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Tumor hypoxia and nutrient starvation are common phenomena in cancerous tissue. Cells that resist this hostile environment are selected for a more aggressive phenotype, usually accompanied by therapy resistance. The hypoxia inducible factors HIF-1a and HIF-2a play a key role in the adaptive homeostatic responses to these challenging conditions inducing a number of target genes that are involved in the regulation of a variety of cellular processes such as angiogenesis, proliferation, metabolism, self-renewal and cell death/cycle arrest. Thus, the HIF pathway encompasses opposing adaptive responses on tumor growthgrowth promoting abilities on the one hand and growth inhibiting on the other. A recent study in our lab uncovered that this switch between cell death and cell survival critically depends on HIF-2a protein levels. Since PHDs (HIF prolyl hydroxylases) are the main regulators of HIF protein abundance and hypoxia drives the malignant phenotype of tumors, we wanted to characterize HIF regulatory functions of PHDs under hypoxic conditions. Our intention was to reveal the importance of PHD contribution to the opposing functions of HIFs under hypoxia. Characterization of PHD1-4 mRNA and protein expression levels under normoxic and hypoxic conditions in glioblastoma cell lines led to the identification of PHD2 and PHD3 as hypoxia inducible PHD isoforms and highlighted their predominant function under hypoxia. Mechanistically, we demonstrated that HIF mediates the hypoxic induction of PHD2 and 3 within a negative feedback loop, promoting its own degradation during prolonged hypoxia. The functional impact of PHD2 and 3 abundance on cell viability under hypoxic conditions was analyzed by disrupting PHD2 and PHD3 function either through a siRNA mediated approach or by application of the PHD inhibitor DMOG. These experiments uncovered that PHD2 and 3 are protective under hypoxic conditions and that PHD inhibition expedites cell death. Combined HIF and PHD suppression under hypoxic conditions abrogated this increased susceptibility to cell death, clearly showing that PHD2 and 3 act in a negative feedback regulatory loop to limit the HIF response under prolonged hypoxia. With respect to possible future therapeutical applications we co-treated cells with a PHD inhibitor and pro-apoptotic agents staurosporine or TRAIL. Co-challenging tumor cells even potentiated the cell death response, indicating a more widespread protective function of PHD. Taken together PHD2 and 3 protect tumor cells from cell death induction, functioning in a negative feedback regulatory loop to constrain the HIF dependent cell death responses under hypoxia. Interestingly, however, when assessing the role of PHD2 and PHD3 in in vivo tumor growth using an intracranial tumor model, we identified an exclusive tumor suppressor function for PHD3. Loss of PHD3 function enhanced tumor growth whereas increased PHD3 expression diminished the tumor burden. The accelerated tumor growth following PHD3 loss could be attributed to a decrease in the induction of apoptosis and an increase in proliferation. Tumor cells are frequently exposed to temporary and spatial depletion of nutrients. Interestingly, PHD3 loss conferred a growth advantage under growth factor deprivation. The growth regulatory function of PHD3 was isoform specific, HIF independent and importantly, did not require the hydroxylase function of PHD3. Previous reports have uncovered a regulatory function of the PHD system in NF-kB signaling. However, our results demonstrated that NF- kB signaling remained unaffected by alteration in the PHD3 status of the cell. Additionally, the PHD3 tumor suppressor function proved to be independent of two putative PHD3 downstream effectors, ATF4 and KIF1Bb. Mechanistically, PHD3 suppression reduced EGFR internalization, enhancing the amount of EGFR expressed on the cell surface. We further showed that the impaired EGFR internalization during PHD3 loss resulted in receptor hyperactivation under stimulated and growth factor deprived conditions. Importantly, PHD3 physcially associated with the EGFR complex as evidenced by co-immunoprecpitation. Consequently, this extended EGFR activation in PHD3 deficient cells resulted in enhanced downstream activation of EGFR signaling and increased proliferation. Consistent with the interpretation that PHD3 loss is beneficial for tumor growth, we found PHD3 promoter methylation in glioblastoma cell lines, hinting at a epigenetic mechanism to finetune PHD3 expression on top of the hypoxic driven gene regulation. Finally, we demonstrated that PHD3 tumor suppressor function is not restricted to glioblastomas since PHD3 suppression in lung adenocarcinoma accelerated subcutaneous tumor growth. With these findings, we expand the knowledge of PHD3 action from its oxygen sensing role to a regulatory function in growth factor signaling. This clearly discriminates PHD3 from the other isoforms and supports the exclusive tumor suppressor function in glioblastoma. Taken together our results identify a complex role of PHD signaling in cancer and delineate HIF dependent and HIF independent functions of the PHD system. We think that the HIF dependent protective effect of PHD2 and 3 and the HIF independent PHD3 tumor suppressor function are not mutually exclusive, but might be activated according to the heterogeneous intra-tumoral conditions. However, PHD3 hydroxylase activity is dispensable for its HIFindependent tumor suppressor function in glioma. This uncouples PHD3 function from co-factor and co-substrate requirements and allows it to act over a broader physiological range, since its influence on cellular processes is not constrained by the availability of rate limiting factors. It might explain, why the enzymatic independent functions of PHD3 predominate in vivo. Thus, therapeutic modulation of the PHD system to inhibit tumor growth has to be based on these contrasting functions of the PHD system. However, their differential dependence on the hydroxylase activity may facilitate a therapeutic strategy to specifically inhibit or promote the protective versus suppressive functions of the PHD system.
Primäre Hirntumore des Zentralen Nervensystems (gehen aus Nervenzellen, Gliazellen, Hirnhäute (Meningen) und auch Hirngefäße aus. Das anaplastische Astrozytom, Oligodendrogliom und Oligoastrozytom (WHO-Grad III) und auch die bösartigste Form, das Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV) bilden den wesentlichen Anteil der astrozytären Tumoren. Bedingt durch die ungünstige Prognose für Patienten mit Glioblastomen bedarf es einer Optimierung der therapeutischen Maßnahmen. Die momentane Therapie besteht nach Konstitution des Patienten und der Lokalisation des Tumors meist aus der Operation mit angeschlossener Strahlen- und eventueller adjuvanten Chemotherapie. Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Faktoren, wie der Ausbreitung und der Lokalisation des Tumors und hat sich in den letzten Jahren leider nur unwesentlich verbessert, da immer noch von einer medianen Überlebenszeit des Patienten zwischen 8 und 15 Monaten im Falle eines Glioblastoms ausgegangen werden kann. Die Entstehung und Progression von malignen Tumorerkrankungen sind eng mit Störungen und Defekten in Signalwegen, die das Zellüberleben und den Zelltod regulieren, verknüpft. Aberrationen, wie die Blockade von Tumorsuppressorgenen, oder die Aktivierung bzw. Überexpression von Onkogenen, führen zur veränderten Expression von Zelltod-inhibitorischen Genen wie den anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedern, und letztendlich zu Abweichungen der normalen zellulären Homöostase. Veränderungen dieser Art bewirken, dass Tumorzellen die Fähigkeit erhalten, unkontrolliert zu proliferieren, infiltrativ zu wachsen und eine eigene Vaskularisierung zu initiieren. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Apoptose- und Zelltodresistenz, die maßgeblich durch die stark erhöhte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit stand daher die Fragestellung im Mittelpunkt, inwieweit anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie zur Resistenz von malignen Gliomzellen gegen die Apoptose und den autophagischen Zelltod beitragen und wie diese Mechanismen gezielt überwunden werden können. Die Blockade der vier Familienmitglieder der Bcl-2-Subfamilie (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w) wurde über den Einsatz von spezifischen Inhibitoren, den sogenannten BH3-Mimetika, vermittelt. BH3-Mimetika besitzen eine hohe Affinität zur Bindungstasche der Bcl-2-Proteine, wobei durch die Bindung eine Blockade des Proteins hervorgerufen wird. Die eingesetzten BH3-Mimetika haben unterschiedliche Bindungsprofile und können daher ein, zwei oder mehrere Proteine der Bcl-2-Familie inhibieren. Die verwendeten Inhibitoren BH3I-2, HA14-1 und ABT-737, die nur eine limitierte Wirkung auf den Zelltod von Gliomzellen entfalteten, sind allesamt nicht in der Lage, Mcl-1 zu blockieren. Deshalb wurde zusätzlich ein Pan-Bcl-2-Inhibitor, das (-)-Gossypol, verwendet. Dieser Inhibitor hemmt alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, und steigerte über die Inhibition und Degradation von Mcl-1 effizient den Zelltod von Gliomzellen. Dagegen zeigte die (-)-Gossypol-Behandlung in nicht transformierte Astrozytenkulturen keine zytotoxischen Effekte. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass durch das BH3-Mimetikum (-)-Gossypol ein autophagischer Zelltod induziert wird. Unter der Verwendung eines charakteristischen Markerproteins, dem LC3-Protein, konnte nach Induktion des nicht-apoptotischen, autophagischen Zelltodes durch (-)-Gossypol eine Translokation von GFP-LC3 in die Autophagosomen und Autolysosomen festgestellt werden. Viele Gliome weisen eine Methylierung des MGMT-Promotors auf, die es den Zellen erschwert, schnell DNA-Schäden zu reparieren. Aufgrund dieser Methylierung sind diese Tumoren sensitiv für eine Behandlung mit alkylierenden Substanzen (Temozolomid). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden die kombinatorischen Effekte von BH3 Mimetika und Temozolomid in MGMT-positiven (U87) und MGMT-negativen (U343) Gliomzelllinien verglichen, wobei sich lediglich in MGMT-negativen U343-Gliomzellen signifikante, kombinierte Effekte ergaben. Dieser Zelltod war mit einer Potenzierung der Autophagie assoziiert, nicht jedoch mit einer Aktivierung von Caspasen und einer lysosomalen Dysfunktion. Die Depletion des endogenen Autophagieinhibitors mTOR bewirkte nach den Behandlungen mit (-)-Gossyol und TMZ einen zusätzlichen zytotoxischen Effekt. Im Gegensatz dazu wurde durch lentivirale RNA-Interferenz gegen die Autophagiegene ATG5 und Beclin1 eine potente Reduktion der zellulären Autophagie und des autophagischen Zelltodes erreicht. Insgesamt unterstreichen diese Daten die zentrale Rolle von Bcl-2 Proteinen für die Regulation der Autophagie und legen nahe, dass durch (-)-Gossypol und (-)-Gossypol in Kombination mit Temozlomid in Gliomzellen zytotoxische Autophagie induziert wird.
Blut steht für Leben - und für den Tod. Das ist in der Medizin nicht anders als in der Mythologie. Vor wenigen Jahrzehnten war die Diagnose Blutkrebs noch ein sicheres Todesurteil. Heute werden viele Leukämiekranke geheilt. An der Goethe-Universität setzt ein Schwerpunkt für Lymphom- und Leukämieforschung deutschlandweit Akzente bei Forschung und Diagnostik.
Wastewater treatment plants (WWTPs) do not eliminate micropollutants completely and are thus important point sources for these substances. In particular, concerns about en-docrine disrupting compounds in WWTP effluents give rise to the implementation of advanced treatment steps for the elimination of trace organic contaminants. The present study investigated ozonation (O3) and activated carbon treatment (AC) at two WWTPs. For an ecotoxicological assessment at WWTP Regensdorf, conventionally treated wastewater, wastewater after ozonation, and ozonated wastewater after sand filtration were evaluated in parallel via the fish early life stage toxicity test (FELST) using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Additionally, a comparative toxicity evalu-ation of ozonated and activated carbon treated effluents was performed at the pilot scale treatment plant in Neuss (WWTP Neuss). For this purpose, four invertebrate tests and one higher plant toxicity test were selected to assess potential biological effects on or-ganisms [Lemna minor growth inhibition test, chironomid toxicity test with Chironomus riparius, Lumbriculus variegatus toxicity test, comet assay with haemolymph of the zebra mussel (Dreissena polymorpha), reproduction test with Potamopyrgus antipo-darum]. All in vivo assays were performed on site at the treatment plants in flow-through test systems. Furthermore, the present study investigated the effects of ozona-tion and activated carbon treatment on endocrine activities [estrogenicity, anti-estrogenicity, androgenicity, anti-androgenicity, aryl-hydrocarbon receptor (AhR) agonistic activity] with yeast based bioassays using solid phase extracted water samples. To evaluate the removal of in vitro non-specific toxicity, a cytotoxicity assay using a rat cell line was applied. The FELST at WWTP Regensdorf revealed a considerable developmental retardation of test organisms exposed to ozonated WW. This was accompanied by a significant decrease in body weight and length compared to reference water, to the conventionally treated WW, and to the ozonated water after sand filtration. Hence sand filtration obvi-ously prevents from adverse ecotoxicological effects of ozonation. An additional test – starting with yolk-sac larvae – resulted in a significant reduction of vitellogenin levels in fish exposed to ozonated wastewater compared to fish reared in conventionally treat-ed wastewater. This demonstrates the effective removal of estrogenic activity by ozonation. At WWTP Neuss, the reproduction test with the mudsnail P. antipodarum exhibited a decreased reproductive output after advanced treatment compared to conventional treatment. This indicates an effective estrogenicity removal by ozonation and activated carbon treatment and is confirmed by results of the yeast estrogen screen with a reduc-tion of in vitro estrogenic activity by > 75%. The L. variegatus test revealed a signifi-cantly enhanced toxicity after ozonation compared to conventional treatment, whereas this effect was reduced following subsequent sand filtration. When ozonation was applied, a significantly increased genotoxicity was observed, detected with the comet assay using haemolymph of the zebra mussel. Again, this effect was removed by subsequent sand filtration to the level of conventional treatment. Activated carbon treatment even resulted in a significant reduction of genotoxicity. At both treatment plants, adverse effects after ozonation may have been a result of the formation of toxic oxidation by-products. However, sand filtration reduced toxication effects, indicating that these oxidation by-products are readily degradable or adsorbable. The results point out that, in any case, ozonation should not be applied without subsequent biologically active post treatment appropriate for oxidation by-products removal (e.g. sand filtration). However, only activated carbon achieved a toxicity reduction compared to the conventional treated wastewater. Thus, it cannot be excluded that po-tential beneficial effects due to ozonation might be masked by residual toxic oxidation by-products passing the sand filter or ozonation is not as effective in toxicity removal as PAC treatment. The yeast based assays with solid phase extracted samples revealed an effective endo-crine activity removal during ozonation and activated carbon filtration (estrogenicity: 77 – 99%, anti-androgenicity: 63 – 96%, AhR agonistic activity: 79 – 82%). The cyto-toxicity assay exhibited a 32% removal of non-specific toxicity after ozonation com-pared to conventional treatment. Ozonation in combination with sand filtration reduced cytotoxic effects by 49%, indicating that sand filtration contributes to the removal of toxicants. Activated carbon treatment was the most effective technology for cytotoxici-ty removal (61%). Sample evaporation reduced cytotoxic effects by 52% (after activated carbon treatment) to 73% (after ozonation), demonstrating that volatile substances contribute considerably to toxic effects, particularly after ozone treatment. These results confirm an effective removal or transformation of toxicants with receptor mediated mode of action and non-specific toxicants during both investigated treatment steps. However, due to the limited extractability, polar ozonation by-products were neglected for toxicity analysis, and hence non-specific toxicity after O3 is underestimated. In the long run, only on-site comparisons at WW receiving water bodies (e.g. communi-ty analysis of fish, macroinvertebrates, plants, microorganisms) – before and after up-grading WWTPs – allow drawing environmentally relevant conclusions regarding bene-fits and risks of advanced WW treatment methods. Conclusively, the benefits and possible negative impacts have to be carefully evaluated to prove that not more environmental impact will be induced than removed by advanced treatment technologies as each additional treatment requires considerable amounts of energy, resources, and infrastructure facilities. Accordingly, comprehensive sustainable approaches for pollution prevention and wastewater treatment (e.g. source control and source separation) are preferable compared to end-of-pipe treatment systems.
Feral cats (Felis catus), introduced into Australia with European settlers in the 19th century, colonized the entire Australian continent in less than 100 years, including the Australian arid zone which covers more than 70% of the continent. Feral cats are responsible for the decline and extinction of a number of native species and the failure of a number of reintroduction attempts, especially in the arid zone. Many ecological studies on feral cats have been conducted on home range size and movement patterns in different environments, abundance and diet, with the aim of gaining a better understanding about their successful invasion of the Australian continent. There are no physiological studies on the feral cat to date. However, there is evidence that there is a strong interrelation between physiology and abiotic factors such as climate. Thus, distribution, habitat, and dispersal of species can not fully be understood without background knowledge of physiology. This PhD aims to contribute to a better understanding of three physiological parameters: metabolism, body mass and body temperature patterns. These parameters may possibly identify physiological adaptation to different climate zones, seasonal conditions and island isolation.
Mit Blut unterzeichnete Dr. Faust seinen zweifelhaften Pakt mit dem Teufel. In der Kulturgeschichte des Menschen hat Blut von jeher eine mystisch aufgeladene Rolle gehabt, die sich in religiösen Ritualen, Heilpraktiken, Liebes- und Freundschaftsbünden niederschlug. Roland Prinzinger beginnt mit einigen Schlaglichtern auf die vielfältigen Bedeutungen des Blutes, die heute noch mitschwingen, wenn wir uns dem Thema nähern. Als Biologe erklärt er dann am Beispiel der Diagnostik bei Vögeln, warum Blut auch aus naturwissenschaftlicher Sicht ein »ganz besonderer Saft« ist.
Eisenhaltige kurze Nervenäste im Oberschnabel dienen offensichtlich ganz unterschiedlichen Vogelarten dazu, die Stärke des Erdmagnetfeldes zu messen und nicht nur seine Richtung wie ein Kompass zu bestimmen. Was die Frankfurter Neurobiologen Dr. Gerta Fleissner und ihr Mann Prof. Günther Fleissner bereits vor einigen Jahren bei Brieftauben entdeckten, können sie jetzt auch für andere Vogelarten belegen.
Die Bedeutung verschiedener CRASP-Proteine für die Komplementresistenz von Borrelia burgdorferi s.s.
(2010)
Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Immunevasion von B. burgdorferi s.s., insbesondere der Bedeutung einzelner CRASP-Proteine für die Komplementresistenz. Sie trägt dazu bei, die Relevanz dieser Proteine für die Pathogenese dieses Erregers zu untermauern. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, verschiedene Vektoren mit den ursprünglichen oder mutierten CRASP-kodierenden Genen cspA, cspZ, erpP und erpA aus B. burgdorferi s.s. zu generieren und diese in das CRASP-negative Isolat B. garinii G1 zu transformieren. Die Expression der speziesfremden Gene als auch der Transport der CRASP-Moleküle auf die Zelloberfläche von B. garinii G1 konnten nachgewiesen werden. Für die konstitutiv CRASP-1- oder CRASP-2-produzierenden Borrelienzellen konnte gezeigt werden, dass diese, auf der Zelloberfläche lokalisierten CRASP-Moleküle mit Faktor H und FHL-1 interagieren, die gebundenen Komplementregulatoren ihre funktionelle Aktivität zur C3b-Inaktivierung aufrechterhalten und die Zellen in Gegenwart von Komplement überleben. Damit wurde erstmals der Nachweis erbracht, dass beide CRASP-Moleküle unabhängig voneinander Schutz vor komplementvermittelter Lyse verleihen. Untersuchungen mit den veränderten CRASP-1-Molekülen ergaben, dass die Transformante G1/pCRASP-1 E147K eine verringerte Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, welche sich jedoch nicht auf die Komplementresistenz der Zellen auswirkte. Im Gegensatz dazu führte eine Aminosäuresubstitution im C-Terminus des CRASP-1-Moleküls an Position 240 zum Verlust der Bindung von Faktor H und einer stark verminderten Bindung von FHL-1, so dass auch keine Kofaktoraktivität nachgewiesen werden konnte. Trotz des Bindungsverlustes beider Komplementregulatoren zeigte die Transformante G1/pCRASP-1 Y240A nur geringe Ablagerungen des lytischen, terminalen Komplementkomplexes (TCC) auf der Zelloberfläche und Wachstum in Gegenwart von aktiven Komplement. Mittels eines Hämolyse-Assays wurde schließlich festgestellt, dass CRASP-1 direkt mit Komponenten des Komplementsystems interagiert und dadurch die Assemblierung des TCC verhindert. Die Bedeutung der Aminosäuren an den Positionen 81, 139, 207 und 211 im CRASP-2-Molekül für die Faktor H / FHL-1-Bindung und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Komplementresistenz der Borrelien wurde gleichfalls nachgewiesen. Dabei wies insbesondere die Transformante G1/pCRASP-2 Y211A ein inhibiertes Wachstum in Humanserum und verstärkt Komplementablagerungen auf der Zelloberfläche auf, was auf den Verlust bzw. der sehr schwachen Bindung von FHL-1 und Faktor H zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Transformanten, welche ein CRASP-2-Molekül mit nur einem Aminosäureaustausch produzierten, zeigten die Transformanten, deren CRASP-2-Molekül zwei Aminosäuresubstitutionen aufwies (G1/pCRASP-2 R139A-Y207A, G1/pCRASP-2 R139A-Y211A, G1/pCRASP-2 Y207A-Y211A) keine Bindung der beiden Regulatorproteine und keinen Schutz der Zellen vor der lytischen Wirkung von Komplement. Neue, unerwartete Erkenntnisse ergaben sich aus den Untersuchungen mit Borrelienzellen, welche das CRASP-3- oder CRASP-5-kodierende erpP- bzw. erpA-Gen enthielten. Obwohl gereinigtes als auch denaturiertes CRASP-3 und RASP-5 in der Lage war, Faktor H zu binden, wiesen die vitalen Zellen der Transformanten G1/pCRASP-3 und G1/pCRASP-5 keine Bindung von Faktor H und keinen Schutz der Zellen vor komplementvermittelter Lyse auf. Aus den durchgeführten Untersuchungen konnten für gereinigtes CRASP-3 und CRASP-5 als auch für die CRASP-3- und CRASP-5-produzierenden Transformanten neue Liganden, nämlich CFHR-2 und CFHR-5, aus Humanserum identifiziert werden. Zusammenfassend lassen sich folgende Aussagen hinsichtlich des molekularen Mechanismus der Komplementresistenz bei B. burgdorferi s.s. aus den erhobenen Daten dieser Arbeit mit transformierten Borrelienzellen formulieren: *Die Komplementresistenz der Borrelien wird durch die Faktor H- und FHL-1-bindenden Proteine CRASP-1 und CRASP-2, jedoch nicht durch CRASP-3 und CRASP-5 determiniert, *CRASP-1 als multifunktionelles Protein ist zusätzlich in der Lage, direkt mit Komplement zu interagieren, *Die C-terminalen Domänen von CRASP-1 und CRASP-2 sind für die Bindung der beiden Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 relevant, *CRASP-3 und CRASP-5 auf der Borrelienoberfläche lokalisiert, interagieren mit CFHR-1, CFHR-2 und CFHR-5, aber nicht mit Faktor H.
Therapy of hemorrhagic shock with following resuscitation-induced liver injury : in vivo study
(2010)
Shock resulting from life-threatening blood-loss (hemorrhagic shock) represents the most frequent injury pattern after a traumatic insult. Hemorrhagic shock induces inflammatory changes, characterized by highly complex pathophysiological pathways often resulting in death. In this study, we establish an experimental in vivo model of H/R in rats and study the mechanisms which determine the hepatic injury after H/R. Furthermore, we show that hemorrhagic shock with following resuscitation is accompanied with release of systemic and local pro-inflammatory mediators, increased infiltration of hepatic neutrophils in the liver, increased oxidative and nitrosative stress, enhanced cell death of both types, apoptosis and necrosis, conspicuous cytoskeletal rearrangements, loss of hepatic integrity and finally high general mortality rates, up to 80%. In addition, the effects of two potential therapeutic interventions to prevent the H/R induced liver injury are explored in a model of H/R in rats. First, the role of JNK and its inhibition by D-JNKI-1 in preservation of hepatic integrity following H/R was analyzed. Second, we investigated the potential of simvastatin to prevent the disturbed inflammatory response and hepatic injury after H/R. The effects of both therapeutic interventions were studied by looking at several inflammatory parameters, markers of oxidative and nitrosative stress, cytoskeleton integrity, microcirculatory parameters, underlying signaling cascades, liver damage and mortality. Highly specific blockade of JNK with the potent, inhibitory peptide D-JNKI-1 revealed the crucial role of the JNK signaling pathway in the H/R induced pathophysiology and strong protective effects of DJNKI- 1 in H/R induced liver injury, when the peptide was applied before and even after hemorrhagic shock. The other therapeutic intervention tested in this study was the use of simvastatin which also revealed protective effects after H/R and even a remarkable improvement in survival after H/R. We show that H/R induced release of pro-inflammatory cytokines, hepatic PMNL infiltration, increased oxidative and nitrosative stress, apoptosis and necrosis can be diminished by treatment with D-JNKI-1 but also with simvastatin in vivo. Furthermore, simvastatin reduces H/R induced cytoskelatal rearrangements, loss of liver integrity and the mortality rate after H/R. The key pathway which underlies these beneficial effects of simvastatin is the Rho kinase pathway. Identification of both mechanisms as well as the effectiveness of both substances provide new insights in the close interaction between hypoxia and the immune system and present a promising basis for the anti-inflammatory, hepatoprotective treatment after H/R.
Iron uptake is an essential process in all Gram-negative bacteria including cyanobacteria and therefore different transport systems evolved during evolution. In cyanobacteria, however, the iron demand is higher than in proteobacteria due to the function of iron as cofactor in e.g. photosynthesis and nitrogen fixation. Most of the transport systems depend on outer membrane localized TonB-dependent transporters (TBDTs), a periplasma-facing TonB protein and a plasma membrane localized machinery (ExbBD). So far, iron chelators (siderophores), oligosaccharides and polypeptides have been identified as substrates of TBDTs. However, in proteobacteria TonB-dependent outer membrane transporter represent a well-explored subject whereas for cyanobacteria almost nothing is known about possible TonB-dependent uptake systems for iron or other substrates. The heterocyst-forming filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 is known to secrete the siderophore schizokinen, but its transport system has remained unidentified. For Anabaena sp. PCC 7120 22 genes were identified as putative TBDTs covering almost all known TBDT subclasses. This is a high number of TBDTs compared to other cyanobacteria. The expression of the 22 putative TBDTs individually depends on the presence of iron, copper or nitrogen. The atypical dependence of TBDT gene expression on different nutrition points to a yet unknown regulatory mechanism. In addition, the hypothesis of the absence of TonB in Anabaena sp. PCC 7120 was clarified by the identification of an according sequence, all5036. Inspection of the genome of Anabaena sp. PCC 7120 shows that only one gene encoding a putative TonB-dependent iron transporter, namely alr0397, is positioned close to genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of a hydroxamate siderophore. The expression of alr0397 was elevated under iron-limited conditions. Inactivation of this gene caused a moderate phenotype of iron starvation in the mutant cells. The characterization of the mutant strain showed that Alr0397 is a TonB-dependent schizokinen transporter (SchT) of the outer membrane and that alr0397 expression and schizokinen production are regulated by the iron homeostasis of the cell. Additional two genes of Anabaena sp. PCC 7120 involved in this process were identified. SchE encoded by all4025 is a putative cytoplasmic membrane-localized transporter involved in TolC-dependent siderophore secretion. The mutation of schE resulted in an enhanced sensitivity to high metal concentrations and in drastically reduction of secretion of hydroxamate-type siderophores. IacT coded by all4026 is a predicted outer membrane-localized TonB-dependent iron transporter. Inactivation of iacT resulted in reduced sensitivity to elevated iron and copper levels, whereas decoupling the expression from putative regulation by exchange of the promoter resulted in sensitization against tested metals. Further analysis showed that iron and copper effects are synergistic because decrease of iron induced a significant decrease of copper levels in the iacT insertion mutant but an increase of those levels in Anabaena sp. PCC 7120 where expression of all4026 is under the trc-promoter. In consequence, the results unravel a link between iron and copper homeostasis.
Aging of biological systems ultimately leads to death of the individual. In humans, organ failure as the result of functional impairments after stroke, cardio-vascular disease, tumor development, neurodegeneration and other diseases are certainly crucial in bringing life to an end. But what happens in individuals with no obvious disease or disorders?
Long-range tertiary interactions determine the three-dimensional structure of a number of metabolite-binding riboswitch RNA elements and were found to be important for their regulatory function. For the guanine-sensing riboswitch of the Bacillus subtilis xpt-pbuX operon, our previous NMR-spectroscopic studies indicated pre-formation of long-range tertiary contacts in the ligand-free state of its aptamer domain. Loss of the structural pre-organization in a mutant of this RNA (G37A/C61U) resulted in the requirement of Mg2+ for ligand binding. Here, we investigate structural and stability aspects of the wild-type aptamer domain (Gsw) and the G37A/C61U-mutant (Gswloop) of the guanine-sensing riboswitch and their Mg2+-induced folding characteristics to dissect the role of long-range tertiary interactions, the link between pre-formation of structural elements and ligand-binding properties and the functional stability. Destabilization of the long-range interactions as a result of the introduced mutations for Gswloop or the increase in temperature for both Gsw and Gswloop involves pronounced alterations of the conformational ensemble characteristics of the ligand-free state of the riboswitch. The increased flexibility of the conformational ensemble can, however, be compensated by Mg2+. We propose that reduction of conformational dynamics in remote regions of the riboswitch aptamer domain is the minimal pre-requisite to pre-organize the core region for specific ligand binding.
Die Gattung Palaua gehört zur Tribus der Malveae (Malvaceae, Malvoideae). Sie umfasst fünfzehn einjährige oder ausdauernde krautige Arten, die für die Nebeloasen („Lomas“, „Desierto Florido“) der Küstenwüste Perus und Chiles endemisch sind. Abweichend von den meisten anderen Gattungen der Malveae besitzt Palaua (mit Ausnahme von P. sandemanii) unregelmäßig übereinander angeordnete Merikapien. Dieses Merkmal ist ansonsten nur von den beiden altweltlichen Gattungen Kitaibela und Malope bekannt, weshalb diese früher mit Palaua in der Tribus Malopeae vereint wurden. Palynologische, cytogenetische und molekulare Analysen zeigten jedoch, dass die Malopeae eine polyphyletische Gruppe bilden und dass die in Südamerika verbreiteten Gattungen Fuertesimalva und Urocarpidium die nächsten Verwandten von Palaua sind. Ebenso wie im Aufbau des Gynözeums unterscheidet sich Palaua auch durch das Fehlen eines Epicalyx vom Großteil der Malveae, einschließlich ihrer Schwestertaxa. Seit der Erstbeschreibung der Gattung durch Cavanilles im Jahr 1785 sind nur zwei detaillierte Bearbeitungen der Gattung Palaua veröffentlicht worden. Die umfassendste davon stammt von Ulbrich (1909). Auf der Grundlage der umfangreichen Aufsammlungen von August Weberbauer beschrieb er mehrere neue Arten in seinem Werk „Malvaceae austro-americanae imprimis andinae“, das er in nachfolgenden Jahren (1916, 1932) vervollständigte. Die zweite bedeutsame Bearbeitung ist die Revision der Gattung durch Macbride (1956) in der „Flora of Peru“. Seit den 50er Jahren des vorherigen Jahrhunderts kamen jedoch zahlreiche Aufsammlungen hinzu, insbesondere durch den peruanischen Botaniker Ramón A. Ferreyra (1912-2005), sowie durch Ernesto Günther (1870-?) zusammen mit Otto Buchtien (1859-1946), Gerd K. Müller (1929-) und Michael O. Dillon (1947-), so dass eine Neubearbeitung von Palaua erforderlich wurde. Darin bestand das Hauptziel der hier vorgestellten Dissertation. Für die Revision der Gattung wurden 618 Herbarbelege der wichtigsten Herbarien morphologisch untersucht. In den Jahren 2002 und 2003 wurden während mehrmonatiger Geländearbeiten in den Lomas-Standorten Perus und Chiles eigene botanische Aufsammlungen durchgeführt sowie Daten zur Verbreitung der Arten und ihrer Ökologie erfasst. Des Weiteren wurde aus dem mitgebrachten Samenmaterial eine mehrere Arten einschließende Lebendsammlung angelegt, mit deren Hilfe detaillierte Untersuchungen zur Blütenmorphologie und Karyologie realisiert werden konnten. Besonders schwierig gestaltete sich die Bearbeitung nomenklatorischer Fragestellungen, da viele der in Berlin (B) aufbewahrten Typusbelege von Weberbauer im Zweiten Weltkrieg zerstört wurden und somit eine Identifizierung vieler Arten problematisch war. Auch die Ermittlung des Typusbelegs der Gattung, den Cavanilles für seine Beschreibung vorliegen hatte, war mühsam. Neben dem Studium der Originalbelege und Protologe mussten auch die historischen Begebenheiten rekonstruiert und Reiseberichte zu den Aufsammlungen durchgesehen werden, um unter anderem den Holotypus der Gattung identifizieren zu können. Die eigenen taxonomischen Studien führten zur Festlegung von insgesamt 8 Lectotypen, 3 Epitypen and 2 Ikonotypen. Im Rahmen der morphologischen Untersuchungen wurden sämtliche taxonomisch relevanten Merkmale detailliert erfasst, einschließlich der verschiedenen Behaarungstypen. Neben den für die Malvaceen bekannten Sternhaaren, sind hier auch Drüsenhaare für Palaua beschrieben und charakterisiert worden. Die anatomischen Studien konzentrierten sich auf Blatt- und Samenmerkmale. Zusätzlich zu den morphologisch-anatomischen Studien wurden molekularsystematische Analysen durchgeführt. Zwei Methoden kamen dabei zur Anwendung: DNA-Sequenzierung und Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Letztere wurde eingesetzt, um insbesondere die Verwandtschaftsverhältnisse junger Taxa, die sich mit DNA-Sequenzdaten kaum auflösen lassen, zu rekonstruieren. In umfangreichen Versuchen stellte sich jedoch heraus, dass diese Methode keine reproduzierbaren Ergebnisse hervorbrachte, vermutlich bedingt durch den sehr hohen Polysaccharidgehalt der DNA-Template, wie es von Malvaceen her bekannt ist. Selbst die Erprobung zahlreicher Reinigungsschritte und –methoden ergab kein zufriedenstellendes Resultat. Für die phylogenetische Rekonstruktion wurden daher ausschließlich DNA-Daten verwendet, und zwar Kern-DNA (Internal Transcribed Spacer, ITS) und Plastiden-DNA (psbAtrnH Intergenic Spacer). Andere getestete Marker, wie z.B. die trnL-F-Region, wiesen zu wenig phylogenetisch informative Merkmale auf. Die morphologischen Analysen ergaben, dass Merkmale wie die Behaarung der Kelch- und Laubblätter, die Blattform und die Größe der Blüten besonders hilfreich für die Abgrenzung der Arten sind. Im Gegensatz zu anderen nah verwandten Gattungen ist die Form der Merikarpien in Palaua relativ uniform und daher als diakritisches Merkmal ungeeignet. Die Größe der Blüte nimmt in der Regel mit der Anzahl der Staubgefäße und Merikarpien zu. Die Palaua-Arten zeigen einige Anpassungen an ihren extrem trockenen Lebensraum. Die meisten Arten sind Annuelle und vollziehen eine rasche Entwicklung während der kurzen Zeit, in der ausreichend Feuchtigkeit verfügbar ist. Bei solchen Pflanzen findet man als Anpassung häufig eine Tendenz zur vermehrten Samenproduktion. In diesem Zusammenhang ließe sich auch die innerhalb des Verwandtschaftskreises ungewöhnliche Stellung der Merikarpien bei Palaua interpretieren, mit der es den Arten gelingt, mehr Samen als bei Arten mit einreihiger Merikarpienanordnung zu produzieren. Als weitere Anpassung findet man bei den ausdauernden Arten größtenteils eine sehr dichte Behaarung, wobei die Sternhaare mehrjähriger Arten wesentlich mehr Strahlen besitzen als die bei den einjährigen Arten. In der hier vorgestellten Revision der Gattung werden 15 Arten anerkannt: P. camanensis, P. dissecta, P. guentheri, P. inconspicua, P. malvifolia, P. modesta, P. mollendoensis, P. moschata, P. rhombifolia, P. sandemanii, P. tomentosa, P. trisepala, P. velutina, P. weberbaueri sowie die neu zu beschreibende P. spec. nov. Die morphologisch abweichende P. sandemanii wird aufgrund der molekularen Analysen ebenfalls zu Palaua gestellt. Die auch in der jüngeren Literatur meist als getrennte Arten aufgefassten P. concinna und P. moschata lassen sich nach Durchsicht des umfangreichen Materials nicht mehr als eigenständige Arten aufrechterhalten. Die vormals als chilenischer Endemit behandelte P. concinna wird hier in die Synonymie von P. moschata gestellt. Auch die peruanische P. micrantha var. hirsuta wurde in die Synonymie der zuvor rein chilenischen P. modesta verwiesen, was bedeutet, dass sich das Vorkommen von P. modesta nun auch auf Peru ausdehnt. Auf infraspezifischem Niveau wurden einige Varietäten und eine Form neu beschrieben, um die im Sammlungsmaterial vorhandene morphologische Variabilität besser zu gliedern. Das ist der Fall bei P. dissecta (2 Varietäten), P. tomentosa (1 Varietät), P. weberbaueri (1 Varietät) und P. mollendoensis (1 Form). Die neuen Taxa werden an anderer Stelle gültig publiziert. Die von Baker (1890) and Ulbrich (1909) gewählte infragenerische Klassifikation mit der Einteilung in die Sektionen Annuae (einjährige Arten) und Perennes (mehrjährige Arten) erweist sich als nicht haltbar. Weder die morphologischen noch die molekularen Daten bieten hierfür Unterstützung. Auch die von Hochreutiner (1956) vorgeschlagene Ausgliederung von P. trisepala als eigene Untergattung Rauhia, aufgrund des Vorkommens von lediglich drei statt fünf Kelchblättern, erscheint nicht sinnvoll. Abgesehen von ihrer reduzierten Kelchblattzahl (3 statt 5 Kelchblätter) ist diese Art morphologisch P. moschata und P. velutina sehr ähnlich. Die Aufstellung einer eigenen Untergattung würde die tatsächlichen Verwandtschaftsverhältnisse verwischen und vermutlich eine paraphyletische Einheit schaffen. Im Vergleich zur Anzahl der Kelchblätter sind Merkmale wie der Aufbau der Infloreszenzen, die Blütengröße und -farbe, sowie die Blattmorphologie (geteilte vs. ungeteilte Blätter) nützlicher für eine infragenerische Unterteilung. Die Form der Stipeln, die von Ulbrich (1909) für eine weitere Unterteilung seiner Sektionen verwendet wurde, ist weniger für eine infragenerische Gliederung als für die Abgrenzung mancher Arten geeignet. Formell wurde in der hiesigen Arbeit auf eine infragenerische Unterteilung verzichtet, da zunächst abgewartet werden soll, ob weiterführende molekularsystematische Untersuchungen nicht doch zu einer besseren Auflösung und auch Unterstützung der basalen Knoten der Palaua-Phylogenie führen. Andernfalls steht zu befürchten, dass wiederum künstliche Sippen geschaffen werden. Nichtsdestotrotz, sprechen die eigenen morphologischen und zum Teil auch die molekularen Daten für eine Gliederung der Gattung in drei taxonomische Einheiten (siehe unten). Die Ergebnisse der molekularen Analysen (kombinierte Analyse von ITS- und psbA-trnHSequenzen) ergaben drei mehr oder weniger gut gestützte Kladen innerhalb einer sehr gut gestützten monophyletischen Palaua. Interessanterweise bildeten die Arten P. inconspicua und P. modesta eine Klade (88% Jackknife-Unterstützung, JK), die die Schwestergruppe zu den restlichen Arten der Gattung darstellt. Beide Arten haben eine von der restlichen Gattung abweichende Blütenmorphologie (kleine Petalen, weniger Merikarpien) und die razemösen Infloreszenzen enthalten neben Einzelblüten in den Achseln der Trägblätter auch 2-4-blütige Teilinfloreszenzen, an denen die Blüten kein Tragblatt aufweisen. Die zweite Klade (JK 97%) beinhaltet die Arten des P. dissecta-Komplexes, dessen Arten sich durch tief geteilte Blätter und große, auffällig rosarot bis violett gefärbte Blüten mit zahlreichen Merikarpien auszeichnen. In der dritten Klade (JK 73%) bildet P. guentheri die Schwestergruppe zu den restlichen Arten. Die hier vereinten Arten sind durch den Besitz ungeteilter Blätter und meist großer, auffällig rosarot bis violett gefärbter Blüten mit zahlreichen Merikarpien gekennzeichnet. Eine Ausnahme bildet P. guentheri, die geteilte Blätter hat und von daher Übereinstimmungen mit den Arten um P. dissecta aufweist. Sie weicht jedoch von den Arten des P. dissecta-Komplexes aufgrund ihrer geringeren Blütengröße und der geringeren Merikarpienanzahl ab. Außerdem sind die Blätter meist stärker reduziert und weniger regelmäßig geteilt als jene. Allerdings bedarf die Stellung von P. guentheri innerhalb der Gattung noch einer eingehenderen Überprüfung mit zusätzlichen (molekularen) Daten, da die Unterstützung für diese Klade vergleichsweise moderat ausfällt. Interessanterweise schließt diese Klade auch die aberrante P. sandemanii ein. Eine phylogenetische Rekonstruktion der Karpellanordnung ergab, dass die einreihige Anordnung der Karpelle in P. sandemanii vermutlich sekundär in Palaua entstanden ist. Allerdings zeigten Hypothesentests (Templeton-Test, Shimodaira-Hasegawa-Test), dass die Datengrundlage nicht ausreichend robust ist, um auch die Alternativhypothese einer sekundären Entstehung der unregelmäßig übereinander angeordneten Karpelle, wie sie die restlichen Arten der Gattung kennzeichnen, zu verwerfen. Innerhalb der Integrifolia-Klade lassen sich außerdem zwei Gruppen von Arten morphologisch deutlich unterscheiden. Die erste Gruppe besteht aus den einjährigen P. malvifolia und P. rhombifolia, die sich durch ihr fast kahles Indumentum auszeichnen und in Nord- bis Zentral-Peru vorkommen. Die zweite Gruppe, gebildet von den ausdauernden P. moschata, P. trisepala und P. velutina, ist durch ein samtiges Indumentum gekennzeichnet. Während sich P. moschata über das gesamte Verbreitungsgebiet der Gattung erstreckt, kommen die anderen Arten nur in Südperu vor. Die Chromosomenzahl von Palaua ist ein wichtiges Merkmal und diente Bates (1968) für deren Zuordnung zur Sphaeralcea-Allianz. Bis dato sind Chromosomenzählungen nur für zwei Arten bekannt gewesen: P. rhombifolia und P. moschata (beide mit 2n = 10 Chromosomen). In dieser Arbeit wurden weitere Zählungen durchgeführt und es wurde bestätigt, dass es neben diploiden auch tetraploide Arten mit 2n = 20 Chromosomen gibt. Polyploidie scheint dabei auf die ausdauernden Arten beschränkt zu sein. In manchen Arten, insbesondere in denjenigen des P. dissecta-Komplexes und in P. tomentosa, findet man eine ausgeprägte phänotypische Variabilität, die die Abgrenzung derselben stark erschwert. Ohne die Ursachen abschließend klären zu können, erscheint diese Variabilität zumindest teilweise als Ergebnis von Hybridisierung, Introgression und Polyploidisierung zu sein. In Bezug auf die Biogeographie der Gattung, zeigt sich, dass 11 Palaua-Arten endemisch für Peru sind und 4 Arten auch in Chile vorkommen. Das Verbreitungszentrum von Palaua ist das Gebiet der Lomas im Süden Perus (Departments Arequipa, Moquegua, Tacna), in dem 12 der 15 Arten auftreten. Die Blütezeit der Palaua-Arten variiert von Jahr zu Jahr, abhängig davon, wie viel Nebelfeuchtigkeit in der südhemisphärischen Winter-/Frühlingszeit für die Pflanzen zur Verfügung steht. Die Entstehung der Nebel variiert außerdem von Norden nach Süden, so dass sich die Blühphasen entlang dieses Gradienten verschieben. So liegt die Blütezeit in Nordperu zwischen Juli und August, in Zentral-Peru zwischen August und September und in Südperu und Chile zwischen Oktober und November. Abweichungen von diesem Schema entstehen vor allem in El Niño-Jahren, in denen auch während des südhemisphärischen Sommers die Lomaspflanzen blühen. Die Lomasvegetation ist eine bedrohte Pflanzenformation, deren Artenvielfalt bisher aber nur in Form eines recht kleinen Naturreservats geschützt wird. Da sich viele Lomasstandorte in der Nähe von Siedlungen befinden, sind etliche der lokal nur begrenzt vorkommenden Arten in ihrem Bestand bedroht. Dies betrifft insbesondere P. rhombifolia und P. malvifolia, deren Verbreitungszentrum im Gebiet der Hauptstadt Lima liegt. Eigene Beobachtungen am Standort haben zudem bestätigt, dass einige Populationen dieser Arten durch von Käfern verursachter Herbivorie nahezu vollständig zerstört werden. Weitere Schutzmaßnahmen zum Erhalt der Palaua-Arten (wie auch der anderen Lomas-Arten) wären daher dringend geboten.
Im ersten Teil der Arbeit wurde eine genetische Disposition für Vorhofflimmern (VHF) untersucht. Der Einzelnukleotidpolymorphismus ("single nucleotide polymorphism", SNP) 38G/S befindet sich im N-Terminus der ß-Untereinheit KCNE1. Diese ß-Untereinheit konstituiert gemeinsam mit der alpha-Untereinheit KCNQ1 die langsame Komponente des verzögerten Gleichrichterstromes, IKs. Die ß-Untereinheit hat hierbei eine modulierende Funktion. Frühere Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit der transmembranären Domäne und dem C-Terminus. Über die Rolle des N-Terminus war bislang wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Aufgabe des N-Terminus bei der Modulation der alpha-Untereinheit zu identifizieren. Außerdem sollte festgestellt werden, welche Aminosäuren hierbei besonders von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden diverse Konstrukte synthetisiert. Für das Konstrukt delta1-38’ wurden die Aminosäuren 1-38 und damit der Großteil des N-Terminus entfernt. Das Konstrukt "linker" enthält anstelle des Glyzins oder Serins an Position 38 fünf Alanine. In der Nähe der von dem SNP betroffenen Aminosäure befinden sich des Weiteren drei Arginine, die mit jeweils einem Alanin substituiert wurden. Für alle Versuche diente die nicht VHF-assoziierte Variante des SNPs als Kontrolle. Alle Konstrukte konnten erfolgreich heterolog exprimiert werden und gleichermaßen mit der alpha-Untereinheit immunopräzipitiert werden. Die aus der Co-Transfektion von KCNQ1 und KCNE1 resultierende Stromdichte wurde mittels "Patch-clamp"-Technik untersucht. Im Vergleich zum Kontrollstrom (KCNQ1 + KCNE1-38S) waren die Ströme aller anderen Gruppen während De- und Repolarisation signifikant kleiner. Zellfraktionierung und konfokale Mikroskopie zeigten, dass im Vergleich zur Kontrolle alle anderen Konstrukte eine verminderte Plasmamembranlokalisation aufwiesen. Die Aufgabe des N-Terminus liegt offensichtlich im Transport beider Untereinheiten an die Plasmamembran und/oder der Verankerung dort. Sowohl die Aminosäure in Position 38 als auch die drei N-terminalen Arginine in der Nähe scheinen für den hier gesuchten Mechanismus von Bedeutung zu sein. Zukünftige Experimente könnten beispielsweise 3D-Simulationen der Proteinfaltung beinhalten, um die potentielle Membranverankerung weiter zu untersuchen. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte erworbene elektrophysiologische Veränderungen im Rahmen von VHF am Beispiel der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IKACh. Es sollten die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen für die Heraufregulierung von IK1 und IKACh bei VHF untersucht werden. Alle Experimente wurden an humanem Gewebe des linken Vorhofs durchgeführt. Das Gewebe stammt von VHF-Patienten, die sich einer Mitralklappen-Operation unterzogen. Als Kontrolle wurde Gewebe von Patienten im Sinusrhythmus (SR) verwendet. Zunächst wurde untersucht, ob transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Veränderungen oder funktionelle Effekte der Heraufregulierung der Ströme zugrunde liegen. Entsprechend wurde die Proteinexpression mittels Western Blot quantifiziert. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte per Realtime-PCR. Veränderungen für IK1 konnten sowohl auf mRNA- als auch auf translationaler Ebene beobachtet werden. Protein- und mRNA-Expression von Kir2.1, der zugrunde liegenden Proteinuntereinheit, waren bei VHF signifikant erhöht; die Expression der inhibitorischen miR-1 war reduziert. Die Bestimmung der Protein- und mRNA-Expression der zugrunde liegenden Proteinuntereinheiten für den Strom IKACh zeigte dagegen keinen Unterschied zwischen Gewebe von Patienten mit VHF und SR. Eine funktionelle Regulierung schien daher möglich. Die Expression der IKACh modulierenden Proteine Calmodulin und G alpha i-3 unter VHF zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der SR-Gruppe. Es war eine Tendenz zur Reduktion des inhibierenden G alpha i-3 zu beobachten. Die Regulierung von IKACh,c bei VHF bleibt in zukünftigen Arbeiten zu untersuchen. Ein möglicher Versuch wäre, therapeutisch in die Regulation der Kir-Untereinheiten einzugreifen, um das VHF-unterstützende, elektrische "Remodeling" des IK1 zu verhindern.
The power to dissociate : molecular function of the twin-ATPase ABCE1 in archaeal ribosome recycling
(2010)
The eukaryotic glyoxalase system consists of two enzymatic components, glyoxalase I (lactoylglutathionelyase) and glyoxalase II (hydroxyacylglutathione hydrolase). These enzymes are dedicated to the removal of toxic alpha-oxoaldehydes like methylglyoxal (MG). MG is formed as a by-product of glycolysis and MG toxicity results from its damaging capability leading to modifications of proteins, lipids and nucleic acids. An efficient removal of MG appears to be essential to ensure cellular functionality and viability. Here we study the effects of the genetic modulation of genes encoding the components of the glyoxalase system in the filamentous ascomycete and aging model Podospora anserina. Overexpression of PaGlo1 leads to a lifespan reduction on glucose rich medium, probably due to depletion of reduced glutathione. Deletion of PaGlo1 leads to hypersensitivity against MG added to the growth medium. A beneficial effect on lifespan is observed when both PaGlo1 and PaGlo2 are overexpressed and the corresponding strains are grown on media containing increased glucose concentrations. Notably, the double mutant has a ‘healthy’ phenotype without physiological impairments. Moreover, PaGlo1/PaGlo2_OEx strains are not long-lived on media containing standard glucose concentrations suggesting a tight correlation between the efficiency and capacity to remove MG within the cell, the level of available glucose and lifespan. Overall, our results identify the up-regulation of both components of the glyoxalase system as an effective intervention to increase lifespan in P. anserina. Key words: Podospora anserina, aging, lifespan, glycation, glucose, methylglyoxal, advanced glycation end products
Background: Studies on the development of the nervous system and the musculature of invertebrates have become more sophisticated and numerous within the last decade and have proven to provide new insights into the evolutionary history of organisms. In order to provide new morphogenetic data on opisthobranch gastropods we investigated the neuromuscular development in the nudibranch Aeolidiella stephanieae Valdez, 2005 using immunocytochemistry as well as F-actin labelling in conjunction with confocal laser scanning microscopy (cLSM). Results: The ontogenetic development of Aeolidiella stephanieae can be subdivided into 8 stages, each recognisable by characteristic morphological and behavioural features as well as specific characters of the nervous system and the muscular system, respectively. The larval nervous system of A. stephanieae includes an apical organ, developing central ganglia, and peripheral neurons associated with the velum, foot and posterior, visceral part of the larva. The first serotonergic and FMRFamidergic neural structures appear in the apical organ that exhibits an array of three sensory, flask-shaped and two non-sensory, round neurons, which altogether disappear prior to metamorphosis. The postmetamorphic central nervous system (CNS) becomes concentrated, and the rhinophoral ganglia develop together with the anlage of the future rhinophores whereas oral tentacle ganglia are not found. The myogenesis in A. stephanieae begins with the larval retractor muscle followed by the accessory larval retractor muscle, the velar or prototroch muscles and the pedal retractors that all together degenerate during metamorphosis, and the adult muscle complex forms de novo. Conclusions: Aeolidiella stephanieae comprises features of the larval and postmetamorphic nervous as well as muscular system that represent the ground plan of the Mollusca or even the Trochozoa (e. g. presence of the prototrochal or velar muscle ring). On the one hand, A. stephanieae shows some features shared by all nudibranchs like the postmetamorphic condensation of the CNS, the possession of rhinophoral ganglia and the lack of oral tentacle ganglia as well as the de novo formation of the adult muscle complex. On the other hand, the structure and arrangement of the serotonergic apical organ is similar to other caenogastropod and opisthobranch gastropods supporting their sister group relationship.
The Opisthobranchia comprise highly specialized marine gastropods and have therefore been subject to diverse investigations covering various biological disciplines. However, a robust phylogeny of these gastropods is still lacking and several subclades have only been rarely studied. Furthermore, crucial aspects for the evolution of Opisthobranchia have not been comparatively analysed. Therefore, the aim of the present thesis is to gain new insights into the phylogeny of the Opisthobranchia with special focus on certain critical groups (Pleurobranchomorpha, Acteonoidea) and to assess several crucial features of the evolution of the investigated clades. The combination of four different gene markers (18S rDNA, 28S rDNA, 16S rDNA and CO1) and modern molecular systematic analysis tools were used to construct phylogenetic hypotheses focussing on Opisthobranchia as a whole as well as Pleurobranchomorpha and Acteonoidea in more detail. Intriguing new aspects of phylogeny and evolution of Opisthobranchia were revealed. First of all, monophyly of Opisthobranchia is definitely rejected based on the present data, while monophyly of Euthyneura (comprising Opisthobranchia and Pulmonata) is supported. Monophyly of opisthobranch subclades is confirmed for Nudipleura (as well as its constituting groups Nudibranchia and Pleurobranchomorpha), Umbraculida, Pteropoda (as well as subclades Thecosomata and Gymnosomata) and Acochlidiacea, for Cephalaspidea (if Runcinacea is regarded as a separate clade) and for Sacoglossa (if Cylindrobulla is accepted as an Oxynoacea). Aplysiomorpha are rendered paraphyletic due to the position of Akera bullata, but this result needs further investigation and should be considered with caution. The Nudipleura are found as the first single offshoot of the Euthyneura implying an early evolutionary separation of the last common ancestor of this clade. The remaining taxa form two main clades, one comprising the opisthobranch subgroups Umbraculida, Cephalaspidea, Aplysiomorpha and Pteropoda, while the other contains the pulmonate taxa and the opisthobranch Sacoglossa and Acochlidiacea. The interrelationships within these clades remain largely unresolved due to low statistical support values. However, a possible sister group relationship of Acochlidiacea and Eupulmonata receives statistical support. Opisthobranchia display various highly specific adaptations to diverse food sources. However, evolution of these specialized traits has never been assessed at an analytical level. The current thesis reconstructs the evolution of dietary preferences with novel methodologies based on the newly proposed phylogenetic hypothesis. Reconstruction of dietary evolution revealed herbivory as the ancestral condition in Euthyneura implying that carnivory evolved at least five times independently in the diverse lineages. The first comprehensive molecular phylogenetic hypothesis of the Pleurobranchomorpha could not reveal monophyly of the two main subclades Pleurobranchaeidae and Pleurobranchidae. This is due to the position of a single taxon (Euselenops luniceps) which is assigned to the Pleurobranchaeidae based on morphology but clusters within Pleurobranchidae in the current hypothesis. Furthermore, the tribe Berthellini and the genus Berthella are rendered paraphyletic by the current analyses. The results of molecular systematic analyses were used to reconstruct historical biogeography of Pleurobranchomorpha. Four different methodological approaches were applied yielding ambiguous results for Pleurobranchomorpha. However, the Pleurobranchidae comprising about 80% of the extant Pleurobranchomorpha most probably derived from an Antarctic origin. Dating of the phylogenetic tree via molecular clock methods yielded divergence of Pleurobranchidae into the Antarctic Tomthompsonia antarctica and the remaining species in Early Oligocene. Afterwards the latter underwent rapid radiation during Oligocene and Early Miocene. This divergence event coincides with two major geological events in the Antarctic region. On the one hand, the onset of glaciation and on the other hand the opening of the Drake Passage with concurrent formation of an Antarctic circumpolar current (ACC). I suppose that these sudden and dramatic changes in climate and palaeogeography probably accounted for migration of the last common ancestor of Pleurobranchidae (besides Tomthompsonia) into warmer regions via the Drake Passage to the Western Atlantic and Eastern Pacific and via the South Tasman Rise to the Indo-West Pacific. Furthermore, the ACC may have triggered larval dispersal to the Eastern Atlantic. The phylogenetic position of Acteonoidea has been a matter of debate for decades and they have long been considered as basal opisthobranchs. Results of the present thesis rather support placement in “Lower Heterobranchia” as sister group of Rissoelloidea. The current division of Acteonoidea into three families has never been investigated by means of phylogenetic methods. Thus, this thesis provides the first comprehensive investigation of this clade challenging present division into three families. The results rather support division into two main clades with the monogeneric Bullinidae clustering within Aplustridae doubting its separate status. Additionally, Rictaxis punctocaelatus which has been assigned to Acteonidae clusters basal to Aplustridae rendering Acteonidae paraphyletic. Since information on morphology of R. punctocaelatus was lacking until now, I conducted the first detailed investigation on morphology and histology of this species in order to reassess the unexpected molecular systematic placement. Character tracing analyses revealed similarities with both acteonoidean families implying an intermediate position of this species which might be assigned to a separate family in the future. Furthermore, the common features of Acteonidae and Rictaxis (massive shell, small foot, anterior mantle cavity opening, and absence of oral gland) are possibly plesiomorphic for the whole Acteonoidea. In summary, the results of the present thesis provide valuable novel insights into the phylogeny and evolution of the Opisthobranchia by employing state-of-the-art approaches of molecular systematics and evolutionary reconstruction. Thus, diverse hypotheses on opisthobranch phylogeny and evolution were either supported or rejected as well as novel hypotheses proposed which offer the basis for further research on these extraordinary gastropods.
Oomyceten – schön, nützlich und gefährlich : sie sind überall zu finden und dennoch kaum bekannt
(2010)
Auf Pflanzen sind sie klein, unscheinbar und leicht verwechselbar. Den Betrachter betören sie beim Blick ins Mikroskop durch wunderschön geformte Sporenträger. Doch Oomyceten, die lange Zeit mit Pilzen verwechselt wurden, können als Pflanzenschädlinge beträchtlichen landwirtschaftlichen Schaden anrichten. Die einzelnen Arten zu unterscheiden und ihre Wirtspflanzen zu kennen, ist eine Voraussetzung dafür, ihre Verbreitung zu kontrollieren. Denn auch in Europa könnten exotische Arten aufgrund der Erderwärmung heimisch werden – mit erwünschten und unerwünschten Folgen.
Fucoxanthin chlorophyll proteins (Fcps), the light-harvesting antennas of heterokont algae, are encoded by a multigene family and are highly similar with respect to their molecular masses as well as to their pigmentation, making it difficult to purify single Fcps. In this study, a hexa-histidine tag was genetically added to the C-terminus of the FcpA protein of the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum. A transgenic strain expressing the recombinant His-tagged FcpA protein in addition to the endogenous wild type Fcps was created. This strategy allowed, for the first time, the purification of a specific, stable trimeric Fcp complex. In addition, a pool of various trimeric Fcps was also purified from the wild-type cells using sucrose density gradient ultracentrifugation and gel filtration. In both the His-tagged and the wild-type Fcps, excitation energy coupling between fucoxanthin and chlorophyll a was intact and the existence of a chlorophyll a/fucoxanthin excitonic dimer was demonstrated using circular dichroism spectroscopy. Mass spectrometric analyses of the trimeric His-tagged complex indicated that it is composed of FcpA and FcpE polypeptides. It is confirmed here that a trimer is the basic organizational unit of Fcps in P. tricornutum. From circular dichroism spectra, it is proposed that the organization of the pigments on the polypeptide backbone of Fcps is a conserved feature in the case of chlorophyll a/c containing algae.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) rücken in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering immer mehr in den Vordergrund. Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen bergen sie keine ethischen Probleme und sind leicht zu isolieren. Die ursprünglich aus Knochenmark gewonnenen MSC können inzwischen aus vielen verschiedenen Quellen wie Nabelschnurblut [Kern et al. 2006], Dentalgewebe [Huang et al., 2009], Plazenta [Huang et al., 2009], Haut [Salvolini et al., 2009] und aus Fettgewebe isoliert werden [Zuk et al., 2001]. Der Immunphänotyp variiert zwischen den aus verschiedenen Quellen gewonnenen MSC nur gering. Die Gewinnung aus Fettgewebe hat den Vorteil, dass eine minimal invasive Prozedur und eine hohe Ausbeute zusammenkommen. Die Stammzellen aus Fettgewebe (ASC) können in der Therapie eingesetzt werden und zu der Regeneration von Geweben nach Verletzungen beitragen [Wong et al., 2008; Poulsom et al., 2001]. Der genaue Mechanismus mit dem die Stammzellen wirken ist allerdings noch nicht geklärt. Sowohl die Integration der MSCs in das Gewebe als auch ein rein parakriner Einfluss wurden nachgewiesen. Klar ist nur, dass ein positiver Effekt von einer Therapie mit MSC ausgeht [Mizuno et al., 2009]. In vivo sind Zellen verschiedenen Einflüssen ausgesetzt, die den Zustand einer Zelle bestimmen. Lösliche Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Vitamine wirken dabei ebenso wie die extrazelluläre Matrix und Zell-Zell-Kontakte auf die Zelle ein, die mit Wachstum, Zellform, Differenzierung oder Ähnlichem antwortet. In meiner Arbeit wurden daher drei unterschiedliche Ansätze für die in vitro Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen untersucht: (1) die Wirkung von löslichen Faktoren, die dem Medium zugesetzt wurden, (2) der Einfluss der extrazellulären Matrix aus zum einen Tubuluszellen und zum anderen Matrigel und (3) die Co-Kultur, bei der auch direkter Zell-Zell-Kontakt untersucht wurde. Damit, und mit einer Kombination der einzelnen Bereiche, sollte das natürliche Umfeld der Tubuluszellen simuliert werden und epitheliale Differenzierung initiieren. Die Zugabe von ATRA, ActA und BMP-7 führte zu einer Differenzierung in die epitheliale Richtung, während die extrazelluläre Matrix aus Tubuluszellen nicht dafür ausreichte. Matrigel hingegen, konnte besonders in der Verbindung mit konditioniertem Medium eine Differenzierung induzieren. Die indirekte Co-Kultur über Membraneinsätze, über die u. a. der parakrine Einfluss der Tubuluszellen untersucht werden sollte, führte zu morphologischen Veränderungen der ASC, die aber nicht mit den hier verwendeten epithelialen Markern nachgewiesen werden konnte. Der direkte Zell-Zell-Kontakt zeigte eine Reduktion des Oberflächen Markers CD90 verbunden mit einer Erhöhung der Expression von CK18. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Zellen ist also auf drei verschiedenen Wegen möglich. Zwischen verschiedenen Isolationen von ASC traten hohe Schwankungen bezüglich der Expression von Oberflächenmarkern und Proliferation auf, was auch einen Einfluss auf die Differenzierung haben könnte. Ein Grund dafür könnte die Heterogenität von ASC sein. Zur Reduzierung dieser wurden daher ein Waschschritt eine Stunde nach Kulturbeginn und eine immunomagnetische Isolation mit CD49a, CD90, CD105 oder CD271 durchgeführt. Die immunomagnetische Aufreinigung führte nur zu einer leichten Verbesserung der Heterogenität, aber zu einer sehr geringen Zellausbeute. Für den Waschschritt konnte gezeigt werden, dass die Expression der Stammzellmarker Nestin, oct4 und sall1 signifikant erhöht und Desmin und smA Expression reduziert wurden, was auf eine Reduktion der Heterogenität hindeutete. Der zusätzliche Waschschritt kann also schnell und unkompliziert die Heterogenität der ASC reduzieren. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen durch den Einfluss von Zell-Zell-Kontakten zeigt vielversprechende Ansätze und sollte weiter verfolgt werden. Eine verlängerte Kulturdauer sollte dabei angestrebt werden, da auch die adipogene Differenzierung zumeist erst nach 14 bis 21 Tagen nachweisbar war. Dafür müsste die Markierung mit CellTracker länger nachweisbar sein. Eine Inhibierung der Proliferation könnte die Grundlage dazu liefern. Um den Stand der Differenzierung in die epitheliale Richtung nachzuweisen, könnten andere epitheliale Marker, Ionenkanäle, die erst spät in den Tubuluszellen angelegt werden, und funktionelle Mechanismen untersucht werden. Das Zusammenspiel der verschiedenen Einflüsse auf die Zelle könnte ebenfalls noch genauer untersucht werden. Für die Regenerative Medizin ist es aus Gründen der GMP sinnvoller, die Zellen nur mit dem Zusatz an löslichen Faktoren zu differenzieren. Der Ansatz mit ATRA, ActA und BMP-7 scheint sehr vielversprechend zu sein und könnte in dieser Hinsicht weiter ausgebaut werden.
Gepaarte assoziative Magnetstimulation (PAS) kann im primären menschlichen Motorkortex (M1) sowohl langzeitpotenzierungs- (LTP) als auch langzeitdepressionsähnliche (LTD) Erregbarkeitsveränderungen hervorrufen. Dies kann durch die Untersuchung magnetisch evozierter Potentiale (MEP) erfasst werden. Dagegen ist wenig über die Auswirkungen von PAS auf willkürliche Aktivität des motorischen Kortex bekannt. Im ersten Experiment haben wir bewegungsabhängige kortikale Potentiale (MRCP) bei zehn gesunden Probanden im EEG registriert, um die willkürliche Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung zweier motorischer Aufgaben zu erfassen. Die Probanden mussten dabei entweder den Daumen abduzieren (Hauptmuskel: Musculus abductor pollicis brevis, APB) oder das Handgelenk strecken (Hauptmuskel: Musculus extensor carpi radialis, ECR). Die Amplituden der motorisch evozierten Potentiale im APB wurden dabei durch PASLTP gesteigert, durch PASLTD vermindert und blieben bei PAScontrol unverändert. Im Gegensatz dazu wurden sie im ECR durch keine PAS-Bedingungen verändert. PASLTP verminderte die Negativität der MRCP während des späten Bereitschaftspotentials (-500 bis 0 ms vor Bewegungsbeginn) nur in der APB-Aufgabe. Diese Veränderungen zeigten sich hauptsächlich über zentralen Elektroden kontralateral zur bewegten Hand. Dieser Effekt korrelierte negativ mit dem durch PASLTP induzierten MEP-Anstieg im APB. PASLTD und PAScontrol hatten dagegen keinen Einfluss auf die MRCP Amplituden. Unsere Ergebnisse deuten auf eine spezifische Wechselwirkung von PAS mit willkürlicher Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung motorischer Aufgaben hin. Dies könnte durch ein Zusammenspiel aus erhöhter Exzitabilität von M1 und einer unterbrochenen effektiven Konnektivität zwischen prämotorischen Arealen und M1 erklärt werden. Die Modulation des dorsolateralen prämotorischen Kortex (PMd) durch repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS) verändert die kortikospinale Erregbarkeit in M1. Die Auswirkungen von PMd-rTMS auf vorbereitende Prozesse für willkürliche Bewegungsabläufe sind jedoch unklar. Contingent negative variation (CNV) repräsentiert im EEG kortikale Vorbereitungsprozesse äußerlich getriggerter Bewegungen während das Bereitschaftspotential (BP) Vorbereitungsprozesse intern getriggerter Bewegungen repräsentiert. Im zweiten Experiment wurden CNV und BP jeweils vor und nach PMd-rTMS untersucht. Das Experiment bestand aus drei CNV-Versuchsblöcken mit insgesamt 243 Durchgängen. Dabei mussten die Probanden auf visuelle Anweisung hin eine zwei-Item Finger-Bewegungssequenz durchführen. RTMS wurde sowohl mit 1 Hz als auch mit 5 Hz bei einer Intensität von 110% der aktiven motorischen Schwelle (AMT) unter individueller MR-Navigation appliziert. Die Erfassung des BP erfolgte während der Durchführung derselben motorischen Aufgaben, allerdings bekamen die Probanden keine Anweisungen. Die Durchschnittsamplituden der frühen und späten Komponente von CNV (CNV1:1500-500 ms vor dem Startsignal (S2); CNV: 500-0 ms vor S2) und der frühen und späten Komponente des BP (BP1: 1500-500 ms vor EMG Beginn; BP2: 500-0 ms vor EMG-Beginn) wurden quantitativ für 25 zentrale Elektrodenpositionen verglichen. CNV2 zeigte eine signifikante Bahnung über dem frontal-zentralen Bereich nach 1 Hz PMd-rTMS, blieb aber unverändert nach 5 Hz PMd-rTMS. CNV1, BP1 und BP2 blieben durch 1 Hz und 5 Hz PMd-rTMS unbeeinflusst. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der dominante PMd eine wichtigere Rolle in der Vorbereitung extern getriggerter Bewegungen spielt, als dies bei intern getriggerten Bewegungen der Fall zu sein scheint. Die CNV2-Antwort könnte eine intensive Interaktion innerhalb des menschlichen motorischen Kontrollnetzwerks anzeigen, die möglicherweise auf kompensationsähnlichen Mechanismen beruht.
Echoortende Fledermäuse verfügen über ein hochauflösendes Gehör. Sie können anhand einer geringen Zeitverzögerung zwischen ausgesendetem Echoortungsruf und dem Echo die Entfernung von Objekten bestimmen. Je nach Spezies und deren spezifischer Ortungsstrategie gibt es unterschiedliche Typen von Ortungslauten. Die meisten Fledermäuse verwenden frequenzmodulierte (FM) Ortungssignale und zählen zu den FM-Fledermäusen. CF-FM-Fledermäuse verwenden dagegen zusätzlich zu FM-Komponenten konstantfrequente Signalelemente (CF-FM). Diese sind besonders zur Detektion flügelschlagender Beuteinsekten in dichter Vegetation von Vorteil. Im auditorischen Kortex (AC) von Fledermäusen existieren so genannte FM-FM-Neurone, die auf die Auswertung der Verzögerungszeiten zwischen Rufaussendung (FM-Ruf) und Echo (FM-Echo) spezialisiert sind. Eine Besonderheit von FM-FM-Neuronen ist, dass sie bei CF-FM-Fledermäusen systematisch, entsprechend ihrer bevorzugten Echoverzögerungen, im AC angeordnet sind. Somit sind die FM-FM-Neurone chronotop entlang einer rostro-kaudalen Achse organisiert. Solche FM-FM-Neurone wurden bislang auch in FM-Fledermäusen nachgewiesen, jedoch waren sie nicht chronotop organisiert. Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war es, FM-FM-Neurone bei der FM-Fledermaus Carollia perspicillata hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrer räumlichen Anordnung im AC zu untersuchen. Die Befunde der vorliegenden Studie an C. perspicillata zeigen, dass alle untersuchten Neurone im dorsalen AC sowohl auf hochfrequente Reintöne als auch auf FM-FM-Stimulation reagierten. Die Echoverzögerungen, auf welche die Neurone im Areal reagierten, lagen zwischen 1 und 32 ms, was einer Distanz zwischen Fledermaus und Objekt von 16 cm bis 5,3 m entspricht. Überraschenderweise waren die kortikalen FM-FM-Neurone bei C. perspicillata chronotop organisiert, ähnlich wie bei insektenfressenden CF-FM-Fledermäusen. Warum eine chronotope Anordnung von FM-FM-Neuronen im AC bei CF-FM-Fledermäusen von Nutzen sein kann, ist nicht geklärt. Bislang wurde vermutet, dass eine systematische Anordnung die Zeitverarbeitungsprozesse optimiert und vor allem beim Insektenjagen in dichter Vegetation vorteilhaft sein könnte. Der vorliegende Befund ist außergewöhnlich, da er zeigt, dass auch bei der überwiegend frugivoren Fledermaus C. perspicillata FM-FM-Neurone chronotop angeordnet sind, und damit verdeutlicht, dass der funktionelle Rückschluss hinsichtlich des Beutefangs neu diskutiert werden muss. Neben der Charakterisierung von FM-FM-Neuronen bei adulten C. perspicillata war Ziel der vorliegenden Arbeit, die postnatale Entwicklung des AC im Hinblick auf die Frequenzrepräsentation zu untersuchen. Während der Entwicklung von C. perspicillata wurden drei wichtige Veränderungen festgestellt: (1) Das Audiogramm zeigt, dass der Hörbereich von Neugeborenen charakteristische Frequenzen (CF) zwischen 15 und 80 kHz aufweist. Dieser Frequenzbereich entspricht etwa 72% des Hörbereichs von Adulten. Während der ersten vier postnatalen Entwicklungswochen findet eine Frequenzverschiebung um etwa 0,4 Oktaven hin zu höheren Frequenzen statt. Insgesamt erhöhen sich die CF der Neurone im dorsalen AC von Neugeborenen bis hin zu Adulten um 30 kHz. (2) Die Sensitivität der hochfrequenten Neurone nimmt während der ersten postnatalen Woche um 15 dB zu und bleibt ab dieser Entwicklungsphase relativ konstant. (3) Die Sensitivität der tieffrequenten Neurone im ventralen AC nimmt im Laufe der Entwicklung um etwa 30 dB zu. Die CF der tieffrequenten Neurone sinken unerwartet während der postnatalen Entwicklung von Juvenilen zu Adulten um etwa 10 kHz. Diese Ergebnisse könnten auf eine bidirektionale Ausreifung der Cochlea hinweisen. Eine dritte ontogenetische Teilstudie der vorliegenden Arbeit befasste sich erstmalig mit den FM-FM-Neuronen und deren Organisation während der postnatalen Entwicklung. Die Befunde zeigen, dass während der Ontogenese drei wichtige Modifikationen auftreten: (1) Bereits bei Neugeborenen liegt der Anteil an FM-FM-Neuronen bei 21% im Vergleich zur Aktivität auf Reintöne. Dieser Anteil nimmt in der ersten Entwicklungswoche auf 56% zu und steigt einhergehend mit der beginnenden Flugtüchtigkeit der Tiere in der dritten Entwicklungswoche abrupt auf 84%. (2) Bei Neugeborenen werden im Vergleich zu älteren Entwicklungsphasen ausschließlich Entfernungen zwischen Fledermaus und Objekt von 50 cm bis 2,5 m auf neuronaler Ebene mittels FM-FM-Neurone codiert. Bereits nach der ersten postnatalen Woche sind die CD ähnlich verteilt wie bei adulten Tieren. Die Sensitivität an den CD nimmt während der Entwicklung vom Neugeborenen zum Adulten um etwa 20 dB zu. (3) Bereits bei Neugeborenen sind die FM-FM-Neurone im dorsalen AC chronotop angeordnet und über alle Altersgruppen hinweg bleibt die Chronotopie bestehen. Die Befunde der vorliegenden Studie zeigen erstmalig, dass die kortikalen Zeitverarbeitungsareale und die Chronotopie pränatal angelegt werden.
Neuere Daten weisen p53 eine wichtige Rolle in der Verarbeitung von Mangelsignalen zu und deuten darauf hin, dass p53-abhängige molekulare Mediatoren des Warburg-Effektes Glukoseverbrauch und mitochondriale Funktion regulieren. Wir stellten deshalb die Hypothese auf, dass p53-wildtyp (p53wt) in Gliomzellen den metabolischen Bedarf reduzieren kann, der durch deregulierte Signaltransduktionsprozessen unter Mangelbedingungen zu Stande kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die shRNA-vermittelte p53-Gensuppression als auch die Temperatur-sensitive dominant-negative p53V135A Mutante in humanen p53wt-Gliomzellen Glukoseverbrauch und Laktatproduktion erhöht, den Sauerstoffverbrauch reduziert und den Hypoxie-induzierten Zelltod steigert. Überdies konnte beobachtet werden, dass eine zelluläre p53-Suppression die Expression von Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), eines Effektors, der in der Atmungskette benötigt wird, reprimiert. Die Restoration von SCO2 in p53wt-defizient-Zellen konnte Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und Sauerstoffverbrauch wieder normalisieren, und vermittelte zugleich eine Resistenz gegenüber Hypoxie von Rotenone, einem Inhibitor des Komplex I der Atmungskette, abhängige Weise. Dies zeigte, dass die SCO2-vermittelten Effekte von einer intakten oxidativen Phosphorylierung abhängig waren. Schließlich vermittelte eine Gensuppression von SCO2 in p53wt-Gliomzellen eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber moderater Hypoxie. Es konnte auch gezeigt werden, dass p53 und HIF-1alpha miteinander kooperieren, um SCO2 unter Hypoxie zu induzieren, was suggeriert, dass i) SCO2 ein neues HIF-1alpha Zielgen sein könnte und ii) SCO2 ein neues Zielprotein darstellen könnte, um Atmung und ROS-Prävention über HIF-alpha zu modulieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Gliomzellen einen Nutzen aus dem Aufrechterhalten eines p53wt-Status erzielen können, da dies ihre Vulnerabilität gegenüber moderater Tumor-Hypoxie reduzieren kann, und dass dieser Effekt SCO2-vermittelt ist. Dennoch konnte die Sensitivität von p53wt-defizient-Zellen gegenüber hochgradiger Hypoxie-induziertem Zelltod nicht über die Effekte von SCO2 erklärt werden, da diese Oxidase ihre Funktionen nur unter ausreichend oxyschen Bedingungen erfüllen kann. Um die Mechanismen aufzuklären, die p53wt-Zellen vor hochgradiger Hypoxie Schutz verleihen, wurde die Rolle von TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), eines weiteren kürzlich charakterizierten metabolischen p53-Zielgens, untersucht. TIGAR zeigt Ähnlichkeit mit der Fruktose-Bisphosphatase-2-Domäne des bifunktionalen Enzyms 6-Phosphofrukto-2-Kinase/Fruktose-2,6-Biphosphatase 2, und reduziert die intrazellulären Konzentrationen von Fruktose-2,6-Bisphosphat (FBP-2). FBP-2 ist ein Glykolyse-Regulator, der in höheren Konzentrationen die Glykolyse hemmt und den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) induziert, was zu einer Verringerung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentrationen (ROS) führt. Die Überexpression von TIGAR in p53wt-Zellen verstärkte die Glykolyse-Hemmung unter normoxischen Bedingungen und erlaubte oxidative Phosphorylierung als kompensatorischen metabolischen Mechanismus. Zudem förderte TIGAR die Expression von Lon, einer Protease, die Untereinheiten der Atmungskette modulieren kann, und zugleich als Radikalfänger fungiert. Jedoch reduzierte TIGAR die Expression von SCO2. Die Restoration von TIGAR in p53wt-defizient-Zellen konnte die Sensibilität gegenüber hochgradiger Hypoxie aufheben. TIGAR reduzierte auch die ROS-Menge und verringerte die Sensitivität gegenüber oxidativen Stress. Zugleich sensibilisierte die Gensuppression von TIGAR in p53wt-Gliomzellen diese Zellen vor hochgradiger Hypoxie. Zudem korrelierte die Expression von HIF-1alpha mit der TIGAR-Expression, was eine neue Rolle von HIF-1alpha in der Regulation des Hypoxie-induzierten Zelltodes und der Protektion vor ROS vermuten ließ. Die Expression der Transketolase-Like-1 (TKTL1), eines Isoenzym der Transketolase im Pentose-Phosphat-Weg, ist in vielen Tumoren hochreguliert. Es wurde spekuliert, dass TKTL1 Zellen Schutz vor oxidativem Zellstress vermitteln kann. Zugleich ist bekannt, dass TKTL1 mit hohen phospho-Akt-Mengen in Gliomen korreliert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TKTL1 ein indirektes p53-Zielgen ist, welches über TIGAR reguliert werden kann. Eine Suppression der TKTL1-Expression in TIGAR-exprimierenden Zellen konnte die über TIGAR vermittelten protektiven Effekte gegenüber endogenen ROS, oxidativem Stress und Hypoxie-induziertem Zelltod aufheben. Folglich wurde hier ein bis jetzt unbekannter Zusammenhang zwischen TIGAR, TKTL1 und HIF-1alpha entdeckt. Ebenso konnte eine TKTL1-Suppression mittels siRNA wie die TIGAR-Suppression die HIF1-alpha-Transaktivierungsfähigkeit reduzieren, was zu der Vermutung Anlass gab, dass TKTL1 HIF1-alpha unter Hypoxie reguliert.
The single unit doctrine proposes that each one of our percepts and sensations is represented by the activity of specialized high-level cells in the brain. A common criticism applied to this proposal is the one referred to as the "combinatorial problem". We are constantly confronted with unlimited combinations of elements and features, and yet we face no problem in recognizing patterns and objects present in visual scenes. Are there enough neurons in the brain to singly code for each one of our percepts? Or is it the case that perceptions are represented by the distributed activity of different neuronal ensembles? We lack a general theory capable of explaining how distributed information can be efficiently integrated into single percepts. The working hypothesis here is that distributed neuronal ensembles signal relations present in the stimulus by selectively synchronizing their spiking responses. Synchronization is generally associated with oscillatory activity in the brain. Gamma oscillations in particular have been linked to various integrative processes in the visual system. Studies in anesthetized animals have shown a conspicuous increase in power for the gamma frequency band (30 to 60 Hz) in response to visual stimuli. Recently, these observations have been extended to behavioral studies which addressed the role of gamma activity in cognitive processes demanding selective attention. The initial motivation for carrying out this work was to test if the binding-by-synchronization (BBS) hypothesis serves as a neuronal mechanism for perceptual grouping in the visual system. To this aim we used single and superimposed grating stimuli. Superimposed gratings (plaids) are bi-stable stimuli capable of eliciting different percepts depending on their physical characteristics. In this way, plaids can be perceived either as a single moving surface (pattern plaids), or as two segregated surfaces drifting in different directions (component plaids). While testing the BBS hypothesis, we performed various experiments which addressed the role of both stimulus and cortical architecture on the properties of gamma oscillations in the primary visual cortex (V1) of monkeys. Additionally, we investigated whether gamma activity could also be modulated by allocating attention in time. Finally, we report on gamma-phase shifts in area V1, and how they depend on the level of neuronal activation. ...
Background: The faunal and floral relationship of northward-drifting India with its neighboring continents is of general biogeographic interest as an important driver of regional biodiversity. However, direct biogeographic connectivity of India and Southeast Asia during the Cenozoic remains largely unexplored. We investigate timing, direction and mechanisms of faunal exchange between India and Southeast Asia, based on a molecular phylogeny, molecular clock-derived time estimates and biogeographic reconstructions of the Asian freshwater crab family Gecarcinucidae. Results: Although the Gecarcinucidae are not an element of an ancient Gondwana fauna, their subfamily Gecarcinucinae, and probably also the Liotelphusinae, evolved on the Indian Subcontinent and subsequently dispersed to Southeast Asia. Estimated by a model testing approach, this dispersal event took place during the Middle Eocene, and thus before the final collision of India and the Tibet-part of Eurasia. Conclusions: We postulate that the India and Southeast Asia were close enough for exchange of freshwater organisms during the Middle Eocene, before the final Indian--Eurasian collision. Our data support geological models that assume the Indian plate having tracked along Southeast Asia during its move northwards.
Background: Current conventional vaccination approaches do not induce potent CD8 T-cell responses for fighting mostly variable viral diseases such as influenza, avian influenza viruses or HIV. Following our recent study on vaccine penetration by targeting of vaccine to human hair follicular ducts surrounded by Langerhans cells, we tested in the first randomized Phase-Ia trial based on hair follicle penetration (namely transcutaneous route) the induction of virus-specific CD8 T cell responses. Methods and Findings: We chose the inactivated influenza vaccine – a conventional licensed tetanus/influenza (TETAGRIP®) vaccine – to compare the safety and immunogenicity of transcutaneous (TC) versus IM immunization in two randomized controlled, multi-center Phase I trials including 24 healthy-volunteers and 12 HIV-infected patients. Vaccination was performed by application of inactivated influenza vaccine according to a standard protocol allowing the opening of the hair duct for the TC route or needle-injection for the IM route. We demonstrated that the safety of the two routes was similar. We showed the superiority of TC application, but not the IM route, to induce a significant increase in influenza-specific CD8 cytokine-producing cells in healthy-volunteers and in HIV-infected patients. However, these routes did not differ significantly for the induction of influenza-specific CD4 responses, and neutralizing antibodies were induced only by the IM route. The CD8 cell response is thus the major immune response observed after TC vaccination. Conclusions: This Phase Ia clinical trial (Manon05) testing an anti-influenza vaccine demonstrated that vaccines designed for antibody induction by the IM route, generate vaccine-specific CD8 T cells when administered transcutaneously. These results underline the necessity of adapting vaccination strategies to control complex infectious diseases when CD8 cellular responses are crucial. Our work opens up a key area for the development of preventive and therapeutic vaccines for diseases in which CD8 cells play a crucial role.
Proteins can be acetylated at the alpha-amino group of the N-terminal amino acid (methionine or the penultimate amino acid after methionine removal) or at the epsilon-amino group of internal lysines. In eukaryotes the majority of proteins are N-terminally acetylated, while this is extremely rare in bacteria. A variety of studies about N-terminal acetylation in archaea have been reported recently, and it was revealed that a considerable fraction of proteins is N-terminally acetylated in haloarchaea and Sulfolobus, while this does not seem to apply for methanogenic archaea. Many eukaryotic proteins are modified by differential internal acetylation, which is important for a variety of processes. Until very recently, only two bacterial proteins were known to be acetylation targets, but now 125 acetylation sites are known for E. coli. Knowledge about internal acetylation in archaea is extremely limited; only two target proteins are known, only one of which--Alba--was used to study differential acetylation. However, indications accumulate that the degree of internal acetylation of archaeal proteins might be underestimated, and differential acetylation has been shown to be essential for the viability of haloarchaea. Focused proteomic approaches are needed to get an overview of the extent of internal protein acetylation in archaea.
Filamentous fungi are of great importance in ecology, agriculture, medicine, and biotechnology. Thus, it is not surprising that genomes for more than 100 filamentous fungi have been sequenced, most of them by Sanger sequencing. While next-generation sequencing techniques have revolutionized genome resequencing, e.g. for strain comparisons, genetic mapping, or transcriptome and ChIP analyses, de novo assembly of eukaryotic genomes still presents significant hurdles, because of their large size and stretches of repetitive sequences. Filamentous fungi contain few repetitive regions in their 30–90 Mb genomes and thus are suitable candidates to test de novo genome assembly from short sequence reads. Here, we present a high-quality draft sequence of the Sordaria macrospora genome that was obtained by a combination of Illumina/Solexa and Roche/454 sequencing. Paired-end Solexa sequencing of genomic DNA to 85-fold coverage and an additional 10-fold coverage by single-end 454 sequencing resulted in ~4 Gb of DNA sequence. Reads were assembled to a 40 Mb draft version (N50 of 117 kb) with the Velvet assembler. Comparative analysis with Neurospora genomes increased the N50 to 498 kb. The S. macrospora genome contains even fewer repeat regions than its closest sequenced relative, Neurospora crassa. Comparison with genomes of other fungi showed that S. macrospora, a model organism for morphogenesis and meiosis, harbors duplications of several genes involved in self/nonself-recognition. Furthermore, S. macrospora contains more polyketide biosynthesis genes than N. crassa. Phylogenetic analyses suggest that some of these genes may have been acquired by horizontal gene transfer from a distantly related ascomycete group. Our study shows that, for typical filamentous fungi, de novo assembly of genomes from short sequence reads alone is feasible, that a mixture of Solexa and 454 sequencing substantially improves the assembly, and that the resulting data can be used for comparative studies to address basic questions of fungal biology.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion ausgewählter Gene näher charakterisiert und ihr globaler Einfluß auf die Regulation der Genexpression untersucht. Im Fokus der Untersuchungen stand ein Gen, welches im Rahmen der Promotion von Alexander Zaigler in der Arbeitsgruppe Soppa (Universität Frankfurt) zunächst als Transkriptionsregulator ähnlich zu rspA aus E. coli identifiziert wurde. Zu Beginn dieser Arbeit konnte durch in silico Analysen das entsprechende Genprodukt zur Enolase Superfamilie (COG1441) zugeordnet werden. Mit Hilfe der „pop-in/pop-out“ Methode wurde das Gen in H. volcanii in frame deletiert und durch Wachstumsversuche, Northern- sowie Westernblot Analysen näher charakterisiert. Bei der Untersuchung des Wachstums konnte ein bemerkenswerter Phänotyp entdeckt werden: nur der Wechsel der Nährstoffquelle von reichhaltigen zu armen Bedingungen resultierte in einer dreitägigen Lagphase. Darüber hinaus wurde die Genexpression im Laufe eines Wachstumzyklus mittels Northern- und Westernblot Analysen bestimmt. Während das Transkript in reichhaltigem Medium nur transient expremiert wurde, wurde es in nährstoffarmen Bedingungen in allen Wachstumsphasen sehr stark induziert. Durch die Ergebnisse konnte zudem eine translationale Regulation der Genexpression nachgewiesen werden. Die Resultate offenbarten eine wichtige Funktion bei der Transition von reichem zu ärmerem Nährstoffangebot und führten schließlich zur Genbezeichnung iftA („important for transition A“). Desweiteren wurden Transkriptomuntersuchungen der Deletionsmutante im Vergleich zum Wildtyp zum Zeitpunkt der höchsten transienten Expression von iftA durchgeführt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass iftA etwa 1% aller Gene des Genoms beeinflußt und gleichzeitig die Zahl differentieller Funktionen dieser Gene sehr gering ist. Die Ergebnisse führten insgesamt zu der Annahme, dass iftA eine Doppelfunktion besitzt, sowohl als enzymatisches Protein im Energiestoffwechsel als auch als essentieller Regulator mit noch unbekannter Funktion. Neben iftA fiel das Augenmerk auf mehrere Gene, die im Rahmen der Promotion von Neta Altman-Price an der Universität in Tel-Aviv als Histon-Acetylasen und –Deacetylasen identifiziert wurden. Zudem konnte in H. volcanii ein essentielles Gen, welches für ein Histon kodiert, entdeckt werden. Das Histon besitzt konservierte Lysinreste, die im eukaryotischen Histon H3 Ziele für eine posttranslationale Acetylierung sind. Für die weiteren Untersuchungen wurden die Lysinreste irreversibel zum einen in Glutamin (acetylierter Zustand) und zum anderen in Arginin (deacetylierter Zustand) mutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen und die Einflüsse der beiden Histonmutanten sowie einer Acetylase- (delta pat1) und einer Deacetylase-Deletionsmutante (delta sir2) auf die globale Genregulation analysiert. Dazu wurden zunächst Transkriptomuntersuchungen in der exponentiellen Wachstumsphase mittels Microarray Analysen an den Mutanten im Vergleich zum Wildytp durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten einen erheblich stärkeren Einfluß auf die Regulation der Genexpression durch das acetylierte Histon sowie der Deacetylase-Deletionsmutante im Vergleich zu den Ergebnissen des deacetylierten Histons und der Acetylase-Deletionsmutante. In der exponentiellen Wachstumsphase liegt das Histon in H. volcanii daher in überwiegend deacetylierter Form vor. Durch die Analysen konnte auch demonstrieren werden, dass Sir2 und das Histon eine regulatorische Wirkung auf exakt die gleichen Gene ausüben und daher unmittelbar miteinander in Verbindung stehen. Die experimentelle Bestätigung dieses Zusammenhangs stellt im Reich der Archaea bisher ein absolutes Novum dar. Die Untersuchungen des Transkriptoms der delta sir2 Mutante enthüllte zudem einen positiven Einfluß von Sir2 auf ein größeres Gencluster (HVO_1201-25). Die Gene dieses Clusters konnten durch in silico Analysen der Chemotaxis und der Flagellenbiosynthese zugeordnet werden. Für die weitere Charakterisierung der Deletionsmutante wurden daher Untersuchungen zur Bestimmung der Motilität von H. volcanii durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Deletion von Sir2 die Beweglichkeit und gerichtete Fortbewegung von H. volcanii in erheblichem Maße beeinflußte, während die Biosynthese der Flagellen nicht beeinträchtigt war. Die Deacetylierung spielt daher eine unmittelbar Rolle bei der Signaltransduktion und Motilität. Insgesamt konnte durch die Arbeit gezeigt werden, dass die Acetylierung und Deacetylierung von Proteinen durch Pat1 resp. Sir2 die Regulation der Genexpression beeinflußt. Dies geschieht in H. volcanii indirekt durch die posttranslationale Veränderung von internen Signalen oder direkt durch die Modulierung des Histons und die damit verbundene Änderung der DNA-Struktur.
While many different RNA aptamers have been identified that bind to a plethora of small molecules only very few are capable of acting as engineered riboswitches. Even for aptamers binding the same ligand large differences in their regulatory potential were observed. We address here the molecular basis for these differences by using a set of unrelated neomycin-binding aptamers. UV melting analyses showed that regulating aptamers are thermally stabilized to a significantly higher degree upon ligand binding than inactive ones. Regulating aptamers show high ligand-binding affinity in the low nanomolar range which is necessary but not sufficient for regulation. NMR data showed that a destabilized, open ground state accompanied by extensive structural changes upon ligand binding is important for regulation. In contrast, inactive aptamers are already pre-formed in the absence of the ligand. By a combination of genetic, biochemical and structural analyses, we identified a switching element responsible for destabilizing the ligand free state without compromising the bound form. Our results explain for the first time the molecular mechanism of an engineered riboswitch.
The TATA Box Binding Protein (TBP) is a 20 kD protein that is essential and universally conserved in eucarya and archaea. Especially among archaea, organisms can be found that live below 0°C as well as organisms that grow above 100°C. The archaeal TBPs show a high sequence identity and a similar structure consisting of α-helices and β-sheets that are arranged in a saddle-shape 2-symmetric fold. In previous studies, we have characterized the thermal stability of thermophilic and mesophilic archaeal TBPs by infrared spectroscopy and showed the correlation between the transition temperature (Tm) and the optimal growth temperature (OGT) of the respective donor organism. In this study, a “new” mutant TBP has been constructed, produced, purified and analyzed for a deeper understanding of the molecular mechanisms of thermoadaptation. The β-sheet part of the mutant consists of the TBP from Methanothermobacter thermoautotrophicus (OGT 65°C, MtTBP65) whose α-helices have been exchanged by those of Methanosarcina mazei (OGT 37°C, MmTBP37). The Hybrid-TBP irreversibly aggregates after thermal unfolding just like MmTBP37 and MtTBP65, but the Tm lies between that of MmTBP37 and MtTBP65 indicating that the interaction between the α-helical and β-sheet part of the TBP is crucial for the thermal stability. The temperature stability is probably encoded in the variable α-helices that interact with the highly conserved and DNA binding β-sheets.
The estimation model PhytoCalc allows a non-destructive quantification of dry weight and nutrient pools of understorey plants in forests by using the relationship between species biomass, cover and mean shoot length. The model has been validated with independent samples in several German forest types and can be a useful tool in forest monitoring. However, in open areas within forests (e.g. clearcuts), the current model version underestimates biomass and produces unreliable nutrient pool estimations. Thus, tissue density, as approximated by leaf dry matter content (LDMC), is systematically higher under high light compared to low light conditions. We demonstrate that the ratio of LDMC under clearcut conditions to LDMC under forest conditions can be used to adjust the PhytoCalc model to clearcut conditions. We investigated the LDMC ratio of five exemplary species commonly occurring on clearcuts. Integrating the square of the ratio as a correction factor improved estimates of biomass to more than 70% fit between observations and predictions. Results also suggest this ratio can be used to correct nutrient concentrations modelled in PhytoCalc, which tend to be overestimated in clearcuts. As morphological groups of plant species exhibit significantly different ratios, we advise using group-specific correction factors for clearcut adjustments in the future.
The editorial board of Aging reviews research papers published in 2009,which they believe have or will have a significant impact on aging research.Among many others, the topics include genes that accelerate aging or incontrast promote longevity in model organisms, DNA damage responsesand telomeres, molecular mechanisms of life span extension by calorierestriction and pharmacologic interventions into aging. The emergingmessage in 2009 is that aging is not random but determined by agenetically-regulated longevity network and can be decelerated bothgenetically and pharmacologically.
Orthopockenviren sind große DNA-Viren, die im Zytoplasma der Wirtszelle replizieren und für über 200 Proteine kodieren. Sie besitzen ein breites Wirtszellspektrum (host-range) und modulieren auf komplexe Art und Weise zelluläre Prozesse, um ihre Replikation zu gewährleisten. Zu diesem Genus der Familie der Pockenviren gehört auch das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA). MVA ist ein hoch attenuiertes, replikationsdefizientes Impfvirus, dem im Vergleich zu ursprünglichen Vacciniavirus-Stämmen viele virale Genfunktionen fehlen. Zu diesen verlorengegangenen Genen zählen so genannte host-range-Gene, die für das breite Wirtszellspektrum des Vacciniavirus (VACV) verantwortlich sind, deren molekulare Funktion aber größtenteils unbekannt ist. Diese Arbeit befasste sich zum einen mit der Untersuchung der Rolle der host-range-Gene K1L und C7L in der MVA-Infektion. Zum anderen sollte geprüft werden, ob der im MVA-Genom unvollständige Leserahmen F11L durch Wiederherstellung seiner Funktionalität den Wirtstropismus von MVA erweitern kann. Das Fehlen von K1L und C7L in MVA ist mit dem Verlust der späten viralen Genexpression verbunden. Als mögliche Ursache hierfür wurde in dieser Arbeit die Phosphorylierung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2alpha (eIF2alpha) entdeckt, welche zum Abbruch der Proteinsynthese in der infizierten Zelle führt. Unter den möglichen Kinasen wurde die Proteinkinase R (PKR) als das verantwortliche Schlüsselenzym identifiziert und somit gezeigt, dass das K1- und C7-Protein den anti-viralen PKR-eIF2alpha-Signalweg inhibieren. Es stellte sich heraus, dass die eIF2alpha-Phosphorylierung alleine jedoch nicht für das Fehlen der späten Genexpression verantwortlich ist. Neben dem inhibitorischen Einfluss auf den PKR-eIF2alpha-Signalweg zeigte sich, dass C7 die Aktivierung des NFKB-Signalwegs reduziert, welcher für eine anti-virale Antwort der Wirtszelle wichtig ist. Ein weiterer Ansatz zur Aufklärung der K1- und C7-Funktion bestand darin, zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren. Hierbei konnte das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein K (HNRPK) als möglicher Interaktionspartner von C7 entdeckt werden. Neben den bisher bekannten host-range-Genen gibt es vermutlich weitere Gene, die den Wirtsbereich des VACV definieren. Das im MVA-Genom defekte F11L-Gen war ein guter Kandidat für eine solche Genfunktion, da es bei der Virionenmorphogenese, Virusausbreitung und der Migration VACV-infizierter Zellen eine Rolle zu spielen scheint. Deshalb wurde ein rekombinantes MVA mit vollständiger F11L-Gensequenz konstruiert und das Wirtszellspektrum dieses Virus untersucht. Die Reparatur des F11L-Gens ermöglichte MVA die Induktion von Zellbewegung nach Infektion, jedoch blieben seine unvollständige Morphogenese und eingeschränkte Vermehrungsfähigkeit in Säugetierzellen unbeeinflusst. F11L hat daher zumindest keine selbstständige Funktion als VACV host-range-Gen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind ein Beitrag zum besseren Verständnis der komplexen Virus-Wirts-Interaktionen des VACV sowie des eingeschränkten Wirtstropismus des Impfvirus MVA.
One of the key functions of blood vessels is to transport nutrients and oxygen to distant tissues and organs in the body. When blood supply is insufficient, new vessels form to meet the metabolic tissue demands and to re-establish cellular homeostasis. Expansion of the vascular network through sprouting angiogenesis requires the specification of ECs into leading (sprouting) tip and following (non-sprouting) stalk cells. Attracted by guidance cues tip cells dynamically extend and retract filopodia to navigate the nascent vessel sprout, whereas trailing stalk cells proliferate to form the extending vascular tube. All of these processes are under the control of environmental signals (e.g. hypoxia, metabolism) and numerous cytokines and peptide growth factors. The Dll4/Notch pathway coordinates several critical steps of angiogenic blood vessel growth. Even subtle alterations in Notch activity can profoundly influence endothelial cell behavior and blood vessel formation, yet little is known about the intrinsic regulation and dynamics of Notch signaling in endothelial cells. In addition, it remains an open question, how different growth factor signals impinging on sprouting ECs are coordinated with local environmental cues originating from nutrient-deprived, hypoxic tissue to achieve a balanced endothelial cell response. Acetylation of lysines is a critical posttranslational modification of histones, which acts as an important regulatory mechanism to control chromatin structure and gene transcription. In addition to histones, several non-histone proteins are targeted for acetylation reversible acetylation is emerging as a fundamental regulatory mechanism to control protein function, interaction and stability. Previous studies from our group identified the NAD+-dependent deacetylase SIRT1 as a key regulator of blood vessel growth controlling endothelial angiogenic responses. These studies revealed that SIRT1 is highly expressed in the vascular endothelium during blood vessel development, where it controls the angiogenic activity of endothelial cells. Moreover, in this work SIRT1 has been shown to control the activity of key regulators of cardiovascular homeostasis such as eNOS, Foxo1 and p53. The present study describes that SIRT1 antagonizes Notch signaling by deacetylating the Notch intracellular domain (NICD). We showed that loss of SIRT1 enhances DLL4-induced endothelial Notch responses as assessed by different luciferase responsive elements as well as transcriptional analysis of Notch endogenous target genes activation. Conversely, SIRT1 gain of function by overexpression of pharmacological activation decreases induction of Notch targets in response to DLL4 stimulation. We also showed that the NICD can be directly acetylated by PC AF and p300 and that SIRT1 promotes deacetylation of NICD. We have identified 14 lysines that are targeted for acetylation and their mutation abolishes the effects of SIRT1 of Notch responses. Furthermore, over-expression or activation of SIRT1 significantly reduces the levels of NICD protein. Moreover, SIRT1-mediated NICD degradation can be reversed by blockade of the proteasome suggesting a mechanism resulting from ubiquitin-mediated proteolysis. Indeed, we have shown that SIRT1 knockdown or pharmacological inhibition decreased NICD ubiquitination. We propose a novel molecular mechanism of modulation of the amplitude and duration of Notch responses in which acetylation increases NICD stability and therefore permanence at the promoters, while SIRT1, by inducing NICD degradation through its deacetylation, shortens Notch responses. In order to evaluate the physiological relevance of our findings we used different models in which the Notch functions during blood vessel formation have been extensively characterized. First, retinal angiogenesis in mice lacking SIRT1 activity shows decreased branching and reduced endothelial proliferation, similar to what happens after Notch gain of function mutations. ECs from these mice exhibit increased expression of Notch target genes. Second, these results were reproducible during intersomitic vessel growth in sirt1-deficient zebrafish. In both models, the defects could be partially rescued by inhibition of Notch activation. Third, we used an in vitro model of vessel sprouting from differentiating embryonic bodies in response to VEGF in a collagen matrix. Our results showed that Sirt1-deficient cells shows impaired sprouting which correlated with increased NICD levels. In addition, when in competition with wild-type cells in this assay, Sirt1-deficient cells are more prone to occupy the stalk cell position. Taken together, our study identifies reversible acetylation of NICD as a novel molecular mechanism to adapt the dynamics of Notch signaling and suggest that SIRT1 acts as a rheostat to fine-tune endothelial Notch responses. The NAD+-dependent feature of SIRT1 activity possibly links endothelial Notch responses to environmental cues and metabolic changes during nutrient deprivation in ischemic environments or upon other cellular stresses.
In der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 ist neben Patientenschulung, Fewichtsreduktion und körperlicher Aktivität die Therapie mit oralen Antidiabetika von besonderer Bedeutung, um langfristig die Blutzuckereinstellung zu verbessern und kardiovaskuläre wie andere Folgeerkrankungen zu minimieren. Allerdings sinkt im Verlauf die Effizienz dieser Therapie, so dass die dauerhafte Gabe von Insulin notwendig wird. Dabei können jedoch auch schwerwiegende Nebenwirkungen, wie z.B. Hypoglykämien und eine wiederrum mit einem erhöhten Risiko an kardiovaskulären Erkrankungen verbundene ausgeprägte Gewichtszunahme auftreten. Demgegenüber führte der GLP-1 Rezeptor-Agonist Exenatide in jüngsten Studien zu einer Verbesserung der Blutzuckereinstellung und Reduktion des Körpergewichts und kann somit als eine neuartige Therapiealternative zum bisher verwendeten Insulin angesehen werden. In der hier vorliegenden prospektiven Studie wurde Exenatide mit Insulin bei Typ 2-Diabetes Patienten mit einer unzureichenden Stoffwechseleinstellung unter Metformin in Bezug auf deren Blutzuckereinstellung und das Hypoglykämie-Risiko verglichen. In dieser 26-wöchigen, multizentrischen, kontrollierten, randomisierten und zweiarmigen Phase IIIb-Studie wurden insgesamt 494 Patienten aus ganz Deutschland untersucht. Die Patienten mit einer unzureichenden Metformin- (Primärkollektiv) oder Kombinationstherapie (exploratives Kollektiv: Metformin plus Sulfonylharnstoff) wurden im Verhältnis 3:1 auf zweimal täglich Exenatide oder zweimal täglich Mischinsulin Aspart 30/70 randomisiert. In einem hierarchischen Modell wurde zunächst die Nichtunterlegenheit von Exenatide gegenüber dem Mischinsulin im Hinblick auf das primäre Endziel der Blutzuckereinstellung (in Form des HbA1c-Wertes) untersucht und anschließend die Überlegenheit von Exenatide in Hinblick auf ein geringeres Hypoglykämie-Risiko. Sekundäre Studienziele waren die Häufigkeit von schweren und von nächtlichen Hypoglykämien, die Veränderung des Körpergewichts sowie des Body Mass Index. Ferner wurden 7-Punkt-Blutzuckertagesprofile und Patientenfragebögen in die Auswertung einbezogen. Bei der insgesamt in acht Visiten unterteilten Studie erfolgte nach zwei Wochen die Randomisierung auf die beiden Therapie-Arme. Während die Dosierung des Mischinsulins im Verlauf der gesamten Studiendauer vom Arzt individuell titriert werden konnte, wurde die Dosis von Exenatide nach vier Wochen von 2 x 5 μg/Tag auf 2 x 10 μg/Tag verdoppelt und bis zum Ende der Studie nicht verändert. Die hier vorliegende Arbeit ist die erste Studie, die das Hypoglykämie-Risiko unter Exenatide und Mischinsulin als primären Endpunkt prospektiv und konfirmatorisch vergleichend untersucht. Im Primärkollektiv konnte die Nicht-Unterlegenheit von Exenatide zum Mischinsulin in Bezug auf den HbA1c-Wert festgestellt werden. Bei der Vermeidung von Hypoglykämien war Exenatide dem Mischinsulin statistisch signifikant überlegen. Zusätzlich konnte unter der Exenatide-Behandlung ein signifikanter Gewichtsverlust festgestellt werden, wohingegen die Patienten im Mischinsulin-Arm signifikant an Gewicht zunahmen. Die gleichzeitige Erreichung dieser Therapieziele (HbA1c<7,0%, keine Gewichtszunahme und keine Hypoglykämien) wurde als Triple-Endpoint definiert und im Exenatide-Arm signifikant häufiger als unter der Mischinsulin-Therapie beobachtet. In den 7-Punkt-Blutzuckertagesprofilen konnte neben einer allgemeinen Blutzuckersenkung in beiden Therapiearmen eine zusätzliche postprandiale Senkung zu den Zeiten der morgendlichen und abendlichen Exenatide-Injektion beobachtet werden. Demgegenüber waren die präprandialen Blutzuckerwerte im Mischinsulin-Arm niedriger, so dass insgesamt eine vergleichbare Verbesserung des Flächenintegrals in den Blutzuckertageskurven erzielt wurde, was die vergleichbare HbA1c-Verbesserung erklärt. Entsprechend zum Gewicht nahmen auch BMI und Hüftumfang der Patienten unter Exenatide ab und unter Insulin zu. Das Gesamtcholesterin und die Triglyceride sanken unter beiden Therapien leicht ab, HDL-Cholesterin stieg leicht an, wohingegen nur unter Exenatide das LDL-Cholesterin abnahm. Ebenfalls sanken nur im Exenatide-Arm der systolische und diastolische Blutdruck. Die häufigsten unerwünschten Ereignisse unter Exenatide waren Übelkeit, Erbrechen, Verdauungsstörungen, Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen, wobei Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen auch unter Insulin zu beobachten waren. Bei der in den Patientenfragebögen DTSQ und SF-12 dokumentierten subjektiven Empfindung der Nebenwirkungen zeigten sich allerdings eine Kompensation der deutlicheren Nebenwirkungen von Exenatide durch dessen Vorteile, u.a. im Hinblick auf seine einfachere Dosierung und der als angenehm empfundenen Gewichtsreduktion. Insgesamt war in beiden Therapie-Armen eine ausreichende Patientenzufriedenheit festzustellen. Unter denjenigen Patienten, bei denen Antikörper gegen Exenatide festgestellt wurden, nahm die Prävalenz einer Antikörperbildung gegen Exenatide bis zum Ende der Studie ab. Die Ergebnisse der hier vorgelegten Studie lassen die Schlussforderung zu, dass der GLP-1 Agonist Exenatide eine therapeutische Alternative zum Mischinsulin in der Behandlung des Diabetes Mellitus Typ 2 darstellt. Da eine Restfunktion der pankreatischen ß-Zellen eine Voraussetzung für den Therapieerfolg darstellt, sollte Exenatide möglichst früh bei nachlassender Wirkung des oralen Antidiabetikums Metformin eingesetzt werden. Hier wirkt Exenatide durch eine Verbesserung der Blutzuckereinstellung, die zudem mit einem verminderten Hypoglykämie-Risiko und einer Gewichtsreduktion verbunden ist. Die Kombination dieser drei bedeutenden Effekte hat den klinisch relevanten Vorteil, das Risiko an kardiovaskulären Spätfolgen und somit die Morbidität und Mortalität von Typ 2-Diabetikern langfristig zu senken. Dieses sollte in einer prospektiven Langzeitstudie untermauert werden.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives Bakterium, das die menschliche Magenmukosa kolonisieren kann. Ca. 50 % der Weltbevölkerung sind mit diesem Erreger infiziert, wobei er ohne medizinische Behandlung über Jahrzehnte in seinem Wirt persistieren kann. Das Bakterium gilt als eine der häufigsten Ursachen bei der Entwicklung von schweren gastrointestinalen Erkrankungen wie chronischer Gastritis und Gastral- oder Duodenalulkus. Darüber hinaus kann eine Infektion aber auch zu einem gastralen Adenokarzinom oder dem MALT- („mucosa-associated lymphoid tissue“) Lymphom führen. Bestimmte H. pylori-Stämme können über ein Typ IV Sekretionssystem (T4SS) das bakterielle Protein CagA („cytotoxin-assoziiertes Gen A“) in die Wirtszelle injizieren und dadurch Signaltransduktionswege stören, die die Morphologie und Mobilität der infizierten Wirtszelle drastisch verändern. In diesem Zusammenhang wurde die putative Phosphorylierung der Proteine VASP („Vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein“) und α-Actinin-4 untersucht, welche beide regulatorische Funktionen im Zytoskelett der Wirtszelle ausüben. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte der Einfluss von H. pylori auf diese Proteine analysiert werden, sowie die daraus resultierenden zellulären Auswirkungen. Es konnte verifiziert werden, dass H. pylori die Phosphorylierung der drei bekannten Phosphorylierungsstellen von VASP, bzw. eine Tyrosin-Phosphorylierung von α-Actinin-4 (ACTN4) induziert. Weiterhin zeigte sich, dass beide Proteine nach einer Infektion mit dem Bakterium in fokalen Kontaktstellen der Zellen lokalisieren. Zusätzlich lies sich zeigen, dass VASP und α-Actinin-4 eine entscheidende Rolle bei der durch H. pylori-induzierten Zellelongation spielen, da eine Herunterregulation der Genexpression von beiden Proteinen über siRNA zu einer Inhibition der morphologischen Veränderungen führte. Die genaueren Studien über VASP zeigten, dass hauptsächlich die Phosphorylierungsstelle VASPSer239 für die H. pylori-induzierte Zellelongation verantwortlich ist und die Phosphorylierung durch die Proteinkinase G (PKG) vermittelt wird. Für α-Actinin-4 konnte in dieser Arbeit des Weiteren gezeigt werden, dass die Kinase c-Abl eine Tyrosin-Phosphorylierung vermitteln kann, wobei die genaue Phosphorylierungsstelle im Protein noch ermittelt werden muss. Durch den Einsatz von H. pylori-Mutanten lies sich darüber hinaus noch zeigen, dass die Phosphorylierung von VASPSer239 und VASPThr278 durch das bakterielle Protein CagA deutlich verstärkt wird. Für die Tyrosin-Phosphorylierung von α-Actinin-4 war CagA sogar ausschlaggebend. Diese neu entdeckten zellulären Zielproteine bei einer H. pylori-Infektion ermöglichen weitere Einblicke in die Deregulation des eukaryotischen Zytoskeletts und möglichen Mechanismen bei der Krebsentstehung.