien lieferten ähnliche Resultate. Die kt-Abhängigkeit des Parameters Rside ist mit der Stärke der transversalen Expansion gemäß Gleichung 6.3 verknüpft. Da die Relation nicht eindeutig ist, muß entweder eine feste Ausfriertemperatur angenommen werden oder es werden gleichzeitig Einteilchenspektren betrachtet, um die Mehrdeutigkeit zu eliminieren. Eine vorläufige Abschätzung ergibt eine mittlere transversale Expansions- geschwindigkteit von v ungefähr gleich 0.6 und einen gemetrischen Radius von RG ungefähr gleich 7.4 fm . Auch diese Ergebnisse sind vergleichbar mit entsprechenden Resultaten bei niedrigeren Kollisionsenergien. Ein weiterer Parameter der Quellfunktion ist die Emissionsdauer. Die Pionen werden nicht zu einem festen Zeitpunkt emittiert, man geht vielmehr davon aus, dass die Zeitpunkte der letzten elastischen Wechselwirkung in der Quelle gaußförmig verteilt sind. Den Mittelwert dieser Verteilung bezeichnet man als Lebensdauer der Quelle, die Breite als Emissionsdauer. Entsprechend Gleichung 6.4 bzw. 6.5 ist die Emissionsdauer mit dem Radius R0 bzw. dem Verhältnis Rout zu Rside verbunden. Wie in Abbildung 5.8 ersichtlich verschwindet der Parameter R0 , außer im kleinsten kt Intervall. Dies entspricht in der PB-Parametrisierung der Tatsache, dass das Verhältnis Rout zu Rside bei hohen kt kleiner als eins ist. Diese Resultate sind nicht vereinbar mit herkömmlichen Modellen. Insbesondere weil eine verlängerte Emissionsdauer als Signatur für die Bildung eines Quark-Gluon-Plasmas vorgeschlagen wurde, wird dieses Ergebnis derzeit intensiv diskutiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind sowohl mit bereits publizierten Daten der STAR Kollaboration als auch mit Resultaten von anderen RHIC Experimenten verträglich (siehe Abbildung 6.8). In Abbildung 6.9 ist die Abhängigkeit der HBT-Radien von kt bei verschiedenen Schwerpunktsenergien dargestellt. Im Gegensatz zu vielen anderen Observablen ändern sich die HBT Radien nur geringfügig. Da man erwartet, dass die Reaktion bei hohen Energien vollkommen anders abläuft, würde man auch davon ausgehen, dass sich die Ausfrierbedingungen ändern. Dass dies nicht in den Zwei-Teilchen- Korrelationen sichtbar wird, deutet darauf hin, dass die Näherungen die notwendig sind, um die gemessenen Radien mit Modellparametern zu verbinden, nicht gültig sind. Die Systematik der HBT Parameter als Funktion der Schwerpunktsenergie enthält damit keinen direkten Hinweis, dass die kritische Energiedichte überschritten wurde, ab der die Kernmaterie in einer Plasmaphase vorliegt. Andererseits werden weder die verschwindende Emissionsdauer noch die Tatsache, dass die anderen HBT-Parameter sich nur wenig mit der Schwerpunktsenergie ändern, als Argument dafür gewertet, dass die kritische Energiedichte nicht überschritten wurde. Die Frage, ob ein Quark- Gluon-Plasma im Labor erzeugt und analysiert werden kann, bleibt damit offen. Das thermische Ausfrieren einer Pionenquelle scheint hingegen anders zu verlaufen, als bisher angenommen wurde. Systematische Studien der Korrelationsfunktion in AA Kollisionen am RHIC in Kombination mit Fortschritten im theoretischen Verständnis der Teilcheninterferometrie in Schwerionenreaktion werden in Zukunft hoffentlich erlauben, die gemessenen Radien in ein konsistentes Bild einzuordnen. In zukünftigen Experimenten am LHC werden noch weit höhere Dichten erreicht als bisher, damit sollten sich auch die Ausfrierbedingungen stark verändern. Es wird sich dann zeigen, ob die Teilcheninterferometrie das geeignete Instrument ist, um die Quellfunktion einer Schwerionenreaktion zu messen.
During the past several years, ceramide has emerged as an important second messenger triggering cell responses including proliferation, differentiation, growth arrest and apoptosis. This thesis has focused on the regulation of neutral ceramidase which critically determines, in concert with ceramide generating sphingomyelinases, the intracellular ceramide levels. In the first part it is reported that besides a rapid and transient increase in neutral sphingomyelinase activity a second delayed peak of activation occurs after hours of IL-1beta treatment. This second phase of activation is first detectable after 2 h of treatment, and steadily increases over the next two hours reaching maximal values after 4 h. In parallel, a pronounced increase in neutral ceramidase activity is observed, which accounts for a constant or even decreased level of ceramide after long-term IL-1beta treatment, despite continuous sphingomyelinase activation. The increase in neutral ceramidase activity is due to expressional up-regulation, as detected by an increase in mRNA level and enhanced de novo protein synthesis. The increase of neutral ceramidase protein levels and activity can be blocked dosedependently by the p38- mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK) inhibitor, SB 202190, whereas the classical MAPK pathway inhibitor U0126, and the PKC inhibitor Ro 31-8220 were ineffective. Moreover, co-treatment of cells for 24 h with IL-1~ and SB 202190 leads to an increase in ceramide formation. Interestingly, IL-1beta-stimulated neutral ceramidase activation is not reduced in mesangial cells isolated from mice deficient in MAPK-activated protein kinase 2 (MAPKAPK-2), which is one possible downstream substrate of the p38-MAPK, thus suggesting that the p38-MAPK-mediated induction of neutral ceramidase occurs independently of MAPKAPK-2. The results suggest a biphasic regulation of sphingomyelin hydrolysis in cytokine-treated mesangial cells with a delayed de novo synthesis of neutral ceramidase counteracting sphingomyelinase activity and apoptosis. Neutral ceramidase may thus represent a novel cytoprotective enzyme for mesangial cells exposed to inflammatory stress conditions. In a second part, the effect of NO on neutral ceramidase was studied. Ceramide levels are strongly increased in a delayed fashion by stimulation of renal mesangial cells with NO. This effect is due to a dual action of NO, comprising an activation of sphingomyelinases and an inhibition of ceramidase activity. The inhibition of neutral ceramidase activity correlates with the decrease of neutral ceramidase protein. A complete loss of neutral ceramidase protein is obtained after 24h of NO stimUlation. Moreover, the NO-induced degradation is reversed by the protein kinase C (PKC) activator, 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) , but also by the physiological PKC activators platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), angiotensin II and ATP, resulting in a normalisation of neutral ceramidase protein as well as activity. In vivo phosphorylation studies using 32Pj-labelled mesangial cells, reveal that TPA, PDGF-BB, angiotensin II and ATP trigger an increased phosphorylation of the neutral ceramidase, which is blocked by the broad-spectrum PKC inhibitor Ro-31 8220, but not by CGP 41251, which has a preferential action on Ca2+-dependent PKC isoforms, thus suggesting the involvement of a Ca2+-independent PKC isoenzyme. In vitro phosphorylation assays using recombinant PKC isoenzymes and neutral ceramidase immunoprecipitated from unstimulated mesangial cells, show that particularly the PKC-alpha isoform, and to a lesser extent the PKC-a isoform, are efficient in directly phosphorylating neutral ceramidase. The data show that NO is able to induce degradation of neutral ceramidase thereby promoting accumulation of ceramide in the cell. This effect is reversed by PKC activation, most probably by the PKC-delta isoenzyme, which may directly phosphorylate and thereby, prevent neutral ceramidase degradation. In the third chapter it is demonstrated that the NO-triggered degradation of neutral ceramidase involves activation of the ubiquitin/proteasome complex. The specific proteasome inhibitor, lactacystin, completely reverses the NO-induced degradation of ceramidase protein and neutral ceramidase activity. As a consequence, the cellular amount of ceramide, which drastically increases by NO stimulation, is reduced in the presence of lactacystin. Furthermore, ubiquitinated neutral ceramidase accumulates after NO stimulation. The data clearly show that the ubiquitin/proteasome complex is an important determinant of neutral ceramidase activity and thereby regulates the availability of ceramide. In a last part, the cellular localisation of neutral ceramidase was investigated using green fluorescent protein (GFP) as fusion protein to examine cellular distribution and translocation of neutral ceramidase. Unstimulated HEK 293 cells reveal after transient transfection experiments that neutral ceramidase is preferentially localized in the cytoplasm. PKC activation led to an accumulation of neutral ceramidase at the nuclear membrane. In summary, this work demonstrates that the neutral ceramidase is a fine regulated protein that plays a critical role in regulating intracellular ceramide levels and thereby the cell's fate to undergo apoptosis or survive. Regulation of neutral ceramidase can be achieved on all levels, i.e. on the mRNA level, the protein level or posttranslationally by phosphorylation and subcellular translocation. Future work will reveal whether neutral ceramidase can serve as a therapeutic target in the development of novel antiinflammatory and anti-tumour drugs.
Die Autorin behandelt am Beispiel Brasilien das universelle Thema der Gewalt gegen Frauen in einem international vergleichenden und interkulturell kommunikativen Zusammenhang. Wichtiges Anliegen ihrer Fallstudie zur Gewalt gegen Frauen ist deutlich zu machen, dass die kontextbedingt aktive Bewegung der Frauen wider Gewalt in Brasilien sich nicht nur von Aktionen und Diskursen aus dem internationalen Bereich inspiriert hat, sondern einen beachtenswerten eigenen Beitrag leistet, von dem auch andere Frauenbewegungen lernen könnten. Voraussetzung hierzu ist allerdings, dass in allen diesen Gesellschaften, denen innerhalb der stratifizierten globalen Zusammenhänge unterschiedlicher Status zugewiesen wird, ein interkulturell kommunikativer Lernprozess stattfindet. In der Einleitung zu dieser Studie wird auf die spezifische Problematik des Themas hingewiesen, die Untersuchungsmethode und die eigene Argumentationsweise vorgestellt, die eng mit der Motivation zur Behandlung des Themas verwoben ist. Im ersten Kapitel wird die Gewalt gegen Frauen als zugleich universales wie auch partikulares Problem diskutiert, und dementsprechend die divergierenden Definitionen der Gewalt gegen Frauen, die vielfältigen Ansätze zum Verständnis von Frauen aus verschiedenen Gesellschaften und schließlich die Vielfalt der Erfahrungen von Frauen gegenüber Gewalt im Licht der interkulturellen Kommunikation vorgestellt und kritisch analysiert. Im zweiten Kapitel werden die diskursiv analytischen Interpretationen der Gewalt gegen Frauen im Licht der interkulturellen Kommunikation behandelt. Die Autorin knüpft an das diskursive Modell der Bedürfnisinterpretation von Nancy Fraser an und wendet es als methodischer Ansatz zur Interpretation der Gewalt gegen Frauen an. Sie weist auf die gesellschaftspolitischen und kulturellen Grenzen dieses Modells (auf die nördliche Hemisphäre beschränkt) hin und versucht es im Lichte des Ansatzes von Patrick Dias zu interkulturellem Lernen im Kontext der international ungleichen Machtstrukturen kritisch weiterzuentwickeln. Das dritte Kapitel analysiert die relevanten gesellschaftlichen Bedingungen mit ihren diskursiven Konstruktionen zum Verständnis von Frauen und deren Stellung im spezifischen Kontext Brasiliens. Das vierte Kapitel stellt die brasilianische Frauenbewegung wider Gewalt gegen Frauen in ihren historischen Zusammenhängen dar: von ihren Anfängen über deren Strategien in den Achtzigern bis im ausgehenden zwanzigsten Jahrhundert hinein; und es schließt mit den Diskussionen im 21. Jahrhundert ab, die verstärkt unter der Metapher der Cidadania (Aufbau der Zivilgesellschaft) steht. Kapitel fünf fasst die Ergebnisse der Untersuchung zusammen und führt den in der Studie angewandten diskursiv analytischen Ansatz im Rahmen der interkulturell immer noch bestehenden herrschaftlichen Kommunikationsstruktur mit einem Plädoyer für ein interkulturelles Lernen, das die globalen Ungleichheiten nicht verkennt, weiter.
Human epidermal-type fatty acid binding protein (E-FABP) belongs to a family of intracellular non-enzymatic 14-15 kDa lipid binding proteins (LBP) that specifically bind and facilitate the transport of fatty acids, bile acids or retinoids. Their functions have also been associated with fatty acid signalling, cell growth, regulation and differentiation. As a contribution to better understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by NMR spectroscopy are reported here. Both unlabeled and 15N-enriched samples of recombinant human E-FABP were used for multidimensional high-resolution NMR. The sequential backbone as well as side-chain resonance assignments have been completed. They are reported here and are also available at the BioMagResBank under the accession number BMRB-5083. The presence of six cysteines in the amino acid sequence of human E-FABP is highly unusual for LBPs. Four of the six cysteines are unique to the E-FABPs: C43, C47, C67 and C87. In the three-dimensional structure of E-FABP, two cysteine pairs (C67/C87 and C120/C127) were identified by X-ray analysis to be close enough to allow disulfide bridge formation, but a S-S bond was actually found only between C120 and C127 [Hohoff et al., 1999]. Since the exclusion of a disulfide bridge between C67 and C87 improved the Rfree factor of the crystallographic model, the existence of a covalent bond between these two side- chains was considered unlikely. This agrees with the NMR data, where SCH resonances have been observed for the cysteine residues C43, C67 (tentative assignment) and C87, thus excluding the possibility of a second disulfide bridge in solution. Based on the NOE and hydrogen exchange data, an ensemble of 20 energy-minimized conformers representing the solution structure of human E-FABP complexed with stearic acid has been obtained. The analysis of homonuclear 2D NOESY and 15N-edited 3D NOESY spectra led to a total of 2926 NOE-derived distance constraints. Furthermore, 37 slow- exchanging backbone amide protons were identified to be part of the hydrogen-bonding network in the >-sheet and subsequently converted into 74 additional distance constraints. Finally, the disulfide bridge between C120 and C127 was defined by 3 upper and 3 lower distance bounds. The structure calculation program DYANA regarded 998 of these constraints as irrelevant, i.e., they did not restrict the distance between two protons. Out of the remaining 2008 non-trivial distance constraints, 371 were intraresidual (i = j), 508 sequential (|i - j| = 1), 233 medium-range (1 < |i - j| £ 4), and 896 long-range (|i - j| > 4) NOEs. The protein mainly consists of 10 antiparallel -strands forming a >-barrel structure with a large internal cavity. The three-dimensional solution structure of human E-FABP has been determined with a root-mean-square deviation of 0.92 ± 0.11 Å and 1.46 ± 0.10 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the portal region (i.e., for residues 4-26, 40-56, 63-75 and 83-134; the portal region apparently represents the only opening in the protein surface through which the fatty acid ligand can enter and exit the internal binding cavity), an average backbone RMSD of 0.85 ± 0.10 Å was obtained, thus reflecting the higher conformational dispersion in the portal region. Superposition with the X-ray structure of human E-FABP (excluding the terminal residues) yielded average backbone RMSD values of 1.00 ± 0.07 Å for the entire residue range and 0.98 ± 0.06 Å without the portal region. This indicates a close similarity of the crystallographic and the solution structures. The structure coordinates have been deposited at the RCSB data bank under PDB ID code 1JJJ. The measurement of 15N relaxation experiments (T1, T2 and heteronuclear NOE) at three different fields (500, 600 and 800 MHz) provided information on the internal dynamics of the protein backbone. Nearly all non-terminal backbone amide groups showed order parameters S2 > 0.8, with an average value of 0.88 ± 0.04, suggesting a uniformly low backbone mobility in the nanosecond-to-picosecond time range throughout the entire protein sequence. Moreover, hydrogen/deuterium exchange experiments indicated a direct correlation between the stability of the hydrogen-bonding network in the >-sheet structure and the conformational exchange (Rex) in the millisecond-to-microsecond time range. The features of E-FABP backbone dynamics elaborated here differ from those of the phylogenetically closely related heart-type FABP and the more distantly related ileal lipid binding protein. The results on protein dynamics obtained in this work allow to conclude that the different LBP family members E-FABP, H-FABP and ILBP are characterized by varying stabilities in the protein backbone structures. Hydrogen/deuterium exchange experiments displayed significant differences in the chemical exchange with the solvent for the backbone amide protons belonging to the hydrogen-bonding network in the >-sheets. The >-barrel structure of H- FABP appears to be the most rigid, with exchange processes presumably slower than the millisecond-to-microsecond time range. ILBP, on the other hand, shows the fastest hydrogen exchange as well as a significant number of exchange parameters (Rex), implying a decreased stability in the >-sheet structure. E-FABP, finally, appears to rank between these two proteins based on the hydrogen/deuterium exchange, with Rex terms in the >-strands indicating millisecond-to-microsecond exchange processes like in ILBP.