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Haematopoietic stem cells (HSCs) are regarded as the prime target for gene therapy of inherited and acquired disorders of the blood system, e.g. X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD). The major reason for this is that HSCs posses the ability to self renew as well as the potential to differentiate into all lineage-specific cell types. However, the need to reach and to maintain sufficient therapeutic levels of genetically modified stem cells and their progeny after gene delivery still presents major challenges for current HSC gene therapy approaches. In particular, one of the main limitations for most genetic defects is the lack of a selective growth advantage of gene-modified cells after engraftment. In vitro and in vivo methods have been developed that focus on either positive or negative selection of HSCs. An artificial selection advantage can be conferred to transduced HSCs by incorporating a selection marker in addition to the therapeutic transgene. In the present study, two novel strategies for positive selection of murine gp91phox gene-modified haematopoietic stem cells were developed and tested, bearing in mind that with selective growth advantage, the possibility of uncontrolled proliferation arises. The first strategy to be investigated was based on the homeobox transcription factor HOXB4, which plays an important role in the control of haematopoietic stem cell proliferation and differentiation. Overexpression of a retroviral bicistronic construct containing the therapeutic gene gp91phox and HOXB4 in murine primary bone marrow cells led to a significant 3–4-fold expansion of transduced cells ex vivo. The numbers of transgene-expressing cells increased 2–3-fold after 2 weeks cultivation under cytokine stimulation. Furthermore, the clonogenic progenitor cell assay (CFU assay) demonstrated that the number of colony-forming cells had increased to levels 2-fold higher than those of mock-transduced cells after 1 week of culture, thereby augmenting the presence of a significant number of stem/progenitor cells in the selected cell population. However, in our experiments, HOXB4-overexpressing murine HSCs did not show any repopulating advantage in transplanted recipient mice over control construct-transduced HSCs. These results indicate that selective expansion of gp91phox gene-modified HSCs can be induced by the HOXB4 transcription factor ex vivo but not in vivo. This is possibly dependent on HOXB4 expression levels, which are too low in vivo to achieve selection. The second strategy made use of a chemically inducible dimerizer system consisting of the therapeutic gene gp91phox and a fusion protein, containing sequences from a growth factor receptor signalling domain (epidermal growth factor receptor, EGFR, or prolactin receptor, PrlR) and the drug binding protein FKBP12, as the selection cassette. This strategy aimed to allow inducible selection that could be easily switched off. The activity of these fusion proteins is controlled through the small molecular dimerizer AP20187. Transduction of BaF/3 cells with lentiviral vectors expressing the EGFR construct induced proliferation and led to complete selection within 18 days (99%). However, removing AP20187 could not turn off proliferation. This construct is, therefore, not suitable as a selection cassette for the expansion of gene-modified HSCs due to its oncogenic potential. Transduction of the construct containing the intracellular domain of PrlR caused significant selective expansion of AP20187-treated BaF/3 cells. Following expression in cells, the fusion protein, which lacks membrane-anchoring sequences, mainly localized to the cytoplasm. Evidence was found to indicate that activated STAT5 might be responsible for this effect. Upon expression of the prolactin construct, phosphorylation of STAT5 and its DNA-binding activity to a ß-casein promoter sequence was strongly increased. Importantly, the induced proliferation was reversible after removal of AP20187. Transduced Sca1+ bone marrow cells obtained from C57BL/6-CD45.1 mice could be expanded about 20–100-fold ex vivo in the presence of AP20187 and mSCF without losing progenitor cell features and the capability to contribute to all lineages of the haematopoietic system. To exclude oncogenic outgrowth of one single clone, the polyclonality of selected cells was proven by ligation-mediated PCR (LM-PCR) analysis. In mouse transplantation experiments, ex vivo-expanded cells repopulated the bone marrow of lethally irradiated mice suggesting that the ex vivo expansion took place at the level of haematopoietic stem and/or progenitor cells. Genomic gp91phox sequences were detected in the bone marrow, spleen and peripheral blood cells of transplanted animals, indicating that gp91phox-containing cells most likely contributed to the reconstitution of haematopoiesis in these mice.
Identifikation eines neuen Brustkrebsantigens NW-BR-3 mittels serologischem Screening (SEREX)
(2005)
Die Tumortherapie hat in den letzten Jahren, vor allem durch die Etablierung neuer molekularbiologischer Techniken, die den Tumor mittels spezifischer immunologischer Methoden angreifen, enorme Fortschritte erzielt. Nach wie vor ist das Mammakarzinom eine der häufigsten Krebsarten der Frau und immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Die bisherigen nicht chirurgischen Therapiestrategien richten sich in erster Linie gegen die allgemeine Zellteilung (Strahlen- oder Chemotherapie) oder sind Antagonisten gegen einen Hormonrezeptor. Die Hinwendung zu speziellen molekularbiologischen Zielen mittels Antigenen scheint hier neue Möglichkeiten der Therapie zu eröffnen. So konnten Boon et al. Ziele von zytotoxischen T-Zellen bei Melanomen isolieren. Die hiermit gefundenen Antigene weisen ein gemeinsames charakteristisches Merkmal auf: ihre Expression in Normalgeweben ist auf Keimzellen in Testis und Ovar beschränkt. Folgerichtig wurde diese Klasse von Antigenen als cancer-testis Antigene beschrieben. Diese Technik stößt jedoch an ihre Grenzen, sobald die Etablierung von stabilen T-Zellinien in bestimmten Tumore nicht gelingt. Pfreundschuh et al. entwickelten daher die SEREX (Serological Analysis of cDNA Expression libraries) genannte Klonierungstechnik, die Antigene basierend auf einer spontanen humoralen Immunantwort des Patienten identifiziert, und somit auf die Etablierung von Zellinien verzichtet. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Identifizierung neuer Tumorantigene als potentielle Zielantigene für Immuntherapiestrategien beim Mammakarzinom. In einem Mammakarzinomscreening identifizierten wir die bereits zuvor beschriebenen Tumorantigene NY-BR-1 und SCR1, sowie ein weiteres, bisher unbekanntes Antigen NW-BR-3, welches ein Cancer-Testis ähnliches Expressionsmuster zeigt. Die Expression dieser Antigene und Implikationen für Immuntherapieansätze wird diskutiert.
Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um den Einfluss der präanalytischen Temperatur- und Lagerungsbedingungen für die Bestimmung der VWF-Parameter eingehender zu untersuchen. Wir untersuchten bei 10 gesunden Personen, 10 Patienten mit von Willebrand-Syndrom Typ 1, 5 Patienten mit VWS Typ 2 und 10 Patienten der neurochirurgischen Klinik den Einfluss verschiedener Lagerungsbedingungen auf VWF:RCo, VWF:Ag, VWF:CB, APTT und FVIII:C. Pro Patient entstanden so folgende Proben: PS Das Blut (ein Röhrchen) wurde sofort zentrifugiert und der Überstand anschließend bei 80° C eingefroren. CR3/CR6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden bei Raumtemperatur gelagert, daraufhin zentrifugiert und eingefroren.. CE3/CE6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden in Eis gelagert, dann zentrifugiert und eingefroren. CK3/CK6 Das Citratblut (zwei Röhrchen) wurde für drei bzw. sechs Stunden zwischen zwei Kühlakkus gelagert, anschließend zentrifugiert und eingefroren. PR3/PR6 Der Plasmaüberstand aus einem Citratröhrchen wurde nach der Zentrifugation abpipettiert, auf zwei Reagenzgläser verteilt und für drei bzw. sechs Stunden bei Raumtemperatur gelagert und danach eingefroren. PE3/PE6 Der Plasmaüberstand aus einem Citratröhrchen wurde nach dem Zentrifugieren abpipettiert, auf zwei Reagenzgläser verteilt und für drei bzw. sechs Stunden in Eis gelagert und nachfolgend eingefroren. Wie man an Hand der Ergebnisse sehen kann, verursachte die gekühlte Lagerung von Citratvollblut teilweise dramatische Veränderungen der Ausgangswerte PS. Zusammenfassend fanden wir keine Kälteinduzierte Erniedrigung der VWF-Parameter im Plasma und bei Patienten mit VWS, Typ 2 ohne messbare Ristocetin-Cofaktor-Aktivität. Auf Grund dieser Ergebnisse nahmen wir an, dass der Kälte-induzierte Verlust der VWF-Parameter und der Faktor VIII-Aktivität zum einen die Gegenwart von Thrombozyten und zum anderen die Anwesenheit hochmolekularer vWF-Multimere benötigte. Wir vermuteten, dass es nur bei Anwesenheit von Thrombozyten und HMW-VWF zu einem hochgradig kälteinduzierten Verlust von VWF:RCo, VWF:Ag und FVIII:C kommt. Von Berger et al (1998) wurde bereits publiziert, dass sich die Thrombozyten bei Kälteeinwirkung in ihrer Zytoskelettstruktur verändern. Hoffmeister et al. (2003) konnten eine kälteinduzierte Zusammenlagerung der GPIb-Rezeptoren n der Thrombozyten-Zelloberfläche beobachten. Wir nahmen an, dass der kälteinduzierte Verlust des VWF auf eine durch Kälte geförderte Bindung des VWF an Thrombozyten, wahrscheinlich durch die gesteigerte Zugänglichkeit der GPIba Untereinheit des vWF, zurückzuführen ist. Auf Grund unserer Ergebnisse empfehlen wir Blut zur Analyse der vWF-Parameter bei Raumtemperatur und nicht bei 4°C zu lagern, ebenso Blutproben zur Bestimmung nicht auf Eis zu verschicken. Empfehlungen für die Behandlung von Blutproben für die Gerinnungsdiagnostik: Die Blutentnahme soll wegen der möglichen tageszeitlichen Schwankungen zwischen 7.00 Uhr und 9.00 Uhr erfolgen. Eine lange und intensive Venenstauung ist zu vermeiden. Die Blutabnahme sollte mit einer großlumigen Kanüle, unter einem gleichmäßigen und zügigem Bluteinstrom, erfolgen. Bei der Abnahme mehrerer Blutentnahmeröhrchen sollte die Gerinnungsdiagnostik erst als zweites oder drittes Röhrchen entnommen werden, um eine Kontamination mit Gewebsthrombokinase zu vermeiden. Das Gerinnungsröhrchen sollte bis zu Markierung gefüllt sein und anschließend mehrfach geschwenkt werden, um eine gleichmäßige Durchmischung von Antikoagulans und Blut zu gewährleisten (Fiedler et al, 2004). Für eine unmittelbare Untersuchung sollte die Lagerung bei Zimmertemperatur erfolgen, Aufbewahrung im Kühlschrank sollten durch Kälteaktivierung unbedingt vermieden werden, da dies zu Gerinnungszeitveränderungen führen kann. Dies steht im Gegensatz zu den NCCLS-Richtlinien von 1998 (Wayne, 1998), die vorgaben, dass für Gerinnungsanalysen verwendete Proben gekühlt gelagert werden sollten, wenn sie nicht innerhalb von zwei Stunden getestet werden können. Bei einer für einen späteren Zeitpunkt geplanten Untersuchungen sollte Citratplasma portioniert eingefroren werden. Das Auftauen der gefrorenen Proben sollte im Wasserbad bei 37°C erfolgen, wobei auf gründliche Durchmischung und vollständige Lösung eventueller Kryopräzipitate zu achten ist. Die anschließende Untersuchung muß unverzüglich erfolgen, da die Stabilität verschiedener Faktoren nach dem Auftauen herabgesetzt ist (Lutze et al, 1999). Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist nicht zulässig. Die Durchführung der Globaltests sollte maximal vier Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt worden sein (Guder et al, 2000; Guder et al, 2002; Narayanan, 2000;Tilsner et al, 1986). Die Bestimmung der Faktor VIII-Aktivität sollte jedoch bis spätestens zwei Stunden nach der Blutentnahme abgeschlossen sein (Lutze et al, 1999; Müller, 1993).
The illusion of apparent motion can be induced when visual stimuli are successively presented at different locations. It has been shown in previous studies that motion-sensitive regions in extrastriate cortex are relevant for the processing of apparent motion, but it is unclear whether primary visual cortex (V1) is also involved in the representation of the illusory motion path. We investigated, in human subjects, apparent-motion-related activity in patches of V1 representing locations along the path of illusory stimulus motion using functional magnetic resonance imaging. Here we show that apparent motion caused a blood-oxygenation-level-dependent response along the V1 representations of the apparent-motion path, including regions that were not directly activated by the apparent-motion-inducing stimuli. This response was unaltered when participants had to perform an attention-demanding task that diverted their attention away from the stimulus. With a bistable motion quartet, we confirmed that the activity was related to the conscious perception of movement. Our data suggest that V1 is part of the network that represents the illusory path of apparent motion. The activation in V1 can be explained either by lateral interactions within V1 or by feedback mechanisms from higher visual areas, especially the motion-sensitive human MT/V5 complex.
Prostaglandin E2 is the major prostaglandin involved in colorectal carcinogenesis. The biosynthesis of prostaglandin E2 is accomplished by several terminal prostaglandin E synthases through catalytical conversion of the cyclooxygenase product prostaglandin H2. Among the known terminal prostaglandin E synthases, microsomal prostaglandin E synthase type 1 and type 2 were found to be overexpressed in colorectal cancer, however the role and regulation of these enzymes in this tumor entity are yet not fully understood. Here we report that the cyclopentenone prostaglandins 15-deoxy-D12,14-prostaglandin J2 and prostaglandin A2, which have been shown to modulate cell growth and neoplasia, selectively down-regulate microsomal prostaglandin E synthase type 2 mRNA and protein expression in the human colorectal carcinoma cell lines Caco-2 and HCT 116. This effect appeared to be PPARgamma independent and was not found to require G-protein-coupled receptor activation. Instead, inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 by cyclopentenone prostaglandins may be mediated by covalent binding of the cyclopentenone ring to cysteine residues on signalling molecules or via a redox-dependent mechanism. Inhibition of microsomal prostaglandin E synthase type 2 was subsequently followed by decreased prostaglandin E synthase activity, which in turn contributed at least in part to the anti-proliferative action of cyclopentenone prostaglandins in HCT 116 cells. Collectively, these data unravel a novel mechanism for the growth-inhibitory effects of cyclopentenone prostaglandins and expose microsomal prostaglandin E synthase type 2 as a new potential target for pharmacological intervention in the treatment of colorectal cancer.
This thesis presents a model for the dynamical description of deconfined quark matter created in ultra-relativistic heavy ion collisions, treating quarks and antiquarks as classical point particles subject to a colour-dependent, Cornell-type potential interaction. The model provides a dynamical handle for hadronization via the recombination of quarks and antiquarks in colour neutral clusters. Gluons are not included explicitly in the model,but are described in an effective manner by the means of the potential interaction. The model includes four different quark flavours (up, down, strange and charm) and uses current masses for the quarks. The dynamical evolution of a system of colour charges subject to the Hamiltonian equations of motion of the model yields the formation of colour neutral clusters of quarks and antiquarks, which are subject only to a small remaining interaction, the strong interquark potential notwithstanding. These clusters can be mapped onto hadrons and hadronic resonances. Thus, the model allows a dynamical description of quarks degrees of freedom in heavy ion collisions, including a recombination scheme for hadronization. The thermal properties of the model turn pout to be very satisfying. The model shows a transition from a confining phase to a deconfined phase with rising temperature, going hand in hand with a softest point in the equation of state and a rise of energy density and pressure to the Stefan-Boltzmann limit of a gas of quarks and antiquarks. Moreover, the potential interaction is screened in the deconfined phase. For the dynamical description of ultra-relativistic heavy ion collision, the qMD model is coupled to UrQMD as a generator for its initial conditions. In this way, a fully dynamical description of the expansion and hadronization of the fireball created in such collisions can be achieved. Non-equilibrium aspects of the expansion dynamics and hadronization by recombination of quarks and antiquarks are discussed in detail, and a comparison with experimental data of collisions at the CERN-SPS is presented. The big advantage of the qMD model is the possibility to study cluster formation, including exotic clusters, and fluctuations in a dynamical manner. As an example, event-by-event fluctuations in electric charge are studied. Such fluctuations have been proposed as a clear criterion to distinguish a deconfined system from a hadrons gas. However, experimental data show hadron gas fluctuation measures even at RHIC, where deconfinement is taken for granted. We will see how the dynamics of quark recombination washes out the quark-gluon plasma signal in the fluctuation criterion. Moreover, we will discuss briefly the problem of entropy at recombination. In a second application, the formation of exotic hadronic clusters, larger than usual mesons and baryons, is studied. Such clusters could provide new measures for the thermalization and homogenization of a deconfined gas of colour charges. Moreover, number estimates for exotic clusters from recombination are considerably lower than corresponding predictions from thermal models, providing a clear difference between statistical hadronization and hadronization via quark recombination. A detailed analysis is provided for pentaquark candidates such as the Theta-Plus. It turns out that the distribution of exotic states over strangeness, isospin, and spin could provide a sensitive measure for thermalization and decorrelation in the deconfined quark phase, if it could be measured.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Arzt-Patient-Beziehung von HIV-Patienten im Hinblick auf bestehende Adherence-Probleme mithilfe qualitativer Methoden untersucht. Dieser Aspekt wurde in der Adherence-Forschung im HIV-Bereich entgegen den Tendenzen der allgemeinen Adherence-Forschung, im Rahmen derer die Arzt-Patient-Beziehung als bedeutsamer Einflussfaktor gilt, bislang nur wenig berücksichtigt. 20 an der Untersuchung teilnehmende Patienten wurden in der HIV-Ambulanz der Universität Frankfurt dergestalt rekrutiert, dass durch ärztliche Zuordnung zwei vergleichbare Gruppen, adhärente und wenig adhärente Patienten, entstanden. Gleichzeitig schätzen die behandelnden Ärzte und die Patienten das Medikamenteneinnahmeverhalten mithilfe von Fragebögen ein. Die Einstufung der Ärzte in eine der beiden Gruppen „adhärent/nicht adhärent“ zeigte in der vorliegenden Untersuchung eine relative Übereinstimmung mit der Selbstbeurteilung der Patienten (Exakter Test nach Fisher: p=0,017). Den Patienten schien es ungeachtet ihrer Adherence schwer zu fallen, sich an ein exaktes zeitliches Einnahmeschema zu halten. Das Mittel der eingenommenen Medikamente lag nach ärztlicher Schätzung für die Patienten der adhärenten Gruppe bei 97% (SD=4) der verordneten Medikamente und für die der nicht adhärenten Gruppe bei 69% (SD=17). Bei der Auswertung des Ärztefragebogens fiel auf, dass der Schwellenwert der Adherence für die befragten Ärzte nicht klar definiert zu sein scheint. Eine wissenschaftlich gesicherte (Neu-)Bestimmung dieses Schwellenwertes der Adherence könnte eine Entlastung von den aus dieser Unsicherheit resultierenden Konflikten für den Patienten bedeuten. Zur Exploration der Arzt-Patient-Beziehung aus der Patientensichtweise wurde auf die handlungsorientierte Methode des Psychodramas zurückgegriffen. Die mittels Rollentausch ermöglichten Inszenierungen eines Arzt-Patient-Gespräches wurden mit Videokameras dokumentiert. Die Auswertung der transkribierten Videos geschah mithilfe der Methode der objektiven Hermeneutik. Aus der Stichprobe wurde durch Kontrastierung eine Auswahl von vier Patienten getroffen. Dies geschah nach den Kriterien „adhärent“ vs. „nicht adhärent“ und „Rollentausch möglich“ vs. „kein Rollentausch möglich“. Es konnte eine Spezifität der untersuchten Patienten abgebildet werden, die nach Heranziehung einschlägiger Literatur durchaus als HIV-typisch verstanden werden kann: In den Darstellungen der Arzt-Patient-Beziehungen imponierten diffuse Nähe-Distanz-Regelungen sowie eine Nicht-Einhaltung des traditionellen asymmetrischen Arzt-Patient-Verhältnisses. Die Patienten traten in übertragungsreichen Beziehungen mit Vergemeinschaftungstendenzen an den Arzt heran. Erklärungsansätze hierfür könnten sein: Eine Traumatisierung durch die HIV-Infektion, eventuell ein kumulatives Trauma einschließend; eine vermeintliche, auf bereits bestehende subkulturelle Identitäten aufbauende „HIV-Identität“; die besondere Stellung der HIV-Infektion im Gesundheitssystem sowie das Fortdauern bereits der Prä-HAART-Ära entstammender Strukturen; ein allgemeinen Wandel des Gesundheitssystems und/oder ein einrichtungsspezifischer Einfluss. Aufbauend auf diese strukturellen Besonderheiten wurde eine Hypothese für die weitere Beschäftigung mit dem Thema „Adherence bei HIV-infizierten Patienten“ generiert: Entsprechend der Kontrastierung nach adhärenten vs. nicht adhärenten Patienten ließe sich als Erklärungsmodell folgern, dass die HIV-Patienten unter der Bedingung, dass ihr Verhältnis zum Arzt ein Besonderes ist, bereit sind, den ärztlichen Anweisungen zu folgen. Daraus könnte ein individueller Grad der Bedürftigkeit bzw. eines Wunsches, als etwas Besonderes in der Beziehung zu ihrem Arzt anerkannt zu werden, resultieren, bei dessen Überschreitung der Patient sich adhärent verhielte. Demnach könnte sich die Zufriedenheit mit der Arzt-Patient-Beziehung als Befriedigung der Bedürftigkeit bzw. o.g. Wunsches verstehen lassen. Die Hypothese legt weiterhin nahe, dass Adherence-Probleme vornehmlich auf einen Selbstwertkonflikt als Konfliktmuster bzw. eine Selbstwertregulierung innerhalb der bestehenden Arzt-Patient-Beziehung zurückführbar wären. Inwieweit die Ausprägung dieser Konfliktstruktur für adhärentes bzw. nicht adhärentes Verhalten verantwortlich ist, ist in weiterführenden Untersuchungen zu klären. Im Rahmen der Einzelfallanalysen offenbarten sich Probleme, die in einer normalen Arzt-Patient-Beziehung kaum lösbar sind. Den hohen Erwartungen an die Adherence entsprechend sollten demnach Strategien ausgebildet werden, mittels derer nach hinreichender Diagnostik eine Behandlung der nicht zur Adherence fähigen Patienten durch verschiedene Interventionen möglich wird. Diese sollten dem individuellen Problem gebührend von psychoedukativen Herangehensweisen über psychotherapeutischen Maßnahmen bis hin zu speziellen Projekten, innerhalb derer eine Behandlung der nicht zur der Adherence fähigen Patienten angeboten wird, reichen.
Nucleotide-binding domains (NBDs), roughly 27 kDa in size, are conservative components of the large family of ABC (ATP-binding cassette) transporters, which includes importers, exporters, and receptors. NBDs or ABC-ATPases supply energy for the translocation of a vast variety of substrates across biological membranes. Despite their hydrophilic sequence, many NBDs tend to aggregate and precipitate in solution upon isolation from the complete transporter. The conditions stabilizing an extremely labile NBD component of the E.coli HlyA transporter, HlyB-NBD, were developed. As a result, the pure highly concentrated enzyme was protected from precipitation for months that allowed screening of the unlimited crystallization conditions in the presence of different substrates and performance of the reproducible functional assays. HlyB-NBD was characterized in regard to its uncoupled ATPase activity, oligomeric state, and stability in solution. Comparative analysis of protein stability and ATPase activity in various buffers suggested an inverse relationship between the two. Kinetic analysis of ATPase activity revealed ATP-induced protein dimerization. Gel-filtration experiments with the wild type protein and H662A-mutant of HlyB-NBD provided further evidence of protein dimerization in the presence of ATP. The crystal structures in post- and pre-hydrolysis nucleotide-bound states of HlyB-NBD were determined at 1.6Å and 2.5Å resolution, respectively. While the hydrolytically deficient H662A mutant of HlyB-NBD was crystallized as a stable dimer in the presence of ATP or ATP-Mg2+, with two nucleotide molecules sandwiched between the two monomers, the same protein was shown to be a monomer in the ADP-loaded state. The wild type protein failed to develop crystals with bound ATP, yet formed ADP-bound crystals identical to those of the H662A-mutant. The X-ray structures of HlyB-NBD in various states of the hydrolytic cycle and the functional studies of the enzyme have provided an opportunity to characterize enzyme-substrate complexes and protein-protein interactions between the NBD subunits in great detail. Comparison of the nucleotide-free, the ADP-, and the ATP-loaded states revealed oligomeric and conformational changes of the protein upon substrate binding and resulted in a molecular picture of the catalytic cycle. The correlated results of the structural and functional investigations of HlyB-NBD are discussed with relation to the mechanism of action of ABC transporters.
Zielsetzung dieser Arbeit war die Klärung der Frage inwieweit Schlafstörungen, die schon während der Trinkphase auftreten, in einem Zusammenhang mit Schlafstörungen im Entzug stehen. Ebenso sollte untersucht werden, ob Schlafstörungen in der Trinkphase eine Vorhersage über die Schwere des Entzugs gestatten und damit als Indikator für den Entgiftungsverlauf und möglicher Komplikation dienen können. Der Anspruch dieser Arbeit war dabei, die Grundlagen für die Entwicklung eines Instrumentariums für die Indikationsstellung stationäreversus ambulante Entgiftungstherapie zu schaffen. Zur Klärung der Fragen wurden im Rahmen einer explorativen Untersuchung Patienten befragt und klinisch- neurologisch sowie labortechnisch untersucht. Die Stichprobe wurde rekrutiert aus konsekutiv im Zeitraum von Juni 2002 bis August 2003 zur Entgiftung im Zentrum der Psychiatrie des Klinikums der J.W. Goethe- Universität Frankfurt aufgenommenen Patienten. Sie umfasste 100 Alkoholkranke, die die ICD-10 Kriterien für eine Alkoholabhängigkeit (Dilling et al., 2000) erfüllten. Ausschlußkriterium war hierbei eine Verweildauer von weniger als 72 Stunden. Eine weitere Voraussetzung war die Fähigkeit und die freiwillige Bereitschaft, an einer in etwa insgesamt 30minütigen Befragung teilzunehmen. Für die Untersuchung wurde ein spezieller Fragenkatalog aus 5 unterschiedlichen Fragebögen erstellt. Die Antwortkategorien waren abgestufte Antworten, sowie größtenteils Multiple- Choice- Fragen. Lediglich die Anamnese wurde anhand eines standardisierten Anamnesebogens in offener Frageform erfasst. Es wurden soziodemographische Daten sowie Daten zum bisherigen Verlauf der Alkoholerkrankung und der Schlafqualität erhoben.
We present a biologically-inspired system for real-time, feed-forward object recognition in cluttered scenes. Our system utilizes a vocabulary of very sparse features that are shared between and within different object models. To detect objects in a novel scene, these features are located in the image, and each detected feature votes for all objects that are consistent with its presence. Due to the sharing of features between object models our approach is more scalable to large object databases than traditional methods. To demonstrate the utility of this approach, we train our system to recognize any of 50 objects in everyday cluttered scenes with substantial occlusion. Without further optimization we also demonstrate near-perfect recognition on a standard 3-D recognition problem. Our system has an interpretation as a sparsely connected feed-forward neural network, making it a viable model for fast, feed-forward object recognition in the primate visual system.
The analysis of doxorubicin-loaded poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles in in vitro glioma models
(2005)
The use of doxorubicin for the treatment of glioma tumours would be an important approach in the chemotherapy treatment since doxorubicin is a very effective neoplastic agent. However, one problem faced by the use of doxorubicin for the treatment of brain tumours is the fact that doxorubicin is a substrate of an efflux pump protein, P-glycoprotein (P-gp), which is located on the luminal side of the brain capillary endothelium and in many tumour cells, which acts pumping out of the cell such substrate, and blocking its transport into the cell. A strategy to enhance the doxorubicin delivery into the brain would be the use of nanoparticles. This work showed, that the treatment of doxorubicin bound to poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles decreased the viability of the three glioma cell lines, the GS-9L, the RG-2, and the F-98 cell lines significantly in comparison to doxorubicin in solution, indicating an improvement of the nanoparticles-bound doxorubicin transport into the cells. The modification of the nanoparticles surface with different surfactants may even enhance the delivery of the drug into the cells. Searching for an improvement of the doxorubicin internalization, the nanoparticles surface was modified using polysorbate 80, poloxamer 188 and poloxamine 908 surfactants. The poloxamer 188 and polaxamine 908 surfactant modified nanoparticles did not show a significant enhancement of the doxorubicin internalization. Contrary, the treatment of polysorbate 80 surfactant modified nanoparticles led in some cases to a significant decrease of cancer cell viability. The use of doxorubicin in the three glioma cell lines allowed the measurement of different responses towards doxorubicin treatment. The different responses were due to the entry of various amounts of doxorubicin into the glioma cells, which express the P-glycoprotein in their cellular membrane. A higher level of the P-gp expression correlated with a weaker response towards the doxorubicin treatment. The GS-9L cell line showed a significant higher level of P-gp expression than the F-98, and RG-2 cell lines, and consequently, the GS-9L cell line presented the highest resistance to doxorubicin with the highest viability values after doxorubicin treatment. Due to the fact that the transport of doxorubicin is governed by the activity of the P-gp in the studied glioma cells, the use of poloxamer 185 as a P-gp inhibitor resulted in an enhancement of the uptake as well as of the accumulation of doxorubicin into the cells. The effect of poloxamer 185 on the doxorubicin uptake was significant marked in the case of doxorubicin-resistance cells, as the GS-9L cell line. In some cases, the presence of the nanoparticles formulation showed also an influence on such uptake improvement. The use of a P-gp inhibitor in combination with chemotherapeutic agents leads to encouraging results. Because of the wide spectrum of substances acting as P-gp inhibitors, the exact inhibitory mechanisms remain still unclear. For instance in our results the evaluation of a described P-gp inhibitor, polysorbate 80 did not show an important improvement in the doxorubicin uptake in the P-gp-expressing cell line, GS-9L. On the other hand, the Polysorbate 80-Dox-PBCA nanoparticles formulation decreased in greater extend the viability of the glioma cells than the poloxamer185-Dox-PBCA nanoparticles. Although, the P-gp inhibition was undoubtedly higher in the presence of poloxamer 185, polysorbate 80 showed a main effect on the disruption of the cellular membrane, resulting in an important cellular viability decrease. It seems that poloxamer 185 presents a direct effect on the functionality of the P-gp protein, which would be of great importance in the sensitization of resistant cancer cells. The range of concentration of poloxamer 185 is very important to yield an inhibitory effect on the P-gp-mediated transport mechanism. The accumulation of Rhodamine-123 (Rho-123), a known P-gp substrate, increased in a range of concentration from 0.001 % to 0.01, whereas at 0.1 % poloxamer 185 the accumulation significantly decreased. A maximal Rho-123 accumulation was reached at 0.01 % poloxamer 185.
In this paper we derive a formula for the energy loss due to elastic N to N particle scattering in models with extra dimensions that are compactified on a radius R. In contrast to a previous derivation we also calculate additional terms that are suppressed by factors of frequency over compactification radius. In the limit of a large compactification radius R those terms vanish and the standard result for the non compactified case is recovered.
Kongressbericht: Auf der Tagung der Deutschen Gesellschaft für Allgemeinmedizin und Familienmedizin e.V. (DEGAM) 2004 entstand die Idee, E-Learning-Aktivitäten in der Allgemeinmedizin sichtbar zu machen und zu bündeln. Ein Kongress sollte die allgemeinmedizinischen Vertreter aus Lehre und Forschung sowie Industrievertreter zusammenbringen, um das Spektrum der Möglichkeiten und laufende Projekte kennen zu lernen. Mit motivierten Referenten, über 60 aktiven Teilnehmern und einem positiven Feedback, kann der Kongress in Frankfurt am 8. und 9. Juli 2005 als erster dieser Art in Deutschland als erfolgreich bezeichnet werden.
Background: Depression is a disorder with high prevalence in primary health care and a significant burden of illness. The delivery of health care for depression, as well as other chronic illnesses, has been criticized for several reasons and new strategies to address the needs of these illnesses have been advocated. Case management is a patient-centered approach which has shown efficacy in the treatment of depression in highly organized Health Maintenance Organization (HMO) settings and which might also be effective in other, less structured settings. Methods/Design: PRoMPT (PRimary care Monitoring for depressive Patients Trial) is a cluster randomised controlled trial with General Practice (GP) as the unit of randomisation. The aim of the study is to evaluate a GP applied case-management for patients with major depressive disorder. 70 GPs were randomised either to intervention group or to control group with the control group delivering usual care. Each GP will include 10 patients suffering from major depressive disorder according to the DSM-IV criteria. The intervention group will receive treatment based on standardized guidelines and monthly telephone monitoring from a trained practice nurse. The nurse investigates the patient's status concerning the MDD criteria, his adherence to GPs prescriptions, possible side effects of medication, and treatment goal attainment. The control group receives usual care – including recommended guidelines. Main outcome measure is the cumulative score of the section depressive disorders (PHQ-9) from the German version of the Prime MD Patient Health Questionnaire (PHQ-D). Secondary outcome measures are the Beck-Depression-Inventory, self-reported adherence (adapted from Moriskey) and the SF-36. In addition, data are collected about patients' satisfaction (EUROPEP-tool), medication, health care utilization, comorbidity, suicide attempts and days out of work. The study comprises three assessment times: baseline (T0) , follow-up after 6 months (T1) and follow-up after 12 months (T2). Discussion: Depression is now recognized as a disorder with a high prevalence in primary care but with insufficient treatment response. Case management seems to be a promising intervention which has the potential to bridge the gap of the usually time-limited and fragmented provision of care. Case management has been proven to be effective in several studies but its application in the private general medical practice setting remains unclear.
Background: Diabetes model projects in different regions of Germany including interventions such as quality circles, patient education and documentation of medical findings have shown improvements of HbA1c levels, blood pressure and occurrence of hypoglycaemia in before-after studies (without control group). In 2002 the German Ministry of Health defined legal regulations for the introduction of nationwide disease management programs (DMP) to improve the quality of care in chronically ill patients. In April 2003 the first DMP for patients with type 2 diabetes was accredited. The evaluation of the DMP is essential and has been made obligatory in Germany by the Fifth Book of Social Code. The aim of the study is to assess the effectiveness of DMP by example of type 2 diabetes in the primary care setting of two German federal states (Rheinland-Pfalz and Sachsen-Anhalt). Methods/Design: The study is three-armed: a prospective cluster-randomized comparison of two interventions (DMP 1 and DMP 2) against routine care without DMP as control group. In the DMP group 1 the patients are treated according to the current situation within the German-Diabetes-DMP. The DMP group 2 represents diabetic care within ideally implemented DMP providing additional interventions (e.g. quality circles, outreach visits). According to a sample size calculation a sample size of 200 GPs (each GP including 20 patients) will be required for the comparison of DMP 1 and DMP 2 considering possible drop-outs. For the comparison with routine care 4000 patients identified by diabetic tracer medication and age (> 50 years) will be analyzed. Discussion: This study will evaluate the effectiveness of the German Diabetes-DMP compared to a Diabetes-DMP providing additional interventions and routine care in the primary care setting of two different German federal states.
Aims: This paper is a review of the literature on problem-related drinking of alcohol among medical doctors, and it deals with the epidemiology and results. Methods: A search of computer literature databases - PubMed and ETOH - was performed to locate articles reporting problem-related drinking among doctors, using population-based samples of doctors within the last two decades. Results: In the light of different definitions of problem-related drinking, there was found a breadth of prevalence of problem-related drinking - from heavy drinking and hazardous drinking (12%-16%) to misuse and dependence (6%-8%) - within the population-based samples of doctors. An increased risk was positively related to male doctors and doctors of the age of 40-45 years and older, and to some factors of work, lifestyle and health. Conclusion: For the future, it seems necessary to sensitise the research for problem-related drinking of doctors in Germany, e.g. initiating a representative survey, analysing the drinking of alcohol in the context of health, life-style and work-related factors.
Herman P. Schwan [1915–2005] was a distinguished scientist and engineer, and a founding father of the field of biomedical engineering. A man of integrity, Schwan influenced the lives of many, including his wife and children, and his many students and colleagues. Active in science until nearly the end of his life, he will be very much missed by his family and many colleagues.
Bupivacain, ein langwirksames Lokalanästhetikum (LA) vom Amidtyp, gilt als das Standardlokalanästhetikum zur Regionalanästhesie bei Kaiserschnittentbindung. Nach einer Episode maternaler Todesfälle infolge intravasaler Fehlinjektion von Bupivacain (Albright 1979) stellte sich die Forderung nach einem LA mit ähnlichen klinischen Eigenschaften aber mit einer größeren therapeutischen Breite. Obwohl bei der Spinalanästhesie (SPA) nur 10 % der LA-Menge verwendet wird, die bei Periduralanästhesie (PDA) zur Anwendung kommt, kann eine versehentliche intravasale Injektion mit Übertritt der potentiell kardio- und ZNS-toxischen LA in die maternale Zirkulation nicht ausgeschlossen werden. Verglichen mit Bupivacain weist Levobupivacain, das linksdrehende Enantiomer von Bupivacain, bei ähnlichen klinischen Eigenschaften eine in zahlreichen in vitro und in vivo Studien belegte geringere Kardio- und ZNS-Toxizität auf (Aberg 1972, Cox et al. 1998, Foster et al. 2000, Alley et al. 2002). Es ist bereits in mehreren Studien erfolgreich zur SPA außerhalb der Geburtshilfe eingesetzt worden (Burke et al. 1999, Bay-Nielsson et al. 1999, Cox et al. 1998, Kopacz et al. 1998, Kanai et al. 1999, Alley et al. 2002). Eine Studie zur Dosisfindung von Levobupivacain zur SPA zur Kaiserschnittentbindung bei Schwangeren findet sich in der Literatur bisher nicht. Deshalb führten wir eine Untersuchung durch, deren Ziel es war, die optimale Dosis von Bupivacain zur Sectio Caesarea zu bestimmen und die anästhetischen und analgetischen Charakteristika von Levobupivacain mit Bupivacain zu vergleichen. 50 Schwangere (ASA I und II, Einlingsschwangerschaft, > 37 Schwangerschaftswoche, 32 +- 5 Jahre, 168 +- 7 cm, 83 +- 15 kg KG) erhielten doppeltblind und randomisiert 7,5 mg, 10 mg oder 12,5 mg Levobupivacain oder 10 und 12,5 mg Bupivacain. Die Anschlagszeit der Anästhesie, die komplette (VAS = 0 mm von 100 mm) und die effektive Analgesiezeit (VAS <= 40 mm von 100 mm), sowie die Charakteristika der motorischen und sensorischen Blockade wurden ebenso wie der Bedarf an zusätzlichen und postoperativen Schmerzmitteln ermittelt. Der Zustand der Neugeborenen wurde durch Apgar-Scores, durch umbilicale Blutgasanalysen und der Notwendigkeit der assistierten Beatmung definiert. Postnatal wurden umbilical-venöse und maternale venöse Blutproben entnommen und eine Substanzplasmaspiegelbestimmung mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromotographie und UV-Detektion durchgeführt. Es zeigte sich, dass Levobupivacain eine vergleichbare Anästhesie wie Bupivacain mit einer geringer ausgeprägten motorischen Blockade bot. Verglichen mit Bupivacain fand sich eine ähnlich lange Anschlagszeit. Die sensorische Blockade sowie die komplette und effektive Analgesiezeit waren nach Gabe von Levobupivacain stat. signifikant kürzer als mit Bupivacain (p = 0,00318 bzw. p = 0,0012). Der postoperative Analgetikabedarf unterschied sich nicht stat. signifikant. Intraoperativ und postoperativ ermittelte Begleiterscheinungen unterscheiden sich nicht stat. signifikant. Die am häufigsten zu verzeichnende Nebenwirkung stellt die sympathikolysebedingte intraoperative Hypotonie mit einer Inzidenz von 80 % für Levobupivacain 10 mg und 70 % für Bupivacain 10 mg dar. Die Zufriedenheit der Schwangeren mit der Anästhesie zur Sectio Caesarea war hoch und unterschied sich nicht stat. signifikant zwischen den beiden Substanzen. Die maternalen Substanzplasmaspiegel zeigten eine Dosisabhängigkeit (0,0372 µg/ml für 7,5 mg, 0,0593 µ/ml, für 10 mg und 0,0693 µg/ml für 12,5 mg). In der vorliegenden Untersuchung lagen die fetalen Gesamtkonzentrationen zwischen 0,0021 µg/ml für Levobupivacain 10 mg und 0,0021 µg/ml für Levobupivacain 12,5 mg. Damit waren auch die neonatalen LA-Spiegel sehr niedrig und wiesen keine stat. signifikanten Unterschiede auf. Der feto-maternale Quotient lag mit 0,06 +- 0,43 deutlich unter den Werten in der vergleichbaren Literatur. Bezüglich des Zustand der Neugeborenen zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Levobupivacain- und den Bupivacaingruppen. Levobupivacain 10 mg stellte die optimale Dosierung zur SPA bei elektiver Sectio Caesarea dar. Nach Gabe von Levobupivacain 7,5 mg bestand bei 40 % der Schwangeren die Notwendigkeit der supplementären intraoperativen i.v. Analgetikagabe. Levobupivacain 12,5 mg zeigte gegenüber Levobupivacain 10 mg keinen klinischen Vorteil. Bei ähnlichen klinischen Eigenschaften ist Levobupivacain daher als klinische Alternative zu Bupivacain zu betrachten und sollte zugunsten einer erhöhten maternalen und fetalen Sicherheit Bupivacain bei der SPA zur Kaiserschnittentbindung ersetzten. Vorteile des Stereoisomers sind neben der geringeren Toxizität eine ausgeprägtere Differentialblockade mit kürzerer und weniger stark ausgeprägter motorischer Blockade.