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Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für biotechnologische Fermentationsprozesse an. Für die Herstellung von Bioethanol ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae der wichtigste Produktionsorganismus. Allerdings kann S. cerevisiae die in Biomasse in großer Menge enthaltenen Pentosen Xylose und Arabinose nicht verwerten. Für einen ökonomisch effizienten Fermentationsprozess ist es daher essentiell, das Substratspektrum der Hefe entsprechend zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, den bereits in Hefe etablierten bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg signifikant zu verbessern. Genetische und physiologische Analysen ergaben, dass eines der heterolog produzierten Enzyme, die L-Arabinose-Isomerase aus Bacillus subtilis, einen limitierenden Schritt innerhalb des Stoffwechselweges darstellte. In einem genetischen Screening konnte ein aktiveres Isoenzym aus Bacillus licheniformis gefunden werden. Zusätzlich wurde der Codon-Gebrauch aller heterologen bakteriellen Gene dem Codon-Gebrauch der hoch-exprimierten glykolytischen Gene von S. cerevisiae angepasst. Mit diesem rationalen Ansatz konnte die Ethanolproduktivität aus Arabinose um mehr als 250% erhöht werden, der Ethanolertrag wurde um über 60% gesteigert. Dies stellte die erste erfolgreiche Verbesserung eines heterologen Stoffwechselwegs in S. cerevisiae über Codon-optimierte Gene dar. In einem breit angelegten Screening wurde zum ersten Mal eine prokaryontische Xylose-Isomerase gefunden, die in S. cerevisiae eine hohe Aktivität aufweist. Durch das Einbringen des xylA-Gens aus Clostridium phytofermentans in verschiedene Hefe-Stämme wurden diese in die Lage versetzt, Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen. Zusätzlich konnte damit die Vergärung von Arabinose und Xylose in einem einzigen S. cerevisiae-Stamm kombiniert werden. Vorherige Versuche, einen Pentose-vergärenden Stamm zu konstruieren, der einen bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg mit dem eukaryontischen Xylose-Reduktase/Xylitol-Dehydrogenase-Weg kombinierte, scheiterten an der unspezifischen Umsetzung der Arabinose durch die Xylose-Reduktase zu dem nicht weiter verstoffwechselbaren Arabitol. Für einen industriellen Einsatz der rekombinanten Hefen war es unerlässlich, die Eigenschaften für die Pentose-Umsetzung in Industrie-relevante Hefe-Stämme zu übertragen. Durch die Etablierung von genetischen Methoden und Werkzeugen ist es in dieser Arbeit gelungen, Industrie-Stämme zu konstruieren, die in der Lage sind, Arabinose oder Xylose zu metabolisieren. Dabei wurden die heterologen Gene stabil in die Chromosomen der Stämme integriert. Diese wurden mit Hilfe von „Evolutionary Engineering“ so optimiert, dass sie die Pentose-Zucker als alleinige Kohlenstoffquellen zum Wachstum nutzen konnten. Fermentationsanalysen zeigten eine effiziente Umsetzung der Pentosen zu Ethanol in diesen Stämmen. Damit ist ein neuer Startpunkt für die Konstruktion von industriellen Pentose-fermentierenden Hefe-Stämmen markiert, der zukünftig effizientere Bioethanol-Produktion ermöglichen wird.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für industrielle Fermentationsprozesse an. Dabei könnte z.B. die Hefe Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung von Bioalkohol eingesetzt werden. S. cerevisiae kann jedoch die in großen Mengen in der Biomasse enthaltenen Pentosen D-Xylose und L-Arabinose nicht vergären. Deshalb wäre ein Hefestamm mit entsprechend erweitertem Substratspektrum von großem wirtschaftlichen Interesse. In dieser Arbeit sollte rekombinante Hefestämme konstruiert bzw. optimiert werden, die in der Lage sind D-Xylose und/oder L-Arabinose zu Ethanol zu vergären. Zunächst wurde ein bereits vorhandener L-Arabinose vergärender Hefestamm unter Einsatz der Methoden der „gerichteten Evolution“ optimiert, L-Arabinose effektiver zu verstoffwechseln. Dies geschah durch repetitive Selektion auf Wachstum mit L-Arabinose als einziger Kohlenstoffquelle unter Sauerstoff-limitierten Bedingungen. Eine genetische und physiologische Charakterisierung des Stammes ergab, dass dieser sowohl Mutationen im Hefegenom als auch auf den L-Arabinose Stoffwechselweg exprimierenden Plasmiden erworben hatte. Dieser Stamm exprimierte die für den L-Arabinose Katabolismus notwendigen Enzyme und Transporter von vier verschiedenen Plasmiden. Für den industriellen Einsatz eines rekombinanten Hefestammes ist es jedoch unerlässlich, die Gene des L-Arabinose Katabolismus stabil in das Genom zu integrieren. In dieser Arbeit ist es gelungen, zwei der insgesamt drei essentiellen Gene des Stoffwechselweges in funktioneller Form in den rDNA-Locus von S. cerevisiae zu integrieren. Im letzten Teil der Arbeit konnte erstmals ein Hefestamm konstruiert werden, der sowohl die Gene des Stoffwechselweges für den L-Arabinose- als auch die des Stoffwechselweges für den D-Xylose-Katabolismus exprimiert. Der Stamm war in der Lage auf Nähragarplatten zu wachsen, bei denen L-Arabinose oder/und D-Xylose die einzigen Kohlenstoffquellen darstellten. Wachstumstests mit Flüssigkulturen sowie HPLC-Analysen des Zuckerverbrauchs ergaben jedoch, dass der Hefestamm überraschenderweise nicht in der Lage war, D-Xylose in Flüssigmedien zu verstoffwechseln. Mögliche Erklärungen hierfür werden diskutiert.