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Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Synthese und Untersuchung funktioneller Materialien für die Modifizierung von Grenz- und Oberflächen. Einen wichtigen Einfluss auf die Bildung der untersuchten, hochgeordneten Strukturen hat das Konzept der Selbstanordnung, dessen Grundlage schwache Wechselwirkungen sind. Ihre Ausbildung erfordert das Vorliegen geeigneter, funktioneller Gruppen in den Präkursoren und damit die Nutzung der vielfältigen Möglichkeiten der chemischen Synthese zur Bereitstellung maßgeschneidert funktionalisierter Moleküle. Den fünf Projekten dieser Arbeit gemeinsam ist daher die Synthese und Untersuchung für den jeweiligen Anwendungszweck geeigneter, dipolarer Präkursor-Moleküle, die zur Ausbildung funktioneller Koordinationspolymere (CPs) bzw. Metall-organischer Gerüstverbindungen (MOFs) und selbstanordnender Monolagen (SAMs) genutzt werden können. In Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern wurden auf dieser Grundlage Untersuchungen zur Anwendbarkeit der erhaltenen Materialien in der Sensorik und zur Oberflächenfunktionalisierung durchgeführt.
Im ersten Projekt dieser Dissertation erfolgte die Untersuchung der Bildungs- und Phasenumwandlungsreaktionen von zehn verschiedenen Kupfer-Terephthalat Koordinationspolymeren. Neben bereits bekannten Koordinationspolymeren konnten so auch drei bisher literaturunbekannte CPs hergestellt und ihre Strukturen durch Kooperationspartner gelöst bzw. Strukturvorschläge gemacht werden. Die Identifikation und Auseinandersetzung mit strukturstabilisierenden Wechselwirkungen schließen dieses Projekt ab und bilden die Grundlage für die Untersuchung der Synthese und Stabilität abgeleiteter, komplexerer Koordinationspolymere.
Im Fokus des zweiten Projekts steht 𝛽-Cu2(bdc)(OH)2, ein Kupfer-Terephthalat Koordinationspolymer, dessen Kristallstruktur zuvor nicht bekannt war, im vorliegenden Projekt aber durch Kooperationspartner auf Basis des Röntgenpulverdiffraktogramms des Materials gelöst werden konnte. Der Vergleich der analytischen Daten von 𝛽-Cu2(bdc)(OH)2 mit der Literatur zeigte gute Übereinstimmungen u. a. der Diffraktogramme und IR-Spektren mit dem in der Literatur als SURMOF-2 bezeichneten, oberflächengebundenen Schichtmaterial. Aufgrunddessen kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei SURMOF-2 um 𝛽-Cu2(bdc)(OH)2 handelt, und folglich dessen Kristallstrukturlösung die beiden bisher in der Literatur vorhandenen Strukturvorschläge für SURMOF-2 ersetzt.
Im Rahmen des dritten Projekts sollten für die Sensorik anwendbare, MOF-basierte Dünnschichtsysteme hergestellt werden. Das Sensorkonzept, das auf der Änderung des dielektrischen Verhaltens der MOFs bei Einlagerung dipolarer Analytmoleküle beruht, erfordert den Einsatz dipolarer Liganden in den entsprechenden Koordinationsnetzwerken. Hierfür wurden mehrere teilweise dipolare pillar-Liganden synthetisiert und diese für den Aufbau von Kupfer(II)terephthalat-basierten pillared-layer MOFs eingesetzt. Im Rahmen des Projekts konnten so auf Grundlage der Erkenntnisse aus Projekt 1 und in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern neue pillared-layer MOFs hergestellt und ihre Kristallstrukturen gelöst werden. Die abschließend durch Kooperationspartner erfolgte Abscheidung dünner, oberflächengebundener Schichten dieser MOFs und erste Untersuchungen hinsichtlich ihrer Eignung für die geplante Sensorikanwendung runden das Projekt ab.
Im vierten Projekt sollte eine geeignete, in situ abspaltbare Schutzgruppe für die Thiolgruppe etabliert und ihr Einfluss auf die Bildung von Terphenylthiolat-SAMs untersucht werden. Diese Voraussetzung erfüllt die im Rahmen dieser Arbeit am Beispiel von CH3-, F- und CF3-terminierten Terphenylthiolen etablierte 3,4-Dimethoxybenzyl-Gruppe, die sich durch den Zusatz von Trifluoressigsäure in der Abscheidungslösung in situ abspalten lässt. Zum Vergleich wurden von Kooperationspartner Monolagen aus den entsprechenden freien Thiolen abgeschieden und untersucht. Schichtdicken, Packungsdichten, Kippwinkel und Elementarzellen von Monolagen aus freien und geschützten Terphenylthiolen zeigen gute Übereinstimmungen. Im Gegensatz zu anderen, ebenfalls in situ abspaltbaren Gruppen hat die Anwesenheit der 3,4-Dimethoxybenzyl-Gruppe folglich keinen negativen Einfluss auf die Struktur und Qualität der gebildeten Monolagen.
In Fortführung des vorangegangenen Projekts wurde im abschließenden Projekt in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern der Einfluss verschiedener Kopfgruppen (H-, CH3-, F-, CF3- und SF5-) und der Länge des aromatischen Rückgrats (Phenyl-, Biphenyl- und Terphenyl-) auf die Ladungstransporteigenschaften der entsprechenden SAMs untersucht. Mit Ausnahme einiger Benzolthiole, lieferten alle betrachteten Präkursoren hochgeordnete, dicht gepackte Schichten aus aufrecht angeordneten Molekülen. Wie erwartet korreliert die Austrittsarbeit der modifizierten Oberflächen mit dem Dipolmoment der jeweiligen Kopfgruppe, wobei der Effekt der SF5-Gruppe mit einer erzielten Austrittsarbeit von annähernd 6 eV besonders hervorzuheben ist. Den Erwartungen entsprechend, sinkt die elektrische Stromdichte bei gleichbleibender Kopfgruppe mit steigender Moleküllänge. Die Stromdichte ist außerdem von der Kopfgruppe abhängig und nimmt von CH3- über H-, CF3- und SF5- bis hin zu F- ab, korreliert aber folglich nicht mit der Austrittsarbeit oder dem Dipolmoment.
The EMT-transcription factor ZEB1 has been intensively studied in solid cancers, where it is expressed at the invasive front and in cancer-associated fibroblasts (CAFs). In tumour cells, ZEB1 has been involved in multiple steps of cancer progression including stemness, metastasis and therapy resistance, yet its role in the tumour-microenvironment is largely unknown. Here, the role of Zeb1 in CAFs was investigated using mouse models reflecting different tumour stages in immunocompetent fibroblast specific Zeb1 KO mice. Fibroblast-specific depletion of Zeb1 accelerated tumour growth in the inflammation driven AOM/DSS tumour initiation model, reduced tumour growth and invasion in the sporadic AOM/P53 model and reduced liver metastasis in a progressed orthotopic transplantation model. Immunohistochemical and single cell RNA-sequencing analysis showed that Zeb1 ablation resulted in attenuated expression of the myofibroblast marker aSMA and reduced ECM deposition, indicating a shift among fibroblast subpopulations. Modulation of CAFs was furthermore associated with increased inflammatory signaling in fibroblasts resulting in immune infiltration into primary tumours and exaggerated inflammatory signaling in T cells, B cells and macrophages. These changes in the tumour microenvironment were associated with increased efficacy of immune checkpoint inhibition therapy. In summary, Zeb1 expression in CAFs was identified as a potential target to block immunosuppression and metastatic dissemination in colon cancer.
Ziel dieser Arbeit ist die Identifikation des Einflusses klassischer Labormaterialien und alternativer Experimentiermaterialien auf fachdidaktische Anforderungen an ein gelungenes Experiment im Chemieunterricht. Dabei umfassen alternative Experimentiermaterialien sowohl Materialien aus der alltäglichen Lebenswelt von Schülerinnen und Schülern als auch Materialien aus dem Bereich der Medizintechnik, die anstelle von Materialien des gängigen Laborbetriebs im Chemieunterricht eingesetzt werden. Um den Einfluss des Experimentiermaterials auf entsprechende Anforderungen untersuchen zu können, wurden im Rahmen eines Mixed-Method-Designs zwei aufeinander aufbauende Studien durchgeführt. Bei Studie I handelt es sich um eine qualitative Interviewstudie unter N = 13 Chemielehrkräften, mit denen vor dem theoretischen Hintergrund fachdidaktischer Anforderungen an ein gelungenes Schulexperiment problemorientierte, leit-fadengestützte Interviews zu Vor- und Nachteilen beim Einsatz alternativer Experimentiermaterialien und klassischer Labormaterialien im Chemieunterricht geführt wurden. Anhand des gewonnenen Interviewmaterials wurden anschließend zunächst Eigenschaften identifiziert, in denen sich beide Materialpools voneinander unterscheiden, um davon ausgehend ein Kategoriensystem aufstellen zu können, das in Form einer Matrix den Einfluss dieser Materialeigenschaften auf organisatorische, experimentelle und affektive Anforderungen an ein Schulexperiment im Chemieunterricht darstellt. Dabei konnte in Bezug auf organisatorische Anforderungen insbesondere ein Einfluss des Experimentiermaterials auf zeitliche und finanzielle Rahmenbedingungen sowie auf Anforderungen zur Sicherheit beim Experimentieren im Chemieunterricht festgestellt werden. Ergebnisse zum Einfluss des Experimentiermaterials auf affektive und experimentelle Anforderungen an ein Schulexperiment wurden wiederum genutzt, um anschließend Hypothesen zum Einfluss des Experimentiermaterials auf entsprechende Anforderungen an gelungene Experimente im Chemieunterricht zu generieren, dabei an gelungene Schülerexperimente im Speziellen. Diese Hypothesen wurden in einer zweiten Studie quantitativ getestet. Innerhalb eines experimentellen Untersuchungsdesigns führten dazu insgesamt N = 293 Schülerinnen und Schüler eines von insgesamt fünf betrachteten Schülerexperimenten mit jeweils klassischem Labormaterial oder in einer jeweiligen Variante aus alternativem Experimentiermaterial durch. Im Anschluss beurteilten N = 237 Schülerinnen und Schüler im Rahmen einer Fragebogenerhebung ihre subjektive Wahrnehmung der Experimentiersituation bezüglich der Variablen Grad der Herausforderung, Beobachtbarkeit, Autonomieerleben, Anspannung/ Druck, Kompetenzerleben und Interesse/ Vergnügen. Mit Ausnahme des Kompetenzerlebens und der Beobachtbarkeit konnte zu allen betrachteten Variablen ein signifikanter Einfluss des Experimentiermaterials festgestellt werden. Um diese Ergebnisse der Hypothesentests näher beschreiben und differenzierter erläutern zu können, beantworteten die 237 Schülerinnen und Schüler zusätzlich offene Fragen zu den von ihnen verwendeten Experimentiermaterialien; mit N = 56 weiteren Schülerinnen und Schülern wurden aus diesem Grund außerdem leitfadengestützte Gruppeninterviews geführt. Um folglich auch aus Schülerperspektive möglichst allgemeingültige Einflüsse beider Materialpools auf fachdidaktische Anforderungen an ein gelungenes Schulexperiment zusammenfassen zu können, werden die Ergebnisse dieser qualitativen Datenerhebung ebenfalls in Form einer entsprechenden Matrix dargestellt und dabei von den konkret durchgeführten Experimenten abstrahiert. Neben dem bereits genannten Einfluss des Experimentiermaterials auf den von Schülerinnen und Schülern wahrgenommenen Grad der Herausforderung, das wahrgenommene Autonomieerleben, die/ den wahrgenommene/n Anspannung/ Druck beim Experimentieren sowie das wahrgenommene Interesse/ Vergnügen an der Experimentiersituation konnte dadurch insbesondere ein Materialeinfluss auf die Durchschaubarkeit eines Versuchsaufbaus und deren einzelner Bestandteile sowie auf die wahrgenommene Authentizität einer Experimentiersituation identifiziert werden. Dadurch zeigt die Gesamtuntersuchung auf theoretischer Ebene die Bedeutsamkeit des konkreten Experimentiermaterials als Qualitätsmerkmal des Chemieunterrichts und gibt Lehrkräften auf unterrichtspraktischer Ebene einen Überblick zu Potentialen und Grenzen alternativer Experimentiermaterialien im Vergleich zu etabliertem klassischem Labormaterial.
The formation of aliphatic α-amino acids by X-ray induced carboxylation of simple amines or amination of simple carboxylic acids is not favored over the formation of other amino acids. The new carboxylic and amino groups are more or less distributed statistically over the carbon atoms of the starting material. On radiationchemical formation of aliphatic hydrocarbons over C3, therefore, an increasing amount of unusual amino acids is produced. The results are influenced by various parameters such as temperature, pH, concentration, linear energy transfer and total dosis of radiation applied. Also peptides can be formed radiationchemically. However, the formation of greater molecules by radiationchemical processes under the conditions of a primitive earth seems to have only a low probability. The reaction mechanisms of radiationchemical carboxylation and amination are discussed.
Wir ermittelten die Geschwindigkeitskonstanten sowie die Arrhenius sehen Aktivierungsenergien und Aktionskonstanten der alkalischen Hydrolyse einer Reihe von Di- und Tripeptiden. Die zur Gewinnung der kinetischen Daten führende quantitative Analyse der Hydrolysate gelang, indem die Peptide vor ihrer Hydrolyse geeignet mit 14C markiert, die Hydrolysate mit Hilfe der Papierchromatographie bzw. der Zonenelektrophorese getrennt und die isolierten Hydrolyseprodukte auf Grund ihrer Radioaktivität quantitativ bestimmt wurden.
Der zeitliche Verlauf der alkalischen Hydrolyse von Di- und Tripeptiden wird durch ein Zeitgesetz 1. Ordnung bezüglich des Peptids und bezüglich der Hydroxylionen dargestellt. Die Abstufungen der Aktivierungsenergien, die den einzelnen Peptidbindungen in Di- und Tripeptiden zugeordnet sind, lassen sich durch die Annahme deuten, daß die Hydrolyse nach dem BAC 2-Mechanismus verläuft. Die Aktionskonstanten wachsen, wenn auch nicht regelmäßig, mit den Aktivierungsenergien.
In der vorliegenden Arbeit wurden selbstanordnende Monolagen (SAMs) entwickelt, welche als gassensitive Schichten auf Goldoberflächen mit kanzerogenem Benzol reversibel wechselwirken. Der Fokus lag dabei auf elektronenarmen Systemen und insbesondere auf hochfluorierten Aromaten. Insgesamt wurden 18 neuartige SAM-Präkursoren mit Substituenten, die starke Dipolmomente induzieren, hergestellt, die mit Hilfe von Thiolat- bzw. Selenolat-Ankergruppen an Goldoberflächen angebunden wurden. Die Charakterisierung dieser Schichten erfolgte mit diversen oberflächenanalytischen Methoden, wie Ellipsometrie und Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRRAS). Für die Erforschung der Selektivität und Sensitivität der präparierten Monolagen wurden Austrittsarbeitsänderungen mit Hilfe einer KELVIN-Sonde gemessen und aus diesen Erkenntnissen systematische Veränderungen an den sensoraktiven Molekülen vorgenommen. So wurden der Fluorierungsgrad des aromatischen Systems, die Kettenlänge des Spacers sowie weitere vielversprechende Strukturmotive untersucht. Insbesondere hochfluoriere Derivate mit CF3-Substituenten zeigten die höchsten Sensitivitäten gegenüber Benzol. Weiterhin wurde ein neues Infrarot-Messprinzip entwickelt und etabliert, welches in situ Messungen während eines Überleitens gasförmiger Analyten ermöglichte. Diese Ergebnisse belegen eine Interaktion zwischen Analyten und Monolage.
Ein weiteres Projekt befasste sich mit elektronenarmen aromatischen Monolagen, die über Cystamin-Einheiten an Goldoberflächen angebunden wurden, sich aber in den dipolaren Kopfgruppen unterschieden. Dieses Vorgehen ermöglicht die Herstellung von SAMs gleicher Packungsdichten, sodass lediglich die unterschiedlichen Substituenten die elektronischen Eigenschaften beeinflussen. Die resultierenden Monolagen wurden mittels mit Rastertunnelmikroskopie, Ellipsometrie, IRRAS sowie Wasserkontaktwinkel-Goniometrie untersucht. Durch eine relativ einfache Veränderung der Kopfgruppe, wobei F3C , F3CS, H3C- sowie NC-Reste eingeführt wurden, war es möglich, die Austrittsarbeit einer Goldoberfläche in einem Bereich von 4.9 bis 5.6 eV einzustellen. Zusätzlich konnte ein gemischtes Disulfid synthetisiert werden, welches eine echte gemischte SAM auf der Goldoberfläche bildete. Dieses Konzept könnte in Zukunft eine noch präzisere Modifizierung der Austrittsarbeit zulassen, was die Entwicklung von effizienteren elektronischen Bauelementen auf Basis von organischen n Typ-Halbleitern ermöglicht.
Abschließend wurden teilfluorierte Benzonitril-Derivate mit Thiolat- bzw. Selenolat-Ankergruppen erforscht, welche als SAMs Informationen über den dynamischen Ladungstransport lieferten. Die Präkursoren unterscheiden sich lediglich im Fluorierungsmuster, welches das Dipolmoment der Gesamtstruktur beeinflusst. Die hergestellten Monolagen wurden mit einer Vielzahl oberflächenanalytischer Methoden (IRRAS, Ellipsometrie, Röntgenphotoelektronen- sowie Röntgen-Nahkanten-Absorptions-Spektroskopie) charakterisiert, die alle die Bildung geordneter SAMs belegten und auf eine eher aufrechte Orientierung der Moleküle auf der Oberfläche hindeuteten. Die Bestimmung der Elektronentransfer-Zeiten mit Hilfe der sogenannten core-hole-clock-Methode zeigte überraschenderweise, dass durch eine Änderung des Substitutionsmusters der Fluoratome der Elektronenübergang nicht beeinflusst werden. Dementsprechend hat das Dipolmoment innerhalb des molekularen Gerüsts keinen signifikanten Einfluss auf die Elektronentransfer-Dynamik.
This cumulative thesis discusses the development of optimized force field parameters for Magnesium and resulting improved simulations of Magnesium-RNA interactions, including the in silico exploration of binding sites. This thesis is based on four publications as well as unpublished data. A fifth publication that was written during the time of the Ph.D. is discussed in the Appendix. This publication analyzes monovalent ion-specific effects at mica surfaces.
Nucleic acids in general and RNA in particular are fundamental to life itself. Especially in the folding and function of RNA, metal cations are crucial to screen the negatively charged nucleic acid backbones to allow for complex functional structures. They stabilize the tertiary structure of RNA and even drive its folding. Furthermore, similarly to proteins, RNAs can catalyze multiple reactions, rather than consisting of the 20 amino acids of a protein, RNA constitues of only four different building blocks. Metal cations play an important role here as additional cofactors. One essential ion is Magnesium (Mg2+), commonly referred to as the most important cofactor for nucleic acids. Mg2+ carries two positive charges. Its comparably small size and high charge result in a high charge density that has strong polarizing effects on its surroundings. Furthermore, Mg2+ forms a sharply defined first hydration shell with an integer number of coordinating water molecules. As a result, an exclusion zone exists around the ion within which no water molecules are observed. Moreover, Mg2+ displays a high solvation free energy and a low exchange rate of waters from its first hydration shell. Finally, it contains a strong preference towards oxygens . Together, this makes Mg2+ a particularly well suited interaction partner for the charged non-bridging phosphate oxygens on nucleic acid backbones and explains its crucial biological role.
The immense number of physiological and technological functions and applications indicates the significant scientific attention Mg2+ received. In experimental studies, however, severe difficulties arise for multiple reasons: Mg2+ is spectroscopically silent and cannot be detected directly by resonance techniques like NMR or EPR. Indirect observation is possible, either by detecting changes in the overall RNA structure with and without bound Mg2+, or by replacing the Mg2+ ion with another spectroscopically visible ion. In the latter, however, it cannot be guaranteed that the altered ion does not also alter the interaction site or even the whole structure. Another detection method is X-ray crystallography, but here challenges arise from Mg2+ being almost indistinguish- able from other ions as well as from water if not for very high resolutions and precise stereochemical considerations.
Alternatively, molecular dynamics (MD) simulations can be performed, with the power of adding atomistic insight to the interplay of metal cations and nucleic acids. MD simulations, however, are only as accurate as their underlying interaction models and the development of accurate models for the description of Mg2+ faces challenges especially in describing three properties:
(i) Polarizability. Commonly used simple models like the 12-6 type Lennard-Jones model typically fail to reproduce simultaneously thermodynamic and structural properties of a single ion in water. Alternative strategies include the use of a 12-6-4 type Lennard-Jones potential as proposed by Li and Merz, where the additional r−4 term explicitly accounts for polarization effects. The resulting Lennard-Jones potential is thereby more attractive and more long-ranged than for typical models of the 12-6 type.
(ii) Kinetics. Most Mg2+ models either fully ignore considerations about the timescales on which water exchanges from the first hydration shell of the ion or use inappropriate methodology to calculate the underlying kinetics. A realistic characterization of the involved timescales is imperative to be able to describe a seemingly simple process like the transition from inner-to-outer sphere binding and vice versa. This transition governs most biochemical reactions involving Mg2+ and therefore subsequent processes can only by as fast as the transition itself. However, already the previous step – the exchange of a water from the first hydration shell of the ion – is described my current Mg2+ models up to four orders of magnitude too slowly, which makes the observation of such events on the timescale of a typical simulation difficult or even impossible. Alln ́er et al. [48] as well as Lemkul and MacKerell explicitly considered the exchange rate into their parameter optimization procedure. To compute the rate, both studies applied Transition State Theory along a single reaction coordinate – the distance towards one of the exchanging waters. However, it could be shown that the water exchange from the first hydration shell requires at least the consideration of both exchanging water molecules in order to be able to realistically record the underlying rate using Transition State Theory. Furthermore, the model of Alln ́er et al. significantly underestimates the free energy of solvation of the ion.
(iii) Interactions between Mg2+ and nucleic acids. Typically, ionic force field parame- terization concentrates on the optimization of solution properties. The trans- ferability of these solution optimized parameters towards interactions with biomolecules, however, often fails.
Post-translational modifications (PTMs) of cell fate regulating proteins determine their stability, localization and function and control the activation of cell protective signaling pathways. Particularly in aberrantly dividing cancer cells the surveillance of cell cycle progression is essential to control tumorigenicity. In a variety of carcinomas, lymphomas and leukemias, the tumor-suppressive functions of the apoptosis- and senescence-regulating promyelocytic leukemia protein (PML) is controlled by numerous PTMs. PML poly-ubiquitylation and polySUMOylation at several lysine (K) residues induce PML degradation that is correlated to a progressive and invasive cancer phenotype. Besides several known E3 ubiquitin protein ligases that are involved in PML degradation, less is known about PML-specific deubiquitylases (DUBs), the respective DUB-controlled ubiquitin conjugation sites and the functional consequences of PML (de)ubiquitylation. Here, we show that the pro-tumorigenic DUB USP22 critically regulates PML protein stability by modifying PML residue K394 in advanced colon carcinoma cells in vitro and that this modification also impacts the homeostasis and function of the leukemia-associated mutant variant PML-RARα. We found that ablation of USP22 decreases PML mono-ubiquitylation and correlates with a prolonged protein half-live in colon carcinoma and acute promyelocytic leukemia (APL) cell lines. Additionally, silencing of USP22 enhances interferon and interferon-stimulated gene (ISG) expression in APL cells in vitro, which together with prolonged PML-RARα stability increases the APL cell sensitivity towards differentiation treatment. In accordance with the novel roles of USP22 as suppressor of the interferon response in human intestinal epithelial cells (hIECs), our findings imply USP22-dependent surveillance of PML-RARα stability and interferon signaling in human leukemia cells, revealing USP22 as central regulator of leukemia pathogenesis.
Das wachsende Verständnis für das fein abgestimmte Zusammenspiel aus Struktur und Funktion von Nukleinsäuren resultiert aus unzähligen Forschungsprojekten. Forschende stehen dabei vor der Herausforderung, dass die zu untersuchenden Oligonukleotide sowohl modifiziert als auch in ausreichender Menge und Reinheit dargestellt werden müssen. Die chemische Festphasensynthese ist ein bewährtes Mittel zur Synthese hochmodifizierter DNA und RNA. Allerdings werden Oligonukleotide mit zunehmender Länge unzugänglicher, da die einzelnen Kupplungsreaktionen nicht quantitativ ablaufen, was zu schwer abtrennbaren Abbruchsequenzen führt. Hinzu kommt, dass während der chemischen Synthese harsche Reaktionsbedingungen nötig sind, denen die gewünschten Modifikationen standhalten müssen. (Chemo-) enzymatische Methoden können diese Hürden überwinden und somit den Zugang zu biologisch interessanten, längeren modifizierten Sequenzen ermöglichen. Jedoch erfolgt der enzymatische Einbau von Modifikationen ohne aufwendige Optimierung lediglich statistisch verteilt. Um weitere Erfolge im Bereich der Strukturaufklärung zu erzielen, werden somit Synthesemethoden benötigt, die sich zum positionsspezifischen Einbau von Modifikationen eignen und gleichzeitig den Zugang zu längeren Oligonukleotiden ermöglichen. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion haben sich in den letzten Jahren lichtadressierbare Verbindungen als gefragte Modifikationen erwiesen. Der Einsatz von Licht als mildes, nicht-invasives Auslösesignal stellt besonders im biologischen Kontext eine interessante Herangehensweise dar. Um hochwertige Aussagen über das Verhalten von Oligonukleotiden in komplexer biologischer Umgebung machen zu können, muss durch die gezielte Platzierung lichtaktivierbarer Verbindungen ein effizientes AN/AUS-Verhältnis geschaffen werden. Der Einbau photolabiler Schutzgruppen erlaubt eine vorübergehende Beeinflussung der Oligonukleotidstruktur, die durch Abspaltung der Schutzgruppe irreversibel (re-) aktiviert werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einbau von Photoschaltern eine reversible Adressierbarkeit durch Isomerisierungsprozesse. Die Synthese komplexer gezielt-markierter Oligonukleotide erfolgt zumeist chemisch und ist daher längenlimitiert.
Ziel dieser Doktorarbeit war es, beide Fragestellungen zu vereinen und eine chemo-enzymatische Methode zur RNA-Synthese zu untersuchen, die zum einen die positionsspezifische Modifizierung mit lichtaktivierbaren Einheiten erlaubt und darüber hinaus die Längenlimitierung der chemischen Festphasensynthese überkommt. Im Zentrum der Methode stehen drei enzymatische Reaktionsschritte zum Einbau von photolabil- und photoschaltbar-modifizierten Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphaten: I) eine 3‘-Verlängerung, in der die modifizierten Bisphosphate mit T4 RNA Ligase 1 mit dem 3‘-Ende einer RNA verknüpft werden; II) die Dephosphorylierung des 3‘-Phosphats mit Shrimp Alkaline Phophatase und III) die Verknüpfung der 3‘-terminal modifizierten RNA mit einem zweiten 5‘-phosphorylierten RNA-Fragment, wodurch eine Gesamtsequenz mit gezielt platzierter Modifikation entsteht (Abb. I).
Im ersten Teilprojekt wurden in kollaborativer Arbeit zunächst benötigte photolabile NPE- und photoschaltbare Azobenzol-C-Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate synthetisiert und grundlegende Bedingungen der enzymatischen Reaktionen erarbeitet. Hierbei konnte der enzymatische Syntheseansatz erfolgreich in Lösung umgesetzt und der chemo-enzymatische Einbau aller synthetisierten Bausteine nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde die Methode in eigenständigen Arbeiten weiterverfolgt, um den multiplen Einbau NPE-modifizierter Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate in direkter Nachbarschaft sowie deren Einbau in DNA/RNA-Mixmere mit Phosphodiester- oder Phosphorthioatrückgrat zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Enzyme neben lichtaktivierbaren Modifikationen zusätzliche Anpassungen der Phosphateinheit sowie unterschiedliche Ribosebausteine in Kombination tolerieren. Da exogene RNA schnell von Exonukleasen abgebaut und somit unwirksam wird, werden zahlreiche stabilisierende Anpassungen an synthetischen RNAs vorgenommen. Zu den häufigsten zählen Phosphorthioate und Modifikationen der Ribose. Mit der erfolgreichen Modifikation der chimären Oligonukleotide eröffnet die erarbeitete Methode einen wichtigen Zugang zu therapeutisch interessanten Oligonukleotiden. Ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung biologisch relevanter Anwendungsmöglichkeiten konnte mit der Synthese, Charakterisierung und Umsetzung eines DEACM-geschützten Uridin-3‘,5‘-Bisphosphates (pUDEACMp) errungen werden. Im Vergleich zur verwendeten NPE-Schutzgruppe ist das Absorptionsspektrum der DEACM-Schutzgruppe bathochrom-verschoben, was eine Abspaltung mit Wellenlängen > 400 nm erlaubt. Dadurch können Zellschäden vermieden und Oligonukleotide mit NPE- und DEACM-Modifikation wellenlängenselektiv angesprochen werden...
Solute carrier (SLC) are related to various diseases in human and promising pharmaceutical targets but more structural and functional information on SLCs is required to expand their use for drug design and therapy. The 7-transmembrane segment inverted (7-TMIR) fold was identified for the SLC families 4, 23 and 26 in the last decade thus detailed analysis of the structure function relationship of one of these families might also yield insights for the other two. SVCT1 and SVCT2 from the SLC23 family are sodium dependent ascorbic acid transporters in human but structural analysis of the SLC23 family is exclusively based on two homologs – UraA from E. coli and UapA from A. nidulans – yielding two inward-facing and one occluded conformation. In combination with outward-facing conformations from SLC4 transporters, and additional information from the SLC26 family, an elevator transport mechanism for all 7-TMIR proteins was identified but detailed mechanistic features of the transport remain elusive due to the lack of multiple conformations from individual transporters.
To increase the understanding of 7-TMIR protein structure and function in this study, the transport mechanism of SLC23 transporters was analyzed by two strategies including selection of alpaca derived nanobodies and synthetic nanobodies against UraA as prokaryotic model protein of the SLC23 family. The second strategy involved mutagenesis of UraA at functional relevant positions regarding the conformational change during transport. Therefore, available structures of 7-TMIR proteins and less related elevator transporters were analyzed and a common motif identified – the alpha helical inter-domain linkers. The proposed rigid body movement for transport in combination with the characteristic alpha helical secondary structure of the linkers connecting both rigid bodies led to the hypothesis of functional relevance of the linkers and a conformational hinge being located in close proximity to the linkers. These positions were identified and used to modulate the biophysical properties of the transporter. Mutagenesis at three relevant positions led to loss of transport functionality and these UraA variants could be recombinantly produced and purified to further examine the underlying mechanistic effects. The variants UraAG320P and UraAP330G from the periplasmic inter-domain linker showed increased dimerization and thermal stability as well as substrate binding in solution. The substrate affinity of UraAG320P was identified to be 5-fold higher compared to the wildtype. The solvent accessibility of the substrate binding site in UraAG320P and UraAP330G revealed reduced open probability that indicated an altered conformational space compared to UraAWT. This phenomenon was analyzed in more detail by differential hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry and the results supported the hypothesis of a reduced open probability and gave further insights into the impact of the two mutations in the periplasmic inter-domain linker in UraA.
This thesis further presents strategies for phage display selection of nanobodies with epitope bias and a post selection analysis pipeline to identify nanobodies with desired binding characteristics. Thereby, whole cell transport inhibition highlighted periplasmic epitope binders and conformational selectivity. A cytoplasmic epitope could be identified by pulldown with inside-out membrane vesicles for one cytoplasmic side binder. Thermal stabilization analysis of the target protein in differential scanning fluorometry was performed in presence of two different nanobodies to identify simultaneous binding by additional thermal stabilization respectively competition by intermediate melting temperatures. Combination of epitope information with simultaneous DSF could be used to identify the stabilization of different UraA conformations by a set of binders and presents a general nanobody selection strategy for other SLCs. Synthetic nanobodies (sybodies) were also included in the analysis pipeline and Sy45 identified as promising candidate for co-crystallization that gave rise to UraAWT crystals in several conditions in presence or absence of uracil. Similar crystals could be obtained in combination with UraAG320P that were further optimized to gain structural information on this mutant. The structure was solved by molecular replacement and the model refined at 3.1 Å resolution confirming the cytoplasmic epitope of Sy45 as predicted by the selection pipeline. The stabilized conformation was inward-facing similar to the reported UapA structure but significantly different to the previously reported inward-facing structure of UraA. The structure further confirmed the structural integrity of the UraA mutant G320P. Despite the monomeric state of UraA in the structure, the gate domain aligned reasonably well with the gate domain of the previously published dimeric UraA structure in the occluded conformation and allowed detailed analysis of the conformational transition in UraA from inward-facing to occluded by a single rigid body movement. Thereby little movement in the gate domain of UraA was observed in contrast to a previously reported transport mechanism. Core domain rotation around a rotation axis parallel to the substrate barrier was found to explain the major part of conformational transition from inward-facing to occluded and experimentally supported the hypothesized mechanism by Chang et al. (2017). Additionally, the conformational hinge around position G320 in UraA could be identified as well as the impact of the backbone rigidity introduced by the highly conserved proline residue at position 330 in UraA on the conformational transition. This position was found to serve as anchoring point the inter-domain linker and determines the coordinated movement of inter-domain linker and core domain. The functional analysis further highlighted the requirement of alpha helical secondary structure within the inter-domain linker that serves as amphipathic structural entity that can adjust to changed core-gate domain distances and angles during transport by extension/compression or bending while preserving the rigid linkage.
The applied strategies to modulate the conformational space of UraA by mutagenesis at the hinge positions in the inter-domain linkers is transferrable to other transporters and might facilitate their structural and functional characterization.
Further, this study discusses the conformational thermostabilization of UraA that is based on increased melting temperatures upon restriction of its conformational freedom. The term ‘conformational thermostabilization’ introduced by Serrano-Vega et al. (2007) could be experimentally supported and the direct correlation between the conformational freedom and thermostabilization was qualitatively analyzed for UraA. The concept of conformational thermostabilization might help in characterization of other dynamic transport systems as well.
Mitochondria are important for cellular health and their dysfunction is linked to a variety of diseases, especially neurodegeneration. Thus, the renewal and degradation of dysfunctional mitochondria is crucial for the well-being of organisms. The selective digestion of damaged mitochondria via the lysosome (mitophagy), is the main pathway to do so.
In my dissertational work, I investigated the connection between protein misfolding, protein import into mitochondria and the degradation of mitochondria via mitophagy. Here, I present a new model for the initiation of mitophagy without collapse of the membrane potential. This model provides the link between protein import into mitochondria, stress signal transduction to the cytosol and the mitochondrial stress sensor PINK1. To comprehensively examine how mitophagy can be triggered, I performed a genome-wide CRISPR knockout screen utilizing the mitophagy reporter mitochondrial mKEIMA. Thereby, I observed numerous novel gene deletions that induce mitophagy. Prominently, I identified an accumulation of gene deletions of the protein import and of protein quality control factors. I validated several of those and examined HSPA9 (mitochondrial HSP70) and LONP1 (a mitochondrial matrix AAA protease) in more detail, regarding their effect on mitophagy and protein import. For this, I used an established fluorescence-based, mitochondrial-targeted EGFP, as well as a newly-developed pulsed-SILAC mass spectrometry approach (mePRODmt). Depletions of both genes resulted in reduced protein import and PINK1-dependent mitophagy. Strikingly, I did not observe any loss of mitochondrial membrane potential, which was hitherto believed to be essential for activation of PINK1-mediated mitophagy. Literature shows that certain mitochondrial stressors can also induce mitophagy without mitochondrial membrane depolarization, which I confirmed with my assays. Next, I characterized the impact of LONP1 and HSPA9 depletion, which are involved in proteostasis maintenance, and the mtHSP90 inhibitor GTPP on mitochondrial protein folding in more detail. GTPP treatment and LONP1 depletion both resulted in the accumulation of an insoluble protein fraction, as judged by proteomic analysis. This insoluble protein fraction enriched several components of the presequence translocase-associated motor PAM, including TIMM44. TIMM44 acts as a link between the translocon, the import pore of the inner mitochondrial membrane (TIM) complex and the PAM complex. Thus, I hypothesized that TIMM44 dissociates from the TIM complex upon protein folding stress, when it becomes part of the insoluble protein fraction. To validate this model, I measured the TIMM44 interactome upon proteostasis disturbance using proximity labeling. Indeed, interaction of TIMM44 with the import pore was almost completely abolished, explaining the loss of matrix-targeted import upon protein folding stress. From these findings, I reasoned that an import reduction mediated by the PAM complex would likely also inhibit the degradation of PINK1. Consistent with this hypothesis, I observed that mitophagy induced by HSPA9 or LONP1 deletion was prevented when PINK1 was genetically deleted. In comparison, non-processed PINK1 was stabilized on mitochondria in wild type cells when mitochondrial protein import was impaired. On this basis, I drew the conclusion that the loss of mitochondrial import was the stress signal, which leads to the stabilization of PINK1, as it could not be processed anymore via the inner mitochondrial membrane protease PARL. PINK1 auto-activates itself upon accumulation and signals to the cytosol that this mitochondrion is damaged. Mitophagy is subsequently initiated by the ubiquitin kinase activity of PINK1. As a result, the autophagy apparatus gets activated, damaged mitochondria are engulfed by a double membrane and removed via lysosomal digestion. This proposed model is, to the best of my knowledge, the first to provide an explanation for protein folding stress-induced and protein import inhibition-triggered mitophagy without mitochondrial depolarization. The model thus extends the PINK1/PARKIN-dependent mitophagy pathway to milder stresses and clears some of the open questions in the field. Furthermore, this work is also important, because protein misfolding stress and dysfunctional mitochondria are two hallmarks of neurodegeneration. In particular, mitochondrial protein import inhibition during Parkinson’s and Huntington disease might be driver of mitochondrial dysfunction. Hence, I hope and anticipate that the newly developed protein import method, mePRODmt, and the proposed model will be beneficial to further characterize underlying processes and to establish which factors prevent or drive these disorders on molecular level.
Die Verwendung von photolabilen Schutzgruppen zur nicht-invasiven Kontrolle von Systemen birgt ein großes Potential für verschiedenste Anwendungsgebiete, die von der Erforschung und Regulation biologischer Prozesse, über den Einsatz in medizinischer Therapie bis hin zur Verwendung als molekulare Datenspeicher reichen. Für diese Umsetzung benötigt es allerdings eine breite Auswahl an entsprechenden PPGs und das Wissen über ihre Reaktionsmechanismen. Im Allgemeinen lässt sich die Konzeptionierung von PPGs in drei Prozesse einteilen, beginnend bei dem Design und der Synthese einer neuen PPG. Bei diesem Schritt liegt der Fokus auf ein oder zwei besonderen Eigenschaften, wie beispielsweise einer Absorptionswellenlänge in einem bestimmten Spektralbereich oder einer hohen Uncaging-Quantenausbeute. Im zweiten Schritt folgt die Untersuchung der PPG bezüglich spektroskopischer und mechanistischer Eigenschaften und ggf. anschließender Optimierung auf synthetischer Ebene. Die so gewonnenen Informationen sind dann hilfreich bei dem letzten Schritt, bei dem es um den Einsatz der PPG in einem entsprechenden System geht. Hierbei müssen die verwendeten PPGs genau auf das Zielsystem abgestimmt sein, dazu zählen verschiedenste Parameter wie Anregungswellenlänge, Extinktionskoeffizient, Art und Struktur der Photoprodukte sowie Uncaging-Effizienz und Geschwindigkeit.
In der vorliegenden Arbeit wurde über die drei vorgestellten Projekte mittels spektroskopischer Methoden zu allen drei genannten Stadien zur Konzeptionierung von PPGs ein Beitrag geleistet. Dazu zählt die Entwicklung der CBT-basierten PPGs, die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung von (DMA)(2)F-PPGs und die Etablierung einer wellenlängenselektiven An-/Aus-Funktionalität eines Antibiotikums. In enger interdisziplinärer Zusammenarbeit zwischen theoretischen, synthetischen und biologischen Teilgebieten konnte jedes Projekt innerhalb der jeweiligen Entwicklungsstufe erfolgreich abgeschlossen werden.
Mithilfe des relativ neuen Ansatzes, bei dem durch quantenmechanische Berechnungen der vertikalen Anregungsenergie von der kationischen Spezies einer PPG-Grundstruktur eine Aussage über ihre Qualität postuliert werden kann, konnte ausgehend von der Fluoren-Grundstruktur eine neue Klasse von PPGs gefunden werden. Dabei erwies sich die CBT-Struktur mit den Schwefelatomen an der para-Position als besonders geeignet. Insbesondere konnte die Grundstruktur durch die (OMePh)2-Substitution, welche in einer signifikanten bathochromen Verschiebung des Absorptionsmaximums resultierte, optimiert werden. Die Untersuchung der Ultrakurzzeit-Dynamik beider p-CBT Strukturen gab Aufschluss über die unterschiedlichen photochemischen Eigenschaften als PPG.
Für die Stoffklasse der Dimethylamino-Fluorene wurde ein wichtiger Unterschied zwischen den einfach- und zweifach-substituierten Derivaten aufgedeckt, der entscheidend für einen signifikanten Uncaging-Effizienzunterschied ist. Dabei stellt sich die Stabilität des symmetrisch-substituierten Fluorenyl-Kations als der wichtigste Faktor bezüglich der Uncaging-Quantenausbeuten heraus. Beide Schutzgruppen sind in der Lage photoinduziert eine AG freizusetzen, wobei der Reaktionsmechanismus über die kationische Spezies (DMA)(2)F + abläuft. Der Unterschied hierbei liegt in der Lebensdauer der beiden Kationen, die im Falle der symmetrischen PPG stark lösungsmittelabhängig ist und bis zu mehreren Stunden betragen kann, was bis dato das langlebigste Kation dieser Molekülklasse darstellt. Für die zukünftige Optimierung dieser PPG-Klasse ist die Erkenntnis über die Gründe für die Stabilität des Kations von großem Vorteil. Der stabilisierende Faktor ist zum einen die zweite Dimethylamino-Gruppe der symmetrischen Verbindung, welche durch die Erweiterung der Mesomerie zur besseren Verteilung der positiven Ladung im Molekül führt. Zum anderen spielt das Lösungsmittel eine entscheidende Rolle. Dabei bieten protische, polare Medien eine zusätzliche Stabilisierung, die notwendig für die Langlebigkeit des Kations ist. Die Lebensdauer des Kations war zudem durch eine zweite Bestrahlungswellenlänge kontrollierbar. Ausgehend vom Kation konnte eine reversible Nebenreaktion in protischen Lösungsmitteln identifiziert werden, die einen Austausch der AG durch das Lösungsmittel darstellt.
Zusätzlich konnte die kleine Stoffklasse der bisher bekannten Photobasen durch die Verbindung (DMA)2F-OH erweitert werden. Genauer betrachtet handelt es sich dabei um eine photoinduzierte Hydroxidfreisetzung, wodurch je nach eingesetzter Konzentration ein pH-Sprung von bis zu drei Einheiten erreicht werden konnte. Dabei stellt sich die Lebensdauer des pH-Sprungs als ein entscheidender Parameter für Photobasen dar, welcher sich für die hier untersuchte Verbindung aufgrund der besonderen Stabilität des entsprechenden Kations, im Vergleich zu einigen der bereits bekannten Verbindungen, als besonders langlebig herausgestellt hat. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von (DMA)2F-OH als Photobase ist die Möglichkeit den pH-Sprung durch zwei verschiedene Wellenlängen sowohl zeitlich als auch örtlich zu kontrollieren, indem die Verbindung zwischen den zwei Spezies (DMA)2F-OH und (DMA)2F + geschaltet werden kann.
Im Hinblick auf die Anwendungen von PPGs zur verbesserten zeitlichen und örtlichen Kontrolle biologischer Zielsysteme ist im Rahmen dieser Arbeit das Prinzip vom wellenlängenselektiven Uncaging zweier PPGs an einem Molekül (two-PPG-one-molecule, TPOM) etabliert worden. Das Zielmolekül war hier das Antibiotikum Puromycin, welches durch seine Fähigkeit an das Ribosom zu binden, die Proteinbiosynthese inhibieren kann. Dabei wurden zwei verschiedene PPGs gefunden, die sowohl aufeinander als auch auf das Biomolekül selbst abgestimmt sind. Im Ausgangszustand sind beide PPGs am Puromycin angebracht, wodurch es in seiner biologischen Wirkung inaktiv ist. Befindet sich das doppelt geschützte Puromycin in der ROI, so kann es durch die Bestrahlung mit einer bestimmten Wellenlänge infolge des ersten Uncaging-Schritts aktiviert werden. Da biologische Systeme nicht statisch sind, können aktivierte Moleküle stets von der gewünschten ROI nach außen gelangen, wodurch der Anspruch der räumlichen Kontrolle nicht erfüllt wird. In diesem Fall kann durch die TPOM-Umsetzung die zweite Bestrahlungswellenlänge auf den entsprechenden Bereich angewendet werden, wodurch das Uncaging der zweiten PPG initiiert und folglich das Puromycin deaktiviert wird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Deaktivierungswellenlänge auch in der Lage ist beide PPGs zu entfernen, wodurch eine vollständige Inaktivierung des Puromycins außerhalb der ROI garantiert werden kann.
Ist die Proteinbiosynthese längerfristig blockiert, führt das schließlich zum Zelltod. Ein großes Anwendungsgebiet dieses Antibiotikums sind die Neurowissenschaften. Aufgrund der Tatsache, dass Puromycin keine Unterscheidung zwischen eukaryotischen und prokaryotischen Zellen macht, findet es keine Anwendung in der Medizin. Eine zeitliche und örtliche Kontrolle seiner Wirkung könnte den Anwendungsbereich dieses Antibiotikums evtl. ausweiten. Das wohl naheliegendste wäre der Einsatz bei Tumorzellen, deren Behandlung durch Zytostatika auf den gesamten Körper wirken und dadurch viele schwere Nebenwirkungen verursachen.
Wie bereits weiter oben beschrieben muss für jedes Biomolekül und das entsprechende Wirkzentrum die Auswahl des passenden PPG-Paares einzeln abgestimmt werden. Dennoch lässt sich anhand des hier etablierten Systems ein Konzept für die erfolgreiche Umsetzung zukünftiger TPOM-Systeme an anderen biomolekularen Wirkstoffen zusammenfassend formulieren.
* Der erste Schritt sollte die Betrachtung des Wirkzentrums des zu modifizierenden Biomoleküls sein: Welche funktionelle Gruppe bzw. Gruppen sind entscheidend für die Bindetasche oder –stelle? Dieser Bereich des Biomoleküls soll im Zuge des Uncagings entweder blockiert oder abgespalten werden. In der unmittelbaren Nähe muss die PPG1 angebracht werden.
* Bei der Wahl von PPG1 ist das wichtigste Kriterium, dass das Biomolekül mit enthaltener Schutzgruppe in seiner Wirkung unbeeinträchtigt bleibt. Dies schränkt die Auswahl beträchtlich ein. Eine mögliche Umsetzung wäre die Anbringung einer Nitro-Gruppe falls vorhanden an einen Benzolring, welcher sich im Fall eines großen Biomoleküls in der Nähe der wichtigen funktionellen Stelle befindet.
* Die zweite PPG (PPG2), deren photoinduzierte Abspaltung zur Aktivierung des Wirkstoffs führen soll, kann strukturell frei gewählt werden. Das Auswahlkriterium hierbei ist das Absorptionsspektrum. Hierbei sollte das Absorptionsmaximum rotverschoben zur PPG1 sein, um eine unerwünschte Abspaltung zu vermeiden. Außerdem darf keine signifikante Absorption von PPG2 bei der Uncaging-Wellenlänge von PPG1 vorhanden sein.
* Beide PPGs sollten eine ähnliche Uncaging-Quantenausbeute vorweisen, um im Deaktivierungsschritt der doppelt geschützten Verbindung durch das höher energetische Licht keine Bevorzugung einer einzelnen Schutzgruppe zu riskieren.
Anhand der erarbeiteten Herangehensweise können weitere Wirkstoffe oder Biomoleküle hin zu einer An- / Aus-Funktionalität modifiziert werden. Mit der Umsetzung des TPOM-Konzepts kann eine Verbesserung der örtlichen und zeitlichen Kontrolle der Aktivität eines Antibiotikums erreicht werden. Für die Anwendung in biologischer Umgebung ist diese präzische Kontrolle essentiell, um unerwünschte Nebenwirkungen angesundem Gewebe zu verhindern.
Die Beteiligung an Schlüsselfunktionen in zellulären Signalwegen macht Kinasen zu einem vielversprechenden Ansatzpunkt in der Wirkstoffentwicklung bei verschiedenen menschlichen Erkrankungen wie z.B. Krebs oder auch Autoimmun- und Entzündungskrankheiten. Die Prävention von post-translationalen Modifikationen durch Phosphorylierung und somit die Regulierung der nachgeschalteten Signalwege ist das Ziel von Kinaseinhibitoren. Die katalytische Aktivität von Kinasen ist abhängig von ATP, welches im hochkonservierten aktiven Zentrum bindet. Bedingt durch diese kinomweite hohe Konservierung stellt die Entwicklung von hoch selektiven ATP-mimetischen Inhibitoren eine Herausforderung dar. Typische ATP-Mimetika sind flach und die oft hydrophoben Moleküle weisen meist eine große Zahl an frei rotierbaren Bindungen auf. Um das aus dieser Flexibilität hervorgehende Problem der teils mangelnden Selektivität zu umgehen, kann eine bioaktive Konformation des Inhibitors durch Makrozyklisierung fixiert werden. Als Konsequenz dieser konformationellen Einschränkung können die entropischen Kosten während des Bindens reduziert werden und folglich zu einer gesteigerten Affinität gegenüber der Kinase führen.
Der Grundstein dieser Arbeit war der makrozyklische Pyrazolo[1,5-a]pyrimidin basierte FLT3 Kinaseinhibitor ODS2004070 (37). Im Rahmen eines kinomweiten Screenings konnten hohe Affinitäten zu verschiedensten Kinasen detektiert werden, was 37 zu einer guten Leitstruktur für das Design von potenten und selektiven Kinaseinhibitoren machte. Im Rahmen dieser Arbeit blieb das literaturbekannte Pyrazolo[1,5-a]pyrimidin basierte ATP-mimetische Bindemotiv sowie das makrozyklische Grundgerüst 37 bis auf einige wenige Variation unverändert.
Strukturelle Optimierungen zur Fokussierung der Selektivität wurden am sekundären Amin zwischen Bindemotiv und Linker als auch über die freie Carbonsäure durchgeführt. Mit einer Anzahl von mehr als 430 identifizierten Phosphorylierungsstellen ist die pleiotropisch und konstitutiv aktive Casein Kinase 2 (CK2) an verschiedensten zellulären Prozessen wie dem Verlauf des Zellzyklus, der Apoptose oder der Transkription regulatorisch beteiligt. Die Fehlregulation von CK2 wird häufig mit der Pathologie von Krankheiten wie zum Beispiel Krebs assoziiert, was CK2 zu einem vielversprechenden Ziel klinischer Untersuchungen macht.
Im Rahmen des CK2-Projekts war es möglich, durch spezifische Modifikationen an 37, die hoch selektiven und potenten CK2-Inhibitoren 47 und 60 zu entwickeln. Ebenfalls gezeigt wurde, dass kleine strukturelle Veränderungen, wie z.B. Makrozyklisierung, einen signifikanten Effekt auf Selektivität und Potenz des Inhibitors haben kann.
Weiter Untersuchungen der Verbindungen lenkten den Fokus weiterer Arbeiten u.a. auf die Serin/Threonin Kinase 17A (STK17A) oder auch death-associated protein kinase-related apoptosis-inducing protein kinase 1 (DRAK1) genannt. Sie ist Teil der DAPK Familie und gehört zusammen mit anderen Kinasen zu den weniger erforschten Kinasen. Bis heute ist nicht viel über ihre zellulären Funktionen und die Beteiligung an pathophysiologischen Prozessen bekannt. Berichtet wurde jedoch eine Überexpression in verschiedenen Formen von Hirntumoren des zentralen Nervensystems (Gliom). Strukturelle Modifikationen, unter Erhalt des makrozyklischen Grundgerüsts 37, führten zu dem hoch selektiven und potenten DRAK1 Inhibitor 121, der alle Kriterien für eine chemical probe Verbindung erfüllt.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die AP-2-assoziierte Protein Kinase 1 (AAK1) aus der NAK Familie, bestehend aus AAK1, BIKE und GAK. Sie ist als potenzielles therapeutisches Ziel für viele verschieden Krankheiten wie z.B. neuropathische Schmerzen, Schizophrenie und Parkinson identifiziert. Durch die Regulierung der Clathrin-mediierten Endozytose ist AAK1 an intrazellulären Bewegungen verschiedener nicht zusammenhängenden RNS- und DNSViren, wie beispielsweise HCV, DENV oder EBOV, beteiligt. Ebenfalls berichtet wurde eine mögliche Assoziation mit dem SARS-CoV-2 Virus, was das Interesse an neuen selektiven AAK1 Inhibitoren verstärkte. Die Entwicklung der hochpotenten und selektiven AAK1 Inhibitoren 61 und 63 basierte ebenfalls auf dem makrozyklischen Grundgerüst 37, das bereits im CK2- und DRAK1-Projekt verwendet wurde.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es im Rahmen dieser Arbeit gelungen ist, ausgehend von einem höchst unselektiven makrozyklischen Grundgerüst, hochpotente und selektive Kinaseinhibitoren für CK2, DRAK1 und AAK1 zu entwickeln und zu charakterisieren. Im Zuge von Untersuchungen verschiedener Struktur-Wirkungsbeziehungen wurde gezeigt, dass es durch geringfügige strukturelle Modifikationen möglich ist, die kinomweite Selektivität zu variieren und auf eine Kinase zu fokussieren. Diese Arbeit brachte nicht nur die erwähnten Inhibitoren hervor, sondern bildet auch die Grundlage für weitere Projekte zur Entwicklung von hoch potenten und selektiven Verbindungen als potenzielle chemische Werkzeuge für den Einsatz in der Forschung.
Trotz der Verfügbarkeit von siRNA, dem aktuellen Goldstandard zur Generierung von RNAInterferenz-vermitteltem Gen-silencing, stellen unerwünschte Immunantworten des Organismus auf doppelsträngige RNA exogenen Ursprungs noch immer ein fundamentales Problem dar, besonders mit Hinblick auf die Entwicklung Oligonukleotid-basierter Wirkstoffe.
Durch das begrenzte Repertoire an Modifikationen, welches durch die Abhängigkeit von zelleigenen Faktoren unter anderem zur Steigerung der intrazellulären Stabilität und zur Reduktion unerwünschter Effekte zur Verfügung steht, konnte bis dato nur einer überschaubaren Anzahl entsprechender Oligonukleotide eine offizielle Zulassung für die therapeutische Anwendung in der Medizin erteilt werden.
Hier bergen künstliche Ribonukleasen, welche die Umesterungsreaktion unabhängig von der zellinternen Maschinerie ebenfalls effizient und sequenzspezifisch bewerkstelligen können, großes Potential als eine Alternative. Während Metall-basierte Systeme in der Regel auf unphysiologisch hohe Konzentrationen zweiwertiger Übergangsmetallionen, wie beispielsweise Lanthanoide oder auch Kupfer, angewiesen sind, könnten metallfreie Katalysatoren dahingehend eine wesentlich flexiblere Option darstellen. Die Optimierung Guanidin-basierter RNA-Spalter für den Einsatz in der Bioanalytik und Medizin stellt seit geraumer Zeit eines der obersten Ziele unseres Arbeitskreises dar. Unter diesen bewährte sich vor allem das Tris(2-aminobenzimidazol), welches in Form von Konjugaten mit Antisense-Oligonukleotiden kurze Modellsubstrate sequenzspezifisch spaltet.
Neben der äußerst mühseligen, vielstufigen Synthese eines konjugierbaren Tris(2-aminobenzimidazol)s waren die untersuchten Systeme mit Halbwertszeiten von teilweise über 20 Stunden jedoch viel zu langsam, um auch potentiell beobachtbare Veränderung des Phänotyps in vivo induzieren zu können. Ein weiterer begrenzender Faktor stellte die Konjugationstrategie des Spalters über Aktivester-Chemie und Aminolinker dar, welche eine Kupplungsausbeute von 0 % bis im besten Fall ca. 30 % lieferte. Um eine Methode zu erhalten, welche routinemäßig zur sequenzspezifischen Spaltung einer Vielzahl verschiedener RNA-Substrate genutzt werden kann, war folglich eine praktikablere Synthesestrategie zur Darstellung der Spalterkonjugate einerseits und zudem eine Erhöhung der Katalysatoraktivität andererseits notwendig, um auch kurzlebige Ziel-RNAs wirkungsvoll ausschalten zu können. In diesem Zusammenhang wurde eine neue Syntheseroute erarbeitet, welche den für die Konjugation funktionalisierten Spalter über wenige Stufen in Mengen von über 10 g lieferte. Daran anschließend konnte die Synthese eines Phosphoramidits realisiert werden, welches in einer manuellen Kupplungsprozedur die Darstellung von 5‘-Konjugaten des Tris(2-aminobenzimidazol)s in exzellenten Ausbeuten und, im Vergleich zur vorherigen Methode, wesentlich kürzeren Kupplungszeiten ermöglichte. Die vollständige Kompatibilität des Phosphoramidits mit der automatisierten Festphasensynthese konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht erreicht werden. Während die manuelle Prozedur Konjugationsausbeuten von über 90 % lieferte, wurden an einem handelsüblichen Oligonukleotid-Synthesizer auch nach Modifikation der Kupplungsprotokolle und bei erhöhtem Amiditverbrauch lediglich 65 %erzielt. Durch Inkorporation von LNA-Nukleotiden in zwei gegen die PIM1-mRNA gerichtete 15mer DNA-Konjugate ließ sich eine Reduktion der Halbwertszeit von Cy5-markierten 22mer Modellsubstrate auf unter 4 h erreichen, wobei dieses Resultat auch anhand eines 412mer Modellsubstrats und in Gegenwart hoher Phosphatkonzentrationen reproduziert werden konnte. Darüber hinaus wurde die besondere Rolle des closing base pairs, sowohl bezüglich der Selektivität als auch der Kinetik der Spaltung, offensichtlich. Während stärker hybridisierende GC-Basenpaare generell eine hohe Präzision gewährleisteten, trat im Falle von AT-Basenpaaren fraying auf, d. h. es konnte auch innerhalb des vermeintlichen Duplex Spaltung beobachtet werden. Genauere Studien zur Positionierung von LNA-Nukleotiden ergaben bei unmittelbarer Lokalisation am 5‘-Terminus von AT-closing base pairs zwar einen selektivitätssteigernden Effekt, überraschenderweise konnte in diesem Fall jedoch auch eine Inhibierung der Spaltungskinetik festgestellt werden. Durch Verschiebung in die vorletzte Position konnte die Aktivität des Konjugats ohne Präzisionsverlust jedoch wiederhergestellt werden. Erste Experimente zur intrazellulären Stabilität der Spalterkonjugate ergaben quantitative, stufenweise Zersetzung, sowohl des DNA- als auch der Mixmer-Konjugate nach wenigen Stunden, was die Notwendigkeit weiterer stabilitätssteigernder Modifikationen zur Vorbereitung auf in vivo-Experimente impliziert. Auf der Suche nach neuen Spaltern stellte sich vor allem das 2-Aminoimidazol als einer der aussichtsreichsten Kandidaten für genauere Untersuchungen heraus. Das korrespondierende Tris(2-aminoimidazol) konnte über eine Marckwald-Synthese in wenigen Stufen dargestellt werden. Erste Spaltexperimente ergaben vor allem in niedrigen Konzentrationen (10 μM) eine im Vergleich zum Benzimidazol-Analogon vielfach höhere Aktivität. Obwohl die Synthese eines funktionalisierten Bisimidazol-benzimidazols gelang, steht dessen Konjugation mit Oligonukleotiden und deren Aktivitätsbestimmung noch aus.
Endolysosomal effectors and their relevance for antiviral activity against the Hepatitis E virus
(2021)
Mit über 20 Millionen registrierter Fälle pro Jahr, repräsentiert das Hepatitis-E-Virus (HEV) eine Hauptursache einer viralen Hepatitis weltweit und stellt ein erhebliches Risiko insbesondere für Schwangere und Immunsupprimierte dar. Jedoch sind Behandlungsoptionen stark limitiert und mit teils schweren Nebenwirkungen verbunden. Neue Erkenntnisse des Wechselspiels zwischen Wirtszelle und HEV werden deshalb benötigt, um neue antivirale Wirkstoffe zu entwickeln. Der Fokus der Arbeit wurde hierbei auf Effektoren des endosomalen Systems gesetzt, welches von HEV zur Freisetzung von Virionen genutzt wird.
Eine virale Infektion führt in der Zelle zur Produktion von Interferonen (IFNs) und weiters zu einer IFN-Antwort. Ein essenzielles Effektormolekül, welches HEV nachweislich effizient repressiert, ist die GTPase guanylate binding protein 1 (GBP1). In dieser Studie wurde beleuchtet, dass Letztere durch eine HEV-Infektion induziert wird. Zusätzlich reduziert die ektopische Expression von GBP1 sowohl die intrazelluläre Menge des HEV Kapsidproteins als auch die Menge freigesetzter Virionen. Mechanistisch liegt diesem Sachverhalt die GBP1-induzierte Inkorporation von Virionen in Lysosomen zugrunde, was schlussendlich deren Abbau nach sich zieht. Erkenntnisse über die Rolle verschiedener GBP1 Proteindomänen innerhalb des Mechanismus wurden unter Verwendung ektopischer Expression von GBP1-Mutanten erlangt. Inkorporation der Mutation R48A führt zum Verlust der GTPase-Aktivität. Andererseits führt eine Inkorporation der Mutation S73A zum Verlust der Homodimerisierung, was die nachfolgende Farnesylierung und gekoppelte Membranassoziation reduziert. Hierbei behält GBP1-R48A Fähigkeiten zur Induktion lysosomalen Abbaus von HEV bei, GBP1-S73A jedoch nicht. Dies wiederum bedeutet, dass eine GBP1 Homodimerisierung notwendig für den antiviralen Mechanismus ist, was eine Adapterfunktion des Moleküls für lysosomale Inkorporation nahelegt. Die Relevanz von GBP1 während einer IFNγ-Antwort wurde deshalb mittels siRNA-basiertem Silencing untersucht. Ähnlich der ektopischen Expression von GBP1 induziert IFNγ die lysosomale Degradation von HEV. In Abwesenheit von GBP1 jedoch, ist dieser Effekt signifikant geringer ausgeprägt, was zu einem Effizienzverlust von IFNy in Bezug auf dessen antiviralen Effekt bedeutet. Dies führte schlussendlich zur Identifizierung von GBP1 als essenziellen Restriktionsfaktor gegen HEV, was seine Rolle in Abhängigkeit seiner Homodimerisierung via Induktion lysosomalen Abbaus erfüllt.
Nebst der Induktion von GBP1, konnte eine Akkumulation von Cholesterin in Lysosomen durch IFNy nachgewiesen werden. Da dieses Lipid einen essenziellen Faktor für endosomale Reifung, Transport und Funktionalität darstellt, wurden Cholesterinspiegel und verbundene transkriptionelle Fußabdrücke im Kontext einer HEV Infektion untersucht. Letztere führt zu einer Dysregulation Cholesterin-assoziierter Genexpression, was eine Reduktion intrazellulären Cholesterins nach sich zieht. Auch in HEV infizierten Patienten liegt eine Abnahme des Serumcholesterins vor. Unter Modulation intrazellulären Cholesterins, wurde deutlich, dass die Inhibition der Cholesterinsynthese durch Simvastatin eine verstärkte Freisetzung von Virionen nach sich zieht, was ebenso in HEV infizierten Patienten nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu zieht eine Erhöhung intrazellulären Cholesterins via Supplementierung von Lipoproteinpartikeln niedriger Dichte (LDL) oder 25-Hydroxycholesterin eine signifikante Reduktion des viralen Kapsidproteins und freigesetzter Virionen nach sich. Dem liegt eine verstärkte Inkorporation von HEV in Lysosomen mit anschließender Degradation zugrunde. Ob dieser Mechanismus pharmakologisch nutzbar ist, wurde mittels eines Screenings Lipid modulatorischer Medikamente untersucht. Der p-Glykoprotein Inhibitor PSC833 und besonders der PPARα-Agonist Fenofibrat stellten sich als äußerst effiziente Inhibitoren des HEV heraus. Beide führen zu einer Erhöhung und Akkumulation zellulären Cholesterins in vesikulären Strukturen. Dies zieht eine dramatische Erhöhung lysosomaler Lokalisation von HEV nach sich und führt letzten Endes zu einer signifikanten Reduktion freigesetzter Virionen.
Zusammenfassend konnten in dieser Studie essenzielle Funktionen von GBP1 in Bezug auf dessen restriktiven Effekt gegen HEV identifiziert werden. Weiters wurde dieses als entscheidender Wirtsfaktor für die IFNγ-Antwort gegen das Virus identifiziert. Andererseits legt diese Studie nahe, dass HEV niedrige Cholesterinspiegel innerhalb infizierter Zellen für die Freisetzung von Virionen benötigt. Andererseits sind erhöhte intrazelluläre Cholesterinspiegel schädlich für die virale Freisetzung, da der lysosomale Abbau von Virionen induziert wird. Dies führte zur erfolgreichen Entdeckung eines neuartigen antiviralen Wirkstoffes, welcher diesen cholesterinabhängigen Effekt effizient induziert: Fenofibrat.
Es ist bekannt, dass die Aktivierung von S1P-Rezeptoren die Expression von profibrotischen Mediatoren, wie dem Bindegewebswachstumsfaktor CTGF, induzieren und deshalb auch eine Rolle bei der Entstehung der Nierenfibrose spielen kann. In diesem Kontext konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung von S1P5 zur TGF-β2-induzierten CTGF-Expression in humanen glomerulären Mesangiumzellen beiträgt (Wünsche et al. 2015). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb die Rolle von S1P5 in einem in vivo-Modell zur Nierenfibrose untersucht. Männliche S1P5-/--Mäuse und Wildtypmäuse mit C57BL/6J-Hintergrund wurden mit einer adeninreichen Diät für jeweils 7 und 14 Tage gefüttert, um eine tubulointerstitielle Fibrose hervorzurufen. Die Nieren von unbehandelten Mäusen des jeweiligen Genotyps dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass S1P5-/--Mäuse geringere Kreatininplasmaspiegel und weniger Schäden im Nierengewebe gegenüber Wildtypen zeigten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von mehreren Fibrosemarkern und proinflammatorischen Zytokinen in den S1P5-/--Mäusen schwächer war als in den Wildtypen. Die Auswertung von histochemischen Färbungen und Western Blots bestätigte diese Beobachtung. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass S1P5 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Adenin-induzierter Entzündung in der Niere und nachfolgender Pathogenese wie Gewebeschäden und Fibrose spielt.
Ceramide sind ein Bestandteil der Lipiddoppelschicht, in allen eukaryotischen Zellen vorhanden und zentrale Moleküle des Sphingolipidstoffwechsels. Die Synthese und der Abbau der Ceramide werden von vielen verschiedenen Enzymen reguliert. Neben ihrer Aufgabe als strukturelle Elemente der Zellmembranen wurde herausgefunden, dass Ceramide auch in verschiedenen Signalwegen involviert sind, die auch bei Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. In Bezug auf die Kettenlänge der angehängten Fettsäure können so genannte kurz- und langkettige Ceramide Apoptose induzieren, wohingegen sehr langkettige Ceramide Zellproliferation fördern. In mehreren Studien wurden bereits Konzentrationsänderungen von kettenlängenspezifischen Ceramiden im Plasma und Serum von Patienten gemessen, die zu diesem Zeitpunkt an einer Nierenerkrankung litten. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob solche Konzentrationsänderungen auch im Nierengewebe von Patienten und Mäusen mit einer Nierenfibrose, dem Kennzeichen nahezu aller chronischen Nierenerkrankungen, zu sehen sind. Zu diesem Zwecke wurden Biopsien der Nierenrinde und des Nierenmarks von fibrotischen Nieren aus Patienten, die an Hydronephrose und/oder Pyelonephritis litten, und von gesunden Gewebeproben untersucht. Letztere wurden durch Nephrektomien zur Behandlung von Nierenkarzinomen gewonnen und dienten als nichtfibrotische Kontrolle. Zum Vergleich mit fibrotischen Nieren aus Mäusen wurden männliche Mäuse der Linie C57BL/6J mit einer adeninreichen Diät für 14 Tage gefüttert. Die Konzentrationen der Sphingolipide wurden mittels Massenspektrometrie gemessen und die Level der fibrotischen Marker wurden mit Hilfe von RT-qPCR und histologischen Färbungen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die sehr langkettigen Ceramide Cer d18:1/24:0 und Cer d18:1/24:1 sowohl in fibrotischen Nierenrindenproben der Patienten als auch in fibrotischen Nieren der Mäuse im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollproben signifikant geringer konzentriert waren. Diese Effekte korrelieren mit der Hochregulation der Fibrosemarker COL1α1, COL3α1 und αSMA in den fibrotischen Nieren. Es konnte gezeigt werden, dass nur bestimmte Ceramide in fibrotischem Nierengewebe in ihrer Konzentration verändert sind, was interessante Fragen hinsichtlich der Ursache dieser Veränderungen, ihrer funktionellen Aufgabe und zu möglichen Effekten einer Manipulation des Ceramidstoffwechsels mit dem Ziel der Behandlung der Nierenfibrose oder der Entdeckung neuer Biomarker aufwirft. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen zudem die Eignung von in vivo-Mausmodellen als translationalen Ansatz für das Verständnis der Beteiligung von Ceramiden in menschlichen Nierenerkrankungen.
Die in vitro-Untersuchungen zu der Rolle des S1P-Transporters Spns2 haben gezeigt, dass Spns2 die Expression von CTGF nach Stimulation von Mausmesangiumzellen mit TFG-β2 verstärkt. 24 Stunden nach Stimulation war im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC im Gegensatz zu Spns2+/+-mMC keine Akkumulation des pro-fibrotischen Zytokins CTGF gegenüber der unstimulierten Kontrolle detektierbar. Nach 48 Stunden Stimulation mit TFG-β2 war die Menge an CTGF im Zelllysat als auch im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC genauso hoch wie in der unstimulierten Kontrolle. Im Zelllysat und im Überstand der Spns2-/--mMC war die Expression von CTGF weiterhin deutlich höher im Vergleich zu den Proben der unstimulierten Zellen. Die basale und TFG-β2-induzierte Genexpression von S1P-synthetisierenden und S1P-degradierenden Enzymen, sowie die Konzentrationen an S1P und Sphingosin in den Zellen unterschieden sich zwischen Spns2-/--mMC und Spns2+/+-mMC nicht.
Fokus meiner Doktorarbeit ist die Anwendung und Entwicklung NMR-spektroskopischer Methoden zur Charakterisierung zeitabhängiger Strukturänderungen von Biomolekülen – von lokalen dynamischen Veränderungen bis zur vollständigen Rückfaltung von Proteinen – und fasst die Ergebnisse meiner drei wichtigsten PhD-Projekte zusammen.
In meinem ersten Projekt habe ich die Leistung eines Temperatursprung-Probenkopfs – mit dem Proben mit hoher Salzkonzentration schnell erwärmt werden können – mithilfe einer Hochfrequenzspule technisch optimiert. Die optimierten Radiofrequenz-Bestrahlungsparameter, Lösungsmittel-bedingungen und der reduzierte Arbeitszyklus führten zu einem Temperatursprung von 20 °C in 400 ms. Ich habe eine Cystein-freie Mutante von Barstar hergestellt, die nach Zugabe von Harnstoff bei 0 °C kalt denaturiert werden kann, während sie ihren gefalteten Zustand bei 30 °C hält. Dadurch wurde auch ermöglicht, dass der Rückfaltungsprozess hunderte Male ohne Abbau oder Aggregation wiederholt werden kann. Die Kombination von reversibler Rückfaltung und rascher Temperaturänderung des kalt denaturierten Barstars ermöglichte die Entwicklung eines neuen kinetischen Experiments, bei dem der Rückfaltungsprozess von Barstar mit einem zweidimensionalen Echtzeit-NMR in hoher Zeitauflösung untersucht wird. Die vollständige Rückgratresonanzzuweisung wurde sowohl für den gefalteten als auch für den kalt denaturierten Zustand von Barstar durchgeführt und ergab, dass in der denaturierten Form beide Prolin-Reste einen gemischten Konformationszustand aufweisen. Dabei befindet sich die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand hauptsächlich in trans-, während im gefalteten Zustand in der seltenen cis-Konformation. Das neue hochauflösende kinetische Experiment zeigte, dass die Rückfaltung von Barstar durch die trans-cis-Isomerisierung der Tyr47-Pro48-Amidbindung verlangsamt wird, was sowohl die Sekundärstruktur als auch die Bildung der Tertiärstruktur beeinflusst. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte ich einen plausiblen Faltungsmechanismus für den langsamen Faltungsweg von kalt denaturiertem Barstar skizzieren. Durch Änderung der Zeitparameter des Heizungszyklus wurde erreicht, dass die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand in der cis-Konformation bleibt und daher der schnelle Faltungsweg dominant wird. Das Starten des Magnetisierungstransfers vor der Temperaturänderung ermöglichte die Aufzeichnung eines Spektrums, das den entfalteten Zustand mit dem gefalteten Zustand korreliert. Dieses Spektrum ermöglichte quantitative Analysen des schnellen Faltungsweges und lieferte sogar indirekte Hinweise auf einen Zwischenzustand. Diese Methode aus Kombination von schnellem Temperatursprung und Kaltdenaturierung zeigt ein hohes Potenzial, Proteinfaltung auf atomarer Ebene experimentell zu untersuchen und ein tieferes Verständnis verschiedener Faltungswege zu erlangen.
In meinem zweiten Projekt – das Teil einer interdisziplinären Forschung war – konzentrierte ich mich auf die NMR-spektroskopische Charakterisierung von Nukleinsäuren, die mit einer photolabilen Schutzgruppe modifiziert wurden. Zuerst wurde mithilfe homonuklearer Korrelationsexperimente eine vollständige Protonresonanzzuweisung erreicht. Danach wurde die relative Konfiguration der photolabilen Schutzgruppen bestimmt basierend auf einer dreidimensionalen Modellstruktur und spezifischer NOE-Korrelationen. Des Weiteren wurde ein Strukturmodell unter Verwendung von NOE-Einschränkungen berechnet. Dieses Strukturmodell zeigte eine eingeschränkte Rotation um die CN-Bindung zwischen dem Käfig und der Nukleobase. Das Modell zeigte auch, dass der Käfig in der Hauptrille positioniert ist und nicht in das Lösungsmittel herausklappt. Im Vergleich zu einem zuvor charakterisierten NPE-Käfig führte die erhöhte Größe zu einer weiteren Senkung des Schmelzpunkts, zeigte jedoch einen geringeren Schmelzpunktunterschied zwischen der S- und der R-Konfiguration des Käfigs, wobei die S-Konfiguration zu einer größeren Reduktion des Schmelzpunktes führt. Dieser Trend wurde weiter untersucht und durch ein Screening unterstützt. Durch selektive Wasserinversions-Rückgewinnungsexperimente konnte ich auch zeigen, dass der Käfig die lokale Stabilität nur bis zu einer Entfernung von zwei benachbarten Basenpaaren von der Modifikationsstelle verringert. Die NOE-Daten dienten auch als guter Bezugspunkt, um die Qualität molekulardynamischer Simulationen zu testen, mit denen zusätzliche Käfigdesigns untersucht wurden. Die Kombination aus Synthese, NMR-Spektroskopie und MD-Simulationen ermöglichte bis jetzt die detaillierteste Untersuchung des Effekts vom Einbau eines einzelnen Käfigs zur Destabilisierung der DNA-Sekundärstruktur. Dabei wurden Einschränkungen des möglichen Designs aufgedeckt, aber auch die Entwicklung einer neuen, effizienteren Struktur ermöglicht.
Mein drittes Projekt konzentrierte sich auf die Charakterisierung eines RNA-Modellsystems. NMR-spektroskopische Daten von kleinen RNA-Modellsystemen – wie NOE, skalare Kopplungen, kreuzkorrelierte Relaxationsraten und RDC – sind eine unschätzbare Referenz für MD-Simulationen, obwohl die Menge der verfügbaren Literaturdaten – bis jetzt – sehr begrenzt ist. ...
Autophagy, together with the ubiquitin-proteasome system, is the main quality control pathway responsible for maintaining cell homeostasis. There are several types of autophagy distinguished by cargo selectivity and means of induction. This thesis focuses on macroautophagy, hereafter autophagy, where a double-layered membrane is formed originating from the endoplasmatic reticulum (ER) engulfing cargo selectively or unselectively. Subsequently, a vesicle forms around the cargo, an autophagosome, and eventually fuses with the lysosome leading to degradation of the vesicle content and release of the cargo “building blocks”. Basal autophagy continuously occurs, unselectively engulfing a portion of the cytoplasm. However, autophagy can also be induced by stress such as starvation, protein aggregation, damaged organelles, intracellular pathogens etc. In this case, the cargo is selectively targeted, and the fate of the autophagosome is the same as in basal autophagy. In recent years, interest in identifying mechanisms of autophagy regulation has risen due to its importance in neurodegenerative diseases and cancer. Given the complexity of the process, its execution is tightly regulated from initiation, autophagosome formation, expansion, closure, and finally fusion with the lysosome. Each of the steps involves different protein complexes, whose timely activity is orchestrated by post-translational modifications. One of them is ubiquitination. Ubiquitin is a small, 76-amino acid protein conjugated in a 3-step reaction to other proteins, in a reversible manner, meaning undone by deubiquitinases. Originally described as a degradation signal targeting proteins to the proteasome, today it is known it has various additional non-proteolytic functions, such as regulating a protein’s activity, localization, or interaction partners. The role of ubiquitin in autophagy has already been shown. However, given the reversibility and fine-tuning of the ubiquitin signal, many expected regulators remain unidentified. This work aimed to identify novel deubiquitinating enzymes that regulate autophagy. We identified ubiquitin-specific protease 11 (USP11) as a novel, negative regulator of autophagy. Loss of USP11 leads to an increase in autophagic flux, whereas overexpression of USP11 attenuates it. Moreover, this observation was reproducible in model organism Caenorhabditis elegans, emphasizing the importance of USP11 in autophagy regulation. To identify the mechanism of USP11-dependent autophagy regulation, we performed a USP11 interactome screen after 4 hour Torin1 treatment and identified a plethora of autophagy-related proteins. Following the most prominent hits, we have investigated versatile ways in which USP11 regulates autophagy. USP11 interacts with the PI3KC3 complex, the role of which is phosphorylating lipids of the ER, thereby initiating the formation of the autophagosomal membrane. Phosphorylated lipids serve as a recruitment signal for downstream effector proteins necessary for the membrane expansion. The core components of the complex are VPS34, the lipid kinase, ATG14, the protein responsible for targeting the complex to the ER, VPS15, a pseudokinase with a scaffolding role, Beclin1, a regulatory subunit, and NRBF2, the dimer-inducing subunit. We have found USP11 interacts with the complex and, based on its activity, USP11 influences post-translational status of all the aforementioned subunits, except for ATG14. Moreover, we have found that loss of USP11 leads to an increase in NRBF2 levels, whereas it does not change the levels of the other proteins. Given that the dimerization of the complex leads to an increase in complex activity, we investigated if the complex is more tightly formed in the absence of USP11, and if it is more active. We have found both to be the case. Although the exact mechanism of USP11-dependent PI3KC3 complex regulation remains to be identified, we found that loss of USP11 stimulates the complex formation and activity, likely contributing to the general effect of USP11 on autophagy flux. Additionally, we found that USP11 modulates levels of mTOR, the most upstream kinase in autophagy initiation steps and general multifaceted metabolism regulator. Loss of USP11 led to downregulation of mTOR levels, suggesting USP11 may rescue mTOR from proteasome-mediated degradation. Furthermore, we found mTOR to be differentially modified depending on the activity of USP11. However, it remains to be shown if USP11-dependent mTOR regulation contributes to the observed autophagy phenotype. Taken together, USP11 is a novel, versatile, negative regulator of autophagy, and an important addition to our knowledge on the regulation of autophagy by the ubiquitin system.
The aim of this work was to establish a new way of predicting novel dual active compounds by combining classical fingerprint representation with state-of-the-art machine learning algorithms. Advantages and disadvantages of the applied 2D- and 3D-fingerprints were investigated. Further, the impact of various machine learning algorithms was analyzed. The new method developed in this work was used to predict compounds, which inhibit two different targets (LTA4H and sEH) involved in the same disease pattern (inflammation). The development of multitarget drugs has become more important in recent years. Many widespread diseases like metabolic syndrome, or cancer are of a multifactorial nature, which makes them hard to be treated effectively with a single drug. The new in silico method presented in this work can help to accelerate the design and development of multitarget drugs, saving time and efforts.
The nowadays readily available access to a large number of 3D-structures of biological targets and published activity data of millions of synthesized compounds enabled this study and was used as a starting point for this work. Four different data sets were compiled (crystalized ligands from the PDB, active and inactive compounds from ChEMBL23, newly designed compounds using a combinatorial library). Those data sets were collected and processed using an automated KNIME workflow. This automation has the advantage of allowing easy change and update of compound sources and adapted processing ways.
In a next step, the compounds from the compiled data sets were represented using a variety of well-established 2D- and 3D-fingerprints (PLIF, AtomPair, Morgan, FeatMorgan, MACCS). All those fingerprints share the same underlying bit string scheme but vary in the way they describe the molecular structure. Especially the difference between 2D- and 3D-fingerprints was investigated. 2D-fingerprints are solely based on ligand information. 3D-fingerprints, on the other hand, are based on X-ray structure information of protein-ligand complexes. One major difference between 2D- and 3D-fingerprints usage is the need for a 3D-conformation (pose) of the compound in the targets of interest when using 3D-fingerprints. This additional step is time-consuming and brings further uncertainties to the method.
Based on the calculated fingerprints state-of-the-art machine learning algorithms (SVC, RF, XGB and ADA) were used to predict novel dual active compounds. The models were evaluated by 10-fold cross validation and accuracy as the primary measure of model performance was maximized. Second, individual parameters of the four machine learning algorithms were optimized in a grid search to achieve maximal accuracy using the optimized partitioning scheme. Overall accuracies, regardless of fingerprint and machine learning algorithm, are slightly better for LTA4H than for sEH.
The goal to predict dual active compounds was realized by comparing the set of predicted to be active compounds for LTA4H and sEH. For the 3D-fingerprint PLIF the machine learning algorithm Random Forest was chosen, from which compounds for synthesis and testing were selected. Of 115 predicted to be active compounds, six compounds were cherry picked. Two compounds showed very good/moderate dual inhibitory activity. Of the 2D-fingerprints, the AtomPair fingerprint in combination with the machine learning algorithm Random Forest was chosen from which compounds were selected for synthesis and testing. 116 compounds were predicted to be dual active against LTA4H and sEH. One of those compounds showed good dual inhibitory activity.
In this work it was possible to show advantages and disadvantages of using 2D- and 3D-fingerprints in combination with machine learning algorithms. Both strategies (2D: ligand-based, 3D: structure-based) lead to the prediction of novel dual active compounds with moderate to very good inhibitory activity. The method developed in this work is able to predict dual active compounds with very good inhibitory activity and novel (previously unknown) scaffolds inhibiting the targets LTA4H and sEH. This contribution to in silico drug design is promising and can be used for the prediction of novel dual active compounds. Those compounds can further be optimized regarding binding affinity, solubility and further pharmacological and physicochemical properties.
The fact that the interaction of oligonucleotides follows strict rules has been utilized to create two- or three-dimensional objects made of DNA. With computer-assisted design of DNA sequences, any arbitrary structure on the nanometer- to micrometer-scale can be generated just by hybridization of the needed strands. As astonishing these structures are, without any modification of the DNA strands involved no function can be assigned to them. Many different ways of functionalizing DNA-nanostructures have been developed with light-responsive nanostructures having a rather subordinated role. Almost all light responsive DNA-nanostructures involve the acyclic azobenzene-linking system tAzo based on D-threoninol which is known to work best at elevated temperatures to ensure optimal switching. As the structure of DNA-constructs is mainly maintained by hydrogen-bonding, variation of the temperature should be avoided in order to keep the structure intact.
To develop a light-responsive nanostructure model system with low-temperature operating azobenzene C-nucleosides, DNA-minicircles have been utilized. Those minicircles bear a lariat-like protrusion with a 10 base long single-stranded overhang, which is responsible for the dimerization with a ring bearing a complementary binding region. DNA-minicircles have been produced in a sequential manner by building and purifying the single stranded minicircle first by splint ligation and prepratative PAGE or RP-HPLC, followed by annealing it to the outer ring and subsequent purification by molecular-weight cut-off. Imaging of DNA-minicircles by atomic force microscopy (AFM) was possible with several methods of sample preparation leading to images of varying quality. With the help of AFM, qualitative analysis of the minicircles was possible. It could be shown, that theoretical and empirical size dimensions of the rings and their interactions were in great accordance. Designing the interaction site of the minicircles proved to be the main task in this project. The amount of C-nucleosidic modifications was identified by screening, followed by a screening of their optimal position and binding partners in the counterstrand. Two azobenzene C-nucleosides in a 10mer binding region and abasic sites opposing them appeared to give the best compromise between absolute dimerization ratio and photocontrolled change of it, as identified by native PAGE. In the following, the dimerization ratios of minicircles containing azobenzene C-nucleosides were compared with minicircles containing tAzo and unmodified minicircles. It could be shown, that the tAzo-modification leads to an elevated binding affinity compared to the unmodified minicircles, but the change upon irradiation is relatively humble compared to the C-nucleosides. For the C-nucleosidic modifications dimerization ratios reached a maximum of 40% in favored trans-state, but could be almost completely turned-off when switching into cis-state. In addition, arylazopyrazole-modified C-nucleosides could be switched into trans-state by irradiating at 530 nm, which is an improvement compared to standard azobenzene, as it shifts irradiation wavelength closer to the phototherapeutic window.
The utilization of DNA-analogous C-nucleosides bring two drawbacks with them: the ribose units include the flexibility of the sugar conformation and it is reasonable to think, that upon isomerization of the azobenzene, part of the steric stress generated is compensated by the sugar reconfiguration, which is lost for duplex
destabilization. In addition, the combination of the ribosidic linker end the end-to-end distance of trans-azobenzene causes the chromophore to penetrate deep into the base stack of the opposing strand, causing a serious destabilization even in favored trans-state. The goal was to find a linker system, that combines the benefits of the azobenzene C-nucleoside without the possibility to change sugar conformation and the strong destabilization in the trans-state. For this reason locked azobenzene C-nucleosides in analogy to LNA nucleosides have been synthesized. The synthesis of LNA analogous azobenzene C-nucleosides (LNAzo) was possible over a 16-step synthesis, with the critical step being the addition of in situ lithiated azobenzene to protected sugar aldehyde. Both anomers of LNAzo and mAzo as reference where incorporated into different oligonucleotide test systems by solid phase synthesis for thorough evaluation. It could be shown, that LNAzo β has a similar performance to mAzo in DNA with overall slightly increased TM- and ΔTM-values. Performance of LNAzo β was similar to mAzo even if steric stress is reduced by using abasic sites in the counterstrand opposing the azobenzene. Only in a RNA context, the true potential of LNAzo β could be observed. In a DNA/RNA duplex, photocontrol could be improved by almost 50%, in a RNA/RNA duplex even by over 100%. Although the primary goal was the improvement of the azobenzene C-nucleoside for a DNA-nanostructure context, LNAzo β proved not to give a sufficient improvement in regard to the cost-value ratio. Never the less, the invention of the locked azobenzene C-nucleoside was a huge success for reversible photoregulation of RNA hybridization. With this, a new way to regulate RNA hybridization has been found, which could be used to create RNA therapeutics in an antisense-approach.
As LNAzo β improved duplex stability only in a limited amount in DNA, further improvements on the backbone have been declared futile and focus shifted onto optimization of the chromophore. First, the azobenzene as it is installed on the ribosidic linker decreases duplex stability by forcing its distal aromat deep into opposing base stacking region. It would be an improvement, if in favored trans-state the distal aromat would be positioned in the less confined space of either major or minor groove and only upon isomerization would shift into base pairing region. Second, the azobenzene itself is not able to contribute to attractive interactions aside from relatively weak π-interactions to adjacent nucleobases, which could be improved, if it could partake in hydrogen bonding. For those apparent reasons, 2-phenyldiazenyl-modified purines have been selected as targets. They combine the ability to contribute to hydrogen bonding of nucleobases with the photochomicity of azobenzenes. Both 2’-deoxyadenosine- and 2’-deoxyguanosine-analogue photoswitches dAAzo and dGAzo have been synthesized and incorporated into 10mer DNA test systems by solid phase synthesis. It could be shown, that duplex stability could be increased compared to established azobenzene C-nucleoside. The improvement was stronger for dAAzo than for dGAzo as in the case for guanosine the amino function on the C2-position had to be replaced by the phenyldiazenyl function, reducing its ability to form hydrogen bonds. Unfortunately, photocontrol of duplex stability caused by 2-phenyldiazenyl purines was rather limited. A reason for this could be the positioning of the distal aromat within the duplex, which can be close to the opposing nucleobase (endo-helical) or in greater distance (exo-helical). The exo-helical conformation of the trans-isomer can only switch to the exo-P-cis-conformation, which relocates the distal aromat in the minor groove, without significant impact on duplex stability.