Refine
Year of publication
- 2002 (32) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (30)
- Article (2)
Has Fulltext
- yes (32)
Is part of the Bibliography
- no (32)
Keywords
- Ameisen (1)
- Artbildung (1)
- Artensterben (1)
- Arzneimittelresistenz (1)
- Astrozyt (1)
- Bioakkumulation (1)
- Biokonzentration (1)
- Biomagnifikation (1)
- Corbicula (1)
- Cytostatikum (1)
Institute
- Biowissenschaften (32) (remove)
Der weltweiten Ausbreitung des humanen Immundefizienzvirus versucht man neben der Entwicklung eines präventiven HIV-Impfstoffes auch durch die Verbesserung der chemotherapeutischen Behandlung HIV-Infizierter entgegen zu wirken. Die hochwirksame antiretrovirale Kombinationsstherapie (HAART) hat neben der Anzahl der opportunistischen Infektionen und AIDS-bedingten Todesfälle auch die Viruslast in vielen HIV-Infizierten über einen langen Zeitraum unterhalb der Detektionsgrenze senken können. Es sind daher neben den klassischen Verlaufsmarkern wie der Viruslast und der Anzahl der CD4 T-Zellen neue Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie notwendig. Der Einfluss der Viruslast auf den CD8 T-Zellaktivierungsstatus während der antiretroviralen Therapie zeigte sich durch den Vergleich von HAART-Respondern und den durch eine hohe Viruslast infolge eines Therapie-Versagens gekennzeichneten HAART-Non-Respondern. Die Beobachtung einer signifikant erhöhten Anzahl an basal, d.h. ohne vorangegangene in vitro Stimulation, aktivierten CD8 CD69 T-Zellen bei HAART-Non-Respondern (p = 0,0049) konnte die Rolle des T-Zell-Aktivierungsstatus als Marker der verbleibenden Viruslast unter HAART nachweisen. Um das Potential der von CD8 T-Zellen sezernierten HIVsupprimierenden ß-Chemokinen und IL-16 als HAART-begleitende Surrogatmarker zu untersuchen, wurde die Expression von MIP-1a, MIP-1ß und RANTES sowie des Lymphokins IL-16 im Serum und im Zellkulturüberstand aktivierter CD8 T-Zellen untersucht. Für HAART-Non-Responder konnte im Zellkulturüberstand von in vitro stimulierten CD8 TZellen eine signifikante Erhöhung der IL-16-Expression (p = 0,0077) und eine erhöhte Expression von MIP-1a im Vergleich zu HAART-Respondern gezeigt werden. Darüber hinaus wurde eine signifikant erhöhte MIP-1ß-Serumkonzentration bei HAART-Non- Respondern (p = 0,0175) nachgewiesen, die mit einer erhöhten Anzahl aktivierter CD8 CD69 T-Zellen assoziiert war. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte somit gezeigt werden, dass neben MIP-1a, vor allem das ß-Chemokin MIP-1ß und das Lymphokin IL-16 vielversprechende Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie darstellen, die als sensitive therapiebegleitende Marker die rechtzeitige therapeutische Intervention vor einem signifikanten Anstieg der Viruslast ermöglichen könnten. Da trotz der intensiven Entwicklung und Verbesserung antiretroviral wirkender Therapeutika die vollständige Elimination des HI-Virus bislang nicht möglich ist, wurde in den vergangenen Jahren konzentriert an der Entwicklung neuer Impfstoffstrategien gearbeitet. Eine durch einen Impfstoff induzierte protektive Immunantwort gegen HIV sollte vor allem gegen Strukturproteine, sowie gegen die regulatorischen Proteine Tat und Rev gerichtet sein. Mit einem MLV-abgeleiteten Transfervektor für die SHIV-Gene tat, rev und env wurde in dieser Arbeit das immunogene Potential zur Induktion einer humoralen und zellulären Immunantwort im Rhesusaffen-Tiermodell untersucht. Durch die Etablierung einer stabilen Verpackungszellinie für den Transfervektor pMgDenv/tat/rev/Dlngfr konnte der effiziente Gentransfer in CD4 T-Zellen mittels [MLV(SHIV)]-Pseudotypvektoren gezeigt werden. Durch Optimierung der Transduktionsbedingungen konnte ein Transduktionstiter von 1-2 x 107 i.E./ml in primäre Rhesus-Lymphozyten erreicht werden. Um das immunogene Potential dieser HIV-Antigen-exprimierenden Zellen in vivo zu untersuchen, wurden in einer Immunisierungsstudie 0,7 - 3,4 x 107 Transfergen-positive PBMC in 3 aufeinander folgenden Transplantationen in einen Rhesusaffen reinfundiert. Die transplantierten Zellen waren nach der 3. Applikation bis zu 7 Tage nach Transplantation in vivo mittels PCR detektierbar. Eine HIV-gp120-spezifische Antikörperantwort konnte fünf Wochen nach der ersten bzw. zwei Wochen nach der letzten Immunisierung nachgewiesen werden. In einem ELIspot-Assay konnte erfolgreich die Induktion einer HIV-1-Env- und Rev-spezifischen CTL-Antwort in den nach 7,5 bzw. 10 Wochen nach der letzten Immunisierung entnommenen PBMCs nachgewiesen werden. Interessanterweise zeigten Sequenzanalysen, dass die induzierte CTL-Aktivität gegen die für einen effizienten Schutz bedeutenden Determinanten des HIV-1- Hüllproteins, gegen die variable Domäne des gp120 als auch gegen die CD4- Bindungsregion gerichtet war. In dieser Immunisierungsstudie war es somit erstmals möglich, durch die Transplantation autologer HIV-Antigen-exprimierender CD4 T-Zellen eine spezifische humorale wie auch zelluläre Immunantwort in vivo zu induzieren.
Lipophile, sedimentgebundene Substanzen sind für endobenthische Tiere in hohem Maße bioverfügbar und können von diesen aufgenommen und angereichert werden. Für benthivore Fische besteht damit das Risiko, diese Chemikalien mit der Nahrung aufzunehmen. Die Aufkonzentrierung sedimentgebundener Chemikalien über zwei oder mehr trophische Ebenen (Biomagnifikation) kann somit durch die Bestimmung der Biokonzentration von Chemikalien in Fischen nach der OECD-Richtlinie 305 (OECD 1996) nicht adäquat erfasst werden. Zur standardisierten Bestimmung der Bioakkumulation und Biomagnifikation wurde eine einfache, zwei trophische Stufen umfassende Labornahrungskette etabliert. Diese bestand aus dem endobenthischen Oligochaeten Tubifex tubifex (MÜLLER) als Beute und dem Dreistachligen Stichling (Gasterosteus aculeatus LINNÉ) als Prädator. Die Experimente wurden mit 14C-markiertem Hexachlorbenzol und Terbutryn in dotiertem künstlichem Sediment und rekonstituiertem Wasser durchgeführt. Um den Einfluss einzelner Expositionspfade an der Gesamtanreicherung der Modellchemikalien zu quantifizieren, wurden die Fische gegenüber dotiertem Wasser bzw. dotiertem Sediment (Biokonzentrationsszenario), vorexponierten Würmern (Biomagnifikationsszenario) und Kombinationen dieser Aufnahmepfade (Bioakkumulationsszenario) exponiert. Sedimentgebundenes HCB wurde im Bioakkumulationsszenario sowohl in den Tubificiden (BAFWurm/Sediment (FG/FG) = 7,8) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 52500; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 47; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 3,2) deutlich angereichert. Da die Gewebekonzentration von HCB im Räuber, auch auf Basis lipidnormierter Konzentrationen, die Konzentration in seiner Beute überstieg (AFFisch/Wurm (lipidnormiert) = 1,3), kann von einer Aufkonzentrierung der Chemikalie entlang der Labornahrungskette ausgegangen werden (Biomagnifikation). Es konnte gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber der Kombination sämtlicher Aufnahmepfade zu deutlich höherer Anreicherung in den Fischen führte als im Falle einzelner Expositionspfade. Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien erlaubt den Schluss, dass HCB von den Fischen im Bioakkumulationsszenario zu ungefähr gleichen Teilen über das Wasser (45%) und über die Nahrung (41%) aufgenommen wurde, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments nur mit 14% zur Gesamtanreicherung beitrug. 14C-Terbutryn wurde im Bioakkumulationsszenario - auf Basis der Gesamtradioaktivität - sowohl in den Tubificiden (AF Wurm/Sediment (FG/FG) = 4,4) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 323; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 10; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 1,4) angereichert. Allerdings wurde Terbutryn in den Stichlingen zum überwiegenden Teil zu einem polareren Metaboliten transformiert (84%). Daher müssen zur Abschätzung der Anreicherung von Terbutryn die auf den Gehalt an Ursubstanz korrigierten Gewebekonzentrationen und Anreicherungsfaktoren betrachtet werden. Hierbei wird deutlich, dass Terbutryn nicht entlang der Labornahrungskette aufkonzentriert wurde (AFFisch/Wurm = 0,09). Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien zeigt, dass der Hauptaufnahmepfad von 14C-Terbutryn in Stichlingen das umgebende Wasser ist, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments und die Aufnahme über die Nahrung eine untergeordnete Rolle spielen. Da die Messung der Bioakkumulation und Biomagnifikation von sedimentassoziierten Substanzen sehr aufwendig ist, werden zur Abschätzung ihres Risikopotentials vermehrt mathematische Modelle entwickelt und eingesetzt, die eine Chemikalienanreicherung in Nahrungsketten vorhersagen sollen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Vorhersagen dreier Modelle mit den experimentell ermittelten Daten verglichen. Hierdurch sollte sowohl die Eignung des entwickelten Testsystems als auch der verwendeten Modelle als nützliche Instrumente des environmental risk assessment überprüft werden. Die Vorhersagen der drei Modelle bei Applikation auf die Daten der Labornahrungskette stimmen gut mit den experimentell bestimmten Konzentrationen von HCB und Terbutryn in den Tubificiden und Fischen überein. Für HCB sagen alle drei Modelle eine Biomagnifikation in der Labornahrungskette vorher. Die Modelle unterschätzen die gemessenen Konzentrationen in den Fischen mit einem Faktor von 1,1 - 1,7 nur geringfügig. Die Konzentration in den Tubificiden wird vom Gobas/Morrison-Modell sehr präzise vorhergesagt (Unterschätzung um Faktor 1,1), während sie im Campfens/Mackay-Modell (Faktor 2,1) und Gobas-Modell (Faktor 6,3) deutlicher unterschätzt wird. Speziell die dem Campfens/Mackay- und Gobas-Modell zugrunde liegenden Annahmen zur Anreicherung in benthischen Organismen erwiesen sich für HCB und Tubificiden als unzureichend zu sein, da die Modelle hierbei nur die Aufnahme aus dem Porenwasser berücksichtigen. Für Terbutryn sind die Modellvorhersagen sehr viel ungenauer als für HCB, da vor allem die starke Metabolisierung von Terbutryn in den Stichlingen unterschätzt wird. Dies resultiert in einer Überschätzung der Terbutryn-Konzentration in den Fischen (Faktor 5,8 - 6,4). Allerdings bleiben zwei Punkte festzuhalten: 1) Die Modelle sagen keine Biomagnifikation von Terbutryn in der Labornahrungskette vorher. 2) Die Modellvorhersagen bestärken die Annahme, dass die Anreicherung von Terbutryn in den Fischen dominiert ist von der Aufnahme aus dem umgebenden Wasser über die respiratorische Oberfläche. Die analysierten Modelle können bei entsprechender Weiterentwicklung als nützliche Instrumente für eine erste Abschätzung des Risikos der Bioakkumulation sedimentgebundener, hoch lipophiler Substanzen in aquatischen Nahrungsketten im Rahmen der Risikoabschätzung (environmental risk assessment) dienen. Zum gegenwärtigen Entwicklungsstand ist die Labornahrungskette jedoch den Modellen vorzuziehen, da sie die konservativeren Daten liefert. Für eine abschließende Beurteilung der vorgestellten Methoden bedarf es allerdings einer Verbreiterung der Datenbasis.
Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
Ausgangspunkt dieser Doktorarbeit ist die dominant erbliche hypertrophische Kardiomyopathie, eine Herzkrankheit, die mit Funktionseinschränkungen des Myokards und einem relativ hohen Risiko für einen plötzliche Herztod assoziiert ist. Als Ursachen wurden ca. 160 Mutationen in bisher zehn verschiedenen Genen nachgewiesen, die - mit einer möglichen Ausnahme - für Proteine des kardialen Sarkomers kodieren. Am häufigsten betroffen sind das ventrikelspezifische -Myosin (schwere Kette) sowie das kardiale Myosin-Bindungsprotein C. Ein in Bad Nauheim initiiertes Projekt hat zum Ziel, die Wirkungen einer Mikrodeletion im - Myosingen (Deletion des Codons 927, E927) auf die Struktur und Arbeitsweise des Herzens in transgenen Mäusen zu untersuchen. Es ist bei diesem Projekt beabsichtigt, die Expression des mutierten Myosin-Transgens so zu steuern, dass es nicht unkontrolliert dauernd (konstitutiv), sondern zeitlich kontrolliert (induzierbar) im Herzen exprimiert wird. Als Induktionssystem der Wahl ist dabei das bakterielle Tetrazyklinrepressor-System vorgesehen. Dieses besteht aus dem Repressor tetR, einer DNA- Repressor-Bindungssequenz tetO und einem von außen zugeführten Induktor (Tetrazyklin, tet, oder Doxyzyklin, DOX, einem tet-Derivat). Da dieses Regulationssystem vor dem aufwändigen Einsatz an transgenen Mäusen zunächst in vitro an Zellkulturen zu testen war, wurden für die transiente Transfektion von Zellen in Kultur zwei Plasmide (mit jeweils zwei verschiedenen Promotoren, also insgesamt vier Plasmide) hergestellt. Ein Plasmid enthielt den Repressor und das zweite die tetO-Sequenz mit einem nachgeschalteten Reportergen (lacZ für -Galactosidase). Die beiden Promotoren waren der ubiquitäre virale CMV-Promotor (hCMV-Promotor) einerseits und der herz- und mäusespezifische -Myosin-Promotor (-MHC Promotor) andererseits. Getestet wurde die Regulierbarkeit des Reportergens in transient transfizierten COS1-Zellen, L6 Myoblasten sowie an neonatalen Kardiozyten von Ratten. Für die Kotransfektion von jeweils einem Paar der Plasmide (mit dem tetR-Gen, bzw. dem tetO/lacZ-Gen) wurde ein modifiziertes und in dieser Arbeit optimiertes ballistisches System (Gene Gun von BioRad) benutzt. Die Versuchsanordnung bestand aus Anzüchtung der Zellen, Transfektion, Induktion und Nachweis des Reporterenzyms. Mit dem hCMV-Promotor wurde in allen drei getesteten Zelltypen eine von DOX abhängige Expression der -Galaktosidase nachgewiesen. Mit dem -MHC Promotor, der wegen seiner Herzspezifität nur an kardialen Rattenmyozyten getestet werden konnte, waren in der Standardversuchsanordnung (nach DOX Induktion) nur sehr geringe Mengen an - Galaktosidase nachweisbar. Um die Regulierbarkeit des lacZ-Gens eindeutig zu demonstrieren, wurden als Stimulatoren des -MHC Promotors die Hormone Trijodthyronin, Insulin und Dexamethason einzeln und in Kombination verwendet. Die höchste Stimulierung (ca. 5-fach) wurde mit einer Kombination aller drei Hormone erreicht. In dieser Anordnung wurde damit gezeigt, dass das binäre tetR/tetO-System in vitro nach Induktion auch mit dem -MHC Promotor funktioniert. Mit diesem Resultat war - im Prinzip - der Weg für Experimente mit transgenen Mäusen vorgegeben. In Transgen-Linien mit Einzeltransgenen (entweder mit dem tetR-Gen oder dem lacZ-Gen, beide unter Kontrolle des -MHC Promotors, letzteres zusätzlich mit der tetO- Sequenz für den Repressor) wurde die herzspezifische Expression der -Galaktosidase eindeutig nachgewiesen, nicht jedoch die des tet-Repressors. Die Gründe dafür können gegenwärtig nur vermutet werden. Die Zahl der Genkopien könnte unzureichend gewesen sein. Da es sich um ein bakterielles Gen handelt, könnte auch eine ungünstige Codon-Verwendung einer effizienten Expression entgegenstehen. Zur Klärung dieser Umstände sind weitere Versuche (die nicht mehr Gegenstand dieser Doktorarbeit sind) inzwischen initiiert worden. Das hier in Zellkultur getestete Regelsystem wird als tetON-System charakterisiert, bei dem das Transgen, dessen Expression kontrolliert werden soll (jetzt das Gen für -Galktosidase, später ein mutiertes ventrikelspezifisches Myosingen), erst nach Zugabe des Induktors (Doxyzyklin, bei Mäusen im Trinkwasser) aktiviert wird. Damit unterscheidet sich dieses System von vielfach benutzten tetOFF-Systemen. Diese bestehen aus einem hybriden Protein, das aus zwei verschiedenen Struktur/Funktionsdomänen besteht: der tet-Bindungsdomäne des bakteriellen tet-Repressors und einem viralen ubiquitären Transkriptionsaktivator (das Hybridprotein hat die Bezeichnung tTA). Die zu regulierenden Zielgene enthalten die tetO- Sequenz. Bindung von tet an tTA führt zur Dissoziation des tTA/tetO-Komplexes und damit zur Deaktivierung des Zielgens. Entzug von tet erlaubt die Bindung von tTA an den Promotor des Zielgens und ermöglicht damit dessen Transkription. Dieses System, dessen Funktionalität an Modellversuchen nachgewiesen wurde, hat gleichwohl Nachteile. Diese sind erstens auf eine gewisse Toxizität des Transkriptionsaktivators tTA und zweitens auf negative Wirkungen in Verbindung mit der Dauerzufuhr von Tetrazyklin (zur Unterdrückung der Expression des Zielgens) zurückzuführen. Da ein in der Literatur auch beschriebenes tTA-basiertes tetON- System als nicht ausreichend berichtet wird, erscheint der Aufwand für die Herstellung eines einfachen (nicht-viralen) und ggf. genetisch modifizierten tetON-Systems für die Anwendung an Mäusen sinnvoll und notwendig.
Obligate Mutualismen gehören zu den bevorzugten Studienobjekten zur Erforschung der Mechanismen und Faktoren, welche Artenvielfalt hervorbringen und erhalten. Die Bestäubung der diözischen Pionierbaumgattung Macaranga (Euphorbiaceae) war bislang unbekannt, und Untersuchungen zur Myrmekophytie in Macaranga beschränkten sich in der Vergangenheit auf die Jugendphase der Assoziation mit Ameisen. Während als gesichert galt, dass die Partnerorganismen in Myrmekophytie- und Bestäubungssystemen voneinander profitieren, blieben Konflikte bzw. Konfliktlösungen in diesen Mutualismen weitgehend unerforscht. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Bestäubung der Ameisenpflanzengattung Macaranga aufzuklären und potentielle Konflikte der Fortpflanzung von Macaranga mit dem Myrmekophytiesystem zu analysieren. Die insgesamt 16-monatigen Freilanduntersuchungen in Malaysia und Indonesien wurden in 6 Aufenthalten (1998-2001) durchgeführt. Von 27 Macaranga-Arten wurden Daten zur Blütenbiologie erhoben. Die Hauptuntersuchungsart war M. hullettii. Zusätzlich fanden Untersuchungen der Infloreszenzmorphologie aller westmalesischen Macaranga-Arten in den Herbarien des Forest Research Institute Malaysia (FRIM) und des Nationaal Herbarium Nederland in Leiden statt. 1) Die Bestäubung von Macaranga Von 27 der 61 Macaranga-Arten, welche auf der Halbinsel Malaysia und den großen Sundainseln Borneo und Sumatra vorkommen, wurden insgesamt 28544 Blütenbesucher gesammelt und das Verhalten der dominierenden Blütenbesucher beobachtet. Bei 52% der Arten dominierte eine Thripsart der Gattung Neoheegeria (Phlaeothripinae; Thysanoptera), bei 15% Thripse der Gattung Mesothrips (Phlaeothripinae, Thysanoptera), bei 11% Wanzen (Miridae und Anthocoridae; Heteroptera), bei 4% Thripse der Tribus Terebrantia, bei 4% Rüsselkäfer, und bei 15% diverse andere Insekten der Ordnungen Coleoptera, Hymenoptera und Diptera. Für den dominierenden Blütenbesucher Neoheegeria spec. wird gezeigt, dass er als effektiver Bestäuber von M. hullettii fungiert. Der Pollentransfer von männlichen zu weiblichen Bäumen und der Samenansatz nach ausschließlichem Zugang von Thripsen zu den Blüten konnte nachgewiesen werden. Die Thripse durchlaufen ihre Larvalentwicklung in weiblichen und männlichen Blütenständen. Der Vergleich der Blühzeiten von M. hullettii und der Entwicklungsdauer von Neoheegeria spec. erbrachte, dass die Dauer der Anthese des Wirtes und die der Entwicklung der Thripse aufeinander abgestimmt ist. Männliche Blütenstände öffnen ihre Knospen zeitlich vor den weiblichen Blütenständen, sodass eine Vermehrung der Thrips-Bestäuber-Population in männlichen Bäumen vor dem Beginn der Blühzeiten beider Geschlechter stattfinden kann. Die Analyse der Bestäubungstypen zeigte, dass blütenbedeckende Hüllblättchen mit Trichomnektarien als Belohnung für bestäubende Thripse und Wanzen dienen. Dieses Merkmal wird für thrips- und wanzenbestäubte Macaranga-Arten als homolog angesehen. Die Blütendeckblättchen umschließen die Blüten so eng, dass nur kleinsten Insekten der Zugang zu den Blüten gewährt wird. Neoheegeria-bestäubte Macaranga-Arten zeichnen sich durch ein reduziertes Androeceum und ein wenig strukturiertes Tectum der Pollenkörner aus. Die Bestimmung der Blühzeiten von 7 sympatrischen Macaranga-Arten erbrachte, dass Arten mit den gleichen Bestäubern zeitlich isoliert sind. Dagegen weisen Arten, deren Blühzeiten sich überschneiden, verschiedene Bestäuber auf. 2) Interaktionen der Reproduktion von Macaranga mit der Myrmekophytie Konflikte zwischen den Bestäubern und den Partnerameisen von Macaranga konnten nicht beobachtet werden. Dafür trat ein anderer, schwerwiegender Konflikt in Erscheinung, der drastische, negative Auswirkungen auf die Fortpflanzung von Macaranga hatte. Die Partnerameisen zerstörten zeitweise die Blüten ihrer Wirte. Dieses Kastrations-Verhalten zeigte sich bei mehreren Crematogaster-Arten, die verschiedene Macaranga-Arten besiedeln. Im Gombaktal, ein Hauptuntersuchungsgebiet im Tieflandregenwald Westmalaysias, trat das Kastrationsphänomen am häufigsten bei M. hullettii auf. 56% der Population wurde von ihren Ameisenbesiedlern (hauptsächlich C. msp. 4) kastriert. Das Phänomen wies eine ungleichmäßige Verteilung auf: Blütenzerstörung korrelierte signifikant negativ mit der Baumgröße. Die Analyse verschiedener Kolonie- und WirtspflanzenParameter ergab Hinweise, dass nicht Nahrungs- bzw. Nistraumlimitierung sondern die Koloniegröße ein entscheidender Faktor für dieses Verhalten war. Ab einer bestimmten Koloniegröße setzte nicht nur das Kastrationsverhalten aus, sondern auch die Außenaktivität der Ameisen nahm stark ab. Gleichzeitig stieg die Brutzunahme deutlich an, und die regelmäßige Geschlechtstierproduktion setzte ein. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Crematogaster (Decacrema), welche noch nicht ihre reife Koloniegröße erreicht haben, die Blüten ihres Wirtsbaumes zerstören, wenn dieser vor den Ameisen mit der reproduktiven Phase einsetzt. Aufgrund der daraus resultierenden Kosten für die Wirtspflanze könnte die Crematogaster-Art (msp. 4) als "unpassender" Partner von M. hullettii angesehen werden. Während die Schutzwirkung gegen Herbivorie an jungen Blättern durch C. msp. 4 aus früheren Untersuchungen gut belegt ist, fungiert diese Ameisenart durch ihr Kastrationsverhalten teilweise als Parasit in der Assoziation mit M. hullettii. Es wird ein Modell vorgeschlagen, in dem die Kastration als ein Konflikt zwischen den Partnern über das Einsetzen der Reproduktionsphase angesehen wird. "Passende" Partner sind folglich daran erkennbar, dass sich das Einsetzen ihrer Reproduktionsphasen weitgehend synchronisiert hat. Aus dieser Hypothese ergibt sich, dass der dominierende Ameisenbesiedler C. msp. 4 von M. hullettii im Tiefland des Untersuchungsgebietes nicht als "echter" Mutualist anzusehen ist. In den submontanen Regionen ist M. hullettii ausschließlich mit C. msp. 3 assoziiert. Letztere Crematogaster-Art wird als der eigentliche "passende" Partner vorgeschlagen, während C. msp. 4 als "echter" Mutualist einer zweiten Macaranga-Art, M. bancana, diskutiert wird. Auf der Basis der gewonnenen Ergebnisse und der Grundlage von jüngsten phylogenetischen Analysen von Macaranga werden Überlegungen zur Evolution der Bestäubungs- und Myrmekophytiesysteme vorgestellt.
Termiten (Insecta: Isoptera) sind soziale Insekten und ein wichtiger Bestandteil der Fauna terrestrischer Ökosysteme der Tropen. Dort stellen sie bis zu 25 Prozent der Bodenfauna und sind als Ökosystem-Ingenieure eine sogenannte Keystone-Gruppe (Abe & Higashi, 1997). Untersuchungen zur Rolle in Stoffkreisläufen wurden bisher hauptsächlich in den Savannen Afrikas oder Asiens durchgeführt. Bis heute sind auffallend wenig Daten aus tropischen Wälden vorhanden. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit mehreren Teilaspekten der Termitenökologie in einem amazonischen Festlandregenwald. Die Atmungsaktivität von 24 Termitenarten wurde mittels Infra-Rot-Gas-Absorptions-Messungen (IRGA-Messungen) bestimmt. Hierbei wurde nach Kasten (Arbeiter und Soldaten) differenziert. Das Verhältnis von Körpermasse und CO2-Produktion folgt einem ubiquitären biologischen Gesetz, nach dem die Metabolismusrate mit zunehmender Köpergröße abnimmt. Die untersuchten Termiten konnten in vier verschiedene Nahrungsgilden eingeteilt werden: Holzfresser, OM-Fresser (OM=organisches Material), Interfacefresser und Spezialisten. In Übereinstimmung mit der taxonomischen und funktionellen Einteilung konnte gezeigt werden, dass Holzfresser mit 0,87 g [CO2 g Biomasse -1] signifikant mehr CO2 als OM-Fresser (0,47 g [CO2 g Biomasse -1]) und Spezialisten (0,42 g [CO2 g Biomasse -1]) produzieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden verschiedene Einflüsse unterschiedlicher Waldsysteme auf die Termitenaktivität untersucht. Die Präsenz von Termiten an Köderfallen wurde dazu in drei verschiedenen Waldsystemen (Primärwald, Sekundärwald und verschiedene agroforstwirtschaftliche Anbausysteme) für den Zeitraum eines Jahres beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Termitenaktivität mit dem Komplexitätsgrad der untersuchten Systeme und der Bodenfeuchte korreliert. Die meisten mit Termiten besetzten Fallen fanden sich im Primärwald. Es war außerdem möglich den Nachweis zu liefern, dass der Vegetationstyp forstwirtschaftlich genutzter Flächen die Termitenaktivität beeinflusst. In vier verschiedenen agroforstwirtschaftlichen Polykulturen wurden sowohl in der Trocken- als auch in der Regenzeit mehr besetzte Köderfallen gezählt als in Monokulturen der untersuchten amazonischen Nutz-Baumarten (Citrus sinensis, Theobroma grandiflorum, Hevea brasilensis, Bactris gasipaes und Cocos nucifera). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Termiten auf Feuchtigkeitsunterschiede im Boden reagieren indem sie zu feuchte (> 28% volum. Wassergehalt) oder zu trockene Standorte (< 23% volum. Wassergehalt) meiden. Auf der Basis der ermittelten Atmungsdaten wurde die Rolle der Termiten im lokalen und globalen Kohlenstoffkreislauf mit Hilfe von Modellen spezifiziert. Erstmalig konnten hierbei die Daten der neotropischen Termiten in ökologische Modelle integriert werden. Zum einen ergab die Modellierung der CO2-Produktion der untersuchten Arten aus Teil A mit dem Makrofaunamodell NEOMITES, dass Termiten in einem tropischem Regenwald in der Lage sind, bis zu 28 Prozent des Bodenkohlenstoffes zu mobilisieren. Zum anderen wurde mit einem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Modell die Nettomenge der Treibhausgase Kohlendioxid und Methan die durch Termiten produziert wird, berechnet. Demnach tragen Termiten tropischer Regenwälder zwischen 0,52 und 2,75 Prozent zur globalen jährlichen Nettoproduktion des Kohlendioxids bei und liegen damit über dem bisher vermuteten Anteil von 0,22-1,56 Prozent. In bezug auf Methan liegen die Ergebnisse der globalen jährlichen Nettoproduktion im Bereich bisheriger Schätzungen (zwischen drei und 19 Prozent). Die durchgeführten Untersuchungen konnten zeigen, dass Termiten auf Bodenqualitätsmerkmale wie Feuchtigkeit reagieren und somit als Monitororganismus bei der nachhaltigen Nutzung tropischer Böden eingesetzt werden können. Durch die Ermittlung der Atmungswerte und der darauf basierenden Modellierung konnte ihre zentralen Rolle im Kohlenstoffkreislauf der Böden tropischer Regenwälder demonstriert werden. Die Modellvorhersagen ihres Beitrags zur Nettoproduktion von Kohlendioxid und Methan zeigen, dass Termiten tropischer Regenwälder keine primäre Quelle des atmosphärischem Kohlendioxids und Methans darstellen. Allerdings liegt ihr Beitrag - insbesondere im Fall von Kohlendioxid - über den bisherigen Annahmen.
Untersucht wurde die spätpleistozäne und holozäne Diatomeenflora aus drei Teilgebieten der westlichen Ostsee, dem Kattegat, der Kieler Bucht und der Pommerschen Bucht. Die Ergebnisse bestätigen die hervorragende Eignung der Diatomeen als Indikatororganismen in der Paläoökologie. Anhand der Mikroflora war es möglich, die wechselhafte Geschichte der verschiedenen Ostsee-Teilgebiete detailliert nachzuvollziehen. Es konnten Lage und Ausdehnung der Paläogewässer während der verschiedenen Stadien der Ostsee-Entwicklung sowie verschiedene abiotische Faktoren der Paläoumwelt - Salinität, pH-Wert, Trophie, Temperatur und Wassertiefe - rekonstruiert werden. Zur Rekonstruktion von Salinität, Trophie und pH-Wert kamen erstmals verschiedene Indikationssysteme - der Halobienindex nach ZIEMANN (1971), das Trophie-Indikationssystem nach HOFMANN (1994) und die pH-Rekonstruktion nach ARZET (1987) - zur Anwendung. Kattegat Der Schwerpunkt der Untersuchung lag auf dem südwestlich der Insel Anholt gelegenen Teil des Kattegats. In den 22 Kernprofilen konnten insgesamt 596 Diatomeentaxa registriert werden. In den Ablagerungen des Spätglazials waren im gesamten Untersuchungsgebiet keine silifizierten Mikrofossilien nachweisbar. Die anhand der seismoakustischen Untersuchungen aufgestellte Gliederung der holozänen Sedimente in die Abschnitte Holozän 1 (H1), Holozän 2 (H2) und Holozän 3 (H3) konnte durch die Analyse der Diatomeenfloren bestätigt werden. Die Ablagerungen des Sedimentabschnitts H1 entstanden während einer Transgressionsphase. Das in Alleröd und Jüngerer Dryas trockengefallene Untersuchungsgebiet wurde zu Beginn des Präboreals vollständig transgrediert. Durch das Auftreten halobionter Diatomeentaxa konnte der Beginn der Transgression im Untersuchungsgebiet auf den Anfang des Präboreals und ein Alter von 10.200 Jahren BP datiert werden. Für die Hauptphase der Transgression wurde ein Alter von rund 9.700 bis 9.300 Jahren BP ermittelt. In Übereinstimmung mit den seismoakustischen Befunden und den Ergebnissen der Makrofossil-Analyse konnte der Sedimentabschnitt H2 als Ablagerung aus dem Mündungsgebiet eines Fließgewässers identifiziert und auf ein Alter von rund 9.300 bis 8.300 Jahren BP datiert werden; wahrscheinlich entwässerte der Ancylus-See zumindest zeitweilig über den großen Belt in diesen Abschnitt des Paläokattegats. Die Diatomeenflora indiziert eine überwiegend durch den Einstrom von Süßwasser beeinflusste Paläoumwelt und ein alkalisches und eutrophes Milieu. Das charakteristische Merkmal der Thanathozönosen ist der hohe Anteil an allochthonen Schalen. Die Analyse der autökologischen Präferenzen zeigt, dass durchschnittlich 30 % der Taxa ursprünglich aus anderen Gewässertypen stammen. Mithilfe der Diatomeenflora konnte der Sedimentabschnitt H2 in drei Abschnitte untergliedert werden. Der Abschnitt H2a wurde während der Bildung einer Landzunge abgelagert, die die Mündung des Fließgewässers vom Paläokattegat trennte. Die Thanathozönosen indizieren die zunehmende Beeinflussung durch den Einstrom von Süßwasser. Der Abschnitt H2b wurde vor rund 8.800 Jahren BP deponiert, während die Landzunge ihre größte Ausdehnung und Isolationskraft erreichte. Die Diatomeenflora indiziert die maximale Beeinflussung durch den Zustrom von Süßwasser. Im Sedimentabschnitt H2c indizieren die Thanathozönosen die Verlagerung der Landzunge infolge küstendynamischer Prozesse und eine zunehmende Beeinflussung durch Meerwasser. Der Sedimentabschnitt H3, der während einer erneuten Transgression vor ca. 8.300 Jahren BP deponiert wurde, ist in weiten Bereichen vollständig frei von silifizierten Mikrofossilien. Eine autochthone, aus überwiegend halobionten Taxa zusammengesetzte Diatomeenflora ließ sich lediglich in einem der Kernprofile nachweisen. Das charakteristische Taxon der Transgressionsfloren in den Sedimentabschnitten H1 und H3 ist Paralia sulcata. Typisch sind des Weiteren Actinoptychus senarius, Cymatosira belgica, Dimeregramma minor, Ehrenbergia granulosa und Plagiogramma staurophorum. Kieler Bucht Aus der Kieler Bucht stand ein Kernprofil zur Verfügung. In diesem Profil konnten insgesamt 344 Diatomeentaxa nachgewiesen werden. Die brackischen Ablagerungen entstanden in der Mastogloia-Phase und konnten mithilfe der Diatomeenflora in zwei Abschnitte - Mastogloia 1 (M1) und Mastogloia 2 (M2) - untergliedert werden. Der Sedimentabschnitt M1 wurde deponiert, während das Milieu des Paläogewässers durch sporadische Ingressionen über den Großen Belt beeinflusst wurde. Die Diatomeenflora indiziert einen Paläosalzgehalt von maximal 9 Promille, ein eutrophes und alkalisches Paläomilieu und eine geringe Wassertiefe. Die Veränderungen im Artgefüge der Thanathozönosen innerhalb des Sedimentabschnitts M2 belegen einen kontinuierlichen Anstieg der Salinität um mindestens 8 Promille und das Auftreten starker Strömungen. Die Sedimentation erfolgte während des Übergangs vom brackigen Mastogloia-Stadium zur marinen Littorina-Phase. Mithilfe der Diatomeenflora konnte nachgewiesen werden, dass sich in dem Paläogewässer der Kieler Bucht frühestens vor 7.100 Jahren BP marine Verhältnisse etablierten. Die Flora indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 17 und maximal 30 Promille. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Sedimentanalyse konnten die Ablagerungen der Littorina-Phase anhand der Diatomeenflora in zwei Subzonen - Littorina 1 (L1) und Littorina 2 (L2) - untergliedert werden. Während das Artgefüge in dem Abschnitt L1 auf große Strömungsgeschwindigkeiten während der Sedimentation hinweist, belegt die Flora in dem Abschnitt L2 eine deutliche Abnahme der Strömungsintensität. Pommersche Bucht In den neun Kernprofilen aus der Pommerschen Bucht konnten insgesamt 265 Diatomeentaxa identifiziert werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der geologischen Untersuchungen zeigt die Diatomeenflora, dass sich der südliche Abschnitt der Pommerschen Bucht nach dem Rückzug des Eisschildes bis in das Atlantikum hinein unabhängig vom nördlichen Teil entwickelte; erst während der Littorina-Phase wurde auch der südliche Abschnitt transgrediert. Mithilfe der Diatomeenflora wurde belegt, dass sich im Spätglazial vor ca. 12.000 Jahren BP im Süden der Pommerschen Bucht ein alkalischer, meso- bis schwach eutropher Süßwassersee etablierte. Die Thanathozönosen indizieren erhebliche Milieuunterschiede zwischen diesem See und dem Baltischen Eisstausee, der zeitweise den nördlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht bedeckte. Im frühen Holozän entwickelte sich im südlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht an gleicher Position wie im Spätglazial wiederum ein Süßwassersee, während der nördliche Abschnitt der Pommerschen Bucht vom Ancylus-See bedeckt war. Die Diatomeenfloren belegen, dass sich die Umweltbedingungen in beiden Paläogewässern ähnelten; sowohl im Norden als auch im Süden lag ein alkalisches und überwiegend eutrophes Milieu vor. Der Beginn der Mastogloia-Phase ist durch einen drastischen Wechsel im Artgefüge der Diatomeenflora gekennzeichnet; Taxa mit höherer Salinitätstoleranz, z. B. Epithemia turgida und Diploneis didyma, ersetzten die rein oligohalobe Ancylus-Flora. Die Veränderungen indizieren einen schwachen aber deutlichen Anstieg der Salinität im Norden der Pommerschen Bucht. Das charakteristische Taxon der Littorina-Phase ist die polyhalobe Planktonart Thalassionema nitzschioides. Es indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 13 Promille. Des Weiteren belegen die Diatomeen den stetig steigenden Wasserspiegel zu Beginn der Littorina-Phase. Chrysophyceen-Zysten, Chaetoceros-Sporen und die Skelette des Silicoflagellaten Distephanus speculum stellen in der Pommerschen Bucht wichtige Leitfossilien dar. Während Chrysophyceen-Zysten typisch für die Sedimente der Mastogloia-Phase sind, haben Chaetoceros-Sporen und Distephanus speculum charakteristischerweise ihren Verbreitungsschwerpunkt in den Ablagerungen des Littorina-Meers.
ATP ist ein weit verbreitetes Signalmolekül im ZNS. Seine Hauptfunktionen betreffen die präsynaptische Modulation der Transmitterfreisetzung und die schnelle exzitatorische Transmission. Die Aktivierung ionotroper P2X-Rezeptoren durch ATP beinhaltet den Einstrom von Kalzium in die Zelle. Unter pathologischen Bedingungen, wie bei Epilepsie oder Ischämie, ist die ATP-Freisetzung erhöht und könnte einen neuronalen Zelltod induzieren. Eine anhaltender Aktivierung von NMDA-Rezeptoren und der dadurch erhöhte Einstrom von Kalzium in die Zelle stellt dabei den primären Effektor der Neurotoxizität dar. Dieses, als Exzitotoxizität bezeichnete Phänomen, ist an vielen neurologischen Krankheiten beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von ATP und anderen Purin- und Pyrimidin-Nukleotiden und von Adenosin auf die Überlebensrate von Neuronen bei induzierter Toxizität in hippokampalen Primärkulturen untersucht. Neurotoxizität wurde durch die Applikation der Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA (30 μM) oder Kainat (300 μM) und durch Applikation von KCl (30 mM) induziert. Purin- und Pyrimidin-Nukleotide wurden in verschiedenen Konzentrationen von 10 μM – 1000 μM koappliziert. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensrate der Neurone mit der Methode des Neuronen-spezifischen zellulären ELISA quantifiziert. Applikation von NMDA reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 56 ± 3%. Der NMDARezeptor-Antagonist MK-801 verhinderte die NMDA-induzierte Toxizität. Die Koapplikation von ATP (0,01-1 mM) schwächte die zytotoxischen Wirkung von NMDA konzentrationsabhängig ab. Die Purine ITP und GTP zeigten ebenfalls eine protektive Wirkung und reduzierten die NMDA-induzierte Toxizität, wohingegen die Pyrimidin-Nukleotide UTP und CTP keinen protektive Wirkung zeigten. Weitere getestete P2-Rezeptor-Agonisten, wie ADP, AMP, Adenosin, α,β-meATP, 2MeSATP, das Dinukleotid Ap4A, α,β-meADP und BenzoylATP waren unwirksam. Der P2-Rezeptor-Antagonist Reactive Blue 2 (100 μM) inhibierte die Wirkung von ATP. Suramin und PPADS (100 μM) verhinderten die protektive Wirkung von ATP nicht. Applikation von Kainat reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 37 ± 0,3%. Der Antagonist CNQX (100 μM) verhinderte die Kainat-induzierte Toxizität. Weder ATP noch GTP zeigten eine protektive Wirkung nach Kainat-induzierter Toxizität. Dies steht im Gegensatz zu ihrer protektiven Wirkung nach NMDA-vermittelter Toxizität. Applikation von KCl reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 61 ± 4%. Die Purin- und Pyrimidin-Nukleotide (1 mM) zeigten bei K+-Depolarisation ein völlig anderes Wirkungsspektrum als bei Applikation von NMDA: GTP > ITP > ATP > ADP > CTP > α,β-meATP > UTP > AMP. 2MeSATP, α,β-meADP, Ap4A, BenzoylATP und Adenosin veränderten die Überlebensrate der Zellen nach KCl-induzierter Toxizität nicht. Weder Suramin noch PPADS (100 μM) inhibierten die protektive Wirkung von ATP. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die protektive Wirkung von ATP, GTP und ITP weder P2- noch Adenosin-Rezeptor-vermittelt war. Zudem schienen sie spezifisch für eine NMDARezeptor-vermittelte Toxizität, da ATP und GTP nach Kainat-Applikation keine Wirkung erzielten und die alleinige Applikation der verwendeten P2-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten (Kontrollen) keine Wirkung auf das Überleben von Neuronen hatte. Deshalb wurde eine direkte Inhibition des NMDA-Rezeptors durch ATP postuliert. In einer Kooperationsarbeit führte Dr. Bodo Laube vom Max-Planck-Institut für Hirnforschung in Frankfurt am Main elektrophysiologische Messungen an Oozyten und hippokampalen Neuronen zur Bestätigung dieser Hypothese durch. ATP inhibierte in Oozyten NMDA-induzierte Einwärtsströme kompetitiv durch Bindung an die NR2B-Rezeptor-Untereinheit. ITP, GTP, AMP waren an dieser rekombinanten NR1/NR2BRezeptorkombination ebenso effektiv, wohingegen UTP, CTP, ADP und Adenosin nur schwache inhibitorische Wirkungen zeigten. In kultivierten hippokampalen Neuronen inhibierte ATP auch NMDA-induzierte Ströme, nicht jedoch Kainat-induzierte Ströme. Die Expression der beiden NMDA-Rezeptor-Untereinheiten NR1 und NR2B wurde durch immunzytochemische Untersuchungen in den hippokampalen Neuronen bestätigt. Die Resultate zeigten, daß ATP direkt NMDA-Rezeptoren mit einer bestimmten Untereinheitenzusammensetzung inhibierten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, daß ATP und andere Purinund Pyrimidin-Nukleotide durch Inhibition des NMDA-Rezeptors neuroprotektive Wirkungen vermitteln können. Dies ist eine neue Funktion von ATP zu der bereits beschriebenen direkten Aktivierung von postsynaptischen P2X-Rezeptoren und zu seiner Rolle als eine extrazelluläre Quelle des synaptischen Modulators Adenosin an glutamatergen Synapsen.
Ein transgenes Mausmodell zur Untersuchung der Zink-vermittelten Modulation des Glyzinrezeptors
(2002)
Zink (Zn2+) ist ein im Zentralnervensystem der Säuger weitverbreitetes Metallion, das in kleinen synaptischen Vesikeln hoch angereichert wird. Zink-reiche Vesikel sind besonders gut dokumentiert in exzitatorischen Synapsen, z.B. im Hippocampus, sie werden jedoch auch in inhibitorischen Synapsen von Neuronen des Rückenmarks oder der Retina gefunden. Nach exozytotischer Freisetzung dieser Vesikel in den synaptischen Spalt können Zink-Konzentrationen von bis zu zehn mikromolar erreicht werden. In vitro hat Zink modulatorische Effekte auf eine Vielzahl von Neurotransmitter-Rezeptoren, so u.a. auf Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-, NMDA-, oder Kainat-Typ, aber auch auf GABAA- und Glyzinrezeptoren (GlyR). Zink wurde daher als endogener Neuromodulator vorgeschlagen. Der modulatorische Effekt von Zink auf den GlyR ist biphasisch: Niedrige mikromolare Konzentrationen bewirken eine Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme, höhere mikromolare Konzentrationen dagegen deren Inhibition. Dieser potenzierende Effekt von Zn2+ kann in transfizierten HEK 293 Zellen oder cRNA-injizierten Xenopus laevis Oozyten durch eine Punktmutation im N-terminalen Bereich des α1-Polypeptids aufgehoben werden (D80A (Lynch et al., 1998), oder D80G (Laube et al., 2000)). Ein revers-genetischer Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit benutzt, um Rückschlüsse auf die physiologische Relevanz der Potenzierung Glyzin-induzierter Ströme durch Zn2+ zu gewinnen: In einem „Knock-In“ Mausmodell wurde durch homologe Rekombination in ES-Zellen eine Mutation in der kodierenden Sequenz des GlyRα1-Genlocus eingeführt, die den o.g. AS Austausch (D80A) in der adulten ligandenbinden Untereinheit des GlyR bewirkt. Um die Veränderung des Genlocus zu minimieren war die als Selektionsmarker bei der Einführung der Mutation benötigte Neor-Kassette von zwei loxP-Sequenzen flankiert, und konnte so nach dem Nachweis des homologen Rekombinationsereignisses durch Wirkung der Cre-Rekombinase wieder entfernen werden. Nach Blastozysteninjektion homolog rekombinierter ES-Zellen zur Herstellung chimaerer Tiere und Keimbahntransmission der Mutation in einem Teil dieser Chimaeren konnten so Mauslinien mit zwei verschiedenen mutierten Allelen generiert werden: In zwei Linien wurde das intronisch miteingeführte Neor-Element bereits in ES-Zellen in vitro deletiert, wonach lediglich eine der loxP-Sequenzen verbleibt; in einer dritten Linie wurde der Selektionsmarker als intronische Insertion belassen. Während heterozygote Tiere aller drei Linien keinerlei offensichtliche Auffälligkeiten zeigen, findet sich bei homozygot-mutanten Tieren aller Linien ein mit der zweiten postnatalen Woche eintretender Phänotyp, dessen auffälligste Symptome eine verstärkte akustisch oder taktil induzierbare Schreckreaktion, ein erhöhter Muskeltonus, taktil induzierbarer Tremor und generalisierter Myoklonus sowie ein verlangsamtes Wiederaufrichten sind. Dieser Symtomkomplex ähnelt stark dem der spontanen Mutationen des GlyRs spasmodic, spastic oder oscillator und weist auf einen Verlust glyzinerger Inhibition als Ursache hin. Die verschiedenen Allele verursachen unterschiedlich starke Phänotypen: Das mutierte Allel, in welchem die Neor–Kassette deletiert ist, bewirkt einen schwachen Phänotyp, wohingegen das Verbleiben des intronischen Neor-Elements einen schwerwiegenderen Phänotyp zur Folge hat, und homozygote Tiere bis auf wenige Ausnahmen bis zur achten Lebenswoche sterben. Die Immunoblot-Analyse zeigt, daß bei homozygot mutanten Tieren dieser stärker betroffenen Linie ein partieller Verlust der Proteinexpression der GlyRα -Untereinheit auftritt. Dagegen ist in Tieren, in denen die Neor-Kassette deletiert ist, keine Verringerung der GlyRα-Expression durch Immunoblot nachweisbar. Der milde Phänotyp ist demnach am einfachsten durch den spezifischen pharmakologischen Effekt der Mutation, d. h. den Verlust der Zn2+-induzierten Potenzierung des GlyR, erklärbar. Hiermit wurde erstmals ein Hinweis daraufhin gewonnen, daß niedrige mikromolare Konzentrationen von Zn2+ für die physiologische Funktion des adulten GlyR notwendig sind. Darüberhinaus unterstreichen die Ergebnisse das Potential des GlyR als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Muskel-relaxierender oder sedativer Substanzen, die - ähnlich der Wirkung von Zn2+ - einen potenzierenden Effekt auf die glyzinerge Inhibition haben.
Im Hauptteil der Dissertation wird die Expression und Lokalisation organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, die unter der Kontrolle des GFAP-Promotors EGFP exprimiert, analysiert. Zum einen wird ein grundlegender Vergleich der Expression synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der Ratte und der PGFAPEGFP-Maus angestellt, zum anderen werden Kulturdauer- und Altersabhängigkeit der Expression untersucht. Des weiteren wird die Expression organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der PGFAPEGFP-MauS in situ überprüft. Die immuncytologischen Untersuchungen zeigten zum einen die Expression und organelläre Lokalisation der synaptischen Proteine SNAP-25, SV2, VAMP2 und Synaptophysin in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, zum anderen einen kulturdauerabhängigen Rückgang der Expression von SNAP-25, wie er für kultivierte Astrocyten aus Neopallia der Ratte beschrieben ist. Des weiteren wird festgestellt, dass die Expression organellärer und synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der PGFAPEGFP-Maus keine Eigenschaft undifferenzierter Astrocyten oder Vorläuferzellen ist. Eine vergleichbare Expression solcher Proteine findet sich in astroglialen Primärkulturen, die aus den Gehirnen unterschiedlich alter Tiere gewonnen worden waren. In der vorliegenden Arbeit gelingt erstmals der Nachweis der Expression und organellären Lokalisation verschiedener organellärer und synaptischer Proteine (SNAP-23, SNAP-25, Synaptophysin, Cellubrevin, SCAMP, vATPase) in Astrocyten in situ. Dieser Befund birgt weitreichende Implikationen bezüglich der in der glialen Signalübertragung und bidirektionalen Kommunikation mit Neuronen verwendeten zellulären Mechanismen in sich. Aufgrund des proteinären Repertoires erscheint es möglich, dass Astrocyten in situ eine mit Neuronen vergleichbare molekulare Maschinerie zur regulierten exocytotischen Freisetzung besitzen. Ein weiterer Teil der Arbeit stellt die Expression und Calcium-abhängige Freisetzung des modulatorischen Neuropeptids Secretogranin II aus U373MG Astrocytoma-Zellen dar. Dieser Zelltyp wird als mögliches Modellsystem für kultivierte hippocampale Astrocyten vorgeschlagen.