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The interaction of fibroblast growth factors (FGFs) with their fibroblast growth factor receptors (FGFRs) are important in the signaling network of cell growth and development. SSR128129E (SSR),[1, 2] a ligand of small molecular weight with potential anti-cancer properties, acts allosterically on the extracellular domains of FGFRs. Up to now, the structural basis of SSR binding to the D3 domain of FGFR remained elusive. This work reports the structural characterization of the interaction of SSR with one specific receptor, FGFR3, by NMR spectroscopy. This information provides a basis for rational drug design for allosteric FGFR inhibitors.
PELDOR (pulse electron-electron double resonance) is an established method to study intramolecular distances and can give evidence for conformational changes and flexibilities. However, it can also be used to study intermolecular interactions as for example oligerimization. Here, we used PELDOR to study the ‘end-to-end’ stacking of small double stranded (ds)RNAs. For this study, the dsRNA molecules were only singly labelled with the spin label TPA to avoid multi-spin effects and to measure only the intermolecular stacking interactions. It can be shown that small dsRNAs tend to assemble to rod-like structures due to π-π-interactions between the base pairs at the end of the strands. On the one hand, these interactions can influence or complicate measurements aimed at the determining of the structure and dynamics of the dsRNA molecule itself. On the other hand, it can be interesting to study such intermolecular stacking interactions in more detail, as for example their dependence on ion concentration. We quantitatively determined the stacking probability as a function of the monovalent NaCl salt and the dsRNA concentration. From this data the dissociation constant Kd was deduced and found to depend on the ratio between the NaCl salt and dsRNA concentrations. Additionally, the distances and distance distributions obtained predict a model for the stacking geometry of dsRNAs. Introducing a nucleotide overhangs at one end of the dsRNA molecule restricts the stacking to the other end, leading only to dimer formations. Introducing such an overhang at both ends of the dsRNA molecule fully suppresses stacking, as we could demonstrate by PELDOR experiments quantitatively.
Secondary multidrug (Mdr) transporters utilize ion concentration gradients to actively remove antibiotics and other toxic compounds from cells. The model Mdr transporter MdfA from Escherichia coli exchanges dissimilar drugs for protons. The transporter should open at the cytoplasmic side to enable access of drugs into the Mdr recognition pocket. Here we show that the cytoplasmic rim around the Mdr recognition pocket represents a previously overlooked important regulatory determinant in MdfA. We demonstrate that increasing the positive charge of the electrically asymmetric rim dramatically inhibits MdfA activity and sometimes even leads to influx of planar, positively charged compounds, resulting in drug sensitivity. Our results suggest that unlike the mutants with the electrically modified rim, the membrane-embedded wild-type MdfA exhibits a significant probability of an inward-closed conformation, which is further increased by drug binding. Since MdfA binds drugs from its inward-facing environment, these results are intriguing and raise the possibility that the transporter has a sensitive, drug-induced conformational switch, which favors an inward-closed state.
Die Tumorprotein-Familie des Proteins p53 besteht aus drei Familienmitgliedern p53, p63 und p73 mit diversen Funktionen als Transkriptionsfaktoren. p53 war das erste Mitglied dieser Familie, das im Jahre 1979 entdeckt wurde und wurde zunächst als krebsverursachendes Protein eingeordnet, weil es in vielen Tumorgeweben in erhöhter Menge vorgefunden wurde. Es wurde allerdings festgestellt, dass der Großteil dieser gefundenen p53-Proteine funktionsunfähig durch Mutationen in ihrer Aminosäuresequenz waren. Unmutiertes p53 hingegen führt zu einem Stopp von Zellteilung oder sogar Zelltod, sofern die Zellen genetischem Stress durch Strahlung oder mutagene Chemikalien ausgesetzt sind. Heute wird p53 als eines der wichtigsten Tumor-Unterdrückungsproteine betrachtet. Die beiden anderen Familienmitglieder p63 und p73 existieren in einer Vielzahl von Isoformen. Neben carboxyterminaler alternativer mRNA-Prozessierung (α, β, γ, usw. Isoformen) führen zwei unabhängige Promotoren auch zu zwei unterschiedlichen Aminotermini. Hier wird zwischen ΔN- und TA-Isoformen unterschieden. Im Falle von p63 treten zwei dominante Isoformen auf, ΔNp63α und TAp63α. Während ΔNp63α eine Rolle in der Differenzierung von Haut spielt, wurde TAp63α bisher ausschließlich in Eizellen gefunden. Dort hat es die Funktion eines Sensors, der die genetische Integrität der weiblichen Keimbahn sicherstellt. Es liegt in Eizellen in hoher Konzentration vor, allerdings in einer komplett inaktiven Form. Werden Schäden im der Erbgut der Eizelle festgestellt, so wird das Protein aktiviert und kann so den Prozess des Zelltods der Eizelle einleiten. Mutationen oder das Fehlen des p63-Genes führen zu Missbildungen während der Entwicklung und zu unvollständig ausgebildeter Haut. Im Falle von p73 gibt es ebenfalls mehrere Isoformen, wobei die Funktionen und Relevanzen der einzelnen Isoformen bisher nicht komplett geklärt werden konnten. Eine p73-negative Maus hat einen diffusen Phänotyp, der sich durch niedrige Intelligenz, fast sterile Männchen und chronische bronchiale Infektion auszeichnet. Generell sind alle Mitglieder der p53-Familie tetramere Proteine und sind nur in diesem Zustand auch aktiv. Die einzige Ausnahme stellt, wie oben beschrieben, TAp63α dar, das in einem inaktiven dimeren Zustand vorliegt und nur durch Modifikation durch zwei unabhängige Kinasen aktiviert werden kann. Dabei geht es in den tetrameren Zustand über und ist daraufhin aktiv.
Alle drei Proteine haben (anhand ihrer längsten Isoform beschrieben) eine konservierte Domänenstruktur. Am Aminoterminus befindet sich zunächst die transaktivierende-Domäne (TAD), die für Interaktionen mit transkriptionellen Koaktivatioren relevant ist. Danach folgt die stark konservierte Desoxyribonukleinsäure (DNA) bindende Domäne (DBD). Sie stellt sicher, dass der Transkriptionsfaktor sequenzspezifisch an der richtigen Stelle auf die DNA bindet. Weitergehend folgt die Tetramerisierungsdomäne (TD), welche den oligomeren Zustand des Proteins herstellt. Im Falle von p53 endet das Protein an dieser Stelle, bei p63 und p73 folgen noch das Sterile-Alpha-Motiv (SAM) und die Transkription-inhibierende Domäne (TID). Die SAM Domäne wird generell als Interaktionsdomäne beschrieben, es konnte allerdings bis dato kein Interaktionspartner gefunden werden. Die TID hat einen negativen Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität der Proteine. Im Falle von TAp63α interagiert sie zusätzlich mit der TAD um den Dimeren Zustand zu stabilisieren.
Histon Acetylasen
Die Acetylierung von Histonen ist neben deren Methylierung die wichtigste Modifikation. Sie ist essenziell für die Transkription innerhalb aller eukaryontischen Lebewesen, da sie durch die Modifikation von Histonen die DNA für die DNA-Polymerase II zugänglich macht. Es gibt insgesamt fünf verschiedene, nicht näher miteinander verwandte Familien von Histonacetylasen. Diese Studie beschäftigt sich ausschließlich mit der KAT3 Familie, bestehend aus den Proteinen p300 und CBP. Beide sind hochgradig konserviert, in gefalteten Bereichen der Proteine erreicht die Sequenzidentität fast 100%. Beide Proteine scheinen sehr ähnliche Aufgaben zu erfüllen, die jedoch nicht komplett identisch sind. Die Fehlfunktion von einem Allel von CBP führt zum Krankheitsbild des Rubinstein-Taybi-Syndrom (RTS), während ein Mangel an p300 sich in Mäusen auf das Gedächtnis auswirkt. Der komplette Verlust beider Allele eines der Proteine ist immer tödlich, genauso wie auch Verlust jeweils eines Allels bei beiden Proteinen. Insgesamt vier unabhängige Domänen in p300/CBP sind in der Lange die transaktivierende Domänen der p53-Familie zu binden. Bei zwei der Domänen handelt es sich um Zinkfinger-Proteine (Taz1 und Taz2), die anderen beiden sind kleine, ausschließlich α-helikale Domänen (Kix und IBiD).
Diese Studie beschäftigt sich mit der Lösung von Strukturen von der transaktivierenden Domäne von p63 und p73 mit der p300-Domäne Taz2. Außerdem wurden die Auswirkungen von direkten Acetylierungen von TAp63α charakterisiert und der Effekt von einem potenten p300/CBP Inhibitor auf Oozyten unter genotoxischem Stress analysiert. Zusätzlich wurde die Phosphorylierungskinetiken von Tap63α wärend der Aktivierung durch Kinasen untersucht.
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Drug-induced liver injury (DILI) has become a major problem for patients and for clinicians, academics and the pharmaceutical industry. To date, existing hepatotoxicity test systems are only poorly predictive and the underlying mechanisms are still unclear. One of the factors known to amplify hepatotoxicity is the tumor necrosis factor alpha (TNFα), especially due to its synergy with commonly used drugs such as diclofenac. However, the exact mechanism of how diclofenac in combination with TNFα induces liver injury remains elusive. Here, we combined time-resolved immunoblotting and live-cell imaging data of HepG2 cells and primary human hepatocytes (PHH) with dynamic pathway modeling using ordinary differential equations (ODEs) to describe the complex structure of TNFα-induced NFκB signal transduction and integrated the perturbations of the pathway caused by diclofenac. The resulting mathematical model was used to systematically identify parameters affected by diclofenac. These analyses showed that more than one regulatory module of TNFα-induced NFκB signal transduction is affected by diclofenac, suggesting that hepatotoxicity is the integrated consequence of multiple changes in hepatocytes and that multiple factors define toxicity thresholds. Applying our mathematical modeling approach to other DILI-causing compounds representing different putative DILI mechanism classes enabled us to quantify their impact on pathway activation, highlighting the potential of the dynamic pathway model as a quantitative tool for the analysis of DILI compounds.
F1Fo‐ATP synthase is one of the best studied macromolecular machines in nature. It can be inhibited by a range of small molecules, which include the polyphenols, resveratrol and piceatannol. Here, we introduce Photoswitchable Inhibitors of ATP Synthase, termed PIAS, which were synthetically derived from these polyphenols. They can be used to reversibly control the enzymatic activity of purified yeast Yarrowia lipolyticaATP synthase by light. Our experiments indicate that the PIAS bind to the same site in the ATP synthase F1 complex as the polyphenols in their trans form, but they do not bind in their cis form. The PIAS could be useful tools for the optical precision control of ATP synthase in a variety of biochemical and biotechnological applications.
The photoregulation of nucleic acids by azobenzene photoswitches has recently attracted considerable interest in the context of emerging biotechnological applications. To understand the mechanism of photoinduced isomerisation and conformational control in these complex biological environments, we employ a Quantum Mechanics/Molecular Mechanics (QM/MM) approach in conjunction with nonadiabatic Surface Hopping (SH) dynamics. Two representative RNA–azobenzene complexes are investigated, both of which contain the azobenzene chromophore covalently attached to an RNA double strand via a β-deoxyribose linker. Due to the pronounced constraints of the local RNA environment, it is found that trans-to-cis isomerization is slowed down to a time scale of ∼10–15 picoseconds, in contrast to 500 femtoseconds in vacuo, with a quantum yield reduced by a factor of two. By contrast, cis-to-trans isomerization remains in a sub-picosecond regime. A volume-conserving isomerization mechanism is found, similarly to the pedal-like mechanism previously identified for azobenzene in solution phase. Strikingly, the chiral RNA environment induces opposite right-handed and left-handed helicities of the ground-state cis-azobenzene chromophore in the two RNA–azobenzene complexes, along with an almost completely chirality conserving photochemical pathway for these helical enantiomers.
The centrosome linker proteins C-Nap1, rootletin, and CEP68 connect the two centrosomes of a cell during interphase into one microtubule-organizing center. This coupling is important for cell migration, cilia formation, and timing of mitotic spindle formation. Very little is known about the structure of the centrosome linker. Here, we used stimulated emission depletion (STED) microscopy to show that each C-Nap1 ring at the proximal end of the two centrioles organizes a rootletin ring and, in addition, multiple rootletin/CEP68 fibers. Rootletin/CEP68 fibers originating from the two centrosomes form a web-like, interdigitating network, explaining the flexible nature of the centrosome linker. The rootletin/CEP68 filaments are repetitive and highly ordered. Staggered rootletin molecules (N-to-N and C-to-C) within the filaments are 75 nm apart. Rootletin binds CEP68 via its C-terminal spectrin repeat-containing region in 75-nm intervals. The N-to-C distance of two rootletin molecules is ∼35 to 40 nm, leading to an estimated minimal rootletin length of ∼110 nm. CEP68 is important in forming rootletin filaments that branch off centrioles and to modulate the thickness of rootletin fibers. Thus, the centrosome linker consists of a vast network of repeating rootletin units with C-Nap1 as ring organizer and CEP68 as filament modulator.