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P2X receptor subunits assemble in the ER of Xenopus oocytes to homomultimeric or heteromultimeric complexes that appear as ATP-gated cation channels at the cell surface. In this work it was intended to investigate the posttranslational modifications such as N-linked glycosylation and disulfide bond formation that is undergone by P2X1 receptors. In addition, the aim of this study was to examine the expression and the quaternary structure of selected P2X receptor isoforms in Xenopus oocytes. The investigation of the quaternary structure of the metabolically or surface labeled His-P2X2 receptor by BN-PAGE revealed that, while the protein complex is only partially assembling in oocytes, the plasma membrane form of the His-P2X2 receptor assembled into trimeric and even hexameric complex as was shown by the BN-PAGE analysis. Besides this finding, it is shown that the His-P2X5 protein that was purified from metabolically or surface labeled oocytes appeared as one single band corresponding to a trimer when analyzed by BN-PAGE. The present study signified that His-P2X6 alone does not reach a defined assembly status and possibly needs the hetero-polymerisation with other P2X subunits to assemble properly for insertion into the plasma membrane. Another finding of this study is that the P2X1 and P2X2 subunits could exist as heteromultimeric protein complexes in the plasma membrane of cells. Purification of surface expressed His-P2X2 subunit allowed the detection of co-injected P2X1 subunit and vice versa in Xenopus oocytes. Incubation with glutardialdehyde led to the cross-linking of P2X2 and P2X1 subunits to dimers and trimers. BN-PAGE analysis of the P2X2/P2X1 complex isolated under nondenaturing conditions from surface-labeled oocytes yielded one distinct band corresponding to a trimeric complex. The analysis of a C-terminally GFP tagged His-P2X1 fusion protein by confocal fluorescence microscopy revealed small clusters of the protein complexes, approximately 4-6 µm in diameter from a diffuse distribution of the protein in the plasma membranes of Xenopus oocytes. The cross-linking or BN-PAGE analysis of the fusion protein resulted in proteins that migrated quantitatively as trimers when purified in digitonin. The analysis of some chimeric constructs confirmed the results of others, which showed that desensitization can be removed from the P2X1 or P2X3 receptor by providing the N-domain from the P2X2 receptor (Werner et al., 1996) The exchange of this domain did not alter the quaternary structure of the chimeras, which showed to be present as trimers when expressed in oocytes. In addition, glycan minus mutants of His-P2X1 receptor were analyzed to examine whether carbohydrate side chains are important for P2X1 subunit assembly, surface expression, or ligand recognition. SDS-PAGE analysis of glycan minus mutants carrying Q instead of N at five individual NXT/S sequons reveals that 284N remains unused because of a proline in the 4 position. The four other sites (153Asn, 184N, 210N, and 300N) carry N-glycans, but solely 300N acquires complex-type carbohydrates. Like parent P2X1 receptor, glycan minus mutants migrate as homotrimers when resolved by blue native PAGE. Recording of ATP-gated currents revealed that elimination of 153N or 210N diminishes or increases functional expression levels, respectively. In addition, elimination of 210N causes a 3-fold reduction of the potency for ATP. If three or all four N-glycosylation sites are simultaneously eliminated, formation of P2X1 receptors is severely impaired or abolished, respectively. It is concluded that at least one N-glycan per subunit of either position is absolutely required for the formation of P2X1 receptors. The SDS-PAGE analysis of surface-labeled His-P2X2 and His-P2X5 receptors revealed that, while the His-P2X2 subunit acquires three complex-type carbohydrates, in case of His-P2X5 polypeptide, only two of the three N-glycans could obtain complex-type carbohydrates during transit of the Golgi apparatus. Furthermore, it was shown that DTT treatment blocked the appearance of newly made His-P2X1 at the plasma membranes of Xenopus oocytes. Also, it was revealed that the effects of DTT on His-P2X1 biogenesis are fully reversible. Removal of the reducing agent leads to subsequent folding and assembly into His-P2X1 receptor complex, followed by transport to the cell surface. The characterization of cysteine minus mutants by SDS PAGE and BN-PAGE demonstrated that, the cysteine substitution in the first cysteine rich domain (C1 - C6) does not have a major effect on assembly for the mutant receptors. In contrast, the replacement of the four cysteine residues (C7 - C10) from the second cysteine rich domain demonstrate a critical importance of this domain for the functional surface expression of P2X1 receptor. The investigations of several double cysteine mutants revealed that according to a similarity in the sensitivity to ATP, the C1 and C6, as well as C2 and C4 and finally C3 and C5 are pairs forming two disulfide bonds in each P2X1 subunit.
The ability to permeate accross the blood brain barrier (BBB) is essential for drugs acting on the central nervous system (CNS). Thus, systems that allow rapid and inexpensive screening of the BBB-permeability properties of novel lead compounds are of great importance for speeding up the drug discovery process in the CNS-area. We used immortalized porcine brain microvessel endothelial cells (PBMECICl-2) to develop a model for measurement of blood-brain barrier permeation of CNS active drugs. Investigation of different cell culture conditions showed, that a system using C6 astrocyte glioma conditioned medium and addition of a cyclic AMP analog in combination with a type IV phosphodiesterase inhibitor (R020-1724) leads to cell layers with transendothelial electrical resistance values up to 300 Ω.cm2. Permeability studies with U-[14C]sucroseg ave a permeability coefficient Pe of 3.24 + 0.14 × 10−4 cm/min, which is in good agreement to published values and thus indicates the formation of tight junctions in vitro.
Für viele pädiatrische Patienten mit Leukämie ist die Durchführung einer Hoch-Dosis- Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation oft die einzige Möglichkeit die Heilungsrate zu verbessern. Die Eliminierung der residualen leukämischen Blasten basiert einerseits auf der Konditionierung mit hoch-aggressiver Chemotherapie. Andererseits ist sie auf immunologische Reaktionen zwischen immunkompetenten Zellen, die entweder in dem Transplantat enthalten sind, oder aus diesem neu entstehen und den verbliebenen leukämischen Blasten zurückzuführen. Diese immunologische Interaktion wird auch als Graftversus- Leukämie-Reaktion (GVL) bezeichnet und hauptsächlich von T-und NK-Zellen vermittelt. Trotz zunächst erfolgreicher allogener Transplantation erleidet ein beträchtlicher Anteil der Patienten ein Rezidiv. Während ein offenes Rezidiv oft nicht mehr behandelbar ist, können Patienten mit drohendem Rezidiv oder minimaler Resterkrankung (MRD) durch Infusion immunkompetenter Zellen des Spenders, sogenannte Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI), teilweise erfolgreich behandelt werden. Die Behandlung mit DLI ist limitiert durch die Graft-versus-host-disease (GVHD), eine mit zum Teil schweren Komplikationen verbundene Reaktion, die potentiell tödlich verlaufen kann. Die gentechnische Veränderung der alloreaktiven Zellen mit einem Suizidgen ermöglicht eine kontrollierte, spezifische Eliminierung dieser Zellen im Falle einer GVHD Entwicklung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene retrovirale Selektions/Suizid- Fusionsvektoren für die Transduktion von Spender T-Zellen im Kontext einer DLI entwickelt. Beide Selektions/Suizid-Fusionselemente wurden in einem für die Transduktion in T-Zellen optimierten retroviralen Vektor generiert. Die Selektionsmarker waren so gewählt, dass eine Anreicherung der Transgen-positiven Zellen über eine immunomagnetische Selektion möglich war. Ein Vektor kodierte für ein Fusionsmolekül aus dem zytoplasmatisch trunkierten humanen CD34-Oberflächenmarker (tCD34) und der Zellzyklus-abhängigen GCV-hypersensitiven HSVtk39 (Herpes-simplex Virus I Thymidin Kinase) Mutante. Durch GCV-Applikation konnte in den transduzierten, tCD34/HSV-tk39 exprimierenden Zellen spezifisch die Apoptose induziert werden. Der zweite Vektor wurde so konstruiert, dass ein Fusionsprotein aus dem humanen DLNGFR-Oberflächenmarker und der Zellzyklus-unabhängigen death-effector-domain (DED) des humanen FADD (Fas-associated-protein with death domain) Moleküls entstand. Über zwei zwischengeschaltete FKBP (FK506-binding protein) Domänen wurden die beiden Elemente miteinander fusioniert. In DLNGFR/Fv'Fv/DED-exprimierenden Zellen konnte die Apoptose durch die Applikation eines spezifisch an die beiden FKBP-Domänen bindenden synthetischen Substrats (AP20187), das die Dimerisierung des DED-Moleküls induzierte, ausgelöst werden. Durchflusszytometrische Analysen von transduzierten und selektierten humanen primären TZellen zeigten, dass beide Fusions-Transgene korrekt in den Zielzellen exprimiert wurden. Die spezifische Induktion der Apoptose durch Aktivierung des jeweiligen Suizidmoleküls wurde in Funktionalitätstestungen nachgewiesen. Beide Fusionsmoleküle vermittelten eine effiziente Eliminierung der transduzierten Zellen (90 %-98 %). In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die beiden Suizidmechanismen einer unterschiedlichen Kinetik unterlagen. Während die DED-induzierte Apoptose sehr schnell auf die Applikation des Suizidaktivators folgte, vermittelte der HSV-tk39 Mechanismus eine deutlich langsamere aber etwas effizientere Eliminierung der Zellen. Erste Untersuchungen einer Kombination beider Fusionsmoleküle deuten auf einen additiven/synergistischen Effekt hin, der zu einer schnellen und effizienten Eliminierung der Zellen führt (>=99 %). Zur Zeit stellt die Strategie der Suizidgen-transduzierten T-Zellen die am vielversprechendste Methode zur Kontrolle einer GVHD-Reaktion dar. Die hier entwickelten Vektoren ermöglichen eine effiziente, kontrollierte Eliminierung der Zellen und bieten Potential zur Weiterentwicklung einer optimierten Strategie.
More than 70 years ago, the effects of extracellular adenosine 5'-triphosphate (ATP), a newly identified and purified biomolecule at that time (Fiske and Subbarow, 1925; Lohmann, 1929) were observed by Drury and Szent-Györgyi (1929). Since then, many pharmacological studies were carried out with extracellular adenine nucleotides in various intact organ systems, isolated tissues, and purified cell preparations. Yet it was not until 1972 that Burnstock introduced the concept of "purinergic nerves" and suggested that ATP might fulfil the criteria generally regarded as necessary for establishing a substance as a neurotransmitter, summarised by Eccles (1964):
• synthesis and storage of transmitter in nerve terminals
Strips of guinea-pig taenia coli (GPTC) were shown to take up large amounts of tritium-labelled adenosine when incubated with tritium-labelled adenosine, adenosine 5'-monophosphate (AMP), adenosine 5'-diphosphate (ADP) and ATP. The nucleoside was rapidly converted into and retained largely as [ 3 H]-ATP (Su et al., 1971).
• release of transmitter during nerve stimulation
Spontaneous relaxation of GPTC as well as relaxations induced by nerve stimulation or nicotine, respectively, in the presence of compounds which block adrenergic and cholinergic responses were accompanied by a remarkable increase in release of tritium-labelled material from taenia coli incubated in [ 3 H]-adenosine (Su et al., 1971).
• postjunctional responses to exogenous transmitters that mimic responses to nerve stimulation
Burnstock et al. (1966) characterised ATP and ADP as the most potent inhibitory purine compounds in the gut and observed that the effects of ATP mimic more closely the inhibitory response of the taenia to non-adrenergic nerve-stimulation than to adrenergic nerve stimulation (Burnstock et al., 1970).
enzymes that inactivate the transmitter and/or uptake systems for the transmitter or its breakdown products
When ATP was added to a perfusion fluid recycled through the vasculature of the stomach, very little ATP remained, but the perfusate contained substantially increased amounts of adenosine and inosine, as well as some ADP and AMP (Burnstock et al., 1970).
• drugs that can produce parallel blocking of potentiating effects on the responses of both exogenous transmitter and nerve stimulation
Tachyphylaxis to ATP produced in the rabbit ileum resulted in a consistent depression of responses to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation, whereas responses to adrenergic nerve stimulation remained unaffected (Burnstock et al., 1970). Lower concentrations of quinidine reduced and finally abolished relaxation of GPTC induced by noradrenaline (NA) and by adrenergic nerve stimulation. Using higher concentrations of the compound, relaxant responses of GPTC to ATP as well as to non-adrenergic inhibitory nerve stimulation were abolished (Burnstock et al., 1970). ...
In der vorliegenden Arbeit wurden drei experimentelle Ansätze gewählt, um kardiale Ionenkanäle zu charakterisieren, die möglicherweise einen Einfluss auf das atriale Aktionspotential haben könnten und die somit potentielle neue Ziel-Gene für die Entwicklung neuer Antiarrhythmika darstellen könnten. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die pharmakologische Untersuchung der Rolle des Schwellungsaktivierten Chloridkanals I Cl,swell für das atriale Aktionspotential. In einer weiteren Studie wurde eine neue regulatorische Untereinheit des hKv4.3-Kanals identifiziert sowie deren physiologische Bedeutung für die Aktivität des transienten Kalium-Auswärtsstroms I to1 charakterisiert. Schließlich wurde ein neuer Kaliumkanal, TASK-4, kloniert, der im humanen Herzen ausschließlich im Atrium vorkommt und deshalb einen Einfluss auf die Erregbarkeit des Herzvorhofs ausüben könnte. Unter mehreren Ethacrynsäure-Derivaten konnte mit DCPIB ein neuer potenter Blocker des I Cl,swell identifiziert werden. Nachfolgende Patch-Clamp und Zwei-Mikroelektroden Spannungsklemmen-Analysen verschiedener nativer und heterolog exprimierter Anionen und Kationenkanäle zeigten, dass DCPIB spezifisch den I Cl,swell Strom hemmt. Dies war eine Voraussetzung, um die Funktion des I Cl,swell beim atrialen Aktionspotential während osmotischer Zellschwellung zu untersuchen. Die Schwellung atrialer Kardiomyozyten führte zur Aktivierung des I Cl,swell und als Folge davon zu einer starken Verkürzung der Aktionspotentialdauer. Diese war durch DCPIB vollständig hemmbar. Unter basalen Bedingungen hatte DCPIB keinen Effekt auf das Aktionspotential. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Aktivierung des I Cl,swell unter pathologischen Bedingungen, die mit einer kardialen Zellschwellung einhergehen, eine ursächliche Rolle beim Auftreten von Arrhythmien spielen kann. Viele frühere Untersuchungen über die Rolle des I Cl,swell bei Arrhythmien erfolgten am Rattenherzen. Unter Verwendung von DCPIB konnten wir aber zeigen, dass die in atrialen und ventrikulären Myozyten von normalen und von hypertrophierten Rattenherzen beschriebenen Chloridströme nicht durch den I Cl,swell hervorgerufen werden. Das Fehlen des I Cl,swell im Rattenherzen stellt damit diese früheren Ergebnisse in Frage. Eine weitere Leitfähigkeit, die im menschlichen Herzen zur Repolarisation der kardialen Membranen während dem Aktionspotential beiträgt, ist der 'Plateau-Strom" I Kp , der in seinen kinetischen Eigenschaften TWIK oder TASK-artigen Kaliumkanälen ähnelt. Als erster Schritt bei der Identifizierung der molekularen Identität dieses Kaliumkanals wurde in dieser Arbeit mit TASK-4 ein neues Mitglied der Säuresensitiven Tandem-von-zwei-Poren-Kaliumkanälen kloniert. Die heterologe Expression des TASK-4 in Xenopus-Oozyten erzeugte Kaliumströme, die eine starke Auswärts-Rektifizierung zeigten, die jedoch bei Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration verloren ging. Die TASK-4-Ströme waren abhängig vom extrazellulären pH-Wert, wobei die pH-Sensitivität im Vergleich zu den anderen TASK-Kanälen zu mehr alkalischen Werten verschoben war. Außerdem zeigten die TASK-4-Ströme die für TASK- Kanäle typischen pharmakologischen Eigenschaften. Aufgrund des Vorkommens von TASK-4 im Atrium und dem Atrioventrikular-Knoten des menschlichen Herzens stellt dieser Kaliumkanal einen neuen potentiellen Angriffspunkt für die Entwicklung eines Vorhof spezifischen Antiarrhythmikums dar. Im Gegensatz zu dem I Kp Strom ist der Ca 2 unabhängige transiente Kalium-Auswärtsstrom I to1 des Herzens für die initiale Phase der Repolarisation während des Aktionspotentials verantwortlich. In vielen Regionen des Herzens trägt die Untereinheit des hKv4.3 Kaliumkanals zum I to1 Strom bei. In dieser Arbeit wurde mit hKChIP2 erstmals eine regulatorische Untereinheit des I to1 identifiziert. Northern-Blot-Analysen haben gezeigt, dass das hKChIP2-Gen ausschließlich im humanen Herzen exprimiert ist, wobei es im Atrium und Ventrikel des adulten humanen Herzens, aber nicht im fötalen Herzen, vorkommt. Weiterhin konnten wir eine neue kurze Spleiß-Variante des hKChIP2-Gens (hKCNIP2) isolieren und durch PCR-Analyse nachweisen, dass diese im menschlichen Herzen die Hauptform des hKChIP2 darstellt. Die Koexpression des hKv4.3 mit beiden hKChIP2-Isoformen in Xenopus - Oozyten bewirkte eine Zunahme der Stromamplitude, eine Verschiebung der Spannung der halbmaximalen Inaktivierung und eine stark beschleunigte Erholung von der Inaktivierung der hKv4.3-Kanäle, die in Anwesenheit von hKChIP2 deutlich mehr dem nativen I to1 Kanal des humanen Epikards ähnelten. Unsere Ergebnisse sprechen sehr stark dafür, dass hKChIP2 eine physiologisch wichtige regulatorische Untereinheit des hKv4.3 ist, die auch zur Heterogenität der I to1 Ströme im humanen Herzen beiträgt. Da der I to1 Kanal an der Entstehung und dem Fortschreiten verschiedener Herzkrankheiten wie den Arrhythmien und der Herzinsuffizienz beteiligt ist, stellt hKChIP2 ein neues Ziel-Gen für die Entwicklung neuer zukünftiger Klasse III-Antiarrhythmika dar. Die in Kooperation mit der Universität Istanbul durchgeführte Aufklärung der Exon-Intron-Organisation des hKCNIP2-Gens liefert zudem die Grundlage für ein zukünftiges systematisches Screening nach Mutationen im hKChIP2-Gen in Familien mit vererbbaren Arrhythmien.
During the past several years, ceramide has emerged as an important second messenger triggering cell responses including proliferation, differentiation, growth arrest and apoptosis. This thesis has focused on the regulation of neutral ceramidase which critically determines, in concert with ceramide generating sphingomyelinases, the intracellular ceramide levels. In the first part it is reported that besides a rapid and transient increase in neutral sphingomyelinase activity a second delayed peak of activation occurs after hours of IL-1beta treatment. This second phase of activation is first detectable after 2 h of treatment, and steadily increases over the next two hours reaching maximal values after 4 h. In parallel, a pronounced increase in neutral ceramidase activity is observed, which accounts for a constant or even decreased level of ceramide after long-term IL-1beta treatment, despite continuous sphingomyelinase activation. The increase in neutral ceramidase activity is due to expressional up-regulation, as detected by an increase in mRNA level and enhanced de novo protein synthesis. The increase of neutral ceramidase protein levels and activity can be blocked dosedependently by the p38- mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK) inhibitor, SB 202190, whereas the classical MAPK pathway inhibitor U0126, and the PKC inhibitor Ro 31-8220 were ineffective. Moreover, co-treatment of cells for 24 h with IL-1~ and SB 202190 leads to an increase in ceramide formation. Interestingly, IL-1beta-stimulated neutral ceramidase activation is not reduced in mesangial cells isolated from mice deficient in MAPK-activated protein kinase 2 (MAPKAPK-2), which is one possible downstream substrate of the p38-MAPK, thus suggesting that the p38-MAPK-mediated induction of neutral ceramidase occurs independently of MAPKAPK-2. The results suggest a biphasic regulation of sphingomyelin hydrolysis in cytokine-treated mesangial cells with a delayed de novo synthesis of neutral ceramidase counteracting sphingomyelinase activity and apoptosis. Neutral ceramidase may thus represent a novel cytoprotective enzyme for mesangial cells exposed to inflammatory stress conditions. In a second part, the effect of NO on neutral ceramidase was studied. Ceramide levels are strongly increased in a delayed fashion by stimulation of renal mesangial cells with NO. This effect is due to a dual action of NO, comprising an activation of sphingomyelinases and an inhibition of ceramidase activity. The inhibition of neutral ceramidase activity correlates with the decrease of neutral ceramidase protein. A complete loss of neutral ceramidase protein is obtained after 24h of NO stimUlation. Moreover, the NO-induced degradation is reversed by the protein kinase C (PKC) activator, 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) , but also by the physiological PKC activators platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), angiotensin II and ATP, resulting in a normalisation of neutral ceramidase protein as well as activity. In vivo phosphorylation studies using 32Pj-labelled mesangial cells, reveal that TPA, PDGF-BB, angiotensin II and ATP trigger an increased phosphorylation of the neutral ceramidase, which is blocked by the broad-spectrum PKC inhibitor Ro-31 8220, but not by CGP 41251, which has a preferential action on Ca2+-dependent PKC isoforms, thus suggesting the involvement of a Ca2+-independent PKC isoenzyme. In vitro phosphorylation assays using recombinant PKC isoenzymes and neutral ceramidase immunoprecipitated from unstimulated mesangial cells, show that particularly the PKC-alpha isoform, and to a lesser extent the PKC-a isoform, are efficient in directly phosphorylating neutral ceramidase. The data show that NO is able to induce degradation of neutral ceramidase thereby promoting accumulation of ceramide in the cell. This effect is reversed by PKC activation, most probably by the PKC-delta isoenzyme, which may directly phosphorylate and thereby, prevent neutral ceramidase degradation. In the third chapter it is demonstrated that the NO-triggered degradation of neutral ceramidase involves activation of the ubiquitin/proteasome complex. The specific proteasome inhibitor, lactacystin, completely reverses the NO-induced degradation of ceramidase protein and neutral ceramidase activity. As a consequence, the cellular amount of ceramide, which drastically increases by NO stimulation, is reduced in the presence of lactacystin. Furthermore, ubiquitinated neutral ceramidase accumulates after NO stimulation. The data clearly show that the ubiquitin/proteasome complex is an important determinant of neutral ceramidase activity and thereby regulates the availability of ceramide. In a last part, the cellular localisation of neutral ceramidase was investigated using green fluorescent protein (GFP) as fusion protein to examine cellular distribution and translocation of neutral ceramidase. Unstimulated HEK 293 cells reveal after transient transfection experiments that neutral ceramidase is preferentially localized in the cytoplasm. PKC activation led to an accumulation of neutral ceramidase at the nuclear membrane. In summary, this work demonstrates that the neutral ceramidase is a fine regulated protein that plays a critical role in regulating intracellular ceramide levels and thereby the cell's fate to undergo apoptosis or survive. Regulation of neutral ceramidase can be achieved on all levels, i.e. on the mRNA level, the protein level or posttranslationally by phosphorylation and subcellular translocation. Future work will reveal whether neutral ceramidase can serve as a therapeutic target in the development of novel antiinflammatory and anti-tumour drugs.
Die Protoonkogene Ras und Raf spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung eines extrazellulären Signals in den Zellkern. Die direkte Interaktion zwischen GTP-gebundenem, aktiviertem Ras und der Proteinkinase Raf führt zur Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade, die eine entscheidende, regulatorische Rolle bei onkogenen, mitogenen und entwicklungsabhängigen Signalwegen besitzt. Die Beeinflussung der Kaskade stellt daher einen interessanten Ansatz für die Arzneistoffentwicklung dar. Trotz der bekannten Proteinstrukturen von Ras und Raf sind bisher nur wenige Stoffe gefunden worden, die die Interaktion direkt beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher ein Testsystem auf der Basis des Hefe-Zwei-Hybrid-System etabliert, mit dessen Hilfe Effektoren der Ras/Raf-Wechselwirkung schnell und einfach identifiziert werden können. Das erste Ziel der Arbeit war die Etablierung einer Testmethode in 96-well-Microtiterplatten, die einen schnellen Durchsatz verschiedener Proben erlaubt. Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit 469 Reinsubstanzen und Pflanzenextrakte in verschiedenen Konzentrationen getestet. Durch die Verwendung geeigneter Kontroll-Hefestämme konnte außerdem eine Aussage über die Spezifität der Substanzinteraktion getroffen werden. Bei einigen Ras/Raf-aktivierenden Substanzen konnten über die Testung systematischer Substanzreihen Struktur-Wirkungsbeziehungen aufgestellt werden. Cycloalkylidencarbonsäuren wurden als erste potente Ras/Raf-Aktivatoren identifiziert, deren wahrscheinlicher Interaktionsbereich durch die Expression verkürzter Raf-Mutanten auf den Bereich von AS 131-194 von Raf eingeschränkt werden konnte. Sie stabilisieren nicht nur die Bindung von mutiertem, sondern auch von Wildtyp-Ras an Raf. In einem zweiten, unabhängigen Säugerzell-Testsystem, das auf der Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade und dem anschließendem Nachweis des phosphorylierten MEK-Proteins beruht, lieferten die aktiven Verbindungen erste Hinweise auf eine Aktivierung der Signalkaskade. Mögliche Optimierungen der beiden verwendeten Testsystem, sowie Alternativen, weitergehende Experimente und Einsatzgebiete von Ras/Raf-Effektoren werden abschließend diskutiert.
Einleitung: Die kurzkettige Fettsäure Butyrat, die im Gastrointestinaltrakt durch bakterielle Fermentation aus nicht resorbierten Ballaststoffen und komplexen Kohlenhydraten der Nahrung gebildet wird, konnte in zahlreichen in vitro-Untersuchungen ihre chemopräventiven Eigenschaften demonstrieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der Butyrat-induzierten Differenzierung und Wachstumshemmung von Kolonkarzinomzellen näher zu charakterisieren. Methodik: Die Versuche wurden an den kolorektalen Karzinomzelllinien Caco-2 und SW620 durchgeführt, die unter Standardbedingungen kultiviert wurden. Für einen Teil der Experimente wurden zusätzlich die Pankreaskarzinomzelllinien MiaPaca-2 und Capan-1 verwendet. Zytotoxische Effekte wurden durch Messung des Enzyms Laktatdehydrogenase im Überstand ausgeschlossen. Die Zellzahl wurde mittels Kristallviolettfärbung und die Proliferation über den Einbau von 5-Bromo-2‘-deoxyuridin (BrdU) während der DNA-Synthese bestimmt. Die Zelldifferenzierung wurde anhand der Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase quantifiziert. Rezeptorbindungsstudien mit [3H]1,25-Dihydroxyvitamin D3 wurden zur Ermittlung der Vitamin D Rezeptor- (VDR-) Bindungsaktivität durchgeführt, die Menge an VDR mRNA wurde über PCR quantifiziert. Die Proteine wurden mittels Western Blot und die Zellzyklusdistribution mit Hilfe eines Durchflusszytometers analysiert. Ergebnisse: Butyrat [3 mmol/L] sowie sein Prodrug Tributyrin, in 3-fach niedrigerer Konzentration eingesetzt ([1 mmol/L]), hemmten das Wachstum der Pankreaskarzinom-zelllinien MiaPaca-2 und Capan-1 ähnlich effektiv. Auch die apoptose- und differenzierungsfördernden Wirkungen von Butyrat und Tributyrin waren vergleichbar. In der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2 erwies sich Butyrat in der Wachstumshemmung und Differenzierungsinduktion als etwas stärker wirksam. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) [10-6 mol/L] besaß in der Zelllinie Caco-2 ebenfalls proliferationshemmende und differenzierungsinduzierende Eigenschaften, die allerdings nur mäßig ausgeprägt waren. Die Kombination aus Butyrat und 1,25-(OH)2D3 wies in etwa eine additive antiproliferative Wirkung auf, wohingegen die Zelldifferenzierung synergistisch verstärkt wurde. Der potenzierende Effekt auf die Differenzierung ließ sich in der Pankreaskarzinomzelllinie Capan-1 bestätigen. Rezeptorbindungsstudien in Caco-2 Zellen ergaben, dass Tributyrin die spezifische Bindung von 1,25-(OH)2D3 an seinen Rezeptor erhöhte, ohne die Affinität des Liganden zu seinem Rezeptor zu beeinflussen. Auf RNA- und Proteinebene ließ sich eine zeit- und dosisabhängige Steigerung der VDR-Expression durch Tributyrin oder Butyrat in den Kolonkarzinomzelllinien Caco-2 und SW620 beobachten. Andere kurzkettige Fettsäuren ähnlicher Struktur beeinflussten hingegen die VDR-Expression in Caco-2 Zellen nur geringfügig oder gar nicht. Die Butyrat-induzierte Differenzierung von Caco-2, SW620 und Capan-1 Zellen ließ sich durch die Kombination mit dem VDR-Antagonisten ZK 191732 [10-5 mol/L] aufheben. Auch der durch die 48-stündige Butyrat-Behandlung von Caco-2 und SW620 Zellen verursachte G0/G1-Zellzyklusstop verschwand vollständig nach Koinkubation mit ZK 191732. Die genauere Untersuchung des molekularen Mechanismus, der dem Butyrat-induzierten Zellzyklusstop zugrundelag, erbrachte eine verminderte Expression der zellzyklusregulierenden Proteine Cyclin D1, E und A sowie der cyclinabhängigen Kinasen cdk2, 4 und 6 durch Butyrat. Weiterhin verstärkte Butyrat die Expression der cdk-Inhibitoren p21Waf1/Cip1 und p27Kip1. Die Butyat-induzierten Veränderungen in den Proteinmengen von p21Waf1/Cip1, cdk6 und Cyclin A ließen sich durch die Kombination mit 1,25-(OH)2D3 synergistisch verstärken und durch die Koinkubation mit ZK 191732 aufheben. Im Gegensatz hierzu wurden die durch Butyrat verursachten Änderungen in der Expression von p27Kip1, cdk2, cdk4, Cyclin D1 und Cyclin E weder durch 1,25-(OH)2D3 verstärkt noch durch den VDR-Antagonisten vermindert. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse demonstrieren, dass Butyrat, das natürlicherweise durch die Nahrung im Darmlumen präsent ist, eine Reihe zellulärer Prozesse in Kolonkarzinomzellen beeinflusst, die schließlich in einer Proliferationshemmung, Differenzierung und Apoptose der Zellen resultieren. An der Regulation dieser Prozesse durch Butyrat ist der VDR zumindest teilweise beteiligt. Dies erklärt die synergistische Wirkung der Kombination aus Butyrat und 1,25-(OH)2D3 auf die Zelldifferenzierung, den Zellzyklusstop sowie auf die Expression verschiedener zellzyklusregulatorischer Proteine in Karzinomzellen. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass Butyrat, als Prodrug in Form von Tributyrin verabreicht, von pharmakologischem Interesse hinsichtlich der Chemoprävention oder -therapie des Kolonkarzinoms sein könnte.
Die alpha-Untereinheiten von Ionenkanälen assemblieren durch eine Tetramerisierung von Coiled-Coils
(2002)
Der spannungsabhängige Kaliumkanal EAG1 besitzt eine carboxyterminale 40 Aminosäuren lange Domäne, die für die Assemblierung von vier alpha-Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal verantwortlich ist. Die Zielsetzung dieser Arbeit war zunächst die Analyse der Sekundärstruktur dieser Assemblierungsdomäne, sowie die Identifikation weiterer Ionenkanäle, die im Carboxyterminus eine strukturelle Homologie zur Assemblierungsdomäne des EAG1- Ionenkanals zeigen. Darüber hinaus sollten Aussagen über die Bedeutung der Domäne für die Funktion des jeweiligen Ionenkanals getroffen werden. Computergestützte Analysen der Sekundärstruktur ergaben, dass strukturell konservierte homologe Domänen in den Familien der durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen (CNG), in den spannungsabhängigen kaliumselektiven Kanälen (neben EAG, auch in ELK, ERG und KCNQ), in den calciumabhängigen Kaliumkanälen (SK, IK), in den nicht selektiven Kationenkanälen (PKD) und in den Calciumkanälen (TRP) zu finden sind. Diese Ionenkanäle zeigen in computergestützten Analysen Domänen, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Coiled-Coil Struktur im Caboxyterminus. Im zweiten Teil ging es darum, die berechnete Sekundärstruktur experimentell zu belegen. Dazu wurden die caboxyterminal gelegenen Proteinbereiche mit einer Möglichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils exemplarisch von den Kanälen EAG1, EAG2 und ERG1 als Peptide synthetisiert und analysiert. Anhand von Gelfiltrationsexperimenten und Lichtstreuung wurde die Stöchiometrie der Peptid-Assemblierung als Tetramerisierung identifiziert. Mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte ein hoher alpha-helikaler Strukturanteil und eine außerordentliche Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen gezeigt werden. Aus diesen Daten kann, in Übereinstimmung mit computergestützten Analysen der Aminosäuresequenz, geschlossen werden, dass die Peptide zu tetrameren Coiled-Coils assemblieren. In Analogie kann diese Art der Zusammenlagerung ebenfalls für die alpha-Untereinheiten der Ionenkanäle angenommen werden, für die in computergestützten Analysen eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils berechnet werden konnte. Die dafür verantwortliche Domäne wurde als „Tetramerisierende Coiled-Coil“ (TCC) Domäne benannt und kann als generelles Strukturmotiv angenommen werden. Im dritten Teil wurde ein auf Oberflächen-Plasmonresonanz basierender Proteininteraktionstest entwickelt, der es ermöglicht, die Kinetik der Tetramerisierung in Echtzeit zu verfolgen. Für die Peptide, deren Aminosäuresequenz der TCC-Domäne eines funktionellen Ionenkanals entsprach, konnte eine Ausbildung homomerer Komplexe gezeigt werden. Eine stabile heterologe Interaktion konnte nur zwischen den aus einer Proteinunterfamilie stammenden Domänen EAG1 und EAG2 gemessen werden. Dagegen interagierten diese Peptide nicht mit der Interaktionsdomäne aus ERG1. Die TCC-Domäne ist demnach in der Lage, die Spezifität der Bindung zu bestimmen. Aufbauend auf den Ergebnissen der Sekundärstrukturanalyse stand nun die Bedeutung der TCC-Domäne für die Funktionalität des jeweiligen Ionenkanals im Zentrum dieser Arbeit. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Austausch einer hydrophoben Aminosäure gegen eine polare Aminosäure innerhalb des Coiled-Coils drastische Auswirkungen auf die Funktion dieser ca. 40 Aminosäuren langen Domäne hatte. Diese Peptide lagen nur noch zu einem geringen Anteil als Tetramere vor und wiesen eine deutlich geringere Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen auf. Im Proteininteraktionsassay äußerte sich der Einfluss des Austausches in einer rascheren Assoziations- und Dissoziationsphase im Vergleich zu den tetrameren Coiled-Coil Peptiden. In vivo durchgeführte elektrophysiologische Messungen an Ionenkanalkonstrukten bestätigten die physiologische Relevanz der TCC-Domäne. Die Abwesenheit dieser Domäne in HERG1 führte zu einem Verlust der Funktion des Ionenkanals. Diese konnte jedoch durch Klonierung der entsprechenden TCC-Domäne des EAG1-Ionenkanals in den HERG1-Ionenkanal wieder hergestellt werden. Das Ionenkanalkonstrukt, bestehend aus dem HERG1-Kanal mit der TCC-EAG1 Domäne konnte, im Gegensatz zu dem HERG1 Wildtyp, funktionelle Heteromultimere mit EAG1 alpha- Untereinheiten bilden, so dass ein Ionenkanal mit veränderten Eigenschaften elektrophysiologisch beschrieben werden konnte. Die Relevanz der TCC-Domäne für die Funktionalität des Ionenkanals wird auch durch natürlich vorkommende Mutationen belegt. Diese beeinflussen die Struktur und damit die Funktion der TCC-Domäne. In Datenbanken des humanen Genoms konnten 38 Mutationen in sieben verschiedenen Genen identifiziert werden, die die Struktur der Coiled-Coil Domäne der resultierenden Ionenkanäle beeinflussen. Diese Mutationen äußern sich in zahlreichen phänotypischen Krankheitsbildern.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.