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Struktur-Funktionsbeziehungen des Verpackungschaperons Gsf2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
(2007)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher charakterisiert. Gsf2 ist ein 46 kDa großes ER-Transmembranprotein mit zwei membrandurchspannenden Domänen, wobei C- und N-Terminus cytosolisch orientiert sind. Zudem besitzt Gsf2 C-terminal ein klassisches Dilysin-Motiv. Eine Deletion des GSF2-Gens resultiert in einer Retention der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 im ER, so dass es sich bei Gsf2 möglicherweise um ein Hexosetransporterspezifisches Verpackungschaperon handelt.
Um Sequenzbereiche zu determinieren, die für die Funktion des Verpackungschaperons bezüglich der Reifung und des ER-Transportes von Hxt1 notwendig sind, wurden verkürzte Versionen des Gsf2-Proteins hergestellt. Die funktionelle Analyse zahlreicher verkürzter Versionen ergab die Lokalisation eines essentiellen Sequenzbereiches in den hinteren 40 Aminosäuren der carboxyterminalen Domäne des Gsf2-Proteins.
Vorläufige genetische und biochemische Untersuchungen hatten ergeben, dass Gsf2 mit Komponenten der Ribosomen, des Sec61-Translokationsapparates und mit Proteinen der COPII-Vesikel interagiert.
Mit Hilfe des Split-Ubiquitin Systems konnte in der vorliegenden Arbeit eine direkte Interaktion zwischen Gsf2 und dem Sec61-Translokations-Komplex und den Komponenten des sekretorischen Weges Sec12 und Sar1 bestimmt werden. Sec12 ist ein Sar1-spezifischer Guanin-Nucleotid-Austausch-Faktor, der für die Aktivierung von Sar1 benötigt wird. Sar1 ist ein kleines G-Protein, welches für die Initiation der COPII-Vesikelbildung benötigt wird. Sar1 ist aber auch für die Erkennung di-basische ER-Exportsignale spezifischer Cargo-Proteine zuständig. Diese Interaktion weist daraufhin, dass Gsf2 über solch ein Motiv verfügt und somit die Verpackung von Hxt1 in COPII-Vesikel gewährleisten könnte.
Postuliert wird ein Modell, wonach Gsf2 bereits eine wichtige Funktion bei der Translokation des Hexosetransporter Hxt1 in die ER-Membran übernimmt. Dabei interagiert Gsf2 mit dem Sec61-Translokon, um den Reifungsprozess der naszierenden Polypeptidkette des Metabolittransporters zu ermöglichen. Anschließend rekrutiert Gsf2 das gefaltete Proteine an Exit-Sites des Endoplasmatischen Retikulums. Es interagiert dort mit Sec12 und Sar1, so dass Gsf2 zusammen mit dem Hexosetransporter in die COPII-Vesikel verpackt und zum Golgi-Apparat transportiert wird. Aufgrund des ERRetentionssignals wird Gsf2 über COPI-Vesikel recycelt.
Dieses Modell impliziert, dass Hxt1 über kein ER-Exportsignal verfügt und daher Gsf2 als guide eine ausschlaggebende Funktion bei dessen Translokation übernimmt.
Riboswitche sind hoch strukturierte RNA‐Elemente, die durch direkte Bindung von kleinen Metaboliten die Expression vieler bakterieller Gene kontrollieren. Sie bestehen aus einer Ligand‐bindenden Aptamerdomäne und einer so genannten Expressionsplattform. Im Zuge der Metabolitbindung an die Aptamerdomäne ändert sich die Konformation der Expressionsplattform. Diese Konformationsänderung führt zu einem vorzeitigen Abbruch der mRNA‐Transkription oder zu einer Inhibierung der Translationsinitiation. In Bacillus subtilis wurden zwei Klassen von Riboswitchen gefunden, die trotz einer sehr hohen Homologie in ihrer Primär‐ und Sekundärstruktur spezifisch zwischen den Purinen Guanin und Adenin unterscheiden.
Durch den direkten NMR‐spektroskopischen Nachweis von Wasserstoffbrückenbindungen konnte der Bindungsmodus von Adenin, Guanin und von weiteren Purinliganden an diese beiden Klassen von Riboswitch‐RNAs beschrieben werden. Für beide Purin‐Riboswitche wurde ein gemeinsamer Bindungsmechanismus des Purinliganden an die RNA beobachtet. Hierbei bildet der Purinligand ein intermolekulares Basentripel mit der Riboswitch‐RNA aus. Die Spezifität der Metabolitbindung ist das Resultat eines intermolekularen Watson‐Crick Basenpaars zwischen dem gebundenen Liganden Guanin und einem Cytidin bzw. zwischen dem Liganden Adenin und einem Uridin der jeweiligen Riboswitch‐RNA. Zusätzlich wurde eine zweite Basenpaarung zwischen der Riboswitch‐RNA und dem gebundenen Liganden entdeckt, die in beiden Riboswitch‐Klassen identisch ist und ein weiteres Uridin der RNA und die N3/N9 Seite des Purinliganden einschließt. Diese Basenpaarung entsteht durch ein bislang unbeschriebenes Wasserstoffbrückenbindungsmuster, das zur Affinität der RNA‐Ligand‐ Wechselwirkung beiträgt. Die beobachteten intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der RNA und dem gebundenen Purinliganden erklären die beobachtete Spezifitätsumkehrung einer C zu U Mutation in der Ligandbindungstasche der Riboswitch‐ RNA und die Unterschiede der Bindungsaffinitäten von verschiedenen Purinanaloga.
Weiterhin wurden die Ligand‐ und Kation‐induzierten konformationellen Änderungen der isolierten Aptamerdomänen beider Purin‐bindenden Riboswitche und des gesamten Guanin‐ Riboswitches mittels NMR‐Spektroskopie untersucht. Demnach ist die Ligandbindungstasche in der Ligand‐ungebundenen Form unstrukturiert und Ligandbindung verläuft nach einem induced fit‐Mechanismus. Die Untersuchung der freien und Mg2+‐gebundenen Form der Ligand‐ungebundenen Aptamerdomäne zeigte Unterschiede zwischen den beiden eng verwandten Purin‐bindenden Riboswitchen. Während die Wechselwirkung zwischen den hoch konservierten Sequenzen der apikalen Schlaufen der Helix II und III in der Mg2+‐freien Form des Guanin‐Riboswitches vorgeformt ist, ist sie in der Mg2+‐freien Form des Adenin‐ Riboswitches nicht ausgebildet, wird jedoch in Gegenwart von Mg2+ ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass dieser konformationelle Unterschied zwischen den Ligand‐ ungebundenen Purin‐Riboswitchen durch die Stabilität der apikalen Basenpaare in Helix II festgelegt wird. Die im Guanin‐Riboswitch gefundene stabile Schlaufen‐Schlaufen‐ Wechselwirkung kann auch außerhalb der Riboswitchsequenz existieren. Durch Mg2+, Mn2+ und Co(NH3)63+ Titrationen der Ligand‐gebundenen Purin‐Riboswitch Aptamerdomänen konnten spezifische Kationbindungsstellen lokalisiert werden, die in beiden Komplexen übereinstimmen und eine Rolle in der Stabilisierung der RNA‐Struktur spielen.
Um die Sekundärstruktur des gesamten Guanin‐Riboswitches in seiner freien und Ligand‐ gebundenen Form zu untersuchen, wurden die NMR‐Spektren dieser RNA mit denen der freien und Ligand‐gebundenen isolierten Aptamerdomäne und der isolierten Terminator‐ und Antiterminatorelemente verglichen. Überaschenderweise bildet bereits die freie Form des gesamten Guanin‐Riboswitches das Terminatorelement und die Aptamerdomäne aus. Somit finden konformationelle Änderungen im Zuge der Ligandbindung einzig in der Aptamerdomäne statt. Weiterhin wurde die Struktur der freien und Ligand‐gebundenen Form einer verkürzten Guanin‐Riboswitch‐RNA untersucht. Diese RNA ist ein Modell für ein Transkriptionsintermediat, das durch eine der drei RNA‐Polymerase‐Ruhestellen induziert wird, die in der Riboswitch‐Sequenz aufzufinden sind. Interessanterweis schließen sich die Ligandbindung an die Aptamerdomäne und die Ausbildung des Antiterminators nicht gegenseitig aus, wie bisher angenommen. Die verkürzte RNA kann in Abhaengigkeit von verschiedenen experimentellen Bedingungen unterschiedliche Sekundärstrukturen annehmen. Das hat interessante Auswirkungen auf die Rolle der im Terminatorelement lokalisierten Transkriptionsruhestelle für den genregulatorischen Prozess und führt zu einem neuen Modell der Funktionsweise des Guanin‐Riboswitches.
Die Nutzung der natürlichen Ressourcen ist zur Sicherung gesellschaftlichen Aktivitäten unverzichtbar, gleichwohl stehen ihrer nachhaltigen Bewirtschaftung immer neue Veränderungsprozesse und damit einhergehende Herausforderungen gegenüber. In Anbetracht von wirtschaftlichen Konzentrationsprozessen, sozio-strukturellen und demographischen Entwicklungen, technischen Innovationen, globalem Wandel und neuen Erkenntnissen zu Risiken stoßen etablierte klassische Verfahren des Planungsdenkens zunehmend an ihre Grenzen. Vor diesem Hintergrund wurden neue und innovative Ansätze zur Ressourcensicherung entwickelt, die vereinzelt auch bereits in der Praxis realisiert wurden. Sie greifen die Herausforderung gegenwärtiger Veränderungsprozesse konzeptionell auf und überführen sie in angepasste Strukturen und Verfahren. Die vorliegende Arbeit beschreibt diesen Übergang zu einem neuen, angepassten Planungsdenken. In seinem Mittelpunkt steht der Begriff der „sozial-ökologischen Ressourcenregulation“. Am Beispiel der Bewirtschaftung der Wasserressourcen werden aktuelle Entwicklungen vorgestellt und exemplarisch anhand von zwei Fallbeispielen vertieft: dem Fuhrberger Feld und dem Hessische Ried unter den spezifischen Gesichtspunkten von Wassergüte und Wassermenge. Die Entwicklungen in beiden Regionen werden zunächst anhand der Anforderungen an eine sozial-ökologische Regulation bewertet. In einem weiteren Schritt werden verallgemeinerte Schlussfolgerungen für eine verbesserte Ressourcenbewirtschaftung und deren Regulation sowohl hinsichtlich der Wassergüte als auch der Wassermenge gezogen. Es zeigt sich hierbei die große Bedeutung der Entstehung adaptiver Strukturen durch Rückkopplungen und den Einbezug der relevanten gesellschaftlichen Akteure; so ist langfristig auch eine Koexistenz von tendenziell konfligierenden Ressourcennutzungen und deren nachhaltige Entwicklung möglich.
Die Erwartungen von Studieninteressierten weichen häufig beträchtlich von den tatsächlichen Studieninhalten und Anforderungen ab. Ein Grund dafür ist, dass viele sich nicht genügend Klarheit verschaffen, welche eigenen Stärken und Schwächen für den Erfolg in Studium und Beruf »tatsächlich« relevant sind. So könnte zum Beispiel ein Abiturient mit guten Noten in Mathematik und Physik und mäßigen Zensuren in Deutsch und Englisch noch schlussfolgern, dass ihm »das Naturwissenschaftliche mehr liegt«. Ob das naturwissenschaftliche Verständnis für ein erfolgreiches Studium der Informatik jedoch gut genug ausgeprägt ist, lässt sich nicht so leicht erschließen. Noch schwieriger ist es für Studieninteressierte einzuschätzen, wie ihre »Soft Skills« ausgeprägt sind – also die Persönlichkeitsmerkmale, die in der Schule nicht systematisch beurteilt werden, jedoch hochgradig aussagekräftig für langfristigen Erfolg in Studium und Beruf sind. Ein Wechsel des Studienfaches zu Beginn des Studiums führt häufig zu einer Verlängerung der Studiendauer. Auch wenn eine derartige »Orientierungsphase« oftmals als normal und wichtig eingeschätzt wird, zeigt die praktische Erfahrung, dass Studierende mit kurzer Studiendauer jenen, die länger studiert haben, bei der Stellenvergabe tendenziell vorgezogen werden. Eine längere Studiendauer wird von Arbeitgebern häufig als Zeichen mangelnder Zielstrebigkeit oder fehlender Berufsmotivation interpretiert und kann sich so Chancen mindernd für Berufseinsteiger auswirken. Ebenso ist es im Interesse der Universitäten, die Zahl der Studienfachwechsel und -abbrüche so gering wie möglich zu halten – nicht zuletzt aus wirtschaftlichen Gründen. Deshalb bietet die Universität Frankfurt Studieninteressierten – zunächst in den Fächern Informatik und Psychologie – mit dem Self-Assessment konkrete Entscheidungshilfen an. Der verfolgte Ansatz zielt darauf ab, Abiturientinnen und Abiturienten möglichst frühzeitig und mit vertretbarem Aufwand die Möglichkeit zu bieten, selbst zu überprüfen, inwieweit ihre Erwartungen an einen Studiengang mit den tatsächlichen Inhalten und Anforderungen übereinstimmen. Das Konzept zur Erstellung eines Self-Assessments, das hier beispielhaft für den Studiengang Informatik vorgestellt wird, entstand nicht umsonst in enger Kooperation mit dem Institut für Psychologie (Prof. Dr. Helfried Moosbrugger, Dr. Siegbert Reiß, Ewa Jonkisz). Denn neben der fachlichen Qualifikation entscheiden über den Studienerfolg auch persönliche Eigenschaften wie Leistungsbereitschaft und Hartnäckigkeit. Die Auswertung des anonym durchgeführten Self-Assessments deckt außerdem Wissenslücken bei den Studieninteressierten auf, so dass eine gezielte Vorbereitung auf das Studium möglich wird. Zum Beispiel bietet der Fachbereich Mathematik und Informatik gezielte Vorbereitungskurse für Studienanfänger an, und zwar in Programmierung und Mathematik. Auch werden in den Semesterferien Repetitorien und Vorbereitungskurse angeboten – alles aus Studienbeiträgen finanziert. Auf diese Weise kann es zu einem homogeneren Kenntnisstand speziell bei den Studierenden im ersten Semester kommen. Ziel ist es, dadurch auch den »Erstsemesterschock « zu mildern. Das Online-Beratungsangebot trägt damit zu einer direkten Verbesserung der Lern- und Lehrsituation bei.
This volume represents a collection of papers that present some of the results of two projects on control: on the one hand, the project Typology of complement control directed by Barbara Stiebels and funded by the German Research Foundation (DFG STI 151/2-2), and on the other hand the project Variation in control structures directed by Maria Polinsky and Eric Potsdam and funded by the US National Science Foundation (NSF grants BCS-0131946, BCS-0131993; website http://accent.ucsd.edu/). Whereas the first project pursued a lexical approach to control with a semantic definition of obligatory control, the second project has mainly pursued a syntactic approach to control – with special emphasis on less studied control structures (such as adjunct control, backward control, finite control, etc.). Both projects have aimed at extending the research on complement control to structures that differ from the prototypical cases of infinitival complements with empty subjects found in many Indo-European languages; their common interest was to bring in new empirical data, both primary and experimental.