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Die postnatale Neovaskularisierung ist eine wichtige Vorraussetzung um Gewebe vor kritischer Ischämie zu schützen. Eine der Grundlagen dieses Prozesses bilden die Angiogenese, bei der neue Kapillaren durch Proliferation und Migration von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Blutgefäßen entstehen. Ein zweiter Eckpfeiler ist die Vaskulogenese, die unter anderem durch zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC) vermittelt wird. Homeobox-Gene der Klasse 1 (Hox) sind Transkriptionsfaktoren, die während der Embryonalentwicklung an der Organogenese und der Entwicklung des kardiovaskulären Systems beteiligt sind. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Homeobox-Proteine auch im adulten Organismus bei der transkriptionellen Regulation von Genen der Angio- und Vaskulogenese eine wichtige Rolle spielen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen eine essentielle Rolle von HoxA9 für die postnatale Neovaskularisierung sowie für die funktionelle Integrität von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen. HoxA9-defiziente Mäuse hatten einen signifikant verringerten Blutfluss nach einer Hinterlauflauf-Ischämie. Für die reduzierte Neovaskularisierung des ischämischen Gewebes, genügte der Verlust eines einzigen HoxA9-Wildtypallels. Außerdem zeigen HoxA9-defiziente Endothelzellen in vitro eine stark gehemmte Migration sowie eine verringerte Gefäßstrukturbildung. Zusätzlich war auch deren Interaktion mit EPC im Matrigel verschlechtert. Eine Bestätigung dieser Beobachtung zeigten Untersuchungen an endothelialen Vorläuferzellen, die ebenfalls einen Verlust angiogener Funktionen bei verminderter HoxA9-Expression aufwiesen. Neben der postnatalen Neovaskularisierung konnten erste Untersuchungen embryonaler Allantois zeigen, das HoxA9 vermutlich auch in der embryonalen Gefäßbildung beteiligt ist. Diese Theorie wird durch eine nicht-Mendelsche Verteilung der postnatalen Genotypen nach Kreuzung heterozygoter HoxA9-Mäuse unterstützt. Als molekulare Ursachen der Hemmung angiogener Funktionen bei Endothelzellen, konnte die Regulation verschiedener Gene nachgewiesen werden. So ist HoxA9 für die Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS), des VEGF-Rezeptors 2 (VEGF-R2), der Adhäsionsmoleküle VE-Cadherin und Integrin v3 sowie des EphB4-Rezeptors von essentieller Bedeutung. Diese von HoxA9 regulierten Gene spielen für die Angio- und Vaskulogenese alle eine entscheidende Rolle. Der EphB4-Rezeptor, die eNOS und der VEGF-R2 werden durch eine direkte Bindung von HoxA9 an den jeweiligen Promotor auf transkriptioneller Ebene reguliert. Bei den Genen Integrin v3 und VE-Cadherin erfolgt die Regulation durch HoxA9 indirekt über andere Gene oder posttranskriptionell. Zusätzlich zum Nachweis der Kontrolle der Genexpression, konnte für den EphB4-Rezeptor nachgewiesen werden, dass dieser von großer Bedeutung für die HoxA9-regulierte Migration ist. Außerdem besitzt der EphB4-Promotor eine für die Regulation der EphB4-Expression durch HoxA9 wichtige Bindungsstelle. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HoxA9 Schubspannungs-abhängig reguliert wird und dabei auch in die Regulation der Schubspannungs-induzierten Migration und die Schubspannungs-abhängige Expression der untersuchten Zielgene von HoxA9 eingreift. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass HoxA9 endotheliale Gene vielfältig reguliert, eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener endothelialer Funktionen spielt und essentiell für die postnatale Neovaskularisierung ist.
Die Atherosklerose stellt eine der Haupttodesursachen der westlichen Zivilisation dar. Die Karotisbifurkation ist eine der Lokalisationsorte für die Formierung einer atherosklerotischen Läsion, die sich nach Lumeneinengung schliesslich in neurologischen Symptomen bemerkbar machen kann. In einer fortgeschrittenen, symptomatisch gewordenen Karotisplaque kann als charakteristisches Merkmal oftmals ein in der Literatur unter dem Begriff der „Ruptur“ bekannte Oberflächendefekt ausgemacht werden. Es gibt allerdings gehäuft Hinweise über eine Thrombusausbildung auf einer intakten Plaqueoberfläche. Es wird vermutet, dass hier apoptotische Endothelzellen eine entscheidende Rolle bei Veränderungen der Gefässwand spielen, die letzlich für die Thrombusbildung verantwortlich ist. Aus diesen Überlegungen heraus untersuchten wir in der vorliegenden Studie das Ausmaß von Endothelzellapoptosen innerhalb eines Karotisplaque bei symptomatischen und asymptomatischen Patientengruppen. Insgesamt wurden 38 stationäre Patienten mit einer ≥70%-igen ACI-Stenose in die Studie eingeschlossen. Als symptomatisch galten die Patienten, die im Sinne von retinalen oder zerebralen TIA’s oder durch sog. „minor strokes“ in einem Zeitraum von 60 Tagen vor dem Operationstag auffällig geworden waren. Das asymptomatische Patientengut bestand aus den Patienten, bei denen die Karotisstenose als „Zufallsbefund“ aus Routineuntersuchungen in Klinik oder bei niedergelassenen Kollegen entdeckt wurde. Die Plaques wurden “en bloc” exzidiert. In den überwiesenden 33 Fällen wurde die Eversionstechnik durch den Operateur angewendet, bei der das Restlumen unbeschädigt bleibt. Nach Entfernung wurden die Präparate umgehend in 4%-iges Formalin fixiert. Nach Dekalzifizierung erfolgte die transversale Sektionierung in 2mm Scheiben. Jeder 2mm Block wurde in Paraffin eingebettet. Insgesamt wurde dann die Gesamtheit aller 279 Blöcke weiter in 3μm dicke Sektionen geschnitten. Das Vorliegen einer rupturierten Gefässwand wurde als ein intimaler Defekt grösser als 1000μm Breite definiert und für jedes Präparat dokumentiert. Die vitalen Zellen der Endothelschicht wurden durch ein standardisiertes Färbeprotokoll (CD31 Immunhistochemie) sichtbar gemacht. Apoptotische Endothelzellen konnten nach Anwendung der TUNEL-Technik visualisiert werden. Die Färbemethoden wurden jeweils zur Orientierung an angrenzenden Sektionen des Plaques durchgeführt. Die Bilder wurden digitalisiert und bei 40-facher Vergrösserung ausgezählt. Eine Endothelzelle wurde als apoptotisch gewertet, wenn sie jeweils eine positive CD31-Markierung sowie eine positive TUNEL-Färbung in angrenzenden Gewebsschnitten auf sich vereinte. Um das Ausmass der Apoptosen in den Reihen des Endothels zu quantifizieren wurde zunächst die Prozentzahl apoptotischer Endothelzellen pro Plaque Sektion ermittelt und anschliessend durch Berechnung des Medians aller konsekutiven Sektionen die mittlere Prozentzahl apoptotischer Zellen erhoben. Insgesamt war das Auftreten von Apoptose innerhalb des Endothel rar; trotzdem zeigte die symptomatischen Patientengruppe eine signifikant höhere mittlere Prozentsatz apoptotischer Endothelzellen im Vergleich zu dem asymptomatischen Kollektiv. Zwischen den rupturierten und unrupturierten Plaques konnte kein signifikantes Ergebnis erzielt werden, beide Gruppen unterschieden sich kaum. Trotz des möglichen Stellenwerts apoptotischer Endothelzellen bei der fortgeschrittenen Atherosklerose existieren bis heute keine Studien, die das Ausmass derselben in Beziehung zu klinischen Symptomen gebracht haben. Bislang konnte der Nachweis dieser Zellreihe in atherosklerotischen Karotisplaques besonders im poststenotischen Bereich erbracht werden. Veränderungen lokaler Hämodynamik scheinen hier eine Rolle bei der Induktion von Apoptose zu spielen. Da in der hier vorliegenden Arbeit sich der Grad der Stenose kaum unterscheidet müssen alternative Wege bestehen, die Apoptose in atheromatösen Plaques fördert. Apoptotische Endothelien fördern ihrerseits prokoagulatorische Eigenschaften durch vermehrte Expression von thrombogenen Faktoren der Gerinnungskaskade. Das klassische Dogma der Plaqueruptur mit konsekutiver Freilegung des nekrotischen Kerns und Thrombusbildung muss daher erweitert werden, da nicht alle Plaques der vorliegenden Studie diese Oberflächendefekte aufwiesen. Durch das leichte Übergewicht des symptomatischen Kollektivs lassen sich diese Theorien der Apoptose als kritischer Faktor in der Progression atherosklerotischer Herde weiter untermauern, benötigen aber weitere Studien um unter Umständen völlig andere Mechanismen aufzudecken.
Two distinct mechanisms contribute to the development of blood vessels: vasculogenesis, which is the de novo formation of vascular structures from progenitor cells, and angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones.
Angiogenesis is a highly ordered and carefully regulated multi-step process, during which the precise spatio-temporal interaction between endothelial and mural cells, i.e. smooth muscle cells and pericytes, is prerequisite for the formation of a functional blood vessel. The crosstalk between these two latter cell ty pes is mediated indirectly by various
secreted growth factors, and directly through cell-cell and cell-matrix interactions. The secretory epidermal growth factor-like protein 7 (EGFL7) has been implicated to
play an important role in the regulation of smooth muscle and endothelial cell recruitment and vascular tube formation. However, in-depth investigation of the underlying molecular mechanism has so far been hampered by the lack of functional recombinant EGFL7. In this study for the first time full length EGFL7 was successfully expressed as a His 6- tagged fusion protein from insect cells using the Baculovirus expression vector system. Recombinant EGFL7 was purified in a two-step protocol involving ion metal affinity chromatography and gel filtration. Furthermore, recombinant EGFL7 was
purified from human embryonic kidney EBN A 293 cells using a similar approach, allowing the production of high amounts of recombinant EGFL7 protein in its native state, with proper post-translational processing and full biological activity. Detailed analysis of the post-translational processing of recombinant EGFL7 and EGFL7-mutants revealed extensive proteolytic processing by protein convertases both at the N- and the C-terminus, the latter being prerequisite for EGFL7 secretion. Furthermore, secreted EGFL7 protein was shown to bind to the extracellular matrix and the responsible heparin-binding domain of EGFL7 was mapped to its N-terminal
portion. Purified recombinant EGFL7 protein was tested for its functionality using cell migration assays, cell proliferation studies and in vivo matrigel studies in mice. In the
modified Boyden chamber migration assay, recombinant EGFL7 proteins inhibited PDGF-BB-induced smooth muscle cell migration. Moreover, recombinant EGLF7 proteins strongly inhibited PDGF-BB-induced proliferation of smooth muscle cells, while it did not affect VEGF induced proliferation of endothelial cells. When applied in the in vivo matrigel plug assay, EGFL7 proteins induced a strong pro-angiogenic response, comparable with that of VEGF on an equimolar basis. Moreover, EGFL7 expression was strongly induced in endothelial cells in response to VEGF stimulation. These novel findings demonstrate the important function of EGFL7 in angiogenesis and are well in line with previous results. They demonstrate a cell specific action of EGFL7 on the different cell types involved in vessel formation, which is a prerequisite for a regulatory function in cell-to-cell crosstalk. Based on the results described here, the following model can be proposed: VEGF, a known strong initiator of angiogenesis, induces endothelial cell proliferation and migration, allowing the
escape from the comparatively rigid structure of a functional vessel to form an angiogenic sprout. At the same time VEGF induces the expression of EGFL7 in endothelial cells. EGFL7 is expressed, proc essed and secreted from these cells. While EGFL7 has no known effect on endothelial cells, it inhibits smooth muscle cell proliferation and migration, providing a mechanism to prevent pre-mature stabilization of the forming vessel. The availability of purified recombinant EGFL7 will be helpful in the detailed characterization of the underlying molecular mechanism of EGFL7 action, including the identification of the putative EGFL7 receptor, and will allow - together with knock-out experiments in mice - the exploration of the additional biological functions of EGFL7. Moreover, considering the strong pro-angiogenic effect of EGFL7 in vivo, it would be also of a great therapeutic interest to investigate its role in the development of tumor vasculature. The insights into these molecular mechanisms might provide a novel approach for the development of anti tumor therapies.
Der ubiquitäre Redoxregulator Thioredoxin-1 (Trx-1) hat wichtige Funktionen für den zellulären Redoxstatus, Zellwachstum und Apoptose. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind beteiligt an der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen wie der Atherosklerose und werden zunehmend in ihrer Rolle als intra- und extrazelluläre Signalmoleküle charakterisiert. Ein Ungleichgewicht zwischen der Entstehung von ROS und ihrem Abbau durch antioxidative Systeme führt zu oxidativem Stress, zur Oxidation von Proteinen und letztlich zum Zelltod. Daher wurde in dieser Doktorarbeit untersucht, wie reaktive Sauerstoffspezies Trx-1 in Endothelzellen regulieren, welchen Einfluss dies für die Endothelzellapoptose hat und welche Bedeutung Antioxidantien, Stickstoffmonoxid (NO) und Schubspannung haben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass H2O2 konzentrationsabhängig die Expression von Trx-1 beeinflusst. Geringe Konzentrationen H2O2 wie 10 und 50 µM induzierten Trx-1-mRNA nach 3 Stunden. Auf Proteinebene fand sich dann nach 6 Stunden eine transiente Hochregulation von Trx-1. Diese geringen Konzentrationen von H2O2 wirkten antiapoptotisch. Dieser antiapoptotische Effekt war von der Trx-1 Proteinexpression abhängig. Im Gegensatz dazu kam es bei hohen Konzentrationen H2O2 zu einer Degradierung von Trx-1. Durch das Antioxidans NAC und NO konnte der Abbau von Trx-1 unter höheren H2O2-Konzentrationen verhindert werden. Untersuchungen zum Mechanismus des Degradierungsprozesses ergaben, dass Trx-1 durch die Aspartatprotease Cathepsin D abgebaut wird. Der protektive Effekt von NO auf die Trx-1 Expression konnte auch im Gewebe eNOS-defizienter Mäuse gezeigt werden, da bereits eNOS-defiziente Mäuse in den Nieren weniger Trx-1 Protein aufwiesen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen. Bei der Entstehung endothelialer Läsionen und der Stabilität atheromatöser Plaques spielt die Endothelzellapoptose vermutlich eine wichtige Rolle. Trx-1 schützt Endothelzellen vor Apoptose, wird jedoch unter oxidativem Stress abgebaut. Faktoren, die Trx-1 unter oxidativem Stress stabilisieren wie NAC und NO, kommt daher eine besondere Bedeutung für die Endothelzellhomöostase zu.
Cytochrome P450 epoxygenases of the 2C family (CYP2C) are highly expressed in the endothelium and metabolize arachidonic acid to different regioisomers of epoxyeicosatrienoic acids (EET). They have a number of roles in the regulation of vascular tone and homeostasis by activating different signal transduction pathways and have recently been reported to be involved in proliferation and angiogenesis. However, the exact mechanisms by which epoxygenases regulate angiogenesis are still unclear. Therefore, the initial aim of the present study was to characterize the relevance of major signalling molecules that are involved in angiogenesis and to investigate possible signalling pathways involved. Initially the effect of CYP2C9 overexpression on expression levels of EphB4, a tyrosine kinase that plays a role in a number of developmental processes, was investigated. EphB4 protein expression was increased in CYP2C9 overexpressing cells without any effects on expression levels of its ligand ephrinB2. To clarify whether EphB4 is a critical determinant of CYP2C9-induced angiogenesis, endothelial cell sprouting was assessed using a collagen gel-based in vitro angiogenesis assay. Following transfection with EphB4 antisense or scrambled oligonucleotides, capillary-like structures were clearly present after 24 hours in cells overexpressing CYP2C9, while EphB4 downregulation abolished CYP2C9-induced sprouting. In addition stimulation of human umbilical vein endothelial cells with VEGF resulted in an increase in CYP2C expression and a subsequent increase of 11,12-EET production; an effect that was abolished by the CYP epoxygenases inhibitor MSPPOH as well as when cells were infected with a dominant negative mutant of AMPK. In vivo 11,12-EET treatment increased EphB4 expression in mesenteric arteries as well as in Matrigel plugs; an effect that was abolished when plugs were impregnated at the same time with small interfering RNA (siRNA) for EphB4. Furthermore, impregnation of Matrigel plugs with VEGF resulted in endothelial cell and smooth muscle cell recruitment into a Matrigel plug and this effect was mediated by CYP2C9-derived EETs as it was prevented by 14,15-EEZE. When infiltration of EET impregnated plugs with endothelial cells and pericytes/smooth muscle cells in vivo was compared to the effects seen in VEGF treated plugs, it was apparent that only EET treatment resulted in the formation of tube like structures that were covered by smooth muscle cells. Therefore, the final aim of the study was to further define the consequences of EET signalling in vivo as well as to characterize its physiological relevance. This hypothesis could be assessed by isolectin injection through the tail-vein where isolectin was taken up only by the EET-impregnated plug. Moreover ultrasound measurements revealed accumulation of contrast agent in EET impregnated plugs compared to control plugs. Taken together our findings emphasize that CYP2C plays a crucial role in the vessel formation process by modulating the effects mediated by two important control elements of the angiogenic response, namely VEGF and EphB4. CYP2C-derived EETs not only participate as second messengers in the angiogenic response, but have the potential to influence much more than angiogenesis by enhancing smooth muscle cell/pericyte recruitment to endothelial cell tubes to promote vascular maturation.