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Um die Rolle von potentiell schmerzauslösenden Substanzen bei der Entstehung von menschlichem Muskelschmerz und von muskulärer Hyperalgesie zu beurteilen, wurde bei dieser Arbeit das DOMS Muskelschmerzmodell und das hypertone NaCl Muskelschmerzmodell in Kombination mit der Mikrodialysetechnik verwendet. Dabei wurden bei 10 gesunden, untrainierten Probanden metabolische Änderungen im Glucosestoffwechsel (Glucose, Laktat) und Fettstoffwechsel (Glycerol), Änderung der Glutamat Freisetzung und Änderungen von inflammatorischen Mediatoren (PGE2, NO, Substanz P) in den schmerzhaften und in den Kontrollmuskeln untersucht. Studienbegleitend erfolgte zur Beurteilung der Effektivität der Übungen und des dabei entstandenen Muskelschadens die Bestimmung von Serum CK, Serum Laktat, des Muskelumfangs und der Muskeldruckschmerzschwelle (PPT). Die Probanden gaben regelmäßig die Schmerzintensität auf einer visuellen Analogskala (VAS) an. Die DOMS Muskelschmerzen wurden 24 Stunden vor dem Beginn der Mikrodialyse durch konzentrisch/ exzentrische Kontraktionen der Wadenmuskulatur im Verum Bein ausgelöst. Während der Mikrodialyse erfolgte die Schmerzstimulation der Wadenmuskulatur durch Plantar- und Dorsalflexion des Fußes. Die Schmerzauslösung beim hypertonen NaCl Modell geschah während der Mikrodialyse durch sequentielle Injektionen von hypertoner NaCl Lösung ( 5 ∗ 200 µl 5.8% NaCl Lösung in 2 Minuten Intervallen) in den Bizepsmuskel am Oberarm. Die Zuordnung der Behandlung (Verum vs. Kontrollmuskel) erfolgte jeweils nach dem Zufallsprinzip.
Direkt nach den DOMS Übungen kam es zu einem signifikanten Anstieg von Laktat im Serum, nach 24 Stunden zu einem signifikanten Ansteigen der CK Aktivität und einer Zunahme des Muskelumfangs. Mit beiden Modellen konnte zuverlässig ein Muskelschmerz erzeugt werden, wobei die Schmerzintensität bei wiederholter Stimulierung abnahm und dies im DOMS Modell stärker ausgeprägt war. Eine mechanische Hyperalgesie konnte nur an den Waden beobachtet werden, die dort aber beidseitig auftrat und damit eine Art „zentraler Übererregbarkeit“ vermuten lässt. Die Dialysatkonzentrationen von Glutamat, PGE2 und Substanz P zeigten aufgrund der Schmerzstimulation im DOMS Bein einen lokalen Anstieg (Glutamat 125 ± 20 µM [p=0.005], PGE2 239 ± 45 pg/ml, Substanz P 64 ± 11 pg/ml). Dabei traten im Kontrollbein keine signifikanten Änderungen auf. Während der Mikrodialyseperiode war die NO Konzentration im DOMS Bein signifikant geringer als im Kontrollbein (p = 0.02), zeigte dabei aber keine Beeinflussung durch die Schmerzstimulation. Gleichzeitig war dabei die Laktatkonzentration im DOMS Bein im Vergleich zum Kontrollbein erhöht. Die Glucose- und Glycerolkonzentrationen wiesen durch die Schmerzauslösung keine bedeutenden Veränderungen auf.
Im Bizepsmuskel kam es infolge der hypertonen NaCl Injektionen zu einem signifikanten Anstieg der Glutamat Konzentration im Dialysat (50 ± 3 µM, p = 0.003), wobei diese im Kontrollmuskel konstant blieb. Die Injektionen hatten aber keinen Einfluss auf die Werte von Glucose, Laktat, Glycerol, NO, PGE2, des Muskelumfangs und der PPT.
Möglicherweise ist ein inflammatorischer Prozess an den peripheren Mechanismen der Muskelschmerzentstehung beim DOMS Modell beteiligt. Die Injektion von hypertoner NaCl Lösung löst den Muskelschmerz vermutlich direkt durch die hohe extrazelluläre Natrium Konzentration aus, wobei es zu einer Depolarisation der Nozizeptormembran mit einer nachfolgenden Glutamat Freisetzung aus den aktivierten Nozizeptoren kommt. Die Vorteile dieses Modells sind die Wiederholbarkeit und die kurze Dauer des Muskelschmerzes. Die dem ausgelösten Schmerz zugrundeliegenden Mechanismen ähneln jedoch nicht den Mechanismen die dem klinischen Muskelschmerz zugrunde liegen. Deshalb könnte es sein, dass die Bedeutungen der Ergebnisse aus diesem Modell relativ beschränkt sind und die Nützlichkeit insbesondere für pharmakologische Studien damit auch eingeschränkt ist.
Der Neurotransmitter Glutamat ist an den peripheren Mechanismen der Muskelschmerzentstehung beteiligt, da die Glutamat Freisetzung direkt mit dem Muskelschmerz beim DOMS Modell und beim Hypertonen NaCl Modell assoziiert war. Die beim DOMS Modell erhöhten Konzentrationen von Laktat, PGE2, sowie die Änderungen von Substanz P und die erniedrigten NO Konzentrationen könnten auch zu der Entstehung von Muskelschmerz beitragen.
Der beobachtete Rückgang der Schmerzintensität bei wiederholter Stimulierung lässt auf eine Art „Gewöhnung“ schließen, die bei Anwendung des DOMS Modells für pharmakologische Untersuchungen einen Nachteil darstellen könnte.
Ziel: Anliegen des Kooperationsprojektes der Klinik für Nephrologie und der Klinik für Psychosomatische Medizin und Psychotherapie ist die internistische und eine umfassende psychologische Untersuchung von152 Lebendnierenspendern, die ihre Niere zwischen 1973 und 2001 in der Universitätsklinik Frankfurt am Main spendeten. Im Rahmen dieser Studie werden aus der oben genannten Arbeitsgruppe heraus, mehrere Arbeiten und Publikationen entstehen. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der 152 Frankfurter Lebendnierenspender in Bezug auf psychosomatische und psychosoziale Aspekte des Erlebens und der Verarbeitung der Lebendnierentransplantation und ihrer Folgen. In der bisherigen empirischen Forschung zu psychischen und psychosomatischen Folgen einer Lebendnierentransplantation wurden beim Spender eher wenige und wenn, dann im Ausmaß begrenzte psychische Komplikationen berichtet. In der Regel sind die psychische Verarbeitung sowie die psycho-sozialen Auswirkungen einer Lebendnierentransplantation insgesamt positiv zu bewerten.
Methode: N= 152 Lebendnierenspender werden internistisch und psychologisch untersucht. Die psychologische Untersuchung verwendet ein breites Spektrum von Erhebungsmethoden. Neben vier standardisierten testpsychologischen Fragebögen wird ein semistrukturiertes ca. einstündiges Interview mit den Spendern geführt. Die vorliegende Arbeit befasst sich gesondert mit dem halbstrukturierten Interview. Die Erlebnisberichte der Spender werden mittels eines eigens erstellten Kategoriensystems ausgewertet.
Ergebnisse: Abschluss der Datenerhebung der vorliegenden Arbeit ist der 15. Februar 2002. Sieben Spender verstarben vor Beginn der Studie, jedoch nicht an den Folgen der Einnierigkeit.Drei Spender waren nicht auffindbar. 19 Spender wurden wegen Wohnsitz im Ausland und/oder Mangel an deutschen Sprachkenntnissen vom psychologischen Interview ausgeschlossen. Von den 123 in Frage kommenden Untersuchungsteilnehmern haben wir mit 100 Spendern Interviews führen können, was einer vergleichsweise hohen Rücklaufquote von 81,3% entspricht. Die meisten Spender trafen ihre Entscheidung sofort (84%) und bereuten ihre Spende im Nachhinein nicht.
Nahezu alle Spender (97%) würden die Entscheidung ihre Niere spenden zu wollen heute wieder treffen. Die meisten Spender bewerten die Spende als ein positives Ereignis vergleichbar mit einer Lebensrettung oder einer Geburt. Einige Spender berichten durch die Spende eine Steigerung ihres Selbstwertgefühls und Selbstbewusstseins erfahren zu haben. 75% der Spender schildern durch die Spende keine Veränderung in der Beziehung zu dem Empfänger erlebt zu haben, bei 23% habe sich die Beziehung verbessert. 3% geben an, die Beziehung zu bestimmten Familienmitgliedern sei nach der Spende schlechter geworden. 3% der Spender bereuen gespendet zu haben. 8% empfanden Druck im Entscheidungsprozess. 5% hatten starke Angst vor der Operation oder dem Leben mit einer Niere. Insgesamt 6% der Spender berichten über langfristige psychische Komplikationen (Verdacht auf: 2% Anpassungsstörung, 2% Angststörung, 1% Depression, 1% Burnout). 11% wünschen sich eine professionelle psychologische Vor- und/oder Nachbetreuung.
Diskussion: Die Ergebnisse der Untersuchung weisen insgesamt auf eine langfristig positive psychische Verarbeitung, sowie auf positive psychosoziale Auswirkungen einer Lebendnierentransplantation hin. Es gibt eine inhomogene Subgruppe mit kleiner Personenanzahl, die negative Erfahrungen mit der Lebendnierenspende machte. Dieser wird gesondert Beachtung geschenkt und die Bereitstellung von adäquaten Beratungs- und Hilfsangeboten diskutiert.
The signal transducer and activator of transcription (Stat) gene family comprises seven members with similarities in their domain structure and a common mode of activation. Members of this gene family mediate interferon induction of gene transcription and the response to a large number of growth factors and hormones. Extracellular ligand binding to transmembrane receptors causes the intracellular activation of associated tyrosine kinases, phosphorylation of Stat molecules, dimerization, and translocation to the nucleus. Prolactin-induced phosphorylation of Stat5 is a key event in the development and differentiation of mammary epithelial cells. In addition to the crucial phosphorylation at tyrosine 694, we have identified an O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) as another secondary modification essential for the transcriptional induction by Stat5. This modification was only found on nuclear Stat5 after cytokine activation. Similar observations were made with Stat1, Stat3, and Stat6. Glycosylation of Stat5, however, does not seem to be a prerequisite for nuclear translocation. Mass spectrometric analysis revealed a glycosylated peptide in the N-terminal region of Stat5. Replacement of threonine 92 by an alanine residue (Stat5a-T92A) strongly reduced the prolactin induction of Stat5a glycosylation and abolished transactivation of a target gene promoter. Only the glycosylated form of Stat5 was able to bind the coactivator of transcription CBP, an essential interaction for Stat5-mediated gene transcription.
Respiratory chain complex I contains 8-9 iron-sulfur clusters. In several cases, the assignment of these clusters to subunits and binding motifs is still ambiguous. To test the proposed ligation of the tetranuclear iron-sulfur cluster N5 of respiratory chain complex I, we replaced the conserved histidine 129 in the 75-kDa subunit from Yarrowia lipolytica with alanine. In the mutant strain, reduced amounts of fully assembled but destabilized complex I could be detected. Deamino-NADH: ubiquinone oxidoreductase activity was abolished completely by the mutation. However, EPR spectroscopic analysis of mutant complex I exhibited an unchanged cluster N5 signal, excluding histidine 129 as a cluster N5 ligand.
Stable supercomplexes of bacterial respiratory chain complexes III (ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase) and IV (cytochrome c oxidase) have been isolated as early as 1985 (Berry, E. A., and Trumpower, B. L. (1985) J. Biol. Chem. 260, 2458-2467). However, these assemblies did not comprise complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase). Using the mild detergent digitonin for solubilization of Paracoccus denitrificans membranes we could isolate NADH oxidase, assembled from complexes I, III, and IV in a 1:4:4 stoichiometry. This is the first chromatographic isolation of a complete “respirasome.” Inactivation of the gene for tightly bound cytochrome c552 did not prevent formation of this supercomplex, indicating that this electron carrier protein is not essential for structurally linking complexes III and IV. Complex I activity was also found in the membranes of mutant strains lacking complexes III or IV. However, no assembled complex I but only dissociated subunits were observed following the same protocols used for electrophoretic separation or chromatographic isolation of the supercomplex from the wild-type strain. This indicates that the P. denitrificans complex I is stabilized by assembly into the NADH oxidase supercomplex. In addition to substrate channeling, structural stabilization of a membrane protein complex thus appears as one of the major functions of respiratory chain supercomplexes.
Nitric oxide (NO)-sensitive soluble guanylyl cyclase (sGC) is the major cytosolic receptor for NO, catalyzing the conversion of GTP to cGMP. In a search for proteins specifically interacting with human sGC, we have identified the multidomain protein AGAP1, the prototype of an ArfGAP protein with a GTPase-like domain, Ankyrin repeats, and a pleckstrin homology domain. AGAP1 binds through its carboxyl terminal portion to both the α1 and β1 subunits of sGC. We demonstrate that AGAP1 mRNA and protein are co-expressed with sGC in human, murine, and rat cells and tissues and that the two proteins interact in vitro and in vivo. We also show that AGAP1 is prone to tyrosine phosphorylation by Src-like kinases and that tyrosine phosphorylation potently increases the interaction between AGAP1 and sGC, indicating that complex formation is modulated by reversible phosphorylation. Our findings may hint to a potential role of AGAP1 in integrating signals from Arf, NO/cGMP, and tyrosine kinase signaling pathways.
Nitric oxide (NO) represents a short lived mediator that pivotally drives keratinocyte movements during cutaneous wound healing. In this study, we have identified p68 DEAD box RNA helicase (p68) from an NO-induced differential keratinocyte cDNA library. Subsequently, we have analyzed regulation of p68 by wound-associated mediators in human and murine keratinocytes. NO, serum, growth factors, and pro-inflammatory cytokines were potent inducers of p68 expression in the cells. p68 was constitutively expressed in the epithelial compartment of murine skin. Upon injury, we found a transient down-regulation of overall p68 protein in wound tissue. However, p68 did not completely disappear during early wound repair, as we found an expression of p68 protein in isolated wound margin tissue 24 h after wounding. Moreover, immunohistochemistry and cell fractionation analysis revealed a restricted localization of p68 in keratinocyte nuclei of the developing epithelium. Accordingly, cultured keratinocytes also showed a nuclear localization of the helicase. Moreover, confocal microscopy revealed a strong localization of p68 protein within the nucleoli of the cells. Functional analyses demonstrated that p68 strongly participated in keratinocyte proliferation and gene expression. Keratinocytes that constitutively overexpressed p68 protein were characterized by a marked increase in serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor expression, whereas down-regulation of endogenous p68 using small interfering RNA markedly attenuated serum-induced proliferation and vascular endothelial growth factor expression. Altogether, our results suggest a tightly controlled expression and nucleolar localization of p68 in keratinocytes in vitro and during skin repair in vivo that functionally contributes to keratinocyte proliferation and gene expression.
The mode of the antitumoral activity of multimutated oncolytic herpes simplex virus type 1 G207 has not been fully elucidated yet. Because the antitumoral activity of many drugs involves the inhibition of tumor blood vessel formation, we determined if G207 had an influence on angiogenesis. Monolayers of human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells, but not human dermal fibroblasts, bronchial epithelial cells, and retinal glial cells, were highly sensitive to the replicative and cytotoxic effects of G207. Moreover, G207 infection caused the destruction of endothelial cell tubes in vitro. In the in vivo Matrigel plug assay in mice, G207 suppressed the formation of perfused vessels. Intratumoral treatment of established human rhabdomyosarcoma xenografts with G207 led to the destruction of tumor vessels and tumor regression. Ultrastructural investigations revealed the presence of viral particles in both tumor and endothelial cells of G207-treated xenografts, but not in adjacent normal tissues. These findings show that G207 may suppress tumor growth, in part, due to inhibition of angiogenesis.
The ubiquitin (Ub) ligase Cbl plays a critical role in attenuation of receptor tyrosine kinase (RTK) signaling by inducing ubiquitination of RTKs and promoting their sorting for endosomal degradation. Herein, we describe the identification of two novel Cbl-interacting proteins, p70 and Clip4 (recently assigned the names Sts-1 and Sts-2, respectively), that inhibit endocytosis of epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor. Sts-1 and Sts-2 contain SH3 domains that interacted with Cbl, Ub-associated domains, which bound directly to mono-Ub or to the EGFR/Ub chimera as well as phosphoglycerate mutase domains that mediated oligomerization of Sts-1/2. Ligand-induced recruitment of Sts-1/Sts-2 into activated EGFR complexes led to inhibition of receptor internalization, reduction in the number of EGFR-containing endocytic vesicles, and subsequent block of receptor degradation followed by prolonged activation of mitogenic signaling pathways. On the other hand, interference with Sts-1/Sts-2 functions diminished ligand-induced receptor degradation, cell proliferation, and oncogenic transformation in cultured fibroblasts. We suggest that Sts-1 and Sts-2 represent a novel class of Ub-binding proteins that regulate RTK endocytosis and control growth factor-induced cellular functions.
Alix/AIP1 is an adaptor protein involved in regulating the function of receptor and cytoskeleton-associated tyrosine kinases. Here, we investigated its interaction with and regulation by Src. Tyr319 of Alix bound the isolated Src homology-2 (SH2) domain and was necessary for interaction with intact Src. A proline-rich region in the C terminus of Alix bound the Src SH3 domain, but this interaction was dependent on the release of the Src SH2 domain from its Src internal ligand either by interaction with Alix Tyr319 or by mutation of Src Tyr527. Src phosphorylated Alix at a C-terminal region rich in tyrosines, an activity that was stimulated by the presence of the Alix binding partner SETA/CIN85. Phosphorylation of Alix by Src caused it to translocate from the membrane and cytoskeleton to the cytoplasm and reduced its interaction with binding partners SETA/CIN85, epidermal growth factor receptor, and Pyk2. As a consequence of this, Src antagonized the negative regulation of receptor tyrosine kinase internalization and cell adhesion by Alix. We propose a model whereby Src antagonizes the effects of Alix by phosphorylation of its C terminus, leading to the disruption of interactions with target proteins.