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RNA research is very important since RNA molecules are involved in various gene regulatory mechanisms as well as pathways of cell physiology and disease development.1 RNAs have evolved from being considered as carriers of genetic information from DNA to proteins, with the three major types of RNA involved in protein synthesis, including messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA).2 In addition to the RNAs involved in protein synthesis numerous regulatory non-coding RNAs (ncRNAs) have been discovered in the transcriptome. The regulatory ncRNAs are classified into small ncRNAs (sncRNAs) with transcripts less than 200 nucleotides (nt) and long non-coding RNAs (lncRNAs) with more than 200 nt.3
LncRNAs represent the most diverse and versatile class of ncRNAs that can regulate cellular functions of chromatin modification, transcription, and post-transcription through multiple mechanisms.4 They are involved in the formation of RNA:protein, RNA:RNA and RNA:DNA complexes as part of their gene regulatory mechanism.4,5 The RNA:DNA interactions can be divided into RNA:DNA heteroduplex formation, also called R-loops, and RNA:DNA:DNA triplex formation. In triplex formation, RNA binds to the major groove of double-stranded DNA through Hoogsteen or reverse Hoogsteen hydrogen bonding, resulting in parallel or anti-parallel triplexes, respectively. In vitro studies have confirmed the formation of RNA:DNA:DNA triplexes.6 However, the extent to which these interactions occur in cells and their effects on cellular function are still not understood, which is why these structures are so exciting to study (Chapter I RNA:DNA:DNA Triplexes).
This cumulative thesis investigates several functional and regulatory important RNAs. The first project involves the improved biochemical and biophysical characterization of RNA:DNA:DNA triplex formation between lncRNAs of interest and their target genes. Triplex formation was confirmed by a series of experiments including electromobility shift assays (EMSA), thermal melting assays, circular dichroism (CD), and liquid state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The following is a summary of the main findings of these publications.
In research article 5.1, the oxygen-sensitive HIF1α-AS1 was identified as a functionally important triplex-forming lncRNA in human endothelial cells using a combination of bioinformatics techniques, RNA/DNA pulldown, and biophysical experiments. Through RNA:DNA:DNA triplex formation, endogenous HIF1α-AS1 decreases the expression of several genes, including EPH receptor A2 (EPHA2) and adrenomedullin (ADM), by acting as an adaptor for the repressive human silencing hub (HUSH) complex, which has been studied by our collaborators in the groups of Leisegang and Brandes.
2) Triplex formation between HIF1α-AS1 and the target genes EPHA2 and ADM was investigated in biochemical and biophysical studies. The EMSA results indicated that HIF1α-AS1 forms a low mobility RNA:DNA:DNA triplex complex with the EPHA2 DNA target sequence. The CD spectrum of the triplex showed distinct features compared to the EPHA2 DNA duplex and the RNA:DNA heteroduplex. Melting curve analysis revealed a biphasic melting transition for triplexes, with a first melting point corresponding to the dissociation of the RNA strand with melting of the Hoogsteen hydrogen bonds. The second, higher melting temperature corresponds to the melting of stronger Watson-Crick base pairing. Stabilized triplexes were formed using an intramolecular EPHA2 DNA duplex hairpin construct in which both DNA strands were attached to a 5 nucleotide (nt) thymidine linker. This approach allowed improved triplex formation with lower RNA equivalents and higher melting temperatures. By NMR spectroscopy, the triplex characteristic signals were observed in the 1H NMR spectrum, the imino signals in a spectral region between 9 and 12 ppm resulting from the Hoogsteen base pairing. To elucidate the structural and sequence specific Hoogsteen base pairs 2D 1H,1H-NOESY measurements of the EPHA2 DNA duplex and the HIF1α-AS1:EPHA2 triplex were performed. The 1H,1H-NOESY spectrum of the HIF1α-AS1:EPHA2 triplex with a 10-fold excess of RNA was semi-quantitatively analyzed for changes in the DNA duplex spectrum. We discovered, strong and moderate attenuation of cross peak intensities in the imino region of the NOESY spectrum. This attenuation was proposed to result from weakening of Watson-Crick base pairing by Hoogsteen hydrogen bonding induced by RNA binding. The Hoogsteen interactions can be mapped based on the analysis of the cross peak attenuation in the NOESY spectra, which we used to generate a structural model of the RNA:DNA:DNA triplex. These biophysical results support the physiological function of HIF1α as a triplex-forming lncRNA that recruits the HUSH-epigenetic silencing complex to specific target genes such as EPHA2 and ADM, thereby silencing their gene expression through RNA:DNA:DNA triplex formation.
Diseases such as cardiac arrhythmias, CPVT and other issues of the human heart still remain largely unexplored. To contribute to this field of research, it is necessary to create tools to control the spatial and temporal release and reuptake of Ca2+ from the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum (SR/ER). Ca2+ release and uptake by the ryanodine receptor (RyR) and Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA), respectively, are essential for the function of excitable cells. In this process, the rapid Ca2+ release from the SR/ER and the associated contraction in muscle cells is modulated by RyR. However, diseases due to calcium leakage, such as cardiac arrhythmias, seizures and contractile dysfunction, are also caused by RyR. The resting Ca2+ concentration in the cytosol, which is important for the cell, is kept in balance by Ca2+ release and reuptake into the SR/ER. This reuptake is controlled quite considerably by SERCA. SERCA is important for development and muscle function in both nematodes such as C. elegans and mammals, though there is also a great need for tools that can help study precise function.
To advance towards the goal of developing tools for optogenetic stimulation of intracellular Ca2+ release from the SR/ER, the model organism C. elegans was chosen. Its advantages are the fully sequenced genome and the neural network connectome. In addition, the ease of maintenance, self-fertilisation, transparency and rapid generation cycles, as well as the fact that it is a eutelic animal, are advantages for the application of the optogenetic approach.
So far, tools for light-induced Ca2+ release (LICR) have already been developed, involving the creation of ChR2 versions with higher Ca2+ conductivity based on the "CatCh" variant and further improving their conductivity through several established mutations. In addition, the pharynx of C. elegans was modified to produce an optogenetically stimulated muscle pump that resembles mammalian cardiac muscle cells. In this work, both optoUNC-68 (optically excitable RyR) and SERCA/LOV2 were generated in different variants by CRISPR/Cas9 and plasmid-based genome editing to achieve light-driven manipulation of calcium homeostasis in C. elegans. Here, LICR was triggered by LOV2 domains in an opto-mechanical manipulation of RyR as well as SERCA. This approach was made possible by recently published high-resolution cryoEM structural images. In addition, alternative approaches using Ca2+ conductance-optimised channelrhodopsin variants were tested in C. elegans body wall muscle cells.
By inserting ChR-XXM into C. elegans and subsequent fluorescence microscopy of the co-introduced GFP, an expression in body wall muscle cells could be detected. Furthermore, in contraction assays, ChR-XXM was demonstrated to induce contractions of the animals of up to 16% compared to the original body length in both medium (0.8mW/mm²) and high (1.4mW/mm²) stimulation at 470nm. ChR-XXM was thus identified as an excellent candidate for the development of an optogenetic tool, as it exhibits significantly increased Ca2+ conductivity compared to other ChR2 variants.
The use of CRISPR/Cas9 to insert AsLOV2 domains (L404-L546) into different insertion sites of RyR allowed the generation of a transgenic strain of C. elegans that could be stimulated to elongate during 0.3mW/mm² photostimulation. This demonstrated that RyR can be manipulated by photostimulation, spatiotemporally through conformational changes in the LOV2 domain and the resulting disruption of the pore region.
The CRISPR/Cas9 method was also used to insert LOV2 domains into SERCA. Here it could be demonstrated that a conformational change of the LOV2 domains induced by photostimulation leads to a stop or impairment of Ca2+ ion translocation by SERCA from the cytosol into the SR/ER. In contrast to LOV2 in RyR, this resulted in a contraction of C. elegans body length.
The data presented here indicate that the intracellular Ca2+ cycle involving the SR/ER and cytosol can be successfully manipulated by the introduction of optogenetic tools. It turned out that the manipulation/impairment of individual components of this system, such as RyR or SERCA, is usually insufficient to achieve a clear response. Therefore, simultaneous manipulation of the two main actors RyR and SERCA is arguably the best way to take another step towards creating optogenetic tools for light-stimulated manipulation of Ca2+ release and reuptake from the SR/ER.
This thesis deals with the NMR characterization of the structure and the folding dynamics of DNA G quadruplexes as potential therapeutic target in cancer therapy and building block for DNA based nanotechnology.
The first part of this thesis (Chapters 1-5) introduces the reader to the world of G quadruplexes.
The main features of the classic Watson Crick double helix and alternative non B DNA structures are illustrated in Chapter 1. Many different base pairing schemes are possible, besides the canonical Watson Crick motif, thereby expanding the structural complexity of DNA. Non canonical base pairing, such as Hoogsteen hydrogen bonding, enables the assembly of triplets and quartets, which are the building blocks of triplex and quadruplex structures, respectively.
The structural characteristics of DNA G quadruplexes are delineated in detail in Chapter 2.
G quadruplex structures are extremely polymorphic, in terms of strands orientation, loops geometry, grooves width and arrangement of the glycosidic torsion angles. The various structural elements as well as the different cation coordination geometries are here presented, with a special emphasis on the diversity of conformations reported for the telomeric DNA G quadruplexes.
Chapter 3 describes the biological roles of G quadruplex structures in the genome. After introducing the architecture of the telomeric DNA and its interacting proteins, the mechanism of the telomeres elongation catalysed by the telomerase enzyme and its implications for cancer are discussed. The occurrence of G quadruplex structures in functional regions of the genome, such as promoter regions of oncogenes, and their possible roles in regulating the gene transcription are then outlined in the second part of the chapter.
The potential of G quadruplex as a novel anti cancer target is examined in Chapter 4 and the proposed anti cancer mechanisms for a ligand stabilizing G quadruplex structures are discussed.
RNA G quadruplexes and their putative role in gene regulation at the level of translation are briefly illustrated at the end of the chapter.
A general overview on the NMR methods to investigate the G quadruplex structures is presented in Chapter 5. The experimental set up used for the real time NMR studies of the G quadruplex folding is also described.
The second part of the thesis (Chapters 6-8), which is the cumulative part, comprises the original publications grouped in three Chapters according to the topic.
The state of the art on small molecules targeting G quadruplex structures is given at the beginning of Chapter 6, including a summary of the experimental structures of G quadruplexes in complex with ligands available up to date. The publications presented in Chapters 6.1-6.3 are concerned with the elucidation of the interaction modes between DNA G quadruplexes and selected ligands with potential therapeutic applications.
The binding ability of two natural alkaloids (berberine and sanguinarine) to telomeric G quadruplexes is examined in Chapter 6.1. The ability of carbazole and diguanosine derivatives (synthetized in the group of Prof. Dash, IISER, Kolkata) to interact with c-MYC G quadruplex and down regulate c-MYC expression is explored in Chapter 6.2 and Chapter 6.3, respectively.
The energy landscape of human telomeric G quadruplex structures is discussed in Chapter 7, in light of the experimental kinetic studies as well as molecular dynamics simulations reported in literature until now. Up to date there is no general consensus regarding the folding pathway of unimolecular human telomeric G quadruplex, in particular due to the lack of atomic resolution data on the species involved in the folding. Chapter 7.1 presents the first real time NMR study of the human telomeric G quadruplex folding kinetics.
The final chapter of this thesis (Chapter 8) outlines the potential of G-quadruplex structures as building blocks in nanotechnology. After illustrating briefly the additional possibilities offered by alternative non B DNA structures to programme nanomaterials, a number of applications employing G quadruplex structures in different fields of nanotechnology are described. The article presented in Chapter 8.1 investigates the structural and photoswitching properties of a novel intermolecular azobenzene containing G quadruplex synthetized in the group of Prof. Heckel (Goethe University, Frankfurt).
In der vorgelegten kumulativen Arbeit wurden strukturelle und funktionale Untersuchungen an Nukleinsäuren durchgeführt, hauptsächlich, aber nicht ausschließlich unter Verwendung von NMR-Spektroskopie (Kernspin Resonanzspektroskopie) als Analysemethode. Die untersuchten Biomoleküle umfassten kleinere und größere biologisch relevante RNAs sowie einen artifiziellen DNA G-Quadruplex. Hierbei konnten Ergebnisse im Bereich der Bestimmung der molekularen Struktur, der Aufklärung der biologischen Funktion und der Wirkstoffentwicklung gewonnen werden, die in sechs verschiedenen Publikationen dargelegt sind, an deren Erstellung der Autor maßgeblich oder hauptverantwortlich beteiligt war. Des Weiteren wird in einem mehrgliedrigen Einleitungssegment auf den Stand der aktuellen Forschung in den jeweiligen Teilgebieten eingegangen.
Das wachsende Verständnis für das fein abgestimmte Zusammenspiel aus Struktur und Funktion von Nukleinsäuren resultiert aus unzähligen Forschungsprojekten. Forschende stehen dabei vor der Herausforderung, dass die zu untersuchenden Oligonukleotide sowohl modifiziert als auch in ausreichender Menge und Reinheit dargestellt werden müssen. Die chemische Festphasensynthese ist ein bewährtes Mittel zur Synthese hochmodifizierter DNA und RNA. Allerdings werden Oligonukleotide mit zunehmender Länge unzugänglicher, da die einzelnen Kupplungsreaktionen nicht quantitativ ablaufen, was zu schwer abtrennbaren Abbruchsequenzen führt. Hinzu kommt, dass während der chemischen Synthese harsche Reaktionsbedingungen nötig sind, denen die gewünschten Modifikationen standhalten müssen. (Chemo-) enzymatische Methoden können diese Hürden überwinden und somit den Zugang zu biologisch interessanten, längeren modifizierten Sequenzen ermöglichen. Jedoch erfolgt der enzymatische Einbau von Modifikationen ohne aufwendige Optimierung lediglich statistisch verteilt. Um weitere Erfolge im Bereich der Strukturaufklärung zu erzielen, werden somit Synthesemethoden benötigt, die sich zum positionsspezifischen Einbau von Modifikationen eignen und gleichzeitig den Zugang zu längeren Oligonukleotiden ermöglichen. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion haben sich in den letzten Jahren lichtadressierbare Verbindungen als gefragte Modifikationen erwiesen. Der Einsatz von Licht als mildes, nicht-invasives Auslösesignal stellt besonders im biologischen Kontext eine interessante Herangehensweise dar. Um hochwertige Aussagen über das Verhalten von Oligonukleotiden in komplexer biologischer Umgebung machen zu können, muss durch die gezielte Platzierung lichtaktivierbarer Verbindungen ein effizientes AN/AUS-Verhältnis geschaffen werden. Der Einbau photolabiler Schutzgruppen erlaubt eine vorübergehende Beeinflussung der Oligonukleotidstruktur, die durch Abspaltung der Schutzgruppe irreversibel (re-) aktiviert werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einbau von Photoschaltern eine reversible Adressierbarkeit durch Isomerisierungsprozesse. Die Synthese komplexer gezielt-markierter Oligonukleotide erfolgt zumeist chemisch und ist daher längenlimitiert.
Ziel dieser Doktorarbeit war es, beide Fragestellungen zu vereinen und eine chemo-enzymatische Methode zur RNA-Synthese zu untersuchen, die zum einen die positionsspezifische Modifizierung mit lichtaktivierbaren Einheiten erlaubt und darüber hinaus die Längenlimitierung der chemischen Festphasensynthese überkommt. Im Zentrum der Methode stehen drei enzymatische Reaktionsschritte zum Einbau von photolabil- und photoschaltbar-modifizierten Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphaten: I) eine 3‘-Verlängerung, in der die modifizierten Bisphosphate mit T4 RNA Ligase 1 mit dem 3‘-Ende einer RNA verknüpft werden; II) die Dephosphorylierung des 3‘-Phosphats mit Shrimp Alkaline Phophatase und III) die Verknüpfung der 3‘-terminal modifizierten RNA mit einem zweiten 5‘-phosphorylierten RNA-Fragment, wodurch eine Gesamtsequenz mit gezielt platzierter Modifikation entsteht (Abb. I).
Im ersten Teilprojekt wurden in kollaborativer Arbeit zunächst benötigte photolabile NPE- und photoschaltbare Azobenzol-C-Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate synthetisiert und grundlegende Bedingungen der enzymatischen Reaktionen erarbeitet. Hierbei konnte der enzymatische Syntheseansatz erfolgreich in Lösung umgesetzt und der chemo-enzymatische Einbau aller synthetisierten Bausteine nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde die Methode in eigenständigen Arbeiten weiterverfolgt, um den multiplen Einbau NPE-modifizierter Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate in direkter Nachbarschaft sowie deren Einbau in DNA/RNA-Mixmere mit Phosphodiester- oder Phosphorthioatrückgrat zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Enzyme neben lichtaktivierbaren Modifikationen zusätzliche Anpassungen der Phosphateinheit sowie unterschiedliche Ribosebausteine in Kombination tolerieren. Da exogene RNA schnell von Exonukleasen abgebaut und somit unwirksam wird, werden zahlreiche stabilisierende Anpassungen an synthetischen RNAs vorgenommen. Zu den häufigsten zählen Phosphorthioate und Modifikationen der Ribose. Mit der erfolgreichen Modifikation der chimären Oligonukleotide eröffnet die erarbeitete Methode einen wichtigen Zugang zu therapeutisch interessanten Oligonukleotiden. Ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung biologisch relevanter Anwendungsmöglichkeiten konnte mit der Synthese, Charakterisierung und Umsetzung eines DEACM-geschützten Uridin-3‘,5‘-Bisphosphates (pUDEACMp) errungen werden. Im Vergleich zur verwendeten NPE-Schutzgruppe ist das Absorptionsspektrum der DEACM-Schutzgruppe bathochrom-verschoben, was eine Abspaltung mit Wellenlängen > 400 nm erlaubt. Dadurch können Zellschäden vermieden und Oligonukleotide mit NPE- und DEACM-Modifikation wellenlängenselektiv angesprochen werden...
Obwohl zahlreiche zelluläre Funktionen von RNAs in direktem Zusammenhang mit Proteinen stehen, wurde auch eine Vielzahl von, unter anderem regulatorischen, RNA-Motiven identifiziert, die ihre Funktion ohne eine initiale Beteiligung von Proteinen ausüben. Das detaillierte Verständnis der zu Grunde liegenden Regulationsmechanismen beinhaltet die Charakterisierung von beteiligten RNA-Architekturen und deren funktionaler Stabilitäten, von dynamischen Aspekten der RNA-Faltungsprozesse sowie die Korrelation dieser Charakteristika mit zellulären Funktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden strukturelle, thermodynamische und kinetische Aspekte der Ligand-bindenden Guanin Riboswitch-RNA Aptamerdomäne des xpt-pbuX Operons aus B. subtilis und eines Cofaktor-abhängigen katalytischen RNA-Motivs, des 'Adenin-abhängigen Hairpin Ribozyms', untersucht. ...
Cells perform a wide range of functions such as signalling, transportation, immunoprotection and metabolism. Unravelling the molecular mechanism behind those processes will provide a platform for more targeted and rational drug design. This is achieved by discerning the structural and functional aspects of the biological macromolecules involved. This thesis discusses about the biophysical characterization of protein structures and the biological importance of protein dynamics. Membrane receptors and enzymes which are ubiquitously present in our biological systems and regulate wide variety of functions are excellent choice for such study. From a pharmaceutical point of view, receptor and enzymes are exceptionally important drug targets as they represent the major share (receptor, 30% and enzymes, 47%) of all marketed drugs. Therefore, apart from biological insights, the detailed study of receptors and enzymes will provide the basis for new pharmaceutical applications. Most information about receptor activation and enzyme activity come from the structural and functional analysis of target members of the above mentioned systems.
In “Chapter 1 – General Introduction” the readers are introduced to the world of proteins with special focus on G-protein coupled receptors (GPCRs) and methyltransferases. The first part of this chapter discusses about GPCRs with emphasis on their classification, structural features and functions. GPCRs are the most abundant membrane receptors present in mammalian cells, accounting for almost 15% of all membrane proteins. The GPCR superfamily consists of ~800 members and can be subdivided into six classes (A-F). Class A containing rhodopsin, peptide hormones, olfactory GPCRs, is the most abundant with a large share of 85% of GPCR protein family. GPCRs share a common architecture of 7 transmembrane a-helices, with different ligand binding sites. Although a variety of ligands ranging from subatomic particles (a photon) to large proteins can activate a GPCR, their mechanism of signal transduction is almost similar. There are two major signal transduction pathways identified for GPCRs: the cAMP pathway and the phosphatidylinositol pathway. The therapeutic relevance of GPCRs has also been pointed out here since a large share (30%) of modern marketed drugs target GPCRs.
In the second part of this chapter, the structural and functional characterizations of methyltransferases (MTs) are discussed in detail. Several important biological processes in cells e.g. drug metabolism, gene transcription, epigenetic regulations are modulated by methylation of targets ranging from small biomolecules to large proteins. MTs are the proteins which catalyze this methylation reaction and transfer the methyl group to an acceptor molecule through SN2 like nucleophilic substitution reaction. The MTs can be classified on the basis of the substrate atoms they methylate: O (54% of all MTs), N (23%), C (18%), S (3%) and other acceptors (such as halides; 2%). They can also be categorized into five different classes (Class I-V) depending upon distinctive structural features facilitating substrate binding or catalytic activity. Rossmann fold and SET (acronym acquired from the Drosophila Su(var)3-9 and 'Enhancer of zeste' proteins) domain are the two characteristic structural motifs commonly found in MTs. Similar to GPCRs, MTs dysfunction has been shown to be involved in various diseases including neuropsychiatric diseases and cancer. Therefore they are also interesting targets for drug development. The final part of this chapter discusses the importance of structural biology in gathering information related to structure and conformational dynamics of proteins. The two prominent biophysical techniques used in structural biology, X-ray crystallography and NMR, are discussed with focus on their advantages and limitation. The importance of NMR spectroscopic techniques to investigate different dynamic processes of protein at atomic resolution under physiological conditions is also discussed. Real time NMR spectroscopy required for the analysis of slow protein dynamic processes (protein folding, enzyme catalysis, domain rearrangement) has been explained in detail.
The second part of the thesis (Chapters 3-4), which is the cumulative part, comprises the original publications grouped into 2 chapters according to their topic:
• NMR-spectroscopic characterization of the transiently populated photointermediates of bovine rhodopsin and it’s interaction with arrestin (Chapter 3)
• Structural and biophysical characterization of PaMTH1, a putative SAM dependent O-methyltransferase from filamentous fungi Podospora anserina (Chapter 4)
Each chapter is initiated by a detailed introduction to the topic, providing the framework for the following papers. The personal contribution of this thesis’ author to each publication is stated in the introduction to the respective article.
Cancer cells, including leukemic cells, can react to therapeutic treatment by altering their metabolic phenotype (“metabolic reprogramming”) to keep their accelerated proliferative state, eventually becoming resistant to the treatment. There is an increasing amount of evidence indicating that metabolic reprogramming is one of the key mechanisms of acquisition of drug resistance by cancer cells. In agreement, several metabolic studies targeting leukaemia and specifically acute myeloid leukaemia (AML) and chronic myeloid leukaemia (CML), have been conducted over the last decades. However, there is still a lack of understanding the metabolic features of both AML and CML leukaemia specially in the acquisition of drug resistance, that is needed for unveiling novel and effective treatments for resistant and non-resistant patients. Therefore, the main objective of this thesis was to investigate the rewiring of cell metabolism occurring in the process of acquisition of resistance to conventional therapeutic treatments in AML and CML malignancies. Next, by revealing this metabolic rewiring, we intended to highlight potential metabolic and non-metabolic targets that could be exploited to overcome resistance to treatments. To this end, we have performed a comprehensive and comparative multi-OMIC study to analyse the links between the metabolic reprogramming and the resistance acquisition of THP-1 and HL-60 AML cell models sensitive or resistant to cytarabine (AraC) and doxorubicin (Dox), and of KU812 CML cell model sensitive or resistant to imatinib, all under normoxic (21% O2) and hypoxic (1% O2) conditions. The results of this thesis are divided into two chapters. On the one hand, in Chapter 1, the multi-OMIC study performed in AML parental and resistant cells unveiled that the acquisition of AraC resistance causes the reprogramming of the glucose metabolism of THP-1 and HL-60 cells by increasing the glycolytic flux whereas it is not associated with an alteration in the mitochondrial respiration. Moreover, our results also exhibited a possible disfunction of ETC complex I as well as alterations in glutamine and serine-glycine-1C metabolism in AML cells that display a more active mitochondrial metabolism. Moreover, we have also identified that the acquisition of Dox resistance causes alterations in the glucose and amino acid metabolism. Importantly, we have observed an important loss of mitochondrial respiration capacity of AML cells resistant to Dox chemotherapeutic drug, which constitutes a potential metabolic vulnerability that can be exploited for the treatment of AML patients resistant to Dox. On the other hand, in Chapter 2 is shown that the acquisition of imatinib resistance causes the reprogramming of glucose metabolism by enhancing the glycolytic flux, PPP, and glycogen metabolism, thus highlighting these metabolic pathways as potential metabolic weaknesses of KU812 cells resistant to imatinib. Moreover, we have observed a high metabolic plasticity of KU812 cells resistant to imatinib which includes the orchestration of many metabolic routes associated with the amino acid metabolism. Importantly, the CML multi-OMIC study has also unveiled an enhanced mitochondrial respiration capacity, which constitutes another potential vulnerability that can be exploited to overcome imatinib resistance. Finally, both AML and CML multi-OMIC studies have allowed us to propose and/or validate different metabolic and non-metabolic targets. In this regard, in this thesis we have identified and validated a battery of single-hit inhibitions that were able to reduce the cell viability of both parental and resistant AML and CML cells. Finally, we have confirmed that the repurposing of Dox chemotherapeutic drug counteracts the imatinib resistance in the KU812 cells resistant to imatinib.
Funktionelle Charakterisierung von Peptidliganden für das komplexe HIV-1-RNA-Verpackungssignal PSI
(2008)
Im Laufe der vergangenen Jahre hat die Identifizierung von Peptidleitstrukturen in der Wirkstoffentwicklung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Phage Display Technologie ist eine Methode, welche zur Selektion von inhibitorischen Peptiden weit verbreitet ist. Prinzipiell eignet sich dieser Ansatz auch für die Suche nach neuen Leitstrukturen für die Therapie der HIV-Infektion, welche in hochspezifische und -regulierte Schritte im HIV-Replikationszyklus eingreifen sollen. Bei der Verpackung viraler RNA in neu entstehende Virionen handelt es sich um einen Prozess, welcher auf der gezielten Erkennung der dreidimensionalen Struktur der PSI-Region am 5'-Ende ungespleißter, viraler RNA durch die NCp7-Domäne des Gagp55-Vorläuferproteins basiert. Darüber hinaus partizipiert das NCp7-Protein noch an der Reversen Transkription der HIV-RNA sowie an der Integration proviraler DNA und spielt somit eine zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus. In vorangegangenen Arbeiten konnten wir mittels der Phage Display Technologie Peptidliganden für die HIV-1 PSI-RNA selektieren, welche die PSI-RNA-NCp7-Interaktion hemmten und in Folge dessen die Verpackung viraler RNA verhindern sollten. Die Bindung der identifizierten tryptophanreichen Peptide an die PSI-RNA konnte zwar zum Teil in vitro mit NCp7 kompetitiert werden, jedoch wiesen die Peptide eine relativ geringe Affinität für die PSI-RNA auf. Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit stand nach Optimierung der Affinität eine umfassende funktionelle Charakterisierung der Peptide hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität in vitro. Zunächst gelang es mittels Spot-Synthese-Membranen die Affinität der PSI-RNA-bindenden Peptide um etwa das 30-fache zu verbessern. Der KD-Wert des optimierten HKWPWW-Peptids lag bei 1,1 µM für ein Teilelement der PSI-RNA, das allein über Verpackungsaktivitäten verfügt. Die folgende Analyse der Bindungseigenschaften des HKWPWW-Peptids an die PSI-RNA über NMR und Fluoreszenz-Spektroskopie offenbarte, dass das Peptid über die hydrophoben Aminosäuren an eine charakteristische Schleifenregion in der Sekundärstruktur der PSI-RNA bindet, ähnlich wie der natürliche Ligand NCp7. Gestützt auf diese Ergebnisse, wurde im Hauptteil des Projekts untersucht, ob das HKWPWW-Peptid in der Lage ist, die Verpackung viraler RNA in HI-Virionen zu hemmen. Hierfür erfolgte die Etablierung diverser Testsysteme, welche die intrazelluläre Expression des Peptids ermöglichten. Die Expression von HKWPWW in Fusion mit RFP in Pseudoviren-produzierenden Zellen über transiente Transfektion führte in der höchsten getesteten DNA-Konzentration (2,5 µg) zu einer 95%igen Reduktion des infektiösen Titers. Dieser inhibitorische Effekt war spezifisch für lentivirale Pseudoviren, da die Produktion gammaretroviraler Pseudoviren nicht durch die Anwesenheit des Peptids beeinflusst wurde. Mittels einer stabilen HKWPWW-exprimierenden T-Zelllinie gelang es nachzuweisen, dass das Peptid sogar in der Lage ist, replikationskompetentes HIV über einen Zeitraum von fünf Tagen zu hemmen. Die Synthese des HKWPWW-Peptids in Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne ermöglichte die direkte Behandlung von HIV-infizierten Zellen und führte zu einer verminderten Freisetzung infektiöser HI-Viren in die Zellkulturüberstände. Dabei lagen die IC50- und IC90-Werte des HKWPWW-Peptids nach zweimaliger Peptidzugabe bei 5, 7 bzw. 28,6 µM. Eine in der Literatur oftmals beschriebene Beobachtung ist, dass bei einer reinen Hemmung der HIV-Verpackung Viren entstehen, welche keine virale RNA enthalten. Das Phänomen war in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids wenig ausgeprägt wie Korrelationen von p24-Antigen-ELISA und die Quantifizierung viraler RNA in Viruspartikeln zeigten. Diese Gegebenheit sowie das Wissen über die mannigfaltigen Funktionen des NCp7-Proteins im HIV-Replikationszyklus ließen vermuten, dass HKWPWW noch zusätzlich andere Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen könnte. Unterstützt wurde diese Annahme dadurch, dass HKWPWW Ähnlichkeiten zu der hydrophoben Plattform von NCp7 aufweist, welche essentiell für die Verpackung viraler RNA sowie die Reverse Transkription ist. Damit in Einklang steht, das neben einer Bindung an die PSI-RNA auch eine schwächere Interaktion des HKWPWW-Peptids mit den viralen TAR- und PBS-Strukturen nachgewiesen werden konnte. Die auch beobachtete Hemmung der frühen HIV-Replikationsschritte durch HKWPWW könnte somit mit einer möglichen Hemmung der Transkription viraler Gene, der Reversen Transkription oder Integration erklärt werden. Jedoch zeigte die elektronenmikroskopische Analyse, dass nicht nur weniger Viren in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids entstehen, sondern dass diese zum Teil einen weniger kondensierten Kern aufweisen. Dies kann als ein Anhaltspunkt angesehen werden, dass HKWPWW tatsächlich auch auf der Ebene der RNA-Verpackung bzw. der viralen Partikelentstehung einen hemmenden Effekt ausübt. Somit resultiert die beobachtete antivirale Aktivität des HKWPWW-Peptids vermutlich aus kombinierten inhibitorischen Effekten auf mehreren Ebenen der HIV-Replikation.
Den photoaktivierbaren Schutzgruppen PPGs wurde als wichtige Werkzeuge, um z. B. biologische Prozesse zu untersuchen, in den letzten Jahren eine beachtliche Aufmerksamkeit zuteil. Der Einsatz von PPGs weist gegenüber chemischen Schutzgruppen wertvolle Vorteile auf, was deren Einsatz für biologische Konzepte attraktiv macht. Insbesondere, da keine weiteren Reagenzien außer Licht als Mittel für die Photolyse benötigt werden. Darüber hinaus ist es möglich, durch Einsatz moderner Lasertechnik, eine homogene Bestrahlung des Reaktionsvolumens mit einer hohen Lichtdosis auf einer, im Vergleich zu klassischen Lichtquellen, kürzeren Zeitskala zu gewährleisten.
Die Diversität der einsetzbaren photosensitiven Schutzgruppen, kommt einerseits der Vielfalt der anwachsenden biochemischen Fragestellungen insofern zugute, als dass die ausgewählten PPGs auf verschiedenste Anforderungen der zu untersuchenden Systeme zugeschnitten werden können. Anderseits kann die, durch einige Problemstellungen, erforderte chromatische Orthogonalität der eingesetzten Schutzgruppen, gewährleistet
werden, deren Umsetzung sich in den letzten Jahren in zahlreichen Studien als erfolgsversprechend erwies. Beide Aspekte sind unter anderem Gegenstand der vorliegenden Arbeit.
Zum einen sollte das Photocaged Puromycin als photolabiles Antibiotikum Derivat, mithilfe der Cumarinylmethyl-Schutzgruppe (DEACM-Puromycin) optimiert werden und mit dem vorherigen Nitrobenzyl-geschützten NVOC-Puromycin mittels spektroskopischer und biochemischer Methoden verglichen werden. Zum anderen sollte eine neue Strategie etabliert werden, mit deren Hilfe das photolytisch entschützte Puromycin erneut deaktiviert werden kann.
DEACM-Puromycin konnte mithilfe eines fünfstufigen Syntheseweges hergestellt werden. Ausgehend von 7-Amino-4-methylcumarin, dessen allylische Methylgruppe durch die Riley-Reaktion mit Selendioxid Se2O zum entsprechenden DEACM-Aldehyd oxidiert wurde und anschließende Reduzierung in Anwesenheit von NaBH4 zum Cumarinalkohol DEACM-OH. Eine nicht toxische Variante, bei welcher Selendioxid umgangen wurde, zeichnete sich ebenso als zielführend aus. DEACM-OH und Puromycin konnten im Anschluss über ein Carbonat-Intermediat miteinander als Carbamat verknüpft und mithilfe von HPLC aufgetrennt werden.
Die Vorrangigkeit des neuen photolabilen Puromycin Derivates (DEACM-Puromycin), wurde zuerst mithilfe der Laser-NMR-Spektroskopie sowie HPLC Verfahren erfasst. Spektroskopische Analysen im Rahmen einer Kollaboration mit dem AK von Professor Wachtveitl bestätigten, dass DEACM-Puromycin für biologische Anwendungen geeignetere photolytische Eigenschaften, wie z. B. einen höheren Extinktionskoeffizienten, eine bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums, sowie eine höhere Quantenausbeute und Uncaging Effizienz der Photolyse, aufwies. Basierend auf einer vergleichbaren HOMO-LUMO Differenz beider Verbindungen (DEACM-OH und DEACM-Puromycin), konnte die Spaltung der Schutzgruppe mithilfe der Differenz der Fluoreszenzslebensdauern mit einer Rate von 0,71*108 s-1 charakterisiert werden. Dies war im Vergleich zum vorherigen NVOC-Puromycin um eine Größenordnung höher. Weitere durchgeführte spektroskopische Methoden wurden mittels quantenchemischer Rechnungen unterstützt, um wichtige Erkenntnisse der kinetischen und dynamischen Abläufe der Photolyse des geschützten Puromycins anzueignen, z. B.:
• Der zur Photolyse von DEACM-Puromycin konkurrierende Fluoreszenzprozess, kann durch protische Medien unterdrückt werden. Dies und die somit ermöglichten Wasserstoffbrückenbindungen, welche die entstehenden ionischen Intermediate während der Photolyse stabilisieren, könnten sich für die Erhöhung der Quantenausbeute der photolytischen Abspaltung von DEACM-Puromycin zu Nutze gemacht werden.
• Anhand von Experimenten auf der ultrakurzen Zeitskala wurde die Population eines angeregten S1-ICT-Zustandes detektiert. Bei diesem findet, in Anwesenheit von polarem Lösungsmittel, einen Ladungstransfer der Diethylaminoreste auf den Cumarinring statt.
• Polare Lösungsmittel bewirken ebenfalls den Übergang zu einem TICT Zustand, welcher als nichtstrahlende Relaxation die Fluoreszenz des DEACM-Puromycins reduziert. Die Auswahl von Substituenten sowie polaren und protischen Lösungsmitteln zur Begünstigung der ICT- sowie TICT- Zustände, könnte zukünftig zur Optimierung der Photolyse Effizienz herangezogen werden.
Die gelungene Optimierung des geschützten Puromycins als ein photosensitives Antibiotikum, durch die DEACM-Schutzgruppe, konnte mittels eines XTT-Zellviabilität-Experimentes mit sf9-Insektenzellen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte die lichtkontrollierte Puromycylierung zur Visualisierung neu synthetisierter Proteine als weitere Funktion des optimierten photoaktivierbaren Puromycins in Zusammenarbeit mit dem AK. Schumann (MPI für
Hirnforschung, Frankfurt am Main) nachgeprüft werden. Obwohl beide photocaged Verbindungen, DEACM- sowie das vorherige NVOC-Puromycin, eine vergleichbare Zellpermeabilität zu den präparierten Neurozellen aufwiesen, zeigte DEACM-Puromycin unter gleichen Bedingungen nach der Belichtung ein signifikant intensiveres Puromycylierungsignal als NVOC-Puromycin. Unter der Annahme, dass sich mehr NVOC- als DEACM-Puromycin in
den Zellen befand, bestätigt diese Beobachtung die Vorrangigkeit des DEACM-Derivates, aufgrund seiner bereits optimierten photochemischen Eigenschaften. Durch den Einsatz eines Zwei-Photonen-Lasers, konnte die Eignung von DEACM-Puromycin für die raumselektive Steuerung der Detektion von neu exprimierten Proteinen, mit größerer Auflösung auf subzellularem Level, nachgewiesen werden.
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