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A low potential electron carrier ferredoxin (E0′ ≈ −500 mV) is used to fuel the only bioenergetic coupling site, a sodium-motive ferredoxin:NAD+ oxidoreductase (Rnf) in the acetogenic bacterium Acetobacterium woodii. Because ferredoxin reduction with physiological electron donors is highly endergonic, it must be coupled to an exergonic reaction. One candidate is NADH-dependent caffeyl-CoA reduction. We have purified a complex from A. woodii that contains a caffeyl-CoA reductase and an electron transfer flavoprotein. The enzyme contains three subunits encoded by the carCDE genes and is predicted to have, in addition to FAD, two [4Fe-4S] clusters as cofactor, which is consistent with the experimental determination of 4 mol of FAD, 9 mol of iron, and 9 mol of acid-labile sulfur. The enzyme complex catalyzed caffeyl-CoA-dependent oxidation of reduced methyl viologen. With NADH as donor, it catalyzed caffeyl-CoA reduction, but this reaction was highly stimulated by the addition of ferredoxin. Spectroscopic analyses revealed that ferredoxin and caffeyl-CoA were reduced simultaneously, and a stoichiometry of 1.3:1 was determined. Apparently, the caffeyl-CoA reductase-Etf complex of A. woodii uses the novel mechanism of flavin-dependent electron bifurcation to drive the endergonic ferredoxin reduction with NADH as reductant by coupling it to the exergonic NADH-dependent reduction of caffeyl-CoA.
Ribosome biogenesis is best understood in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In human or mammalian ribosome biogenesis, it has been shown that basic principles are conserved to yeast, but additional features have been reported. Our understanding about the interplay between proteins and RNA in human ribosome biogenesis is far from complete.
The present study focused on the analysis of the human ribosome biogenesis co-factors PWP2, EMG1 and Exportin 5 (XPO5) to understand the degree of conservation of ribosome biogenesis. The proteins were characterized in respect to their localization and interaction partners. For the early 90S co-factor, PWP2, it was possible to pull down and identify the human UTP-B complex with MALDI mass spectrometry. Besides the orthologues of the members of this complex known in yeast (TBL3, WDR3, WDR36, UTP6, UTP18), the human UTP-B complex is not only conserved from yeast to humans, but contains also additional components, like the DEAD-box RNA helicase DDX21, which lacks a yeast orthologue. DDX21 was localized to the nucleus, assembled to the native UTP-B complex and co-precipitated also with other UTP-B complex members, presumably extending the functions of this complex in ribosome biogenesis.
This phenomenon was also observed for the 90S co-factor EMG1, an RNA methyltransferase, whose mutant form causes the Bowen-Conradi syndrome, if aspartic acid is mutated to glycine at position 86. This study revealed that the mutant, EMG1-D86G, clearly lost its nucleolar localization and co-precipitated to histones for unknown reasons.
A participation of the nuclear export receptor XPO5 in human ribosome biogenesis was shown in this study. Pulldown analysis, sucrose density gradients and UV crosslinking and analysis of cDNAs of XPO5 revealed the involvement of XPO5 in pre-60S subunit maturation. Moreover, besides the known pre-miRNAs and tRNAs as substrates for nuclear export, XPO5 crosslinked to snoRNAs. XPO5 was further demonstrated to interact with the miRNA Let-7a, which has an important regulatory function for MYC, a transcription factor required for ribosome biogenesis.
All results support a role of these proteins in human ribosome biogenesis and therefore it seems that the biogenesis of ribosomes in human cells requires additional components, like DDX21 and XPO5.
Due to recent technical developments, it became evident that the mammalian transcriptome is much more complex than originally expected. Alternative splicing(AS) and the transcription of long non-coding RNAs (lncRNAs) are two phenomenas which have been greatly underestimated in their frequency. Nowadays it is accepted that almost every gene has at least one alternative isoform and the number of lncRNAs exceeds the one of protein-coding genes.
We built user-friendly web interfaces which can process Affymetrix GeneChip Exon 1.0 ST Arrays (exon arrays) and GeneChip Gene 1.0 ST Arrays (gene arrays)for the analysis of alternative splicing events. Results are presented with detailed annotation information and graphics to identify splice events and to facilitate biological validations. Based on two studies using exon arrays, we show how our tools were used to profile genome-wide splicing changes under silencing of Jmjd6 and under hypoxic conditions. Since gene arrays are not intended for AS analysis originally, we demonstrated their applicability by profiling alternative splicing events during embryonic heart development.
To measure lncRNAs expressions with exon arrays, we completely re-annotation all probes and built a lncRNA specific annotation. To demonstrate the applicability of exon arrays in combination with our annotation, we profiled the expression of tens of thousands of lncRNAs. Further, our custom annotation allows for a detailed inspection of lncRNAs and to distinguish between isoforms, as we validated by RTPCR.
To allow for a general usage to the research community, we integrated the annotation in an easy-to-use web interface, which provides various helpful features for the analysis of lncRNAs.
Mitochondrial cristae morphology is highly variable and altered under numerous pathological conditions. The protein complexes involved are largely unknown or only insufficiently characterized. Using complexome profiling we identified apolipoprotein O (APOO) and apolipoprotein O-like protein (APOOL) as putative components of the Mitofilin/MINOS protein complex which was recently implicated in determining cristae morphology. We show that APOOL is a mitochondrial membrane protein facing the intermembrane space. It specifically binds to cardiolipin in vitro but not to the precursor lipid phosphatidylglycerol. Overexpression of APOOL led to fragmentation of mitochondria, a reduced basal oxygen consumption rate, and altered cristae morphology. Downregulation of APOOL impaired mitochondrial respiration and caused major alterations in cristae morphology. We further show that APOOL physically interacts with several subunits of the MINOS complex, namely Mitofilin, MINOS1, and SAMM50. We conclude that APOOL is a cardiolipin-binding component of the Mitofilin/MINOS protein complex determining cristae morphology in mammalian mitochondria. Our findings further assign an intracellular role to a member of the apolipoprotein family in mammals.
Im Zentralen Nervensystem (ZNS) kommunizieren neuronale Synapsen über eine Kombination von chemischen und elektrischen Signalen, die in ihrer Umgebung eine spezifische Komposition von Ionen benötigen. Um eine strenge Kontrolle des ZNS-Milieus zu gewährleisten, hat sich in Säugetieren eine endotheliale Blut-Hirn-Schranke (BHS) entwickelt. Die BHS limitiert den parazellulären Molekül Transport und wird von den Kapillargefässen des Gehirns gebildet, wobei die physische Barrier von den Tight Junctions (TJs) des vaskulären Endothels generiert wird. Das Gehirnendothel ist Teil einer neurovaskulären Einheit (NVE), zu der auch Perizyten (PZ), Astrozyten (AZ), Mikroglia und Interneurone zählen. Fehlkommunikation oder defekte zelluläre Komponenten in der NVE führen in der Regel zu Störungen in der BHS Funktion und können schwerwiegende neuronale Erkrankungen zur Folge haben.
Vor einigen Jahren haben wir und andere Forschungsgruppen herausgefunden, dass der Wnt/β-Catenin Signalweg essentiell für die Vaskularisierung des Gehirns während der Embryonalentwicklung ist und darüber hinaus auch eine bedeutende Rolle in der Induktion der BHS spielt. Des Weiteren konnte im Zebrafischmodell eine Aktivierung des kanonischen Wnt Signalweges auch im adulten Organismus nachgewiesen werden. Allerdings ist die Quelle der Wnt Wachstumsfaktoren bis dato unbekannt. Der Wnt Signalweg ist eine hoch konservierte und komplexe zelluläre Signalkaskade, die in allen mehrzelligen Organismen vorkommt. Wnt Wachstumsfaktoren sind sekretierte, hydrophobe Signalmoleküle, die sowohl über lange als auch kurze Strecken entweder den β-Catenin-abhängingen („kanonischen“) oder β-Catenin-unabhängingen („nicht-kanonischen“) Wnt Signalweg aktivieren können.
Da die meisten ZNS Erkrankungen mit einem Zusammenbruch der BHS-Funktion assoziiert sind, ist die Forschung bestrebt die Mechanismen, die der Entstehung und Aufrechterhaltung der BHS zugrunde liegen, zu ermitteln und zu verstehen. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es herauszufinden, ob AZ Wnts produzieren und ob deren Wirkung auf das Gehirnendothel an der Aufrechterhaltung der BHS beteiligt ist. Zu diesem Zweck, habe ich ein in vitro BHS Kokultivierungs-Modellsystem etabliert das erstmalig ausschliesslich auf der Verwendung von murinen AZ und Gehirnendothelzellen basiert. Zu Beginn der Studie wurden sowohl primäre AZ als auch eine murine Gehirnendothel-zelllinie (MBE) bezüglich ihrer zell-spezifischen Eigenschaften charakterisiert. Dabei konnte belegt werden, dass sowohl die primären AZ als auch die MBE Zelllinie, aufgrund ihrer Proteinexpressionsprofile als repräsentative Vertreter ihres Zelltyps eingestuft werden können. Die darauffolgenden Untersuchungen konnten zeigen, dass primäre AZ über mehrere Passagen hinweg fast alle 19 Wnt Liganden auf mRNA Ebene exprimierten. Ferner konnte in primären Gehirnendothelzellen und zwei Gehirnendothelzelllinien die korrespondierenden Frizzled (FZD) Rezeptoren und low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) Korezeptoren nachgewiesen werden. Dieser Befund legte Nahe, dass AZ und Gehirnendothelzellen die basalen Eigenschaften besitzen, um über den Wnt Signalweg miteinander zu kommunizieren. Die Stimulation von pMBEs mit Astrozyten konditioniertem Medium (AKM) induzierte die Hochregulation von Claudin-3 einem bekannten kanonischen Wnt Zielgens. Interessanterweise konnte diese Regulation teilweise durch die Zugabe von dickkopf 1 (Dkk1), einem Wnt/β-Catenin Antagonisten, inhibiert werden.
Um die physiologische Rolle der Wnt Liganden zu bestimmen, habe ich mir die Eigenschaft des universellen Sekretionsmechanismus der Wachstumsfaktoren, welcher von dem Transmembranprotein evenness interrupted (Evi) abhängig ist, zu Nutze gemacht. Die Verpaarung von Evifl/fl mit hGFAP-Cre Mäusen erlaubt die AZ-spezifische Deletion des Evi Proteins (Evi KO), was zur Folge hat, dass die Astrozyten der Nachkommen keine Wnt Wachstumsfaktoren sekretieren können.
In vitro führte der Verlust von Wnts in AKM zu einer teilweisen Delokalisierung von Junction Proteinen. Während die Kokultivierung mit Evi WT AZ einen straken Anstieg im TEER und reduzierte Permeabilitätsmesswerte induzierten, konnten diese pro-BHS Eigenschaften bei Evi KO AZ nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass Wnts sekretiert von AZ den BHS Phenotyp positive beeinflussen, indem sie die Zell-Zell-Verbindung verstärken, was wiederum zu erhöhtem Zellwiderstand und reduzierter transzellulärer Permeabilität führt. Die Analyse des in vivo Phänotyps von Evi KO Mäusen ergab, dass mit fortschreitendem, postnatalem Alter makroskopisch erkennbare zerebrale Blutungen auftraten. Ausserdem konnte ich zeigen, dass eine Subpopulation von Blutgefässen Malformationen aufwies, die mit reduzierter Astrozytenendfuss-Assoziierung einhergingen.
Das Wissen um die Beteiligung des Wnt Signalweges an der Regulation der BHS auch im adulten Organismus kann in Zukunft von wichtiger Bedeutung sein, da es potentielle therapeutische Anwendungen ermöglicht.
Protein quality control systems (PQC), i.e. UPS and aggresome-autophagy pathway, have been suggested to be a promising target in cancer therapy. Simultaneous pharmacological inhibition of both pathways have shown increase efficacy in various tumors, such as ovarian and colon carcinoma. Here, we investigate the effect of concomitant inhibition of 26S proteasome by FDA-approved inhibitor Bortezomib, and HDAC6, as key mediator of the aggresome-autophagy system, by the highly specific inhibitor ST80 in rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines. We demonstrated that simultaneous inhibition of 26S proteasome and selective aggresome-autophagy pathway significantly increases apoptosis in all tested RMS cell lines. Interestingly, we observed that a subpopulation of RMS cells was able to survive the co-treatment and, upon drug removal, to recover similarly to untreated cells. In this study, we identified co-chaperone BAG3 as the key mediator of this recovery: BAG3 is transcriptionally up-regulated specifically in the ST80/Bortezomib surviving cells and mediates clearance of cytotoxic protein aggregates by selective autophagy. Impairment of the autophagic pathway during the recovery phase, both by conditional knock-down of ATG7 or by inhibition of lysosomal degradation by BafylomicinA1, triggers accumulation of insoluble protein aggregates, loss of cell recovery and cell death similarly to stable short harpin RNA (shRNA) BAG3 knock-down. Our results are the first demonstration that BAG3 mediated selective autophagy is engaged to cope with proteotoxicity induced by simultaneous inhibition of constitutive PQC systems in cancer cell lines during cell recovery. Moreover, our data give new insights in the regulation of constitutive and on demand PQC mechanisms pointing to BAG3 as a promising target in RMS therapy.
Metastasic breast cancer is the leading cause of death by malignancy in women worldwide. Tumor metastasis is a multistep process encompassing local invasion of cancer cells at primary tumor site, intravasation into the blood vessel, survival in systemic circulation, and extravasation across the endothelium to metastasize at a secondary site. However, only a small percentage of circulating cancer cells initiate metastatic colonies. This fact, together with the inaccessibility and structural complexity of target tissues has hampered the study of the later steps in cancer metastasis. In addition, most data are derived from in vivo models where critical steps such as intravasation/extravasation of human cancer cells are mediated by murine endothelial cells. Here, we developed a new mouse model to study the molecular and cellular mechanisms underlying late steps of the metastatic cascade. We have shown that a network of functional human blood vessels can be formed by co-implantation of human endothelial cells and mesenchymal cells, embedded within a reconstituted basement membrane-like matrix and inoculated subcutaneously into immunodeficient mice. The ability of circulating cancer cells to colonize these human vascularized organoids was next assessed in an orthotopic model of human breast cancer by bioluminescent imaging, molecular techniques and immunohistological analysis. We demonstrate that disseminated human breast cancer cells efficiently colonize organoids containing a functional microvessel network composed of human endothelial cells, connected to the mouse circulatory system. Human breast cancer cells could be clearly detected at different stages of the metastatic process: initial arrest in the human microvasculature, extravasation, and growth into avascular micrometastases. This new mouse model may help us to map the extravasation process with unprecedented detail, opening the way for the identification of relevant targets for therapeutic intervention.
ß1-integrins are essential for angiogenesis but the mechanisms regulating integrin function in endothelial cells (EC) and their contribution to angiogenesis remain elusive. BRAG2 is a guanine nucleotide exchange factor for the small Arf-GTPases Arf5 and Arf6. The role of BRAG2 in EC and angiogenesis and the underlying molecular mechanisms remains unclear. siRNA-mediated BRAG2-silencing reduced EC angiogenic sprouting and migration. BRAG2-siRNA-transfection differentially affected a5ß1- and aVß3-integrin function: specifically, BRAG2-silencing increased focal/fibrillar adhesions and EC adhesion on ß1-integrin-ligands (fibronectin and collagen), while reducing the adhesion on the aVß3-integrin-ligand, vitronectin. Consistent with these results, BRAG2-silencing enhanced surface expression of a5ß1-integrin, while reducing surface expression of aVß3-integrin. Mechanistically, BRAG2 mediated recycling of aVß3-integrins and endocytosis of ß1-integrins and specifically of the active/matrix bound a5ß1-integrin present in fibrillar/focal adhesions (FA), suggesting that BRAG2 contributes to the disassembly of FA via ß1-integrin-endocytosis. Arf5 and Arf6 are promoting downstream of BRAG2 angiogenic sprouting, ß1-integrin-endocytosis and the regulation of FA. In vivo silencing of the BRAG2-orthologues in zebrafish embryos using morpholinos perturbed vascular development. Furthermore, in vivo intravitral injection of plasmids containing BRAG2-shRNA reduced pathological ischemia-induced retinal and choroidal neovascularization. These data reveals that BRAG2 is essential for developmental and pathological angiogenesis by promoting EC sprouting through regulation of adhesion by mediating ß1-integrin internalization and associates for the first time the process of ß1-integrin endocytosis with angiogenesis.
Autophagie ist ein evolutionär stark konservierter Degradationsmechanismus für geschädigte Proteine bis hin zu ganzen Organellen eukaryotischer Zellen. Dabei umhüllt eine Doppelmembran, bisher unbekannten Ursprungs, das zu degradierende Material und bildet das Autophagosom. Dies fusioniert später mit Lysosomen, wodurch dessen Inhalt proteolytisch zersetzt und die Bestandteile der Zelle wieder zur Verfügung gestellt werden kann.
In dieser Abeit wurde der Fokus auf den mitochondrialen Abbau über Autophagie (Mitophagie) und dessen Funktion als ein mitochondrialer Qualitätsmechanismus gesetzt. Als Zellmodell wurden primäre humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) verwendet. Diese zeichenen sich durch einen Übergang von einer mitotischen, jungen in eine lange postmitotische, seneszente Phase während der Kultiverungszeit aus. Dabei durchlaufen sie einer zelluläre und mitochondriale Morphologieänderung. , wodurch sich die Möglichkeit bot , die Autophagie unter verschiedenen Parametern zu betrachten.
So wird generell eine Abnahme des autophagosomalen / lysosomalen Weges mit dem Alter beschrieben und die Abhängigkeit der Mitophagie von der mitochondrialen Länge.
Mitophagie ist unter normalen Kultivierungsbedingungen ein mikroskopisch selten zu beobachtender Vorgang. Daher wurde ein mitochondriales Schädigungsystem etabliert, welches die photosensibiliesierende Wirkung des Farbstoffs MitoTracker Red Cmx Ros (MTR) nutzt, um Mitochondrien gezielt oxidativ zu schädigen und die Mitophagie zu aktivieren.
Mitotische HUVEC zeigten 2 h – 8 h nach oxidativer Schädigung eine mitochondriale Fragmentierung größtenteils begleitet von einem Verlust des Membranpotentials. Über einen Zeitraum von 72h-120h kam es zur Regeneration des mitochondrialen Netzwerks durch Neusynthese mitochondrialer Biomoleküle. Entgegen der rescue Hypothese konnten oxidativ geschädigte Mitochondrien nicht durch eine Fusion mit funktional intakten Mitochondrien gerettet werden und wurden über den autophagosomalen / lysosomalen Weg abgebaut, gekennzeichnet durch die Ubiquitin-Ligase Parkin vermittelte Markierung und finaler Kolokalisation mit den autophagosomalen und lysosomalen Markerproteinen LC3B und LAMP-2A. Auf mRNA- und Proteinebene zeigte sich in diesem Zeitraum eine erhöhte Expression autophagie-relevanter Gene (ATGs) ATG5, ATG12 und LC3B.
Der Vergleich von mitotischen mit postmitotischen HUVEC nach oxidativer Schädigung wies zwei grundlegende Unterschiede auf.
Zum einem behielten, in Gegensatz zu jungen Zellen, die Mitochondrien alter HUVEC ihre Morphologie und ihr Membranpotential bei. Diese erhöhte Widerstandfähigkeit gegenüber oxidativem Stress konnte auf die erhöhte Expression der mitochondrial lokalisierten Serin / Threonin Kinase PINK1 zurückgeführt werden, ein Schlüsselgen in Parkinson.
Die PINK1-Transkription stand invers zu der Expression der mitochondrialen Teilungsfaktoren Fis1- und Drp1, welche in postmitotischen HUVEC stark vermindert war.
Andererseits wiesen alte Zellen eine verminderte Degradationsfähigkeit geschädigter Mitochondrien auf. Dieser Umstand war durch eine verminderte lysosomale Azidität bedingt. Eine externe ATP-Zugabe förderte die Azidität der Lysosomen alter Zellen und die Fusion mit Autophagosomen, wodurch Mitochondrien und ihre geringere ATP-Produktion im Alter als ein Faktor der Autophagie ermittelt weden konnte.
Die Autophagierate steht in Verbindung mit der Lebensspanne von Zellen bis hin zu ganzen Organismen. Durch die Überexpression autophagie-relevanter GFP-Fusions-Proteine ATG5, ATG12 und LC3B, welche nach oxidativer Schädigung in ihrer Expression verstärkt wurden, förderten die Mitophagie und wurden stabil in junge HUVEC exprimiert. Diese Überexpressionen bewirkten eine verbesserte mitochondriale Qualität, veranschaulicht durch ein erhöhtes Membranpotential und die ATP-Bereitstellung, einer besseren mtDNA Integrität und sie verlängerten die Lebensspanne signifikant, wobei die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezien (ROS), entgegen der von Harman aufgestellten Alterungstheorie, keine Verminderung zeigte. Dennoch wiesen sie einen erhöhten Gehalt oxidativ modifizierter Proteine auf, welche letztendlich auf die erhöhten Autophagosomenanzahl zurückgeführt werden konnte, in denen höchstwahrscheinlich das oxidativ geschädigte Material gelagert wird.
In dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass Mitochondrien nach oxidativer Schädigung eine Teilung vollziehen und geschädigte Mitochondrien selektiv über Autophagie abgebaut werden. Dabei fungiert Mitophagie als ein mitochondrialer Qualitätmechanismus und steht unmittelbar mit der Lebensspanne in Verbindung.
The antibacterial properties of nanosilver have led to a versatile application spectrum including medical purposes and personal care products. However, the increasing use of nanosilver has raised concerns about its environmental impacts. Long-term exposure studies with aquatic invertebrates are essential to assess possible adverse effects on aquatic ecosystems. In the present study, acute (48 h), chronic (21 d) and long-term effects of nanosilver (primary size 15 nm) on five successive generations of three Daphnia species (D. magna, D. pulex, and D. galeata) were investigated. Acute EC50 values of nanosilver were 121 µg Ag L−1 for D. magna being the least sensitive species and 8.95 and 13.9 µg Ag L−1 for D. pulex and D. galeata, respectively. Chronic exposure provided EC10 values of 0.92 µg Ag L−1 for D. magna showing the most sensitive chronic reaction and 2.25 and 3.45 µg Ag L−1 for D. pulex and D. galeata, respectively. Comparative exposure to AgNO3 revealed a generally higher toxicity of the soluble form of silver. The multi-generation experiments resulted in effects on the population level for all tested species. Exposure of D. magna indicated an increased toxicity of nanosilver in the fifth generation of animals exposed to 10 µg Ag L−1. Neonates from pre-exposed parental daphnids did not completely recover when transferred into clean water. Exposure of D. pulex and D. galeata revealed not only increasing toxicity in some generations, but also greater tolerance to nanosilver. This study contributes to the assessment of the risk potential of nanosilver on aquatic ecosystems. It shows that effects of nanosilver vary within one genus and change with exposure duration. Therefore, long-term studies considering different aquatic species are needed to better understand the possible effects of nanosilver on aquatic ecosystems.