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Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen des zwischen 2011 und 2013 durchgeführten Forschungsprojektes „Förderung von Modellbildungs- und Falsifikationsprozessen im Elementar- und Primarbereich“ entstanden ist, untersuchte auf Grundlage neuerer entwicklungspsychologischer Forschungsbefunde die Möglichkeiten der Förderung im naturwissenschaftlichen Denken bei Kindern im Elementarbereich. Nach der theoretischen Einordnung des Themas und der Darstellung der Forschungslage wurden im empirischen Teil in einem ersten Schritt die Kompetenzen beim Schlussfolgern im Themengebiet Elastizität und Plastizität und beim Wissenschaftsverständnis von Kindern im Alter von vier bis zehn Jahren, eingeteilt in vier Altersstufen, ermittelt; weiterhin wurden die Verknüpfungen beider Kompetenzbereiche untersucht. Als Instrumente dienten ein bereits erprobter Schlussfolgerungstest sowie ein neu entwickelter Test zur Kompetenzmessung von Wissenschaftsverständnis. In der Grundschule wurden die Tests jeweils als Gruppentests und im Kindergarten als Einzeltests durchgeführt. Die Stichprobe um-fasste 142 Kinder, 82 Kinder aus dem Primarbereich und 60 Kinder aus dem Elementarbereich. Beim Schlussfolgern zeigte sich, dass es für Kinder aller einbezogenen Altersgruppen deutlich leichter war, mit Ereignissen umzugehen, die eine Vermutung bestätigen, als mit solchen, die eine Vermutung widerlegen. Zudem stellte sich heraus, dass der Umgang mit Ereignissen, die im Hinblick auf eine Vermutung irrelevant sind, noch schwieriger war. Mit zunehmendem Alter war eine Kompetenzsteigerung erkennbar. Die Analyse der Tests ergab außerdem einen Zusammenhang zwischen Wissenschaftsverständnis und Schlussfolgern sowie einen deutlichen Einfluss exekutiver Funktionen. Im zweiten Schritt wurden zwei ausgewählte Trainingsmaß-nahmen zur Förderung der Koordination von Theorie und Evidenz bei Kindern im Alter von fünf bis sechs Jahren auf ihre Wirksamkeit hin geprüft, und zwar einerseits durch die Unter-stützung mit adaptivem Nachfragen bei fehlerhaften Antworten sowie andererseits durch eine intensive Förderung mit Modellierung. Die an einer Stichprobe von 63 Kindern durchgeführte Trainingsstudie war als Prä-Post-Studie angelegt und umfasste die Überprüfung des erworbenen Wissens. Die Studie ergab, dass die intensiv geförderten Kinder deutlich höhere Kompetenzen erworben hatten als die durch adaptive Unterstützung unterstützten Probanden. Außer-dem wurde ein Transfer-Test im Inhaltsgebiet Schwimmen und Sinken durchgeführt; hierbei wurden beide Trainingsgruppen in gleicher Weise mit adaptivem Nachfragen unterstützt. Dabei zeigten Kinder beider Trainingsgruppen deutlich höhere Kompetenzen beim Schlussfolgern als im Post-Test, dennoch zeigten Kinder mit vorheriger intensiver Förderung durch Modellierung wiederum höhere Kompetenzen im Transfer-Test als Kinder aus der Gruppe mit adaptiver Unterstützung. Abschließend wurde noch ein Argumentationstest durchgeführt, bei dem Kinder aller drei Experimentalgruppen (Trainingsgruppe 1, Trainingsgruppe 2, Kontrollgruppe) über-greifende Kompetenzen beim Schlussfolgern zeigen konnten. In diesem Test zeigte sich zwischen den drei Gruppen kein Unterschied im Hinblick auf angemessene Antworten beim Schlussfolgern.
In der Dissertation wird das Antwortverhalten von Kindern bei der Koordination von Theorie und Evidenz untersucht. Diese Fähigkeit ist besonders beim naturwissenschaftlichen Lernen relevant. Dazu werden zwei Studien vorgestellt. In der ersten Studie, der Querschnittsstudie wird das Antwortverhalten von Kindern im Alter von fünf bis neun Jahren am Beispiel der Leitfrage: „Warum springt ein Ball?“ untersucht. Verschiedene Vermutungen wie zum Beispiel „Dinge, die rund sind, springen“, werden geprüft. In der zweiten Studie, dem Kernstück der Arbeit werden zwei Fördermaßnahmen zum Training der Koordination von Theorie und Evidenz bei fünf- bis sechsjährigen Kindern vorgestellt.
Fünfzehnhundertsiebenundachtzig : Literatur, Geschichte und die Historia von D. Johann Fausten
(2014)
Ausgehend von der Beobachtung, dass die 1587 in Frankfurt am Main erschienene »Historia von D. Johann Fausten« überaus erfolgreich war, wird die These formuliert, dass dieser Erfolg auf der dichten Vernetzung mit zeitgenössischen Techniken, Praktiken und Diskursen beruht. Um Teile dieses Netzwerks zu rekonstruieren, beschränkt sich der Beobachtungszeitraum auf die 1580er und frühen 1590er Jahre. Innerhalb dieses Zeitraums wird etwa untersucht, wie man am »Faustbuch« weiterschreibt, welche Rolle die Hexen- und Zaubererverfolgung spielt, wie es um den Einfluss der Transformationen des Postsystems und des Kalenders bestellt ist und was man von außergewöhnlichen Zeichen zu halten hat, die auf dem Körperäußeren erscheinen. Methodisch ist die Arbeit dem New Historicism verpflichtet, dessen vermittelnde Stellung zwischen ›Literatur‹ und ›Geschichte‹ auch dazu genutzt wird, gängige disziplinäre Grenzziehungen in Frage zu stellen.
In der Arbeit wird Fuzzy-Regression als mögliche ökonometrische Analysemethode bei fehlerbehafteten Daten modelliert und erprobt. Dazu ist die interpretatorische Lücke zu schließen, die einerseits zwischen den Datenproblemen in empirischen Datensätzen und ihrer Modellierung als Fuzzy-Daten und andererseits zwischen der Modellierung der Fehlereinflüsse in den Fuzzy-Daten und den Aussagen und Analysen besteht, die auf der Basis einer Fuzzy-Regression über die vorliegenden Daten getroffen werden können. Da bereits eine Vielzahl von Ansätzen zur Fuzzy-Regression entwickelt wurden, wird als das Hauptproblem nicht die Modellierung der Fuzzy-Methoden als solcher gesehen, sondern vielmehr die fehlende Vorstellung über die mögliche Bedeutung der Fuzzy-Modellierungen im konkreten Anwendungsfall. Die Arbeit vollzieht deshalb im Sinne einer Machbarkeitsstudie die verschiedenen Schritte von den Fehlereinflüssen in wirtschaftsbezogenen Datensätzen und deren Modellierung als Fuzzy-Daten bis hin zur explorativen Analyse mit Fuzzy-Regression nach. Dabei werden für jeden der Schritte exemplarische Beispiele ausgewählt, um die Denkweise der Fuzzy-Modellierung auszuarbeiten und die Möglichkeiten und Grenzen der Methoden aufzuzeigen. Die Untersuchungen zeigen, dass vor allem die Fuzzy-Modellierung von Fehlereinflüssen in den Merkmalsdaten und die Beschreibung von gleichförmigen Strukturen in den Fehlereinflüssen durch Fehlerszenarien als Analyseinstrumente geeignet sind, da sie eine Grundlage für eine weitergehende Untersuchung der Fehlereinflüsse bilden. Als Ausblick auf ein Schätzmodell für Fuzzy-Regression bei Fehlern in den Daten werden abschließend einige Ansätze für die Einbettung des Regressionsproblems für Fuzzy-Merkmalsvariablen in die Verteilungsmodelle für Fuzzy-Zufallsvariablen vorgestellt, die auf der Konstruktion der Fehlerszenarien basieren.
Ziel: Das Ziel der vorliegenden Studie ist die vergleichende Bewertung von fusionierten T2-gewichteten und Kontrastmittel-(KM)-gestützten T1-gewichteten Magnetization-prepared Rapid Gradient-(MPRAGE)-Sequenzen im Hinblick auf die Diagnose und Lokalisation von vestibulären Schwannomen (VS) und / oder intralabyrinthären Schwannomen (ILS). Dabei werden die Parameter benötigte Zeitdauer bis zur Diagnose, Diagnosegenauigkeit, die Qualität des Bildmaterials und die Zahl der Artefakte evaluiert.
Material und Methoden: Insgesamt werden die Magnetresonanztomografie-(MRT) -Daten von 53 Patienten, davon 10 mit einer VS-, 20 mit einer VS / - ILS Kombination und 4 mit einer reinen ILS- Erkrankung, evaluiert. Es wurden zwei Kontrollgruppen, bestehend aus 16 Patienten ohne Auffälligkeiten und 3 Patienten mit detektierten Pathologien, in die Datenerhebung integriert. Zwei Radiologen mit 10 und 12jähriger Berufserfahrung evaluierten die konventionellen und fusionierten Sequenzen (Konsensusbefunder 1 und 2). Weiterhin untersuchten zwei Gruppen von Radiologen mit 1-2 und 3 – 4 Jahre Weiterbildung die konventionellen MRT-Sequenzen oder die Fusionsbildung. Die Zeit der Diagnosefestlegung wurde gemessen. Die Bildqualität und die Zahl der Artefakte wurden anhand einer 5-Punkte-Bewertungsskala festgelegt.
Die Ergebnisse der beiden Gruppen wurden mittels geeigneter statistischer Verfahren analysiert und verglichen.
Ergebnisse: Die Befunder, denen die fusionierten Bilder zur Verfügung standen, konnten die Diagnose in allen Fällen schneller stellen. Die Diagnoseerstellung erfolgte durch die Befunder fast doppelt so schnell (33,4 s versus 63,5 s). Die Interrater-Reliabilität bezüglich der Erkennung von VS/ILS-Läsionen war – unabhängig vom Bildmaterial – exzellent (Cohens-Kappa (κ) 0,914–1,000). Mit den fusionierten Sequenzen ist eine präzise (Sensitivität: 100 %; Spezifität, 88,9–100 %) Diagnose möglich.
Die Erstellung einer Fusionssequenz an der Konsole beansprucht 33,8 ± 2,6 s.
Die Bildqualität der Fusion wurde von den Ratern als hervorragend eingestuft.
Nach drei Monaten erzielten zwei Befunder, die zunächst die Fälle mit Hilfe konventioneller MRT-Sequenzen beurteilt hatten, in einer erneuten Bewertung anhand der Fusionsbildgebung kürzere Befundungszeiten (32,0 s vs. 67,5 s) sowie eine bessere ILS-Erkennung (κ = 0,564 vs. κ = 0,845) und ILS-Klassifikation (κ = 0,573 vs. κ = 0,801).
Fazit: Die Fusionsbildgebung aus T2- und T1-gewichteten MR-Sequenzen MPRAGE erlaubt eine bessere, schnellere und präzisere Diagnose von VS und ILS.
Klinische Relevanz: Die Darstellung der flüssigkeitsgefüllten Architektur des KHBW und des inneren Gehörgangs mithilfe der Fusionsbildgebung (3D-T2- und KM-unterstützte T1-gewichtete Sequenzen) bietet dem Radiologen die Möglichkeit seine Diagnosefähigkeit zu verbessern und seinen Klinikalltag zu erleichtern. Vor allem kleine Läsionen, die in der radiologischen Routinediagnostik schwer zu erkennen sind, lassen sich mithilfe der Fusion besser diagnostizieren und abgrenzen.
Proliferation and apoptosis are fundamental cellular processes that are important for the development and homeostasis of multi-cellular organisms. Deregulation of these processes plays an important role in tumor formation. Often, genes that control homeostasis by regulating proliferation and apoptosis are mutated or improperly expressed in tumors. In this project, the physiological and pathological functions of FUSE Binding Protein 1 (FBP1) were studied to elucidate the involvement of this gene in the context of embryonic development and tumorigenesis. Two reasons led to the hypothesis that FBP1 might be relevant in this context. FBP1 was isolated in the group of PD Dr. Martin Zörnig using a functional yeast survival screen for the identification of anti-apoptotic genes involved in tumorigenesis, and the anti-apoptotic function of FBP1 was confirmed in the human colon carcinoma cell line RKO. In addition, FBP1 had been published to function as a transcriptional regulator that activates expression of the proto-oncogene c-myc. This gene stimulates cell proliferation and is overexpressed in many tumors. Analysis of FBP1 expression by immunhistochemistry in normal and tumor tissue samples revealed frequent and significant overexpression of FBP1 in Hepatocellular Carcinoma (HCC). To study the functional relevance of FBP1 activity for this tumor type, apoptosis and proliferation of the HCC cell line Hep3B were studied in dependence of FBP1 expression. Downregulation of FBP1 by lentiviral expression of FBP1-specific short hairpin RNA (shRNA) reduced proliferation and increased sensitivity to apoptosis. Subcutaneous injection of FBP1-deficient Hep3B cells into immunodeficient NOD/SCID mice demonstrated that tumor growth was strongly decreased in comparison to control cells. mRNA expression studies by quantitative real time PCR showed reduced mRNA levels of the pro-apoptotic genes Bik, Noxa, TRAIL and TNF-􀀁 in the absence of FBP1. In addition, the cell cycle inhibitors p21 and p15 were repressed by FBP1 while Cyclin D2 expression was decreased in the absence of FBP1. Surprisingly, expression of c-myc was not altered by FBP1 downregulation, indicating a different mechanism of c-myc regulation in HCC cells. These results demonstrate that overexpression of FBP1 inhibits apoptosis and stimulates proliferation in HCC cells by regulating the transcription of relevant target genes. Therefore, FBP1 might represent a promising therapeutic target for the treatment of HCC. For analysis of the physiological function of FBP1, a gene trap mouse model was established. In these mice, the gene trap vector pT1􀀂geo is inserted in intron 19 of the FBP1 locus, leading to the expression of a fusion protein consisting of a truncated FBP1 (lacking the last 62 amino acids), 􀀁-Galactosidase and Neomycin Phosphotransferase. Luciferase reporter assays demonstrated that the fusion protein was not capable of activating the c-myc promoter and even showed a dominant negative effect. Thus, this gene trap mouse serves as a functional FBP1 knockout model. Phenotyping of the FBP1 gene trap mice showed that homozygous mutation of FBP1 resulted in embryonic lethality at late stages of embryonic development (E15.5-E16.5). Heterozygous mice were viable, but born at lower frequencies, indicating a gene dosage- or a dominant negative effect of the FBP1 fusion protein. The cellular effects of FBP1 inactivation were tested in mouse embryonic fibroblasts isolated from FBP1 gene trap mice. While proliferation was reduced in the absence of wildtype FBP1, apoptosis was not affected. Expression analysis showed that in homozygous MEFs p15 and p21 transcripts were upregulated, while decreased cmyc mRNA levels were measured. Closer inspection of homozygous gene trap embryos revealed an anemic phenotype that appeared most pronounced around embryonic day 15.5. Analysis of fetal livers, the main site of hematopoiesis at this stage of development, showed a strongly reduced total cell number in homozygous embryos. Evaluation of the different hematopoietic cell lineages did not reveal significant changes in particular differentiated cell types. Instead, all cell lineages seemed to be affected equally by FBP1 inactivation. In contrast, analysis of hematopoietic progenitor cell populations showed an increased percentage of multipotent progenitor cells (MPPs) and a strongly reduced number of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs). Functional analysis of MPPs by in vitro colony formation assays demonstrated that the FBP1-mutant cells possess a normal colony formation potential while their expansion capacity was reduced. Competitive transplantation of lineage negative fetal liver cells into irradiated recipient mice resulted in reduced engraftment of liverderived progenitor cells from homozygous FBP1 gene trap mice. However, stable engraftment was observed over a period of 12 weeks, demonstrating that the FBP1-deficient LT-HSCs are in principle capable of long-term repopulation. These results demonstrate that FBP1 exerts an essential function during definitive hematopoiesis. It can be speculated that FBP1 influences proliferation, apoptosis and possibly also stem cell self-renewal through the regulation of specific target genes within the hematopoietic progenitor cells. Alternatively, extrinsic effects caused by the absence of FBP1 activity could impair the function of the progenitor cells.
Channelrhodopsine sind blaulichtsensitive, Retinal-bindende Proteine aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Channelrhodopsin 2 (ChR2) wurde als heptahelikaler, kationenselektiver Ionenkanal charakterisiert (Nagel et al., 2003). Wie die zur selben Proteinfamilie gehörende Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) wird ChR2 durch Licht aktiviert; allerdings wird hierbei ein passiver Strom ausgelöst, bei dem Kationen entsprechend ihres elektrochemischen Gradienten fließen. Aufgrund dieser Eigenschaft eignet sich ChR2 zur lichtinduzierten Depolarisation von Zellen und zur Auslösung von Aktionspotentialen in Neuronen, über deren Membran ein Konzentrationsgradient von Kationen anliegt (Boyden et al., 2005). Die Stimulation elektrischer Aktivität von ChR2-exprimierenden Neuronen im Hirngewebe von Mäusen, die ChR2 transgen exprimieren, kann beispielsweise genutzt werden, um die Konnektivität von Neuronen und Hirnbereichen zu untersuchen (z.B. Wang et al., 2007). Für diese und weitere Anwendungen war es interessant, ChR2 zelltyp- oder regionenspezifisch in Mäusen zu exprimieren. Zu diesem Zweck sollte ChR2/eGFP bicistronisch oder ChR2-YFP als Fusionsprotein unter einem ubiquitären Promotor exprimiert werden; die Expression sollte aber durch ein Stop-Element unterbunden werden, das von loxP-sites flankiert ist (unaktiviertes Transgen). Das Enzym Cre- Rekombinase entfernt durch Rekombination das Stop-Element an diesen Erkennungssequenzen, wodurch die ChR2-Expression ermöglicht werden sollte (aktiviertes Transgen). Die Cre-Rekombinase kann dabei sowohl viral als auch transgen unter zelltyp- und regionenspezifischen Promotoren exprimiert werden und damit die regionale Spezifität und den Zeitpunkt der ChR2-Expression bestimmen. Es wurden drei Mauslinien über Pronukleus-Injektionen erhalten, die den Reporter β-Galactosidase des unaktivierten Transgens exprimierten. Die Verpaarung von Mäusen dieser Linien mit Cre-Rekombinase-exprimierenden Mauslinien führte aber nur zu einer ineffizienten Aktivierung des Transgens, so dass ChR2-Expression einzig mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Nach viraler Expression der Cre-Rekombinase im Hippokampus konnte eine Aktivierung des ChR2-Transgens auch mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden. Mangels GFP-Fluoreszenz waren die transgenen Linien aber nicht für gezielte elektrophysiologische Ableitungen verwendbar. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Mäuse über embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert. Bei diesem Ansatz wird eine geringere Kopienzahl des Transgens ins Genom integriert. In den ES-Zellen konnte durch transiente Cre-Rekombinase-Expression gezeigt werden, dass das Transgen effizient aktiviert werden konnte. Aus mehreren ES-Zell-Klonen wurden chimäre Mäuse erhalten, die zum jetzigen Zeitpunkt auf Keimbahntransmission getestet werden. Wie ChR2 einen Kationenkanal bildet und welche Transmembrandomänen und Aminosäuren daran beteiligt sind, ist unbekannt. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Positionen E90, E97 und E101, welche in der zweiten Transmembranhelix untereinander zu liegen scheinen, Teil einer Ionenpore sein könnten. Um den Einfluss dieser Aminosäuren auf die Kationenleitung und/ oder – selektivität zu untersuchen, wurden diese Positionen substituiert und die resultierenden ChR2-Mutantenproteine in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch analysiert. Um Na+- bzw. Protonen-mediierte Ströme unterscheiden zu können, wurden Na+-haltige und Na+-freie Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Lichtinduzierte Ströme von ChR2E97A, ChR2E97Q, ChR2E97K und ChR2E101K waren im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert, ausschließlich bei pH 4 zu detektieren und wohl hauptsächlich durch Protonen getragen. Die isofunktionale, aber ladungsneutrale Mutation ChR2E90Q zeigte nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Alaninsubstitution (E90A) als auch Ladungsinversion (E90K) führte zu starken Veränderungen des ChR2-Stroms im Vergleich zum Wildtyp. ChR2E90A zeigte im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Protonenströme sowie einen erhöhten Natriumstrom, der durch Protonen inhibierbar war. Die Ladungsinversion ChR2E90K führte zu allgemein stark verminderten Leitfähigkeiten, lediglich bei pH 4 konnten noch Ströme gemessen werden. Die Ergebnisse sind der erste Hinweis auf eine Beteiligung von Glutamatresten an der Ionenleitfähigkeit in der Transmembranhelix 2 von ChR2.
Funktionsorientierte Bausteine zur Integration kontinuierlicher Medien in verteilte Anwendungen
(1997)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer komfortablen Beschreibung verteilter Anwendungen, die kontinuierliche Medien integrieren. Die Klarheit des Ansatzes ergibt sich aus der Beschränkung auf die anwenderrelevanten Funktionalitäten. Weitere Gebiete, die systembezogen sind, wurden nur soweit wie nötig behandelt. Die Aufgaben anderer Bereiche, wie des Betriebssystems und des Managementsystems sowie der Kommunikationsdienste, konnten nur gestreift werden, indem die anwendungsabhängigen Anforderungen spezifiziert wurden. Durch deren Extraktion und die Zuordnung der Anforderungen an die einzelnen Bereiche, ergibt sich eine klarere Sicht auf Betriebssystem, Management und Kommunikationsdienste und deren notwendige Weiterentwicklung. Das entwickelte Funktionenmodell beschreibt zusammenhängend alle mit kontinuierlichen Medien verbundenen Arbeiten. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, wie aus den Funktionen auf kontinuierlichen Medien durch die Spezifikation geeigneter Schnittstellen Bausteine zur Integration der Medien in verteilte Anwendungen erstellt werden. Die Beschrei bung der Bausteine erfolgt durch diese Schnittstellen; es sind Steuer-, Daten- und Managementschnittstellen. Die Herauslösung der gesonderten Beschreibung der Multimedia-Datenflußstruktur schafft einerseits die Grundlage für eine Teilklassifikation der Anwendungen nach Medien-Gesichtspunkten. Andererseits kann die Erstellung einer Anwendung aus einer bestimmten Anwendungsklasse, wie zum Beispiel ein einfaches Wiedergabesystem, durch die gesonderte Beschreibung der Multimedia-Datenflußstruktur schneller in der Bausteinstruktur realisiert werden. Das Funktionenmodell wird auch in [Fritzsche96] beschrieben. Das in dieser Arbeit konzipierte Bausteinmodell gewährleistet eine integrierte Beschreibung von Geräten, Werkzeugen und Anwendungen kontinuierlicher Medien. Die verwendete Beschreibungstechnik erlaubt dabei nicht nur eine übersichtliche Darstellung sondern bietet auch hierarchische Strukturierungen an. Das Zusammenspiel der Bausteine erfordert zu sätzliche Komponenten zur Steuerung und Abstimmung der einzelnen Funktionen, die in dieser Arbeit neu eingeführt werden. Es lassen sich sowohl zentralistische als auch verteilte Steuerungen realisieren. Mit einer entsprechenden Schnittstelle versehen kann eine Steuerkomponente eine ganze Gruppe von Bausteinen dem Benutzer als Einheit zur Verfügung stellen. Somit lassen sich auch verschiedene Medien und/oder mehrere Funktionen gemeinsam mit einer Steuerkomponente zu einem Baustein zusammenfassen. Diese zusammenge setzten Bausteine bieten nun echte Multifunktionalität und Multimedialität. Durch die Komponenten- und Anwendungsmodellierung nach [Zimm93] wird darüber hinaus eine flexible, auch dynamisch änderbare Anwendungsstruktur vom Anwendungs-Management ermöglicht. Das Bausteinmodell wird auch in [Fritzsche96] behandelt. Bisherigen Ansätzen für Multimedia-Komponenten fehlt die allgemeine Interoperabilität der Komponenten. Diese kann nur durch eine umfassende, formale Spezifikation der Komponenten-Schnittstellen, insbesondere aber von Steuerschnittstellen, erfolgen. Zur Spezifikation der Schnittstellen ist die Integration der kontinuierlichen oder zeitabhängigen Medien als abstrakte Datentypen unabdingbar. Auf diese Art werden aus den Komponenten Bausteine. Im vorliegenden Ansatz wurden erstmalig Steuerschnittstellen für Multimedia-Komponenten spezifiziert und als Hierarchie dargestellt. Der neue Ansatz erlaubt es daher, multimediale Systeme nach einem Baukastensystem zu erstellen, indem Bausteine durch Bindung untereinander zu einer Anwendung zusammengesetzt werden. Nach der Verbindungsstruktur der multimedialen Anwendung können verschiedene Anwendungstypen unterschieden werden. Die Definition der Komponentenschnittstellen bezieht sich auf ein abstraktes Datenmodell für kontinuierliche Medien. Das Datenmodell ist eine eigenständige Weiterentwicklung der Ansätze von [Herrtw91] und [Gibbs94] und kann auch zur Realisierung der Komponenten verwendet werden. Multimediadaten wurden zunächst auf zwei Ebenen als Sequenz und Sequenzelemente modelliert. Daraus lassen sich bereits einige Funktionen auf den Daten ableiten, die von den Bausteinen realisiert werden müssen. Kennzeichnend für die Sequenzelemente ist, daß sie die Zeitparameter Zeitpunkt und Dauer besitzen und damit eine explizite Integration der Zeit in das Datenmodell realisieren. Aus diesen Parametern der Elemente können auch für die Sequenz die Parameter Zeitpunkt und Dauer abgeleitet werden. Somit könnte eine Sequenz selbst wieder Element einer Sequenz werden. Da diese Sequenzen von Sequenzen aber zum Teil schwer zu handhaben sind und zum Aufbau von sehr komplexen Verschachtelungen verleiten, wird in dieser Arbeit eine andere Erweiterung der Datenhierarchie, eine Liste, vorgestellt. Diese Erweiterung führt nur eine weitere Hierarchieebene oder Granularitätsstufe ein, ist aber durch die vorgegebenen Funktionen gleichmächtig wie die Verschachtelung der Sequenzen, im Operationsablauf aber leichter nachzuvollziehen. Die Liste repräsentiert die gröbste Granularitätsstufe. Diese ist mit der Titelfolge einer Schallplatte oder einer CD vergleichbar. Die einzelnen Teile haben zueinander nur eine lose Ordnung. In der ersten Verfeinerung der Granularität wird in jedem einzelnen Listenelement eine strenge zeitliche Ordnung gefordert; ein Listenelement ist eine Sequenz. In der zweiten Stufe der Verfeinerung, der Unterteilung der Sequenzen, treten die bereits bekannten Se quenzelemente auf. Die Daten werden im Ticker-Schrittgeber-Modell interpretiert. Dieses Modell erhält zwei Zeitebenen, den Ticker als Bezugssystem der Funktionen untereinander und den Schrittgeber als Steuerung der einzelnen Funktionen. Ein zweistufiges Uhrenmodell mir festgesetzten Operationen und Uhrenbeziehungen wird in dieser Arbeit neu eingeführt. Die Beziehung zwischen Schrittgeber und Ticker ist, daß ein Schritt nach einer bestimmten Anzahl von Ticks erfolgt. Der Startwert des Tickers kann frei gewählt werden, ebenso der Startwert des Schrittgebers. Für den Schrittgeber bestimmt sein Start-Tick, wann er beginnt fortzuschreiten. Ein Schrittgeber ist mit genau einer Sequenz verbunden, deren Start-Schritt beschreibt, bei welchem Schrittwert das erste Sequenzelement gültig wird. Die Start-Zeitpunkte der Elemente und ihre Dauern werden in Schritten gemessen. Das Datenmodell für Multimedia wurde in [Fritzsche95] veröffentlicht. Implementierungen Als Grundlage für die Entwicklung der Bausteine zur Integration kontinuierlicher Medien in verteilte Anwendungen wurden die Funktionen auf den Medien herangezogen. Diese sind in ihren einfachsten Formen die Grundfunktionen Perzeption, Präsentation und Speicherung der Medien, wobei die Speicherung in die Funktionen Schreiben in den Speicher und Lesen aus dem Speicher geteilt wird. Die durch die Perzeption festgelegten, oder künstlich erzeugten Mediendaten können zwischen den einzelnen Funktionen übertragen werden. Eine Bearbeitung der Daten ist beim Austausch zwischen den Funktionen möglich. Die Veränderung der Daten und ihr Bezug zu den Grundfunktionen wird durch die Verarbeitungsfunktionen der Typen f 1 bis f 5 beschrieben. Die Funktionen werden durch Operationen gesteuert, die aus dem Datenmodell abgeleitet werden. Insbesondere wird so auch die explizite Veränderung der Zeitparameter möglich. Somit bietet das Datenmodell eine geeignete Grundlage für jede Art der Verarbeitung kontinuierlicher Medien. Das entwickelte Modell unterstützt die Anwendungserstellung durch objektorientierte Ansätze auf den Ebenen der Konzeption, der Anwendungsspezifikation und der Komponentenentwicklung. Konzeptionell bietet das Funktionenmodell die schnelle und übersichtliche Darstellung der Anwendung. Die aus dem Funktionenmodell ableitbare Anwendungsspezifikation unterstützt die weitere Entwicklung durch Anwendungs- und Komponentenschablonen, sowie durch die vorgefertigte und erweiterbare Hierarchie der Schnittstellen und durch die Bibliotheken für Standardbausteine. Die Verwendung dieser Elemente der Anwendungsspezifikation läßt sich teilweise automatisieren. Das Ergebnis der Anwendungsspezifikation ist eine Menge von Komponenten, die alle vollständig spezifiziert sind. Diese Komponenten sind die funktionsorientierten Bausteine zur Integration kontinuierlicher Medien in verteilte Anwendungen. Im ersten Schritt wurde das vorgestellte Datenmodell mit seinen Operationen in einer objektorientierten Programmiersprache (C [Lipp91]) implementiert [Braun92]. Darauf aufbauend wurden verschiedene Anwendungsfunktionen und Normalisierungsoperationen entwickelt und für den Bereich Audio realisiert [Bast93]. Die von den Funktionen auf kontinuierlichen Medien abgeleiteten Bausteine werden, wie in der vorliegenden Arbeit ausführlich dargestellt, als Komponenten verteilter Anwendungen realisiert. Aus den verschiedenen Realisierungsebenen sollen hier zwei Beispiele hervorgehoben werden. Zunächst wird auf die Komponentenrealisierung eingegangen; danach folgt die Realisierung von Tickern und enger Kopplung. Diese beiden Punkte stellen zentrale Aufgaben des Ansatzes dar. Realisierung von Komponenten Die Realisierung der Komponenten gliedert sich in zwei Abschnitte. Der erste Abschnitt ist die Zerlegung einer Komponente in Standardobjekte nach [Zimm93]. Die Standardobjekte entstammen Kommunikationsklassen, Stub- und Dispatcherklassen, Anwendungsklassen und Kooperationsprotokollklassen. Die Objekte der Anwendungsklassen realisieren die Anwendungsfunktionalität der Komponente. Das Ausprogrammieren dieser Objekte stellt den zweiten Abschnitt der Komponentenrealisierung dar. Dazu liefert das entwickelte Datenmodell die Programmierunterstützung. Zur Abbildung der Spezifikationskonstrukte der Komponenten auf Implementierungskonstrukte wird in [Zimm93] eine Methode vorgestellt, die die unterschiedlichen Konstrukte für Schnittstellen, Kommunikationskontexte und Komponenten auf Klassen und Objekte abbildet. So entsteht eine Klassenhierarchie von C Klassen [Lipp91] für kommunikations-, anwendung-s und managementorientierte Objekte. Weiterhin wird in [Zimm93] ein Verfahren vorgestellt, durch das in Abhängigkeit von den Eigenschaften einer Komponente parallel ablaufende Datenflüsse in ein System von leichtgewichtigen Prozessen (Threads) transformiert werden können. Als Resultat gewinnt man eine modulare Softwarearchitektur der Komponente, die sich aus interagierenden Objekten und zugehörigen Threads zusammen setzt. In [Zimm93] werden folgende Objektklassen unterschieden: . Kommunikationsklassen . Stub- und Dispatcherklassen . Anwendungsklassen . Kooperationsprotokollklassen. Eine elementare Objektarchitektur aus diesen Klassen ist in Abbildung 54 dargestellt. Es gibt jeweils eine Realisierung für eine Supplier-Komponente und eine Consumer- Komponente. Die Anwendungsobjekte können bezüglich ihrer Funktionalität in initiierende und akzeptierende Objekte eingeteilt werden. Im Falle unidirektionaler Schnittstellen sind die Anwendungsobjekte auf der Konsumentenseite (z.B. Benutzerkomponente) für die Initiierung von Methoden an Schnittstellenobjekten verantwortlich. Beispielsweise ist ein Anwendungsobjekt innerhalb der Benutzerkomponente für die Initiierung der Steueroperationen verantwortlich. Im Falle von interaktiven Komponenten [Zimm93] erfolgt dazu ein Benutzerdialog mit einem interaktiven Benutzer. Also realisiert innerhalb der Benutzerkomponente das Anwendungsobjekt einen solchen Benutzerdialog. Anwendungsobjekte auf der Konsumentenseite stellen somit typischerweise keine eigenen Methoden bereit, sondern bestehen lediglich aus einem Konstruktor. Auf der akzeptierenden Seite, den Anbieter (Supplier), realisiert ein Anwendungsobjekt die Operationen an einer Schnittstelle. Dazu wird eine Methode accept benötigt, falls ein verbindungsorientierter Kommunikationskontext zugrunde liegt. Diese Methode dient der Behandlung eingehender Verbindungswünsche. In [Alireza94] werden verschiedene Komponentenrealisierungen ausführlich vorgestellt. Die Realisierung der Ticker und Schrittgeber stellt die Einbettung der zeitbezogenen Komponenten in ihre (Betriebssystem) Umgebung dar. Ähnlich, wie eine Komponente über den Socketmechanismus Zugang zum Kommunikationssystem erhält, erhält eine zeitbezogene Komponente über den Ticker-Schrittgeber-Mechanismus Zugang zum Zeitbezugssystem. Denn die Schrittgeber beziehen sich auf Ticker, Ticker aber auf die Systemzeit. Da auch die Systemzeit als Takt zur Verfügung gestellt wird, können Ticker und Schrittgeber wegen ihrer ähnlichen Funktionalitäten aus einer gemeinsamen Zeitgeberklasse abgeleitet werden. Im Anhang C ist die Deklaration dieser gemeinsamen Klasse angegeben. In einer Anwendung beziehen sich die Schrittgeber verschiedener Komponenten auf einen gemeinsamen Ticker. Dieser Ticker liegt in der Systemumgebung der den Komponenten gemeinsamen interaktiven Benutzerkomponente. Die interaktive Benutzerkomponente verteilt die Ticks über die Steuerschnittstellen an die Komponenten und realisiert so die enge Kopplung der Komponenten. Bei einer Tickrate von 600 Hz ist es nur innerhalb eines Systems sinnvoll jeden Tick als Ereignis zu verteilen. Anstatt nun zu jedem Tick ein Ereignis zu verteilen werden bei der Tickverteilung Tickwerte mit fester Rate verteilt, wobei diese Rate in die Größenordnung der Schritte fällt. Um die Übertragungsraten gemäß den Anforderungen an der Steuerschnittstelle klein zu halten, wird zu jedem Schritt nur ein Teil (1 Byte) des Tickwertes übertragen. Begonnen wird mit der Übertragung des höchstwertigen Bytes, so daß im letzten Schritt einer Tickerübertragung mit dem letzten Byte der genaue aktuelle Tickwert übertragen wird. Ähnliche Verfahren werden bereits bei anderen Synchronisations verfahren verwendet. Eine genaue Beschreibung sowie die Kodierung für die verschachtelte Übertragung von Tickwerten und SchnittstellenAufrufen wird in [Hesme93] vorgestellt. Weitere Entwicklung Zur Realisierung verteilter multimedialer Anwendungen, muß man die einzelnen verteilten Komponenten bestimmen und ihre Funktion beschreiben. Die Komponenten tauschen unter einander Steuerungsinformationen und Multimediadaten aus. Diese Daten und das beim Austausch verwendete Protokoll sollten allgemein standardisiert sein, um den Zusammen schluß heterogener Systeme zu ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, wie sowohl die Daten als auch das Zusammenspiel der Komponenten festgelegt werden können. Obwohl alle Geräteklassen und Geräte funktionen sowie verschiedene Werkzeuge entwickelt wurden, und das vorgestellte Modell die gesamte Entwicklung verteilter multimedialer Anwendungen unterstützt, ist dieses große Gebiet noch lange nicht erschöpfend behandelt. Eine Erweiterung der Managementschnittstellen und die Realisierung von komplexen Werkzeugen sind die vordringlichsten Aufgaben. Damit entsteht ein mächtiges Entwicklungswerkzeug für Multimediaanwendungen. Funktionsorientierte Bausteine zur Integration kontinuierlicher Medien in verteilte Anwendungen Eine weitere Aufgabe ist die genauere Untersuchung der Nebenbedingungen, die zur Unterscheidung der Funktionen der Typen f 1 bis f 5 führten. Aus diesen Untersuchungen sowie aus den Ergebnissen der Ticker- und Schrittgeber-Realisierung lassen sich dann genauer spezifizierte Anforderungen an die Betriebs- oder Kommunikations-Systeme ableiten.
Die Hitzestressantwort stellt einen universellen Schutzmechanismus aller lebenden Organismen dar. Infolge einer Temperaturerhöhung werden Hitzestresstranskriptionsfaktoren (Hsf) aktiviert und bewirken eine gesteigerte Expression von Hitzestressproteinen (Hsp). Als molekulare Chaperone schützen diese die Zelle vor durch Hitze verursachten Schäden. In höheren Pflanzen ist dieses Phänomen sowohl auf der Ebene der Hsf als auch der Hsp besonders komplex. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktion von Komponenten des Chaperonsystems in der pflanzlichen Thermotoleranz. Zur Untersuchung der Thermotoleranz wurde ein transientes Expressionsystem mit Mesophyllprotoplasten aus steril angezogenen Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum) zweier Linien (WT und CS) verwendet. CS-Pflanzen zeigen Cosuppression von HsfA1 und zeichnen sich durch eine Integration zweier direkt aufeinander folgender Transgenkassetten in invertierter Orientierung aus. Die fehlende Expression von HsfA1 in CS-Pflanzen ist die Folge eines Prozesses, der als RNA-interference (RNAi) bezeichnet wird. In unserem transienten Expressionssystem wurden Mesophyllprotoplasten mit einem Expressionsplasmid transformiert, das für Luciferase aus Photinus pyralis als thermosensitivem, leicht nachweisbarem Reporterprotein kodiert. Mit Hilfe dieses Testsystems konnten wir den Schutz der Luciferase gegen eine thermische Denaturierung bei 41°C (30 min) und die nachfolgende Renaturierung für 120 min bei 25°C in Abhängigkeit von endogenen und transient exprimierten Hsp und Hsf beobachten. Mit Hilfe der RNAi-Technologie und unter Verwendung von genspezifischen inverted repeat-Konstrukten konnten wir weiterhin die Bildung einzelner Komponenten des endogenen Chaperonsystems verhindern und damit ihre Funktion untersuchen. Es zeigte sich, dass in Protoplasten aus CS-Pflanzen praktisch alle hitzestressinduzierten Proteine fehlten und diese nicht in der Lage waren, Thermotoleranz auszuprägen, wie unter Verwendung des Reporterproteins Luciferase nachgewiesen werden konnte. Weiterhin fand keine Bildung cytoplasmatischer Multichaperonkomplexe, der sogenannten Hitzestressgranula (HSG), statt. Dieser Defekt in der Ausprägung von Thermotoleranz konnte durch Expression von HsfA2, HsfA3 und HsfA4b repariert werden. Die Überexpression dieser Hsf führte gleichermaßen zu (1) einer Expression von Chaperonen, (2) Thermoprotektion des Reporterenzyms Photinus pyralis-Luciferase und (3) Bildung von HSG-Komplexen. In weiteren Analysen lag unser Augenmerk insbesondere auf Vertretern der sHsp, sowie der Hsp70- und Hsp101-Chaperonfamilien. Hierbei erwies sich, dass vor allem Klasse CI-sHsp und Vertreter der Hsp70-Famile beim Schutz der Luciferase gegen Denaturierung während eines Hitzstresses eine Rolle spielen, während hauptsächlich Hsp101 und Vertreter der Hsp70-Familie in der darauf folgenden Erholungsphase von Bedeutung sind. Die Untersuchung der Interaktionen von drei Klassen cytoplasmatischer sHsp und ihrer intrazellulären Verteilung im Rahmen meiner Arbeit zeigte, dass jeder dieser Klassen eine unterschiedliche Funktion im Netzwerk cytoplasmatischer sHsp zukommt. Unter Verwendung nativer Gelelektrophorese und indirekter Immunfluoreszenz konnte nachgewiesen werden, dass sHsp der Klassen CI, CII und CIII in der Lage sind, auf der Ebene oligomerer Komplexe zu interagieren und ihre intrazelluläre Lokalisation wechselseitig zu beeinflussen. Proteine der Klasse CII zeigten eine starke Tendenz zur Bildung von Aggregaten, in die Klasse CIII-sHsp rekrutiert wurden. Im Unterschied dazu verfügten Klasse CI-Proteine über die Fähigkeit, diese Aggregate aufzulösen. Die detaillierte Untersuchung von fünf Isoformen der Klasse CI und zwei Isoformen der Klasse CII aus Lycopersicon esculentum ergab, dass diese oligomere Komplexe einer unterschiedlichen Anzahl von Untereinheiten bilden. Nach Coexpression waren Proteine beider Klassen in heterooligomeren Komplexe zu finden. Allerdings deuteten sich bei der Analyse der Fähigkeit einzelner Isoformen der Klasse CI, Heterooligomere mit Klasse CII-Proteinen zu bilden, Unterschiede an. sHsp kommt weiterhin eine Funktion in der Kontrolle der Aktivität von HsfA2 zu. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass sHsps der Klassen CI und CII völlig unterschiedliche Rollen in der Regulation der intrazellulären Verteilung von HsfA2 spielen. Nach Überexpression in Mesophyllprotoplasten bildete LpHsp17.4-CII, nicht aber das nahe verwandte LpHsp17.3-CII mit HsfA2 große, cytoplasmatische Aggregate. Hsp17-CI dagegen verhinderte die Coaggregation von Hsp17.4-CII mit HsfA2.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher charakterisiert. Gsf2 ist ein 46 kDa großes ER-Transmembran-Protein mit zwei membrandurchspannenden Domänen, wobei C- und N-Terminus cytosolisch orientiert sind. Zudem besitzt Gsf2 C-terminal ein klassisches Dilysin-Motiv. Dies deutet daraufhin, dass Gsf2 über den retrograden Transportweg mittels COPI-Vesikel recycelt wird. Dies impliziert auch einen Transport von Gsf2 über den anterograden Transportweg [COPII]. Bisherige Befunde deuteten darauf hin, dass Gsf2 in das sekretorische System involviert ist. Eine Deletion des GSF2-Gens resultiert in einer Retention der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 im ER. Für die Identifikation von potentiellen Interaktionspartnern von Gsf2 im sekretorischen System wurden Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems [SUS] durchgeführt. Dabei konnten Interaktionen zwischen den Proteinen Sar1, Sec12, Hxt1 und dem Sec61-Translokations-Komplex mit dem vermeintlichen Verpackungschaperon Gsf2 identifiziert werden. Zusätzlich konnte unter Anwendung einer Pull-Down-Analyse die Interaktion zwischen Gsf2 und Hxt1 biochemisch bestätigt werden. Zur Aufklärung von funktionellen Domänen, wurde ein in Gsf2 identifiziertes potentielles ER-Export-Motiv [RR](F)[RR] durch den Austausch durch fünf Alanine modifiziert. Die Veränderung der Aminosäuresequenz [RR](F)[RR] (354-358 AS) in Gsf2 bewirkte einen partiellen Funktionsverlust bei einer restriktiver Temperatur von 37°C. Des Weiteren deuteten mehrere Anhaltspunkte darauf hin, dass Gsf2 mit Hxt1 in COPII Vesikel verpackt wird. Eine Aufreinigung von konstitutiven COPII-Vesikel aus in vivo erwies sich experimentell als nicht durchführbar. Deshalb wurde ein in vitro Ansatz [COPII vesicle budding assay] ausgewählt. Dafür wurden die für die Vesikelbildung benötigten Komponenten aufgereinigt und mit ER-Donormembranen inkubiert. Mittels Western-Blot-Analyse konnte Gsf2 in COPII Vesikeln nachgewiesen werden. Das Vorhandensein eines klassischen Rücktransport-Motivs (KKSN) am C-Terminus von Gsf2 weist zudem daraufhin, dass das Protein über den retrograden Transportweg [COPI] zurück zum ER transportiert wird. Durch die Blockade des retrograden Transportweges mit anschließender Lokalisationsuntersuchungen mittels Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Fehlverteilung von Gsf2 an der Plasmamembran festgestellt werden. Somit wird Gsf2 möglicherweise über den retrograden Transportweg recycelt. Postuliert wird ein Modell bei dem Gsf2 für die Aufkonzentration spezifischer Cargomoleküle [Hxt1] an ER-Exit-Sites zuständig ist und deren Verpackung in COPII Vesikel gewährleistet. Anschließend wird es über den retrograden Transportweg zurück zu ER transportiert.