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Fokus meiner Doktorarbeit ist die Anwendung und Entwicklung NMR-spektroskopischer Methoden zur Charakterisierung zeitabhängiger Strukturänderungen von Biomolekülen – von lokalen dynamischen Veränderungen bis zur vollständigen Rückfaltung von Proteinen – und fasst die Ergebnisse meiner drei wichtigsten PhD-Projekte zusammen.
In meinem ersten Projekt habe ich die Leistung eines Temperatursprung-Probenkopfs – mit dem Proben mit hoher Salzkonzentration schnell erwärmt werden können – mithilfe einer Hochfrequenzspule technisch optimiert. Die optimierten Radiofrequenz-Bestrahlungsparameter, Lösungsmittel-bedingungen und der reduzierte Arbeitszyklus führten zu einem Temperatursprung von 20 °C in 400 ms. Ich habe eine Cystein-freie Mutante von Barstar hergestellt, die nach Zugabe von Harnstoff bei 0 °C kalt denaturiert werden kann, während sie ihren gefalteten Zustand bei 30 °C hält. Dadurch wurde auch ermöglicht, dass der Rückfaltungsprozess hunderte Male ohne Abbau oder Aggregation wiederholt werden kann. Die Kombination von reversibler Rückfaltung und rascher Temperaturänderung des kalt denaturierten Barstars ermöglichte die Entwicklung eines neuen kinetischen Experiments, bei dem der Rückfaltungsprozess von Barstar mit einem zweidimensionalen Echtzeit-NMR in hoher Zeitauflösung untersucht wird. Die vollständige Rückgratresonanzzuweisung wurde sowohl für den gefalteten als auch für den kalt denaturierten Zustand von Barstar durchgeführt und ergab, dass in der denaturierten Form beide Prolin-Reste einen gemischten Konformationszustand aufweisen. Dabei befindet sich die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand hauptsächlich in trans-, während im gefalteten Zustand in der seltenen cis-Konformation. Das neue hochauflösende kinetische Experiment zeigte, dass die Rückfaltung von Barstar durch die trans-cis-Isomerisierung der Tyr47-Pro48-Amidbindung verlangsamt wird, was sowohl die Sekundärstruktur als auch die Bildung der Tertiärstruktur beeinflusst. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte ich einen plausiblen Faltungsmechanismus für den langsamen Faltungsweg von kalt denaturiertem Barstar skizzieren. Durch Änderung der Zeitparameter des Heizungszyklus wurde erreicht, dass die Tyr47-Pro48-Amidbindung im ungefalteten Zustand in der cis-Konformation bleibt und daher der schnelle Faltungsweg dominant wird. Das Starten des Magnetisierungstransfers vor der Temperaturänderung ermöglichte die Aufzeichnung eines Spektrums, das den entfalteten Zustand mit dem gefalteten Zustand korreliert. Dieses Spektrum ermöglichte quantitative Analysen des schnellen Faltungsweges und lieferte sogar indirekte Hinweise auf einen Zwischenzustand. Diese Methode aus Kombination von schnellem Temperatursprung und Kaltdenaturierung zeigt ein hohes Potenzial, Proteinfaltung auf atomarer Ebene experimentell zu untersuchen und ein tieferes Verständnis verschiedener Faltungswege zu erlangen.
In meinem zweiten Projekt – das Teil einer interdisziplinären Forschung war – konzentrierte ich mich auf die NMR-spektroskopische Charakterisierung von Nukleinsäuren, die mit einer photolabilen Schutzgruppe modifiziert wurden. Zuerst wurde mithilfe homonuklearer Korrelationsexperimente eine vollständige Protonresonanzzuweisung erreicht. Danach wurde die relative Konfiguration der photolabilen Schutzgruppen bestimmt basierend auf einer dreidimensionalen Modellstruktur und spezifischer NOE-Korrelationen. Des Weiteren wurde ein Strukturmodell unter Verwendung von NOE-Einschränkungen berechnet. Dieses Strukturmodell zeigte eine eingeschränkte Rotation um die CN-Bindung zwischen dem Käfig und der Nukleobase. Das Modell zeigte auch, dass der Käfig in der Hauptrille positioniert ist und nicht in das Lösungsmittel herausklappt. Im Vergleich zu einem zuvor charakterisierten NPE-Käfig führte die erhöhte Größe zu einer weiteren Senkung des Schmelzpunkts, zeigte jedoch einen geringeren Schmelzpunktunterschied zwischen der S- und der R-Konfiguration des Käfigs, wobei die S-Konfiguration zu einer größeren Reduktion des Schmelzpunktes führt. Dieser Trend wurde weiter untersucht und durch ein Screening unterstützt. Durch selektive Wasserinversions-Rückgewinnungsexperimente konnte ich auch zeigen, dass der Käfig die lokale Stabilität nur bis zu einer Entfernung von zwei benachbarten Basenpaaren von der Modifikationsstelle verringert. Die NOE-Daten dienten auch als guter Bezugspunkt, um die Qualität molekulardynamischer Simulationen zu testen, mit denen zusätzliche Käfigdesigns untersucht wurden. Die Kombination aus Synthese, NMR-Spektroskopie und MD-Simulationen ermöglichte bis jetzt die detaillierteste Untersuchung des Effekts vom Einbau eines einzelnen Käfigs zur Destabilisierung der DNA-Sekundärstruktur. Dabei wurden Einschränkungen des möglichen Designs aufgedeckt, aber auch die Entwicklung einer neuen, effizienteren Struktur ermöglicht.
Mein drittes Projekt konzentrierte sich auf die Charakterisierung eines RNA-Modellsystems. NMR-spektroskopische Daten von kleinen RNA-Modellsystemen – wie NOE, skalare Kopplungen, kreuzkorrelierte Relaxationsraten und RDC – sind eine unschätzbare Referenz für MD-Simulationen, obwohl die Menge der verfügbaren Literaturdaten – bis jetzt – sehr begrenzt ist. ...
Die Familie der Proteorhodopsine (PR) besteht aus Hunderten von PR Molekülen, die unter Lichteinwirkung Protonen pumpen und somit eine bedeutende Rolle für die Energiegewinnung spielen könnten. Da der pKa Wert des Proton Akzeptors der Schiff‘schen Base (SB) (~7.2) dem pH Wertes der Ozeane (~7.9) ähnelt, wird auch über eine regulatorische Funktion spekuliert. Wird in Erwägung gezogen, dass 24 000 PR Moleküle pro SAR86 Zelle vorhanden sind (Beja et al. 2001) und dass 13% der Bakterien der Meeresoberfläche PR besitzen (Sabehi et al. 2005) liefert dieses Protein wahrscheinlich einen bedeutenden Energiebeitrag neben der Photosynthese. Einblicke in den Mechanismus der Energieumwandlung erfordern sowohl die Untersuchung des Chromophores, welches die Lichtenergie absorbiert als auch der Struktur des Apoproteins, das durch die Generierung eines Protonengradienten zur Energiegewinnung beiträgt. Der Fokus der Doktorarbeit liegt auf dem Chromophor und seiner Umgebung. Eine erste Charakterisierung der SB und des Retinals erfolgt durch UV/VIS und NMR Messungen (Pfleger et al. 2008). Die 13C chemische Verschiebungen von 10,11-13C2 Retinal und die 15N chemische Verschiebung der protonierten SB, gebildet durch K231, zeigt eindeutig, dass im Grundzustand nur eine Konformation der Retinals, all-trans, vorliegt. Die 15N chemische Verschiebung weist außerdem auf eine starke Wechselwirkung der SB mit ihren Gegenionen hin. Desweiteren kann durch Messungen der 15N chemischen Verschiebung der SB bei verschiedenen pH Werten der pKa Wert der SB abgeschätzt werden, auf ~12. Diese Stabilisierung der positiv geladenen protonierten Form der SB weist auf die Existenz eines Wasserclusters hin, das durch die hohe Dielektrizitätskonstante die protonierte Form der SB stabilisieren könnte. Um zu überprüfen, ob Wasser an der SB gebunden ist, wird ein sogenanntes 15N-1H HETCOR Experiment durchgeführt. Der Bereich der 15N chemischen Verschiebung der SB korreliert mit einer Protonenresonanz bei ~5 ppm, welche im Bereich einer Wasserresonanz liegt und die durch D2O austauschbar ist. Dies indiziert eine wichtige Bedeutung von Wasser in der Nähe der SB für die Funktion von PR. Der Einfluss von Mutationen des Histidins H75 und des Aspartats D97 auf die 15N chemische Verschiebung der SB sowie die Auswirkung von Histidinmutationen auf das Chromophor deuten eine direkte Wechselwirkung von Aspartat 97 und der SB an, nicht aber eine direkte Wechselwirkung von H75 und der SB. Neben dem Chromophor ist außerdem das Signalpeptid Gegenstand der Untersuchung der Doktorarbeit. Motivation für die Untersuchung war die Inhomogenität der Proben, die im Zusammenhang mit ungleich prozessiertem PR stehen könnten. Ein zweiter Teil beschäftigt sich mit neuen Konzepten der Datenaufnahme, da das S/R in der Festkörper NMR ein limitierender Faktor darstellt. Diese beinhalten Verstärkung der Relaxation (RELOAD) sowie die Refokussierung von T2 bei Verwendung eines Prozessierungsschrittes, der „half echo alternating transformation“ (HEAT).
Die Untersuchung von RNA mittels NMR-Spektroskopie hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, weil die Zahl der neu entdeckten RNA-Funktionen, wie z.B. RNA-Schalter in Bakterien, stark gestiegen ist. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe der NMR-Spektroskopie einen Beitrag zum besseren Verständnis der biochemischen Prozesse, in die RNA-Moleküle involviert sein können, zu leisten.
Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2, 3 und 4) werden zum einen die Entwicklung neuer Methoden für die RNA-Strukturbestimmung vorgestellt und zum anderen die Leistungsfähigkeit der modernen NMR-spektroskopischen Strukturaufklärung demonstriert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) wird die NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der RNA-Schalter-Funktion eingesetzt. Die biologische Funktion von RNA oder Proteinen setzt oftmals eine dynamische Struktur voraus und involviert Konformationsänderungen infolge biochemischer Signalweiterleitung. Für die Charakterisierung solcher Prozesse eignet sich die NMR-Spektroskopie insbesondere gut, weil sie in Lösung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen angewandt wer-den kann. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Basenpaarungen können wichtige strukturelle Eigenschaften (Faltung, Strukturhomogenität und Dynamik) entschlüsselt und in einen Zusammenhang mit der Funktion gebracht werden.
Im Folgenden werden die einzelnen Kapitel vorgestellt.
Nachdem das erste Kapitel eine allgemeine Einleitung in die NMR-Spektroskopie, RNA-Struktur und Funktion der RNA-Schalter darstellt, folgt im Kapitel 2 die Einführung einer neuen Methode, die eine quantitative Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta in RNA/DNA mittels NMR-Spektroskopie ermöglicht (Abb. 1). Sie basiert auf der Wechselwirkung zwischen dem CH-Dipol und der 31P-CSA, die von der relativen Orientierung abhängig ist. Die Methode wurde für die CH- und CH2-Gruppen in Form von zwei Pulssequenzen (2D- und 3D-G-HCP) zur Messung von insgesamt fünf kreuz-korrelierten Relaxationsraten entlang des RNA/DNA-Rückgrats optimiert. Die Funktionsfähigkeit der Methode wurde zunächst an der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA getestet und zur Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta genutzt. Die Ergebnisse flossen in die Strukturrechnung der 14mer RNA, die im Kapitel 3 vorgestellt wird, mit ein. Des Weiteren gelang es die Anwendbarkeit der Experimente an einer größeren 27mer RNA zu demonstrieren. Die neue Methode ist deswegen von Bedeutung, weil die Winkel alpha und zeta nicht über 3J-Kopplungskonstanten gemessen werden können.
(Nozinovic, S., Richter, C., Rinnenthal, J., Fürtig, B., Duchardt-Ferner, E., Weigand, J. E., Schwalbe, H. (2010), J. Am. Chem. Soc. 132, 10318-10329.)
Im Kapitel 3 wird die NMR-spektroskopische Bestimmung der Struktur einer Model-RNA, der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA, vorgestellt. Die Strukturrechung wurde mit verschiedenen NMR-Datensätzen, die in der Arbeitsgruppe einschließlich dieser Doktorarbeit gesammelt wurden, durchgeführt. Zusammen mit den Ergebnissen aus dem Kapitel 2 konnte eine sehr präzise Struktur mit einem RMSD von 0,37 Å (20 Strukturen) in sehr guter Übereinstimmung mit experimentellen Daten ermittelt werden. Die gerechnete Struktur repräsentiert eine der gegenwärtig genauesten und umfassendsten Strukturbestimmungen einer RNA, bei der jeder Torsionswinkel quantitativ bestimmt wurde. Einen besonderen Höhepunkt stellt die strukturelle Analyse der 2’OH-Gruppen dar, die im anschließenden Kapitel 4 weiter vertieft wurde.
(Nozinovic, S., Fürtig, B., Jonker, H. R. A., Richter, C., Schwalbe, H. (2010), Nucleic Acids Res. 38, 683-694)
Über Jahre war bekannt, dass die Größe der 1J(C1’,H1’)- und 1J(C2’,H2’)-Kopplungskonstanten innerhalb der Ribonukleotide von der lokalen Struktur des Zuckers und der Orientierung der Nukleobase beeinflusst wird. In dieser Arbeit (Kapitel 4) wurde zum ersten Mal ein systematischer Vergleich zwischen NMR-Messungen und DFT-Rechnungen durchgeführt, der eine eindeutige Zuordnung der Hauptkonformationen des Zuckers (C3’- oder C2’-endo) und der Nukleobase (anti oder syn) anhand der 1J(C,H)-Kopplungskonstanten erlaubt. Die beschriebene Methode wurde an einer größeren 27mer RNA erfolgreich erprobt. Weiterhin wurde erstmalig entdeckt, dass zudem die Orientierung der 2’OH-Gruppe einen signifikanten Einfluss auf die 1J(C,H)-Kopplungen hat (Abb. 3). Mithilfe von NMR-Messungen und DFT-Rechnungen konnte aus 1J(C,H)-Kopplungskonstanten die Orientierung von allen 2’OH-Gruppen in der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA bestimmt werden. Die Methode hat den großen Vorteil, dass 2’OH-Gruppen, die aufgrund des schnellen Austauschs mit Wasser oder D2O keine NMR-Signale liefern, analysiert werden kön-nen.
(Nozinovic, S., Gupta, P., Fürtig, B., Richter, C., Tüllmann, S., Duchardt-Ferner, E., Holthausen, M. C., Schwalbe, H. (2011), Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5397-5400)
Im Kapitel 5 wird eine NMR-spektroskopische Untersuchung an der Aptamerdomäne des Adenin-bindenden RNA-Schalters (pbuE) vorgestellt. Im Fokus der Forschung stand die Frage: Welchen Einfluss hat die Länge der P1-Helix auf die Struktur und die Ligandbindung der freien Aptamer-domäne?
Durch den Vergleich von zwei Konstrukten mit unterschiedlich langer P1-Helix war es möglich, intrinsische Scherkräfte, die durch die Ausbildung der P1-Helix in der freien Aptamerdomäne entstehen, festzustellen. Es hat sich im Konstrukt mit der verlängerten P1-Helix gezeigt, dass diese zur Destabilisierung der P3-Helix und des Schlaufenkontakts führen. Diese strukturellen Änderungen haben außerdem zur Folge, dass die Bindungsstärke des Liganden reduziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass ein strukturelles Gleichgewicht zwischen Sekundärstrukturelementen die tertiäre Faltung beeinflusst und die Funktion moduliert.
(Nozinovic, S., Reining, A., Noeske, J., Wöhnert, J., Schwalbe, H. (2011), in Vorbereitung)
Channelrhodopsin-2 (ChR2) is a light-gated cation selective channel from the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii, which is involved in phototaxis and photophobic responses. As other rhodopsins, ChR2 comprises a seven-transmembrane helix (TMH) motif and a retinal as the light-sensitive chromophore. The chromophore is covalently attached via a protonated Schiff base to the conserved lysine residue Lys257 located in TMH7. Based on its primary sequence and the all-trans configuration of the retinal in the ground state, ChR2 is assigned to the type I rhodopsins, also referred to as microbial-type rhodopsins. Upon light activation, the retinal isomerizes from the all-trans to the 13-cis form. This photoisomerization, which is accompanied by conformational changes of the protein, eventually leads to the opening of the channel and cation translocation. Cation flux during the conductive state leads to depolarization of the cell membrane and subsequent triggering of action potentials when expressed in neurons. Therefore, ChR2 has become the most versatile optogenetic tool, enabling a non-invasive investigation of neural circuits at high spatial and temporal resolution. With the rapidly increasing importance of ChR2 as a tool in neurobiology and cell biology, structural information is the prerequisite to an unambiguous understanding of the molecular mechanisms of this unique light-activated ion channel. The coupling between isomerization and structural alterations is well understood for other microbial-type rhodopsins, like bacteriorhodopsin (bR), halorhodopsin (HR) and sensory rhodopsin II (SRII). In case of ChR2, the first data on light-induced conformational changes came from spectroscopic studies and structural information is still missing. However, in order to fully understand the mechanism of light transduction by ChR2, it is necessary to determine the changes in the protein structure at specific steps in the photocycle.
By the time I started my PhD thesis, there was no structural information of ChR2 available. Therefore, the objective of this thesis was to obtain structural information of the transmembrane domain containing the first 315 amino acids of ChR2 by cryo electron crystallography. Besides revealing the structure of membrane proteins, cryo-EM of two-dimensional (2D) crystals is ideal for investigating conformational changes in membrane proteins induced by different stimuli. Therefore, the second objective of my thesis was the investigation of light-induced conformational changes in the slow C128T ChR2 mutant. The ~1,000 times longer lifetime of the open state of the C128T mutant compared to the wild-type allowed to trap different intermediates that accumulate during the photocycle.
In 2012, the X-ray structure of a channelrhodopsin-1/channelrhodopsin-2 chimaera (C1C2) at 2.3 Å resolution in the closed dark-adapted state was published (Kato et al., 2012). The structure revealed the essential molecular architecture of C1C2, including the retinal-binding pocket and the putative cation conduction pathway. Together with biochemical, spectroscopic, mutagenesis experiments, and the high-resolution model, some functionally important residues of ChR2 have been identified. However, unambiguous explanation of the molecular determinants that contribute to activation (gating) and transport were still mostly unknown.
RESULTS AND CONCLUSIONS
The first half of my theses dealt with 2D crystallization of ChR2. I succeeded in obtaining 2D crystals of ChR2 of four different types, which differed in size, crystal packing, crystal contacts and resolution, yielding structure factors up to 6 Å resolution. The crystals were grown by reconstituting the protein with different lipids at various lipid-to-protein ratios. The best crystals formed with the synthetic lipid DMPC and EPL upon detergent removal by dialysis. The projection maps calculated from these crystals revealed the overall structure of C128T ChR2 at 6 Å resolution and were published in 2011 (Müller et al., 2011). Surprisingly, ChR2 was found to be a dimer in all crystal types. The ChR2 dimer was stable both in detergent solution and in the presence of lipids for 2D crystallization. The monomers clearly showed the expected densities for the seven TMHs.
The arrangement of the ChR2 dimers on the four 2D lattices was different. However, comparison of the individual rojection maps revealed no significant differences within the ChR2 interface in the four crystal forms. The observation that the structure of the dimer was the same in all four crystal forms and in different lipids suggested strong specific contacts between the two protomers and implied that the protein was also dimeric in the native membrane. These findings were in agreement with Western blot analysis of plasma membranes from oocytes expressing ChR2 and laser-induced liquid bead ion desorption mass spectrometry, which both showed ChR2 as a dimer. The unusual stability of the ChR2 dimer contrasts with other microbial rhodopsins, which exist in different oligomeric states, i.e. monomers, trimers or dimers. These observations raised the question whether the functional unit is the monomer or the dimer.
The comparison of the projection map of the light-driven proton pump bR at the same resolution showed similar overall dimensions. Based on this comparison, the densities which became evident in the ChR2 projection maps could be assigned to the corresponding seven densities in bR. The shape of the densities near the dimer interface suggested that TMHs 2, 3, and 4 are oriented more or less perpendicular to the membrane plane, while the other four helices appear to be more tilted, as in bR.
Based on the high-resolution bR structure and the projection structures obtained, I have built a homology model. On the basis of this homology model, several residues found in the dimer interface were selected for mutational studies in order to disrupt the dimer interface.
The investigation of light-induced conformational changes in C128T ChR2 was the second part of my thesis. I designed an experimental setup for trapping light-induced conformational changes in C128T ChR2. In addition, I optimized the sample preparation in a way that the different illumination conditions did not alter the quality of the crystals. I have trapped two different functional states, namely the conductive open state and the non-conductive closed dark-adapted state.
In order to visualize the location and the extent of conformational changes, projection difference maps were calculated between the open and the closed state. Visual inspection of the difference maps between the open and the two closed states revealed three difference peaks that map to the TMHs 2, 6, and 7, indicating significant and specific rearrangements of these helices. The strong pair of positive/negative peaks at TMH6 suggests an outward tilt movement of approximately 2 Å. Close comparison of similar work on bR revealed that this movement is likely to occur at the cytoplasmic end of TMH6. A second highly significant negative peak is observed at TMH7, indicating a less pronounced tilt compared to TMH6. The third negative peak at TMH2 indicates a loss of density in this region. No significant differences were recorded at the TMH1, 5 and at the dimer interface formed by TMH3 and 4.
I succeeded in trapping and characterizing the open and closed state in the photocycle of ChR2 and could demonstrate that the transition from the closed to the open state is linked to significant light-induced tilt movements of TMH6 and 7, plus a loss of order in TMH2. These conformational changes are likely to create a large water-filled conducting pore, which seems to be required for the conductance of up to 2,000 ions per photocycle. The previously mentioned spectroscopic studies support the difference structures I obtained. This approach sets the stage for studying structural changes accompanying the formation and decay of other photocycle intermediates in ChR2. Future studies will aim at three-dimensional maps of the open and closed state at higher resolution.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an GXG Modellpeptiden konnten eindeutig zeigen, dass diese Peptide, auch ohne das Vorhandensein von langreichweitigen Wechselwirkungen, bestimmte Sekundärstrukturen präferieren. Ein Teil der beobachteten, auftretenden Strukturmotive lässt sich hierbei über den sterischen Anspruch der Seitenkette erklären, ein anderer Teil über die Ladung der Seitenkette. In Kombination mit anderen Spektroskopischen Methoden konnten zehn dieser Peptide genauestens untersucht werden. Hierbei zeigte sich, dass diese Peptide nicht nur die favorisierten Regionen des Ramachandran-Diagramms besetzen. Ein Vergleich mit dem Vorkommen bestimmter Aminosäuren, beispielsweise in loop Regionen von Proteinen, zeigt dass die Sequenz dieser loops nicht zufällig ist. Tatsächlich besitzt ein Teil der Aminosäuren, die besonders häufig an bestimmten loop Positionen vorkommen, bereits die intrinsische Vorliebe, die notwendige Konformation einzunehmen. Diese Aminosäuren und die umgebenden loops sind somit eventuell nicht nur das simple Verbindungsglied zwischen zwei Sekundärstrukturen, sondern kommen selbst als Ausgangspunkte für Peptid- bzw. Proteinfaltung in Frage.
Ein weiteres Augenmerk der Arbeit lag auf der Messung von skalaren und dipolaren Kopplungen an isotopenmarkierter RNA. Es wurden vier Pulssequenzen entwickelt, die es ermöglichen, 1J skalare bzw. dipolare Kopplungen in der Zuckerregion von 13C- markierter RNA mit hoher Präzision zu messen. Die entwickelten J-modulierten Experimente ermöglichen die Messung von 1J(H2’C2’), 1J(C1’C2’) sowie 1J(C2’C3’) Kopplungen selbst für größere RNA Moleküle. Die Detektion erfolgt hierbei auf den C1’H1’ Signalen, die Zuordnung der Kerne, deren Kopplung gemessen wird, ist nicht einmal erforderlich. Die Anwendbarkeit konnte für verschiedene Systeme mit 14 bis 70 Nukleotiden demonstriert werden. Die erreichte Präzision ermöglichte es außerdem auch sehr kleine Effekte, wie beispielsweise die Ausrichtung von RNA im Magnetfeld zu detektieren.
Diese Arbeit zeigt außerdem zwei Beispiele für die gezielte Modifikation, um Lanthanid Bindungsstellen einführen zu können. Auf chemischen und biochemischen Weg konnte isotopenmarkierte, in vitro transkribierte RNA modifiziert werden. Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine Bindung von Lanthanid-Ionen an die modifizierte RNA. Die auftretenden, eher kleinen Effekte, sind vermutlich auf die noch zu hohe Flexibilität der eingeführten Modifikationen. Vor allem bei der chemischen Modifikation besteht hier noch Potential zur Optimierung, nachdem die generelle Anwendbarkeit der Methode demonstriert wurde.
Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse von Kopplungsmustern zur Analyse und zum Vergleichen von Naturstoffen. Hier konnten aus einer Reihe von Derivaten eindeutig die identifiziert werden, die verglichen mit der Ausgangsstruktur, die gleiche Konformation besitzen. Die gewonnenen Ergebnisse decken sich hier mit durchgeführten biologischen Tests, die ebenfalls dasselbe Derivat als aktiv identifizieren konnten, was klar für eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung spricht.
In der vorliegenden Arbeit werden Methoden und Anwendungen gezeigt, um skalare und dipolare Kopplungen im Bereich von Peptiden, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen zu nutzen. Die durchgeführten Arbeiten reichen dabei von der speziellen Probenpräparation zur Messung von dipolaren Kopplungen bis hin zur Entwicklung neuer NMR-spektroskopischer Methoden zur Messung von Kopplungen mit höherer Präzision und an größeren Systemen als bisher.
The present work wishes to contribute with information on two members of the primary active transporter group, which differ both in structure and function: Wilson Disease Protein which uses the energy released by ATP hydrolysis to transport copper across cell membranes, and Proteorhodopsin, which uses the energy of light to build up a proton gradient across the bacterial cell membrane, both heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. The surface detection experiments using HA-tagged WNDP confirm the proposed topology of WNDP. The HA-tag per se does not interfere with the function of WNDP, as shown for WNDP HA56 by ATP-dependent phosphorylation after expression in Sf9 cells. Sequence modifications within the WNDP HA56 template-construct reveal some interesting features: i) the N-terminal domain, which contains the 6 metal binding sites, is not necessary for plasma membrane targeting; ii) elevated surface expression of WNDP was observed when the carboxy terminus containing the tri-Leu motif is missing, which suggests that this motif might be involved in the retrieval of the protein from the plasma membrane; iii) the mutations TGE>AAA (proposed to lock the protein in the E1 conformation and lead to constitutive plasma membrane localisation) and D1027A (phosphorylation deficient) did not interfere with the surface localisation of the protein; iv) the mutations CPC>SPS (copper transport deficient) and H1069Q (phosphorylation deficient, most common mutation in Wilson Disease) reduced plasma membrane expression to less then 50%. Western blot analysis shows that the overall expression level of all constructs is similar to that of the reference construct WNDP HA56. These findings suggest that motifs involved in copper binding and catalytic activity do not interfere with plasma membrane targeting of WNDP in Xenopus oocytes. However, the H1069Q mutation could interfere with the distribution of WNDP protein within the cells. In the case of Proteorhodopsin, data presented in this work support earlier observations according to which proteorhodopsin can operate as an outwardly and inwardly directed light-driven ion pump. The residues proposed to play the roles of proton donor (E108) and acceptor (D97) are important for proton translocation. In the absence of an anionic residue at position 97 no outward pumping takes place, but inward charge translocation may occurs under appropriate conditions. An M-like state similar to that known from BR detectably accumulates under neutral pH conditions or under conditions where reprotonation of the Schiff base from the cytoplasmic side is slowed down, as in case of the mutants at position 108. Under acidic conditions PR pumps inwardly under the concerted action of pH and transmembrane potential. The experiments performed in parallel with PR and BR wild-types brought not only interesting information about similarities and differences between the two retinylidene ion pumps, but also led to the observation that the life-time of the M state in BR wild-type can be extended in addition to hyperpolarising transmembrane potentials also by extracellular acidic pH, when the proton gradient through the cell membrane is directed opposite to the ion transport (i.e. when the electrochemical gradient opposing the direction of proton transport increases). Direct photocurrent measurements of HA-tagged PR and BR have shown that the inserted tag may interfere with the functionality of the protein. Next to E108 and D97 in PR other residues in the vicinity of the retinal binding pocket contribute to the translocation of protons, as exemplified by the mutant L105Q: additionally to changing the absorption maximum of the protein, this mutant is a less effective proton pump than the wild type. The example of PR suggests that transduction of light energy by – and reaction mechanisms of retinylidene ion pumps have not been entirely deciphered by the extensive studies of bacteriorhodopsin.
The transporter associated with antigen processing (TAP) is a heterodimeric ATP-binding cassette (ABC) transport complex, which selects peptides for export into the endoplasmic reticulum (ER) and subsequent loading onto major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules to trigger adaptive immune responses against virally or malignantly transformed cells. Due to its pivotal role in adaptive immunity, TAP is a target for infectious diseases and malignant disorders, such as bare lymphocyte syndrome type I and cancer. A detailed knowledge about the TAP structure and transport mechanism is fundamental for the development of therapies or drugs against such diseases, but numerous aspects are insufficiently determined to date. The aim of this PhD thesis was to elucidate several structural details of TAP using powerful biochemical and biophysical methods and thereby to contribute to the understanding of the translocation machinery functionality.
High protein yields, an efficient isolation from the lipid environment and subsequent purification of a stoichiometric, stable, and functional TAP complex are prerequisites to get detailed insights into TAP functionality. The natural product digitonin is typically used as detergent to isolate TAP, but suffered from fluctuating purity and high costs. The novel detergent GDN was selected from a number of potential detergents upon their ability to isolate and purify TAP overcoming the limitations of digitonin without compromising on functional integrity. State-of-the-art biophysical techniques, such as solid-state nuclear magnetic resonance (NMR), require highly concentrated protein samples. A new and mild procedure to concentrate TAP was established within this thesis. Freeze drying is superior to conventional concentration techniques, such as ultrafiltration, resulting in TAP inactivation and aggregation already at concentrations of 10 mg/mL. This new procedure enables stabilizing TAP in a condensed glycerol matrix and to concentrate the transport complex up to 30 mg/mL active transporter. The functional integrity of the freeze-dried TAP complex was verified by determining equilibrium dissociation constants, peptide dissociation and ATP-hydrolysis rates as well as long-term stabilities identical to untreated TAP. The combined application of the detergent GDN and the freeze drying procedure facilitates the cost-efficient isolation of functional and highly concentrated TAP and enables to study the structure and mechanism of the peptide transporter TAP using modern analyses methods.
Information on peptide-TAP interactions at atomic level have not been obtained so far. This lack of knowledge hampered the mechanistic understanding of the initial steps of substrate translocation catalyzed by TAP. Dynamic nuclear polarization (DNP) enhanced magic angle spinning (MAS) solid-state NMR on highly concentrated TAP samples prepared with the freeze-drying procedure was used within this thesis to study this challenging membrane protein-substrate complex. The affinity and specificity of peptide binding by TAP are mediated by multiple recognition sites in the N- and C-terminal regions. Side-chains of positions 1, 3, and 9 are most substantially affected upon binding to TAP, revealing recognition principles of the translocation machinery. The nonamer peptide binds to TAP in an extended conformation with an N-to-C terminus distance of ~2.5 nm. Molecular docking revealed that the peptide substrate is locked with its N and C termini between TAP1 and TAP2 and adopts a tilted pose with respect to the membrane plane. The identified contact sites of TAP are consistent with results from earlier crosslinking and mutational analyses on the TAP complex.
The inadequate structure determination and insufficient knowledge about the dynamics of substrate translocation impedes a detailed comprehension of the TAP transport mechanism. Advanced biophysical methods, such as pulsed electron paramagnetic resonance (EPR) or single-molecule Förster resonance energy transfer (FRET), enable to locate the peptide-binding pocket and to elucidate dwell-times, conformational states and dynamics within the translocation cycle of TAP. The specific introduction of spin or fluorescent labels via single cysteines for such studies requires a cysteine-less TAP complex. The endogenous cysteine 213 in TAP2 remained to create a pseudo Cys-less TAP complex within this thesis due to its altered substrate repertoire when mutated to serine as shown in previous studies. Latter complex was used to introduce single-Cys mutations in the cytosolic extensions of transmembrane helices of TAP1. Their functional integrity with respect to peptide binding and translocation was comparable to pseudo Cys-less TAP. All pseudo single cysteines were efficiently labeled, but unintentionally C213TAP2 was labeled as well and TAP concomitantly inactivated. These unsatisfactory initial experiments required the generation of a functional, entirely Cys-less TAP transporter within this thesis. Therefore, C213TAP2 was replaced by all 19 proteinogenic amino acids. All analyzed mutants were capable to bind a high-affinity peptide of TAP, but with varying affinities and binding capacities. The replacement of C213 by isoleucine enabled the generation of a cysteine-less TAP complex with functional characteristics similar to the wild-type transporter and will promote the elucidation of the translocation mechanism of the peptide transporter TAP in future studies using pulsed EPR and single-molecule FRET.
The increasing resistance of almost all pathogenic bacteria to antibiotics (multidrug resistance) causes a severe threat to public health. The mechanisms underlying multidrug resistance include the induced over expression of multidrug transporters which extrude a variety of lipophilic and toxic substrates in an energy dependent fashion through the membrane out of the cell. These proteins are found in all transporter families. The work described in this thesis is dedicated to drug-proton antiporters from the small multidrug resistance (SMR) family. These efflux pumps with just four transmembrane helices per monomer are so far the smallest transporters discovered. Their oligomeric state, topology, three dimensional structure, catalytic cycle and transport mechanism are still rather controversial. Therefore, the aim of this thesis was to directly address these questions for the small multidrug resistance proteins Halobacterium salinarium Hsmr and Escherichia coli (E. coli) EmrE using a number of biophysical methods such as NMR, transport assays, mass spectrometry and analytical ultracentrifugation. Especially the work on Hsmr has been challenging due to the halophilic nature of this protein. In Chapter 1, key questions and the most important biophysical techniques are introduced followed by Material and Methods in Chapter 2. Depending on experimental requirements, cell free or ‘classical’ in vivo expression has been used for this thesis. Cell free expression as an option for the production of small multidrug transporters has been explored in Chapter 3. It has been possible to produce the SMR family members Hsmr, EmrE, TBsmr and YdgF in vitro. The expression of Hsmr was investigated in more detail under different experimental conditions. Hsmr was either refolded from precipitate or maintained in a soluble form during expression in the presence of detergents and liposomes. Furthermore, amino acids for which no auxotrophic strains were available could be labelled successfully. This expression system has been also used for preparing labelled samples of EmrE as described in Chapter 9. In vivo in E. coli expression of Hsmr, as described in Chapter 4, provided large amounts of proteins if fermenter production was used. Uniform labelling and selective unlabelling with stable isotopes (13C, 15N) for NMR spectroscopy was achieved in vivo in a more efficient and cost effective manner than using the cell free approach for this protein. Hsmr could be purified successfully from both in vitro and in vivo expression media. Hsmr is expressed in vivo and in vitro with N-terminal formylation. The Nterminal formylation is unstable and Hsmr in the presence of low salt concentrations was amenable to N-terminal degradation. It was found that Hsmr shows longest stability in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, but best reconstitution conditions were found, when dodecyl maltoside is used and exchanged with Escherichia coli lipids. A molar protein lipid ratio of 1 to 100, amenable to solid state nuclear magnetic resonance, has been achieved. Sample homogeneity was shown by freeze fracture electron microscopy. The oligomeric state of Hsmr in detergent has been assessed by SDS PAGE, blue native PAGE, size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation and laser induced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID) as described in Chapter 5. A concentration and detergent dependent monomer-oligomer equilibrium has been found by all methods. The activity of Hsmr under the sample preparation conditions used here was shown using radioactive and fluorescence binding as well as fluorescence and electrochemical transport assays (Chapter 6). For transport studies, a stable pH gradient was generated by co-reconstitution of Hsmr with bacteriorhodopsin and subsequent sample illumination. Based on the observed long term stability of Hsmr in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, liquid state NMR experiments were attempted in order to assess the correct folding of Hsmr in detergent micelles (Chapter 7). 1D proton and 2D HSQC spectra of U-15N Hsmr revealed a poor spectral dispersion, low resolution and only a small number of peaks. These are at least partly due to long rotational correlation times of the large protein detergent complex. This problem has been overcome by applying solid-state NMR to Hsmr reconstituted into E. coli lipids (Chapter 8). Uniform 13C labelled samples were prepared and two dimensional proton-driven spin diffusion and double quantum-single quantum correlation spectra were acquired successfully. Unfortunately, the spectral resolution was not yet sufficient for further structural studies. Reasons for the observed linebroadening could be structural heterogeneity or molecular motions which interfere with the NMR timescale. Therefore, the protein mobility has been probed using static 2H solid state NMR on Ala-d3-Hsmr. It could be shown, that parts of Hsmr are remarkably mobile in the membrane and that this mobility can be limited by the addition of the substrate ethidium bromide. Ethidium bromide as well as tetraphenylphosphonium (TPP+) is typical multidrug transporter substrates. The membrane interaction of TPP+ in DMPC membranes has been resolved by 1H MAS NMR. It was found that it penetrates into the interface region of the lipid bilayers and therefore behaves like many other transporter substrates adding to the hypothesis that the membrane could act as a pre-sorting filter. Finally, Chapter 9 is dedicated to the characterisation of the essential and highly conserved residue Glu-14 in EmrE by solid-state NMR. In order to avoid spectral overlap, the single Glu EmrE E25A mutant was chosen instead of the wildtype. The protein has been produced in vitro to take advantage of reduced isotope scrambling in the cell free expression system as verified by analytical NMR spectroscopy. Correct labelling of EmrE was tested by MALDI-TOF and solid-state NMR. The dimeric state of DDM solubilised EmrE has been probed by LILBID. The labelled protein was reconstituted into E. coli lipids to ensure a native membrane environment. Activity was determined by measuring ethidium bromide transport. Freeze fracture EM revealed very homogeneous protein incorporation even after many days of MAS NMR experiments. 2D 13C double quantum filtered experiments were used to obtain chemical shift and lineshape information of Glu-14 in EmrE. Two distinct populations were found with backbone chemical shift differences of 4 - 6 ppm which change upon substrate binding. These findings indicate a structural asymmetry at the assumed dimerisation interface and are discussed in the context of a model for shared substrate/proton binding. These studies represent the first successful use of cell free expression to prepare labelled membrane proteins for solid-state NMR and allow for the first time an NMR insight into the binding pocket of a multidrug efflux pump.
Integral membrane proteins (IMPs) account for 20-40% of all open reading frames in fully sequenced genomes and they are target of approximately 60% of all modern drugs. So far, cellular expression systems are often very insufficient for the high-level production of IMPs. Toxic effects, instability or formation of inclusion bodies are frequently observed effects that prevent the synthesis of sufficient amounts of functional protein. I have successfully established an individual cell-free (CF) expression system to overcome these IMP synthesis difficulties. The CF system was established in two different expression modes. If no hydrophobic compartment is provided, the IMPs precipitate in the reaction mixture. Interestingly, these insoluble proteins are found to differ from inclusion bodies as they readily solubilize in mild detergents and the bacterial small multi drug transporter EmrE, expressed in the insoluble mode was shown to reconstitute into liposomes in an active form. Alternatively, IMPs can be synthesized in a soluble way by supplementing the CF system with detergents. A comprehensive overview of 24 commonly used detergents was provided by analyzing their impact on the CF system as well as their ability to keep three structurally very different proteins in solution. The class of long chain polyoxyethylene-alkyl-ethers turned out to be most suitable for soluble expression of a-helical EmrE, the bacterial b-barrel type nucleoside transporter Tsx and the porcine vasopressin receptor type 2, resulting in several mg of protein per mL of reaction mixture. So far IMPs have almost completely been excluded from solution nuclear magnetic resonance (NMR) analyses. I could demonstrate that CF expression enables efficient isotopic labeling of IMPs for NMR analysis and further facilitates selective labeling strategies with combinations of 13C and 15N enriched amino acids that have not been feasible before. Four different G-protein coupled receptors (GPCRs) were successfully CF expressed in preparative scale and for the human endothelin B receptor (ETB), ligand binding ability was observed. A series of truncated ETB derivatives containing nested terminal deletions have been CF produced and functionally characterized. The core area essential for Endothelin-1 binding as well as a central region responsible for ETB oligomer formation was confined to a 39 amino acid fragment including the proposed transmembrane segment 1. The binding constant (KD) of ETB was determined to 6 nM for circular ET-1 by SPR and 29 nM for linear ET-1 by TIRFS. This data indicate a large potential of the established individual CF expression system for functional IMP synthesis.
Solid state NMR is a emerging method for the study of membrane proteins, which has received much interest in recent years. Limiting the study of many pharmacologically relevant targets, are the often long measuring times, required to obtain especially higher dimensional solid state NMR spectra of good quality. To address this problem, multiple methods where developed in this work, which can be categorized into two groups. The first set of methods aims at the quality of certain spectra, by implementing a spectral filter, which increases the fidelity of the measured data. The second set of methods, addresses the problem of long measuring times directly, by increasing the sensitivity per unit time, as could be shown, for example, on homo- and heteronuclear singlequantum-singlequantum correlation experiments. The gains in measuring time for the latter group of methods are typically in the order of 2-3, but some experiments allow multiple methods to be employed simultaneously, which can lead to a decrease in measuring time of a factor of up to 8. It is important to mention, that none of the methods introduced in this work require any equipment in addition to the conventional setup present in most sold state NMR laboratories and no changes or addition to the samples under study are required. Therefore the gains reported in this work come at no extra cost and require only minimal implementation effort on the side of the user.