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In the first part of this work, the development of a novel two-dimensional native gel electrophoretic system (2-D BN/hrCNE) is described. This new system simplifies proteomics and biochemical analysis of mega protein complexes that are dissociated into the constituent complexes during 2-D electrophoresis, thereby reducing the complexity of the system considerably. This technique is exceptionally well suited for the in-gel detection of fluorescence-labeled proteins and the identification of individual enzymes and protein complexes by specific in-gel assays on native gels.
In the second part, a new technique for the native immunoblotting of blue native gels (NIBN) was developed. This new technique allows for the identification of conformation-specific antibodies and the discrimination of antibodies recognizing linear epitopes of denatured proteins. Identification of conformation-specific antibodies is becoming increasingly important not only for the electron microscopic identification of native proteins but also for structural investigations in general. For this purpose, a commonly used protocol for Western blotting of blue native gels was modified in such a way that the native state of proteins and protein complexes was retained throughout the complete protocol. Instead of using the denaturing methanol in Western blotting protocols, mild detergents such as Tween 20, digitonin and Brij 35 were used for the obligatory removal of protein bound Coomassie-dye.
The detection of respiratory complex I by activity staining on the blot membrane demonstrated that all three non-ionic detergents preserved the native state of complex I. The native state of the enzyme on the blot membrane was also monitored and confirmed with the help of a set of conformation-specific antibodies. NIBN can be used as a simple alternative method to the demanding native ELISA to screen for conformation-specific antibodies for structural studies. Unlike the time consuming native ELISA, NIBN does not require introduction of appropriate affinity tags and purification of the target protein by chromatography. Thus, the NIBN technique is especially useful for microscale projects and for proteins not easily accessible to genetic manipulation.
The third part aimed at identification of the immediate protein interaction partners of Cox26, a hydrophobic protein that has been identified by our group as a novel component of yeast respiratory supercomplex. Multi-dimensional electrophoretic techniques were applied to identify non-covalent and covalent protein-protein interactions of Cox26. Three-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS-PAGE) gave both qualitative and quantitative information on covalent and non-covalent interactions of Cox26 and subunits of cytochrome c oxidase (complex IV), and showed that most of the Cox26 protein was non-covalently bound to the complex IV moiety of the respirasomes. Four-dimensional electrophoresis (BNE/BNE/SDS/SDS-PAGE) applying reducing and non-reducing conditions revealed that a minor fraction of Cox26 used a single cysteine residue in the center of a predicted transmembrane helix to form a disulfide bond with the Cox2 subunit of complex IV. A structural role of Cox26 protein in the assembly/stability of respiratory strings or patches has been suggested.
The last part of this work focused on the isolation and characterization of native and morphologically intact nucleoids from bovine heart mitochondria, since only a few studies on nucleoid organization and composition have been carried out on mammalian tissues. The nucleoids appeared as distinct bands (apparent mass around 30-36 MDa) in blue native-PAGE on large pore gels. The moderate variation in particle size seems to reflect variations in the binding of loosely nucleoid-associated components like respiratory chain complexes. The estimated 30-36 MDa mass of nucleoids on native gels suggested that each nucleoid contains one mtDNA molecule provided that nucleoids contains equal amounts of DNA, protein and RNA (Miyakawa et al., 1987).
Electron microscopic analysis of native nucleoids, which was performed by Dr. Karen Davies from the Max-Planck-Institute of Biophysics, Department of Structural Biology, Frankfurt, showed homogenous pool of particles with dimensions in 85x100 nm (in negative stain) and 100x150 nm (in cryo-tomography). Some of the nucleoids showed dumbbell-shape indicating dimerization of nucleoids. Recent EM and high-resolution light microscopy analysis of mammalian nucleoids have reported that nucleoids have a size of 70 nm in average. We also observed the same size of 70 nm in cryo-tomogramms when we applied harsher treatment of the native nucleoid particles with dimensions 100x150 nm. This observation is in agreement with published nucleoid sizes from both EM and high-resolution light microscopy, if we assume that native nucleoids have been dissociated under harsher treatment.
The protein composition of bovine heart mt-nucleoids was analyzed by a number of complementary approaches to identify low and highly abundant, easily dissociating and tightly bound proteins, and to rank the 90 most abundant mt-nucleoid proteins. Native and denaturing gel electrophoresis techniques were coupled to LC-MS/MS to achieve a comprehensive protein component analysis. Qualitative MS analysis of highly purified nucleoids identified more than 400 proteins, including well known nucleoid proteins such as mitochondrial transcription factor and mtDNA-binding protein (TFAM), mitochondrial single-stranded DNA-binding protein (mtSSB), mitochondrial DNA polymerase subunit gamma-2 (POLG2) and mitochondrial helicase C26H10ORF2 protein (Twinkle). These proteins were ranked according to Mascot scores, and sorted according to presumed functional properties. A large group of proteins involved in protein synthesis comprised an almost complete set of subunits of mitochondrial ribosomes suggesting that the nucleoids contained significant amounts of mitochondrial ribosomes. Identification of sixty six proteins from the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system comprising around 100 proteins in total suggested that OXPHOS proteins are also associated with mt-nucleoids.
Interestingly, TFAM, described as a main mtDNA packaging factor in human and other mammalian cells, was not confirmed here as a major nucleoid component from bovine heart mitochondria. Fluorescence staining of protein spots on 2-D IEF/SDS gels clearly identified TFAM, but according to the stain intensity, this protein did not rank in the list of the 90 most abundant nucleoid proteins. Western blot analysis of sucrose gradient fractions revealed an enrichment of putative TFAM isoform in nucleoid fractions. Unexpectedly, the uncharacterized mitochondrial protein Es1 was identified as the most abundant nucleoid protein in bovine heart nucleoids instead. This implicates that nucleoid organization may differ between species and tissues. A functional characterization of Es1 is required to clarify its role in mammalian nucleoids.
Ausgangspunkt der Dissertation bilden 2.700 keltische und römische Fundmünzen sowie zahlreiche Produktionsreste aus Bunt- und Edelmetall, die auf dem Castellberg, Kreis Bitburg-Prüm, geborgen wurden. Die Funde stammen zum überwiegenden Teil aus den großflächigen Ausgrabungen und Prospektionen, die im Rahmen des von der Deutschen Forschungsgemeinschaft geförderten Schwerpunktprogramms „Romanisierung“ durchgeführt wurden.
Nach bisherigem Forschungsstand befand sich auf dem ausgedehnten Bergplateau vom 2. bis 1. Jh. v. Chr. ein Oppidum der Treverer. Im Verlauf der römischen Okkupation entwickelten sich an diesem Platz ein gallo-römisches Heiligtum sowie eine Zivilsiedlung, welche eine Platzkontinuität bis zum Beginn des 5. Jh. n. Chr. aufweisen.
Aufgrund der komplexen Siedlungsabfolge sowie der gut dokumentierten archäologischen Kontexte nehmen die Funde vom Castellberg eine Schlüsselrolle für die Erforschung der latènezeitlichen Münzprägung Nordgalliens ein und bieten beste Voraussetzungen, Zirkulation und Funktion von Münzen in diesem Raum bis zur Spätantike zu untersuchen.
Wesentliches Ziel der Studie bilden die Erfassung und Dokumentation der genannten Funde sowie deren archäologische, archäometrische und numismatische Auswertung auf Grundlage der erschlossenen Fundkontexte.
Zu Beginn stehen methodische Überlegungen zur chronologischen Einordnung und zur histographischen Darstellung des Fundgutes.
Die anschließenden Betrachtungen widmen sich dem antiken Geldbegriff. Die Auseinandersetzung mit der Wertgrundlage des antiken Geldes stellt eine Voraussetzung dar, um das Vorkommen von Münzen aus archäologischen Kontexten historisch angemessen zu beschreiben und damit die Funktion von und den Umgang mit Geld in der Antike zu erfassen.
Einen Schwerpunkt der Arbeit stellen die nachfolgenden quellenkritischen Untersuchungen zu den Bedingungen des Zustandekommens und der Überlieferung der Münzfunde dar. Anhand des Fundmaterials vom Castellberg werden exemplarisch die Auswirkungen antiker und nachantiker selektiver Faktoren dargelegt. Durch den Abgleich mit strukturell vergleichbaren Fundplätzen wird anschließend eine Überprüfung und Erweiterung der Ergebnisse vorgenommen, wobei insbesondere Fragen nach den antiken Selektionsmechanismen im Vordergrund stehen.
Im Anschluss erfolgt die Auswertung der Fundmünzen aus den Ausgrabungen und Prospektionen. Mit Hilfe von Befundanalysen, Münzkartierungen und Münzreihenauswertungen werden die einzelnen Fundkomplexe detailliert auf ihre zeitlichen und räumlichen Verhältnisse hin untersucht. Auf diesem Weg gelingt es, weiterführende Erkenntnisse zur Genese, Entwicklung und zum Ende des spätlatènezeitlichen Oppidums sowie des gallo-römischen Vicus und Heiligtums auf dem Castellberg zu gewinnen.
Am Ende der Arbeit stehen Fragen zum treverischen Münzwesen im Vordergrund. Neben dem umfangreichen Material vom Castellberg wurden zahlreiche weitere keltische Münzen von Vergleichsfundplätzen als Materialbasis für die vorgenommenen Stempelstudien, Gewichtsuntersuchungen und Metallanalysen herangezogen.
Es wird zunächst aufgezeigt, dass die bisher gebräuchliche Typologie der treverischen Silberprägung weiter zu differenzieren und präzisieren ist. Die Ergebnisse führen ferner zu Konsequenzen für die relativchronologische Fixierung der betreffenden Münztypen.
Die nachfolgenden Stempelstudien konzentrieren sich auf die beiden frühesten Silbermünztypen der Treverer; es werden Art und Umfang dieser Prägungen aufgezeigt sowie Rückschlüsse für die Fertigungstechnik der Prägestempel gezogen.
Einen zentralen Aspekt der Dissertation bildet die abschließende Auswertung der Metallanalysen an ausgewählten Münztypen der Treverer, Remer und Leuker. Die Analysen geben Auskunft über die Spezifika der betreffenden Emissionen und liefern ein ergänzendes Bild zu den numismatischen Studien. Des Weiteren wird dargelegt, inwieweit die Herkunft der ausgemünzten Erze nachvollzogen werden kann.
Ausgehend von dem bedeutenden Neufund einer Patrize sowie zahlreichen Funden von Münzschrötlingen, Fehlgüssen und Metallschmelzresten vom Castellberg wird darüber hinaus die Frage geklärt, ob auf dem Plateau eine treverische Prägestätte zu lokalisieren ist und welche Münztypen dort geprägt wurden. Weitere Funde von Prägewerkzeugen aus dem Untersuchungsgebiet werfen grundlegende Fragen zu den Fertigungstechniken auf, denen in diesem Zusammenhang ebenso nachgegangen wird.
Die Untersuchungen liefern erstmals konkrete Erkenntnisse zu Ablauf und Organisation des Münzwesens der Treverer sowie zu strukturellen Veränderungen, die im Zusammenhang mit dem Gallischen Krieg und der nachfolgenden römischen Einflussnahme zu sehen sind.
Hintergrund. Ziel dieser Studie war es, zu bewerten, ob die Datenübertragung während peripherer endovaskulärer Eingriffe durch ein sprachgesteuertes, optisches Head-Mounted Display verwirklicht, und ob hierdurch der Arbeitsablauf der Intervention verbessert werden kann.
Methoden. Wir benutzten die Google Glass® Explorer Edition in Verbindung mit einer eigens entwickelten Glass App, um vorhandene Grafiken über die Datenbrille durch Sprachbefehle zugänglich zu machen. 40 Medizinstudenten im letzten Drittel des Medizinstudiums wurden in zwei Gruppen randomisiert.
Jeder Proband erhielt die Aufgabe eine PTA der A. femoralis superficialis an einem High-Fidelity-VR-Simulator (ANGIO-Mentor®, 3D Systems) durchzuführen. Während Gruppe A hierfür nötige Informationen über einen zusätzlich installierten Monitor erhielt, verwendete Gruppe B Google Glass®, um jeweilige Informationen durch zuvor definierte Sprachbefehle aufzurufen. Die objektive Bewertung der erbrachten Leistung erfolgte durch standardisierte Bewertungsbögen in dichotomer Nominalskalierung und durch die Messung der für die Aufgaben benötigten Zeit. Am Ende jeder Simulation erfolgte die subjektive Bewertung seitens der Probanden durch standardisierte Fragebögen mit 5-Level-Likert-Skalierung.
Ergebnisse. Eine maximale Punktzahl von 10 Punkten war erreichbar. Der in Gruppe A und Gruppe B gefundene Median lag bei 9 Punkten mit nicht signifikanten Abweichungen (p = 0,91). Die Gesamtdauer des Eingriffs betrug zwischen 12 und 14 Minuten. Gruppe B war unter Verwendung von Google Glass®, aufgrund technischer Schwierigkeiten mit der getesteten App, im Schnitt um 1:07 Minuten signifikant langsamer (p = 0,01). Dennoch konnte nachgewiesen werden, dass Google Glass® bei dem Transfer einfacher Informationen schneller oder zumindest gleichwertig gegenüber dem klassischen Monitoring war.
In diesem Kontext erachteten 92,5% der Probanden die Digitalisierung im klinischen Alltag als sinnvoll. 17 von 20 Teilnehmern (85%) empfanden die Handhabung von Google Glass® als einfach bis sehr einfach. Alle Teilnehmer waren der Ansicht, dass Augmented Reality bei peripheren endovaskulären Eingriffen im Katheterlabor nützlich sein könnte.
Schlussfolgerung. Google Glass® war dem klassischen Monitoring im Katheterlabor hinsichtlich der Gesamtinterventionszeit nur geringfügig unterlegen und behinderte den Arbeitsablauf während einer simulierten PTA der A. femoralis superficialis nicht. Unsere Studie offenbarte hierbei technische Schwierigkeiten bei der Genauigkeit der Spracherkennung und der Bildqualität von Google Glass®. Trotzdem konnten einzelne Aufgaben durch die Nutzung der Google Glass® signifikant schneller durchgeführt werden. Wir erwarten, dass nach Überwindung dieser technischen Probleme der Arbeitsablauf während endovaskulären Eingriffen mit einem optischen Head-Mounted Display verbessert werden kann.
Effekte von Neonikotinoiden auf die Aktivität des Muskels M17 und das Lernverhalten der Honigbiene
(2015)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Auswirkung von Neonikotinoiden auf die Muskelspikeaktivität des Muskels M17 und auf das Lernvermögen in einer komplexen Aufgabe an der Honigbiene (Apis mellifera carnica) durchgeführt. Dabei wurden drei verschiedene Substanzen verwendet: Clothianidin, Thiacloprid und Imidacloprid. Neonikotinoide stehen häufig im Verdacht, für das Sterben von Bienenvölkern verantwortlich zu sein, da die Bienen bei ihrer Nahrungssuche an behandelten Pflanzen den Substanzen ausgesetzt sind und diese möglicherweise damit auch an ihr Volk weitergeben. Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, diese mögliche Gefährdung der Honigbiene durch Neonikotinoide weiter aufzuklären und deren Risiken zu beurteilen. Der Hintergrund für die Versuche zur Muskelspikeaktivität waren vorangegangene Versuche, die Auswirkungen von Neonikotinoiden auf die Motorik von sich frei bewegenden Individuen dokumentierten. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich diese Effekte auch an der Spikeaktivität des Muskels M17 widerspiegeln. Dafür wurden Elektromyogramme des Muskels M17 zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Gabe der Substanzen erstellt und deren mediane Anzahl mit einer Kontrollgruppe verglichen.
In einem ersten Versuch wurden Clothianidin (1 µM), Thiacloprid (1 µM), Imidacloprid (1 µM) oder eine Kontrollsubstanz (PBS) in die Kopfkapsel appliziert. Beim Vergleich mit der Kontrollgruppe zeigten sich für Imidacloprid keine Auswirkungen. Clothianidin verursachte eine deutlich erhöhte mediane Spikerate des Muskels M17, während Thiacloprid diese absenkte, beides im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch bei einer um 30 Minuten versetzten Doppelapplikation von Clothianidin (1 µM) und Thiacloprid (10 µM) stellten sich diese Effekte ein, wobei Clothianidin eine dominante Rolle einzunehmen scheint. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen zur Laufaktivität, welche sich ebenfalls durch Clothianidin erhöhte und durch Thiacloprid absenkte.
Ein weiteres Experiment untersuchte die Auswirkung einer akuten Fütterung mit Clothianidin (1 ng in 1 µl) bzw. Thiacloprid (250 ng in 1 µl) auf die Anzahl der Muskelaktionspotenziale. Auch hier zeigt sich eine deutliche Erhöhung der Spikeanzahl durch Clothianidin und eine Absenkung der Spikeanzahl durch Thiacloprid, was die Ergebnisse des ersten Versuchs nochmals bestätigt.
Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Auswirkung einer chronischen Fütterung mit Clothianidin (50 ppb) bzw. Thiacloprid (5000 ppb) auf die Anzahl an Spikes durchgeführt. Die Bienen wurden dabei über mehrere Wochen im Volk mit den jeweiligen Substanzen gefüttert. Dabei zeigte sich, dass auch eine chronische Fütterung der Bienen mit Clothianidin ihre Anzahl an Muskelaktionspotenzialen deutlich erhöht, während eine chronische Fütterung mit Thiacloprid diese absenkt. In einer Kombination der chronischen Fütterung mit einer zusätzlichen akuten Fütterung des jeweils anderen Neonikotinoids zeigte sich, dass auch hier Clothianidin eine dominante Rolle gegenüber Thiacloprid einnimmt und auch keine synergistischen oder Gewöhnungseffekte der beiden Substanzen eintreten. Die chronisch eingefütterten Völker entwickelten sich dagegen wie die Kontrollvölker, sodass die hier beschriebenen Auswirkungen auf die Einzelbiene keine sichtbaren Effekte auf ganze Völker zu haben scheinen.
Zusätzlich wurden Versuche zum Duftlernen in einer komplexen Lernaufgabe, dem positiven Patterning, unter Einfluss von Clothianidin durchgeführt. Die Bienen müssen dabei zwischen unbelohnten Einzeldüften und einem belohnten Duftgemisch, bestehend aus den beiden Einzeldüften, unterscheiden. In verschiedenen Versuchsdurchläufen wurden 0,25 ng oder 1 ng Clothianidin (jeweils 1 µl) in den Thorax injiziert, entweder vor der Akquisitionsphase oder vor dem ersten Abruftest nach drei Stunden. In keinem der Versuchsdurchläufe zeigten sich Effekte des Clothianidins auf den Lernvorgang, weder in der Akquisitionsphase noch in den Abruftests. Somit wurden weder das Lernen an sich, noch die Konsolidierung und damit die Überführung des Gelernten in das Langzeitgedächtnis durch das Clothianidin beeinflusst. Allerdings könnte die Immunabwehr der Bienen nach längerer Einwirkung des Clothianidins (24 h) in der höheren Konzentration herabgesetzt sein, da viele Bienen starben.
Insgesamt ergaben sich Effekte von Clothianidin und Thiacloprid auf die Anzahl der Aktionspotenziale des Muskels M17, die sich aber im gesamten Volk nicht widerspiegeln. Der Lernvorgang in der hier durchgeführten komplexen Lernaufgabe wird durch Clothianidin nicht beeinflusst. Möglicherweise entsteht dieser Unterschied in den Ergebnissen durch eine Bindung der Substanzen an verschiedene Rezeptorsubtypen, die pharmakologisch unterschiedliche Eigenschaften besitzen und somit auch unterschiedliche Auswirkungen zeigen.
Atherosklerotische Stenosen der Karotiden sind eine häufige Erkrankung mit variablem Verlauf und stellen durch ihre potentielle Emboligenität einen wichtigen Risikofaktor für zerebrale Ischämien dar. Klinische und paraklinische Parameter helfen, das individuelle Schlaganfallrisiko bei Patienten mit hochgradigen ACI-Stenosen einzuschätzen, das unmittelbar nach einem thrombembolischen Ereignis besonders hoch ist. Als histomorphologisches Korrelat dieser "Vulnerabilität" wird die Ruptur der fibrotischen Deckplatte der Plaque propagiert, die häufiger bei symptomatischen Patienten nachzuweisen ist. Sie korreliert mit der Infiltration der Gefäßwand durch aktivierte Leukozyten, die über molekulare und zelluläre Interaktionen die Zell- und Bindegewebskomposition der Plaque verändern können. Die strukturelle Integrität atherosklerotischer Läsionen beruht auf der extrazellulären Vernetzung von kollagenem Bindegewebe, das überwiegend von phänotypisch veränderten glatten Gefäßmuskelzellen produziert wird. Eine Hypothese besagt, dass die im Rahmen der Inflammation stattfindende Zunahme proapoptotischer Mediatoren über eine Ausdünnung der zellulären und bindegewebigen Strukturen zu einem Verlust an mechanischer Stabilität führt und somit eine symptomatische Ruptur begünstigt. Da der Nachweis einer Ruptur mit Exponierung des thrombogenen nekrotischen Kerns allerdings nur in einem Teil der symptomatischen Plaques und umgekehrt auch in einem Teil der asymptomatischen nachgewiesen werden kann, ist aber bislang unklar, ob o.g. Abläufe in der humanen Karotis-Atherosklerose tatsächlich mit einer klinischen Relevanz einhergehen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher das Auftreten der Apoptose von glatten Gefäßmuskelzellen (mittels DNA in situ end labeling Technik, TUNEL-Färbung) in 38 prospektiv gesammelten Endarterektomie-Präparaten hochgradiger Karotisstenosen quantitativ erfasst und statistisch in Beziehung gesetzt zu Parametern der Plaque-Instabilität, klinisch definiert durch kürzliche (< 60 Tage zurückliegende) ischämische Ereignisse (n=19) und histopathologisch definiert über den Nachweis einer Plaque-Ruptur (n=14). Außerdem wurde eine morphometrische Analyse der einzelnen Plaque-Komponenten durchgeführt und deren Ergebnisse zu den zellulären und klinischen Parametern in Beziehung gesetzt. Die Morphometrie ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen symptomatischen vs. asymptomatischen und rupturierten vs. unrupturierten Plaques was die Größe der fibrotischen Deckplatte, die durchschnittliche Dicke (Kern-Lumen-Distanz) und die dünnsten bzw. dicksten Stellen der Deckplatte anbelangt. Anzahl und Konzentration apoptotischer glatter Muskelzellen war deutlich (p<0,001) erhöht in symptomatischen, klinisch instabilen, Karotisplaques. Allerdings waren die Apoptose-Raten in Präparaten, die eine Plaque-Ruptur aufwiesen, nicht signifikant erhöht. Darüber hinaus fand sich kein Hinweis darauf, dass erhöhte Apoptose-Raten zu einem quantifizierbaren Verlust glatter Gefäßmuskelzellen in der fibrotischen Deckplatte führen. Auf dem Boden dieser Ergebnisse kann gefolgert werden, dass erhöhten Apoptose-Raten glatter Gefäßmuskelzellen in der humanen Atherosklerose offenbar eine tragende Bedeutung bei der Entwicklung thrombembolischer Ereignisse zukommt. Allerdings wird die Annahme, dass erhöhte Apoptose-Raten über einen Verlust an glatten Gefäßmuskelzellen Einfluss auf die morphometrischen Eigenschaften der fibrotischen Deckplatte atherosklerotischer Karotis-Läsionen nehmen und zu deren Ausdünnung führen durch die vorliegende Untersuchung nicht gestützt. Vielmehr scheint es plausibel, dass die Apoptose glatter Muskelzellen im Rahmen inflammatorischer Prozesse Einfluss auf die Komposition der Karotisplaque nimmt und so über eine Desintegration der zellulären und bindegewebigen Bestandteile zu reduzierter mechanischer Widerstandskraft und Rupturneigung führt.
Der durchflusszytometrische Nachweis antigenspezifischer T-Lymphozyten über die
Zytokinproduktion nach Kurzeitstimulation ermöglicht Aussagen über die zelluläre
Immunität, was in bestimmten Patientenkollektiven wie z. B. stammzelltransplantierten
Patienten von großem Wert sein kann. Infektionen mit Herpesviren wie z.B. dem
humanen Zytomegalievirus (CMV) oder den Herpes-Simplex-Viren (HSV) können in
diesem Kollektiv zu schweren, zum Teil auch letal verlaufenden Erkrankungen führen.
Zwar wurde diese Methode inzwischen durch die Entwicklung kommerzieller Testkits
zum Nachweis dieser Lymphozyten direkt aus Vollblut vereinfacht. Dennoch ist die
Durchführung dieses Tests nur wenig standardisiert und sehr aufwendig. In dieser
Arbeit wurde die Methode der Bestimmung antigenspezifischer T-Lymphozyten aus
Vollblut daher im Bezug auf die Durchführbarkeit optimiert sowie die Anwendbarkeit
dieser Methode bei Patienten mit bestehender Lymphopenie evaluiert.
Im Einzelnen wurde zunächst die Messung antigenspezifischer CD4+ T-Lymphozyten
anhand des Superantigens Staphylokokkenenterotoxin-B (SEB) sowie der Herpesviren
CMV und HSV-1 eingeführt. Hierzu wurde die Spezifität der Lymphozytenreaktionen
im Hinblick auf den Immunstatus von Probanden getestet und die Reproduzierbarkeit
der Messergebnisse ermittelt. Zur Vereinfachung der Stimulation wurde der
Thermoblock eingeführt, der die Inkubation der Proben automatisch nach einer
vorgegebenen Zeitspanne beendet. Vergleichende Ansätze nach der herkömmlichen
Methode mit einer Inkubation im Brutschrank ergaben keine Differenzen zwischen den
Inkubationsmethoden hinsichtlich der Resultate. Weiterhin wurde versucht, die Proben
zu konservieren, um so das Zeitfenster zwischen Blutentnahme und Verarbeitung der
Blutprobe zu vergrößern. Hierfür wurden die Proben mit dem Reagenz CytoChex®
behandelt, einem Zellstabilisator, der der Konservierung von Leukozyten dient. Trotz
mehrfacher Abwandlung des Protokolls gelang es nicht, die Blutproben für die
antigenspezifische Stimulation zu konservieren.
Ein zentraler Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Fragestellung nach der
Anwendbarkeit dieses Testes zum Nachweis CMV-spezifischer T-Lymphozyten im
Rahmen einer Lymphopenie. Dies wurde bei einem Kollektiv stammzelltransplantierter
Patienten untersucht. Es zeigte sich, dass in diesem Kollektiv der Test durchführbar ist,
wenn mindestens 1.000 CD8+ T-Lymphozyten bzw. 3.000 CD4+ T-Lymphozyten durchflusszytometrisch nachgewiesen werden konnten. Anhand dieses Kollektivs wurde
zuletzt die Effizienz dieser Methode durch Weglassen der Kontrollantigenmessungen in
bestimmten Fällen und Einführung eines Auswertungstemplates zur indirekten
Ermittlung CD4+ T-Lymphozyten aus der CD8+ T-Lymphozytenmessung gesteigert.
Zusammenfassend bringen die in dieser Arbeit vorgestellten Modifikationen der
Standardmethode eine deutliche Vereinfachung mit sich. Weiterhin wird es möglich,
auch im Rahmen einer Lymphopenie antigenspezifische T-Lymphozyten nachzuweisen.
Dies ermöglicht zumindest weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Fragestellung
nach einer ausreichenden Immunantwort gegen CMV bei immunsupprimierten
Patienten. So können in Zukunft auch bei Patienten mit hohem Risiko für eine CMVReaktivierung
und Erkrankung Aussagen über die Immunsituation gemacht werden um
möglicherweise eine Verbesserung der diagnostischen und damit auch therapeutischen
Situation dieser Patienten zu erzielen.
Die zunehmende Resistenzentwicklung bei der Therapie gegen Herpes Simplex Viren vom Typ-1, besonders bei immundefizienten Patienten, erfordert die Entwicklung von Therapie-Alternativen. In Anlehnung an die Erkenntnisse der Traditionellen Chinesischen Medizin, die sich die Wirksamkeit von Heilpflanzen zu Nutze macht, wurde in dieser Arbeit das antivirale Potential von Extrakten aus Rheum Spezies gegen HSV-1 untersucht. Rheum oder Rhabarber gehört zur Familie der Polygonaceae. Die hier verwendeten Extrakte stammen aus den Wurzeln und Rhizomen von Rheum palmatum L. und Rheum rhaponticum, welche ursprünglich aus Asien stammende Heilpflanzen sind. Rheum ist reich an polyphenolen Inhaltsstoffen der Gruppe der Flavonoide und Tannine, welche Gegenstand der Forschung sind und denen schon vielfache pharmakologische Wirkungen zugesprochen wurden. Die antivirale Wirksamkeit von Rheum wurde bislang nur in der chinesischen Literatur veröffentlicht, wo bestimmte Untersuchungen mit HBV und HSV vorgenommen wurden. Hier wurde in einem Zellkulturmodell mit Vero-Zellen eine antivirale Testung vorgenommen. Die Auswirkungen der Rheum Extrakte auf den durch HSV-1 verursachten zytopathischen Effekt wurden untersucht. Eine Verminderung oder das Fehlen des CPE wurde als antivirale Wirksamkeit gewertet. In zwei Versuchsreihen, einmal mit simultaner Beimpfung der Vero-Zellen mit Virus in einer MOI von 0,01 und Extrakten in Konzentrationen von 500µg/ml bis 4µg/ml und dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wurde das Verhalten der Zellen beobachtet. Unter dem Auflichtmikroskop wurde das Ausmaß des CPE beurteilt und anschließend mit Hilfe des Computerprogramms CalcuSyn die IC50 Werte berechnet. Der Wert der 50% inhibitorischen Konzentration sagt aus, bei welcher Extraktkonzentration 50% der Zellen einen CPE aufweisen und ist somit Maß für die antivirale Wirksamkeit. Weiterhin wurden die Rheum Extrakte mittels MTT-Assay auf ihre Zytotoxizität hin untersucht und der TC50 Wert als Maß der Toxizität berechnet. Der aus IC50 und TC50 berechnete Therapeutische Index setzt Wirksamkeit und Toxizität in Relation und ist ein Wert für die mögliche Validität einer Substanz. Je höher dieser Wert, desto viel versprechender die Substanz. Besonders Extrakte 9, 10 und 17 bedürfen der genaueren Betrachtung, da sie in der vorliegenden Untersuchung Therapeutische Indexe von >12, >9,8 und >17,9 gezeigt haben. Dies deutet auf ein antivirales Potential, bei keiner nachweisbaren Zytotoxizität in verwendeten Konzentrationen, hin. Im Vergleich zeigte Aciclovir einen TI von 22. Mit diesen drei Substanzen wurde der Versuch dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wiederholt. Vor Allem Extrakt Nr. 17 zeigte auch bei Vorinkubation von einer und sechs Stunden mit einem IC50 von 80µg/ml und 95,5 µg/ml eine signifikante Reduktion des CPE. Dies gibt einen Hinweis auf die mögliche Art des Wirkmechanismus, denn Zeichen der Wirksamkeit trotz Vorinkubation sprichen für eine Intervention im späteren Stadium des viralen Replikationszyklus. Problematisch ist die Übertragung der hier ermittelten in vitro Ergebnisse auf in vivo Verhältnisse. Allerdings sind die Ergebnisse vielversprechend und eine weiterführende Untersuchung erscheint lohnenswert. Hier ist vor Allem die genaue Charakterisierung und Isolierung der Inhaltsstoffe der wirksamen Extrakte notwendig. Nachfolgend könnte die Wirksamkeit der ermittelten Polyphenole in einem Tierversuch verifiziert werden.
Einleitung: Das Pseudoaneurysma (PSA) stellt eine der häufigsten Komplikationen nach arteriellen Punktionen dar. Dabei unterscheiden sich die Komplikationsraten kathetergestützter Verfahren bei diagnostischen Eingriffen deutlich von jenen bei therapeutischen Eingriffen. Zur Behandlung des Pseudoaneurysmas steht eine große Bandbreite an Therapieoptionen zur Verfügung, unter anderem die ultraschallgestützte Thrombininjektion (TI) sowie die Therapie mittels konventionellem Druckverband (DV). Jedoch werden venöse Thrombosen nach der Behandlung des Pseudoaneurysmas beschrieben. Der Einfluss von Antikoagulantien (AK) und Thrombozytenaggregationshemmern (TAH) sowohl auf die Erfolgsraten der Pseudoaneurysmatherapie als auch die anschließende Entstehung venöser Thrombosen wurde bisher noch nicht analysiert.
Fragestellung: Die Effektivität des Druckverbands und der Thrombininjektion bei Patienten mit Pseudoaneurysma und damit assoziierten venösen Thrombosen wurde geprüft. Außerdem wurden die Auswirkungen von Antikoagulantien und Thrombozytenaggregationshemmern auf die Erfolgsraten der Pseudoaneurysmatherapie und die damit assoziierten venösen Thrombosen untersucht.
Methoden: Es wurden von Januar 2010 bis Dezember 2018 insgesamt 468 Patienten mit Pseudoaneurysma untersucht, wovon 238 Patienten in die retrospektive Studie eingeschlossen wurden. Die Behandlung des Pseudoaneurysmas erfolgte mittels Thrombininjektion oder Druckverband. Nach Ablauf von 24 Stunden wurde der Therapieerfolg sonographisch kontrolliert, wobei auch auf das Neuauftreten venöser Beinvenenthrombosen geachtet wurde. Bei allen Patienten wurde die Medikation mit Antikoagulantien und Thrombozytenaggregationshemmern zum Zeitpunkt der Pseudoaneurysmatherapie erhoben.
Ergebnisse: Die Thrombininjektion war dem Druckverband sowohl hinsichtlich des größeren Therapieerfolgs (TI 86% vs. DV 52%, p<0,001) als auch der geringeren Thromboseinzidenz (TI 7,7% vs. DV 21,3%, p=0,039) signifikant überlegen.
Insgesamt erlitten 40 der 238 Patienten eine neu aufgetretene venöse Thrombose der unteren Extremität. Auch bei Betrachtung des Einflusses von Antikoagulantien und Thrombozytenaggregationshemmern erwies sich die 5 Thrombininjektion als dem Druckverband signifikant überlegen. Jedoch wurde bei der Thrombininjektion eine um 18% niedrigere Erfolgsrate unter Antikoagulation festgestellt (TIoAK 97% vs. TImAK 79%, p=0,22), wohingegen bei Druckverbandanlage unter Antikoagulation die Erfolgsrate nur um 6% geringer war (DVoAK 57% vs. DVmAK 51%, p=0,38). In Bezug auf die Thromboseraten nach Thrombininjektion bzw. Druckverband unter Antikoagulation oder Thrombozytenaggregationshemmern konnten keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden.
Fazit: Es konnte nachgewiesen werden, dass die Thrombininjektion eine sichere Methode zur Behandlung des Pseudoaneurysmas darstellt und nach Ansicht der Autoren, bei vorhandener Expertise, primär angewandt werden sollte.
Denn die Thrombininjektion ist dem Druckverband in Bezug auf Erfolgs- und Thromboseraten signifikant überlegen. Antikoagulantien beeinträchtigen den Erfolg der Thrombininjektion stärker als den des Druckverbands, weshalb bei Notwendigkeit einer Pseudoaneurysmatherapie die Pausierung der Antikoagulantien im Rahmen einer patientenspezifischen Risiko-Nutzen-Abwägung in Betracht gezogen werden sollte.
Das Nierenzellkarzinom (NZK) ist der häufigste maligne Tumor der Niere. In vielen Fällen sind bereits bei der Erstdiagnose Metastasen vorhanden oder entstehen im Verlauf der Therapie. Die Behandlungsmöglichkeiten für diese NZK-Patienten sind äußerst limitiert. Nahezu 2/3 der Betroffenen versterben an ihrer Erkrankung. Die Etablierung neuer Therapieansätze zur Behandlung des NZK ist dringend gefordert. Es wird postuliert, dass ein Therapiekonzept basierend auf dem Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitor Valproat (VPA) kombiniert mit niedrig dosiertem Interferon (IFN)-alpha eine innovative und effiziente Behandlungsoption für austherapierte NZK-Patienten eröffnen könnte. In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss einer VPA-Mono- versus VPA/IFN-alpha-Kombinationstherapie auf die malignen Eigenschaften verschiedener NZK-Zelllinien evaluiert. Mittels funktioneller Untersuchungen wurden Proliferations- und Adhäsionsphänomene unter den entsprechenden Therapien näher betrachtet. Fluorimetrische und molekularbiologische Studien dienten der detaillierten Aufklärung der den Veränderungen zugrunde liegenden Wirkmechanismen. Zur translationalen Gestaltung wurden zusätzlich tierexperimentelle Untersuchungen durchgeführt. VPA induzierte eine signifikante Reduktion der Proliferation von NZK-Zellen, die durch die additive Gabe von IFN-alpha weiter verstärkt wurde. Die anti-proliferativen Effekte korrelierten mit einer Zunahme der Zellen in der G0/G1-Phase und einer damit einhergehenden verminderten Anzahl an Zellen in der S-Phase. Die Verschiebung der Zellzyklusphasen war mit einer deutlichen Modulation relevanter regulatorischer Zellzyklusproteine assoziiert. Des Weiteren resultierte VPA und die korrespondierende Kombination mit IFN-alpha in einer signifikanten Inhibition der Adhäsion an Endothel und die extrazellulären Matrixproteine. VPA und die VPA/IFN-alpha-Kombination übten ihren Einfluss dabei offensichtlich über eine Modulation von Adhäsionsrezeptoren, implizit Integrine und CD44-Varianten, aus. Die antiproliferative und –adhäsive Wirkung war in der Regel nach längerer Inkubationszeit von 5 Tagen deutlich stärker als nach 3 Tagen. In analog behandelten normalen Nierenzellen zeigten sich im Vergleich keine solchen Effekte. Die Behandlung mit VPA und IFN-alpha scheint somit spezifisch maligne Zellen zu beeinflussen. VPA induzierte in den NZK-Zellen ferner die Reduktion von Protoonkogenen und MAP-Kinasen sowie die Zunahme von Tumorsuppressoren. Die zusätzliche Gabe von IFN-alpha resultierte in einer weiteren Wirkungsverstärkung gegenüber VPA allein. VPA und die Kombination mit IFN-alpha inhibierten zudem signifikant die HDAC6-Aktivität und -Proteinexpression der NZK-Zellen. Diese Hemmung ging mit einer Hyperacetylierung der Histone einher. Die epigenetische Modulation führte zur veränderten Genregulation und Transkription. So nahmen VPA und die korrespondierende Kombination neben den genannten funktionellen und molekularbiologischen Veränderungen maßgeblich Einfluss auf das Genexpressionsprofil der Tumorzellen. Die Expression negativer Regulatoren der Proliferation, Migration und Adhäsion sowie von Genen involviert in Differenzierung und Immunantwort wurden erhöht, wohingegen die Anzahl der Transkripte von Genen mitverantwortlich für die Ausbildung von Resistenzen und die Nährstoffversorgung der Tumoren reduziert wurde. Translationale tierexperimentelle Studien bestätigten die klinische Relevanz der VPA- und VPA/IFN-alpha-Behandlung, die in einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums resultierten. Die Wachstums-Inhibition war mit einer starken Modulation regulatorischer Proteine des Zellzyklus, der Apoptose und des HDAC-Systems assoziiert. Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren das viel versprechende Wirkungspotential von VPA und der korrespondierenden Kombination mit niedrig dosiertem IFN-alpha. VPAs anti-proliferative und -adhäsive Effekte in vitro und in vivo eröffnen die Perspektive für eine innovative Strategie in der Behandlung des NZK. Aufgrund der präsentierten Daten lässt sich postulieren, dass VPA und IFN-alpha die Grundlage für ein neues, effizientes Therapiekonzept bei austherapierten NZK-Patienten darstellen könnte.
In this thesis we introduce the imaginary projection of (multivariate) polynomials as the projection of their variety onto its imaginary part, I(f) = { Im(z_1, ... , z_n) : f(z_1, ... , z_n) = 0 }. This induces a geometric viewpoint to stability, since a polynomial f is stable if and only if its imaginary projection does not intersect the positive orthant. Accordingly, the thesis is mainly motivated by the theory of stable polynomials.
Interested in the number and structure of components of the complement of imaginary projections, we show as a key result that there are only finitely many components which are all convex. This offers a connection to the theory of amoebas and coamoebas as well as to the theory of hyperbolic polynomials.
For hyperbolic polynomials, we show that hyperbolicity cones coincide with components of the complement of imaginary projections, which provides a strong structural relationship between these two sets. Based on this, we prove a tight upper bound for the number of hyperbolicity cones and, respectively, for the number of components of the complement in the case of homogeneous polynomials. Beside this, we investigate various aspects of imaginary projections and compute imaginary projections of several classes explicitly.
Finally, we initiate the study of a conic generalization of stability by considering polynomials whose roots have no imaginary part in the interior of a given real, n-dimensional, proper cone K. This appears to be very natural, since many statements known for univariate and multivariate stable polynomials can be transferred to the conic situation, like the Hermite-Biehler Theorem and the Hermite-Kakeya-Obreschkoff Theorem. When considering K to be the cone of positive semidefinite matrices, we prove a criterion for conic stability of determinantal polynomials.