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In the adult mammalian central nervous system, two defined neurogenic regions retain the capacity to generate new neurons throughout adulthood, namely the subependymal zone (SEZ) at the lateral ventricles and the subgranular layer of the hippocampus (SGL). Adult neurogenesis consists of a whole set of events including proliferation, fate specification, migration, survival and finally synaptic integration of newly born neurons. Each of these events is controlled by the interplay of numerous factors. In this study two signalling systems were analysed with regard to their functional role in adult neurogenesis in vivo, namely the purinergic system and the growth factor EGF. Neither short- nor long-term application of the P2Y receptor agonists UTP and ADPβS and the P2Y receptor antagonist suramin into the lateral ventricle of adult mice altered cell responses as compared to vehicle controls in vivo. In contrast, analysis of the expansion rates of cultured neural stem cells (NSCs) from knockout mice revealed a strong increase in the number of NSCs from NTPDase2-/- mice, whereas cell numbers of NSCs from P2Y1-/- and P2Y2-/- mice were significantly reduced in comparison to wildtype levels. Notably, in vivo proliferation rates were potently elevated in the SGL and the SEZ of NTPDase2-deficient mice. However, in vivo proliferation in both neurogenic niches of the single receptor knockout mice P2Y1-/- and P2Y2-/- and P2Y1-/- P2Y2-/-double-knockout mice did not differ significantly from the wildtype. In mice lacking the P2Y2 receptor the survival of newly born neurons in the hippocampal granule cell layer was significantly increased. These data provide the first line of evidence that purinergic signalling is involved in the control of neural stem cells behaviour not only in vitro but also in vivo. In order to further characterise the role of epidermal growth factor (EGF) in adult neurogenesis, transit amplifying precursors (TAPs) and type B astrocytes were identified as EGF-responsive cell populations following ventricular EGF injection, whereas ependymal cells, neuroblasts and NG2-positive cells did not or only to a minor extent respond to EGF injection. These EGF-responsive cell populations were found on both, the septal as well as striatal lateral ventricle walls. Long-term ventricular EGF infusion for 6d, 1. increased cell proliferation of both ventricle walls revealing a gradient along the rostro-caudal axis, 2. altered the balance between neuronal and macroglial cell fates to generate oligodendrocyte precursors and 3. lead to an entire remodelling of the classical architecture of the SEZ.
Während der vergangenen Jahrzehnte stieg die durchschnittliche Lebenserwartung der Bevölkerung in den westlichen Industrieländern durch die Verbesserung der allgemeinen Lebensbedingungen, insbesondere durch die Fortschritte in der Hygiene und der Medizin sowie stabile politische Verhältnisse, kontinuierlich an. Aufgrund dieser demographischen Entwicklung zu einer zunehmend älter werdenden Gesellschaft nimmt auch das Auftreten von progressiven, altersabhängigen Erkrankungen, wie zum Beispiel der Parkinson‟schen Krankheit zu. Dieser Trend stellt sowohl für die betroffenen Patienten und ihre Angehörigen als auch für die Gesundheits- und Sozialsysteme eine gewaltige und kostenintensive Herausforderung dar. Um wirkungsvolle Therapien entwickeln zu können, die früh im Krankheitsverlauf eingreifen und die Manifestation der Erkrankung verhindern oder verzögern beziehungs-weise die darauf abzielen, die Symptome der Erkrankung nach deren Manifestation zu lindern, ist es unerlässlich, die diesen progressiven, altersabhängigen Krankheiten zugrundeliegenden Mechanismen zu erforschen und entsprechende krankheitsspezifische, molekulare Biomarker zu identifizieren. Darüber hinaus stellt die Identifizierung solcher Biomarker einen wichtigen Ansatzpunkt für die klinische Diagnostik und Therapeutik sowie für die Entwicklung neuer therapeutischer Behandlungsstrategien dar. Das subzellulär vorwiegend präsynaptisch lokalisierte Protein alpha-Synuklein blieb in den Jahren nach seiner Erstbeschreibung 1988 durch Luc Maroteaux von der biomedizinischen Forschung weitgehend unbeachtet. Erst die Assoziationen von unterschiedlichen Mutationen des alpha-Synuklein-Gens mit seltenen, autosomal-dominant vererbten, monogenetischen Varianten der Parkinson‟schen Krankheit (PARK1 und PARK4) seit 1997 sowie die Identifizierung des Proteins im Jahre 1998 als Hauptbestandteil von intrazellulären Proteinaggregaten (Lewy-Körpern und Lewy-Neuriten), deren Vorkommen charakteristisch für progressive, neurodegenerative und unter dem Sammelbegriff „Synukleinopathien“ klassifizierte Erkrankungen (wie beispielsweise auch die häufigen, sporadischen Formen der Parkinson‟schen Krankheit) ist, ließen das alpha-Synuklein in den Fokus der biomedizinischen Forschung rücken. Trotz intensiver Bemühungen der weltweiten Forschungsgemeinschaft konnten seitdem in den vergangenen 13 Jahren die physiologischen Funktionen von alpha-Synuklein und die den unterschiedlichen Synukleinopathien zugrundeliegenden, molekularen pathophysiologischen Mechanismen nicht genau identifiziert werden. Stattdessen führte die intensive Forschung an alpha-Synuklein mit den unterschiedlichsten experimentellen Herangehensweisen und Modellsystemen zu verschiedenen und teilweise kontroversen Hypothesen und Theorien über dessen physiologische Funktion und pathophysiologische Wirkungsweisen. Die in dieser Dissertationschrift dargestellten experimentellen Untersuchungen wurden an zwei speziellen transgenen Mausmodellen durchgeführt, die entweder einen vollständigen Mangel (= „knockout“; KO) des alpha-Synuklein-Proteins oder eine transgene Überexpression von humanem, A53T-mutierten alpha-Synuklein aufwiesen. Das Hauptziel der dargestellten Studien war es, neue Erkenntnisse hinsichtlich der physiologischen Funktionen des alpha-Synuklein-Proteins, beziehungsweise der krankheits-relevanten, pathophysiologischen Mechanismen der den familiären PARK1- und PARK4-Varianten der Parkinson‟schen Krankheit zugrundeliegenden alpha-Synuklein-Mutationen (Substitution von Alanin durch Threonin an Position 53 der Aminosäuresequenz (A53T; PARK1) sowie Überexpression (Genduplikation/-triplikation; PARK4)) zu gewinnen...
In der vorliegenden Arbeit konnte das Subkompartiment der synaptischen aktiven Zone erstmals in der für Proteomstudien erforderlichen Qualität aufgereinigt werden. Nach Präparation des Gesamthirns der Ratte wurden über verschiedene Homogenisations- und Zentrifugationschritte Synaptosomen gewonnen, die durch einen hypoosmotischen Schock zum Platzen gebracht wurden. Der Inhalt, vornehmlich synaptische Vesikel, wurde in einem Saccharosedichtegradienen aufgetrennt. Die Analyse dieses Gradienten bestätigte, dass sich in den unteren, dichteren Fraktionen (Fraktionen 28-34) Elemente synaptischer Vesikel und auch der Plasmamembran befanden. Damit war eine wichtige Grundvoraussetzung für eine nachfolgende Proteomuntersuchung gedockter synaptischer Vesikel erfüllt. Die Analyse dieser Fraktionen durch Western-Blot und mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigte aber auch, dass sie diverse Organellmarker enthielten und insgesamt eine heterogene Zusammensetzung von membranären Strukturen zeigten. Daher folgte als weiterer Aufreinigungsschritt eine immunmagnetische Trennung mit monoklonalen Antikörpern gegen das ubiquitäre integrale Protein synaptischer Vesikel, SV2. Die hohe Reinheit der resultierenden Fraktion gedockter synaptischer Vesikel konnte durch elektronenmikroskopische Analysen und proteinchemische Methoden (2D BAC-/SDS-PAGE und Western Blot) nachgewiesen werden. Die Optimierung der Integrität der verwendeten Proben erlaubte eine funktionelle Zuordnung der durch die hochsensensitiven massenspektrometrischen Analysen identifizierten Proteine. Zur Proteinidentifikation wurden zwei verschiedene Methoden herangezogen: die zweidimensionale BAC-/SDS-PAGE mit anschliessender MALDI-TOF Analyse und die eindimensionale SDS-PAGE mit nachfolgender nanoLC ESI MS/MS. Beide Methoden ergänzten sich; generell wurde über die zweite Methode eine größere Anzahl von Proteinen identifiziert. Durch die Verwendung und Kombination der verschiedenen massenspektrometrischen Methoden und unterstützt durch eine Western Blot Analyse konnten insgesamt 245 Proteine identifiziert werden. Dabei handelte es sich um (i) integrale synaptische Vesikelproteine, (ii) transient mit synaptischen Vesikeln assoziierte Proteine, (iii) Proteine der Plasmamembran und Zelloberfläche, (iv) Signalkaskadenproteine und kleine GTPasen, (v) Proteine des Zytoskeletts, (vi) glykolytische und andere metabolische Enzyme, sowie (vii) Chaperone und (viii) mitochondriale Proteine. Im zweiten Teil der Arbeit wurden ausgewählte Proteine genauer untersucht. Die Analyse der löslichen Proteine WK1 und WK2 zeigten in Genexpressionsstudien eine ubiquitäre Gewebeverteilung. Rekombinante Proteine wurden in Zelllinien exprimiert, um einen Einblick in deren subzelluläre Lokalisierung zu erhalten. Die Expressionsanalyse der integralen Transmembranproteine zeigte für alle Kandidaten eine neuronale Expression der mRNA. Für jeden der Kandidaten wurden individuelle Genexpressionsmuster im Hirn beobachtet. Gegen zwei der Kandidatenproteine konnten funktionelle Antikörper erzeugt werden. Die Immunomarkierung mit anti-Ttyh1-Antikörpern zeigt eine hochspezifische Färbung der Fasertrakte in verschiedenen Hirnarealen sowie eine neuronale Lokalisation in Primärkulturen des Hippokampus und des Neokortex der Ratte. Lingo1-Immunfärbungen markierten selektiv Nervenzellen des limbischen Systems und Mitralzellen des Bulbus olfactorius. Diese Studie führt konsequent die Idee der spezifischen Aufreinigung von Vesikelkompartimenten der Synapse weiter: Mit der Einführung eines hochaffinen immunchemischen Anreicherungsschrittes in dem Aufreinigungsprozess wird dem bisherigen Methodenarsenal zur Spezifizierung der Probe über physiko-chemische Parameter eine neue Dimension hinzugefügt: Die molekulare Identität.
Im adulten Säugerhirn findet Neurogenese in der SVZ der Seitenventrikel kontinuierlich statt. Eine Vielzahl von Signalsystemen steuert in komplexer Weise zelluläre Antworten und reguliert die Proliferation, Differenzierug und Wanderung NSZ. Gegenwärtig ist nur wenig über die zugrundeliegenden Signalwege bekannt. Zunehmend gibt es Hinweise darauf, dass Nukleotide an diesen Prozessen beteiligt sind. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, das die Nukleotide ADPbetaS und UTP in kultivierten NSZ der adulten SVZ einen schnellen Kalziumeinstrom induzieren und die Wachstumsfaktor-vermittelte NSZ-Proliferation steigern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System zur Kultivierung adhärenter adulter NSZ etabliert. Die Untersuchungen zeigen, dass adulte NSZ eine Vielzahl an P2Y- und P2X-Rezeptoren, sowie die Nukleotid-hydrolysierenden Enzyme NTPDase2 und TNAP exprimieren. Untersuchungen der ADPbetaS-, UTP- und EGF-vermittelten Signalwege zeigen, dass alle drei Agonisten eine ERK1/2- und CREB-Phosphorylierung induzieren, wobei sich die zeitlichen Charakteristika zwischen den Nukleotiden und EGF unterscheiden. Inhibierungsexperimente geben Einblicke in die dabei aktivierten Signalkaskaden und weisen auf eine ADPbetaS-induzierte Transaktivierung des EGF-Rezeptors hin. Während UTP über den P2Y2-Rezeptor wirkt, übt ADPbetaS seine Funktion über den P2Y1- und P2Y13-Rezeptor aus. Die Daten implizieren zudem, dass Nukleotide und EGF gleiche Zielproteine über verschiedene Signalwege induzieren und dass sie das Potenzial besitzen, bei der Kontrolle der Zellproliferation in der adulten Neurogenese synergistisch zu agieren. Vergleichende Analysen mit kultivierten NSZ aus Wildtyp-, P2Y1- und P2Y2-Rezeptor-Knockout-Mäusen belegen ein verändertes Antwortverhalten in Gegenwart von ADPbetaS, UTP und EGF und lassen kompensatorische Mechanismen vermuten. Die Resultate dieser Arbeit demonstrieren zudem, dass ATP, ADPbetaS, UTP und EGF die Migration von NSZ induzieren. Parallel dazu konnten Veränderungen des Aktinzytoskelletes, wie die Zunahme an F-Aktin, die Bildung von Stressfasern und eine Veränderung der Zellmorphologie gezeigt werden. Diese Prozesse gehen mit einer Aktivierung der Proteinkinasen Akt und FAK einher. Die Daten weisen darauf hin, dass Nukleotide und EGF für die Zytoarchitektur der SVZ und die Wanderung von Neuroblasten zum OB eine wichtige Rollen spielen könnten.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Bindeeigenschaft des synaptischen Vesikelproteins SV31 zu den divalenten Metallionen Zn2+, Ni2+ sowie Cu2+ nachgewiesen und reproduziert werden. Die Bindung an Zn2+ wurde dabei sowohl in vitro an der Sepharosesäule als auch in vivo in NGF-differenzierten PC12-Zellen bestätigt (3.2.1 - 3.2.3). In einer Kollaboration mit dem Max-Planck-Institut für Biophysik wurde des Weiteren eine mögliche Zinktransportfunktion von SV31 untersucht. Dafür wurde die Ladungstranslokation durch myc-SV31-enthaltene CHO-Zellmembranen nach Zinkzugabe gemessen (3.2.5). Weiterhin konnte durch subzelluläre Fraktionierung von PC12-Zellen ein Verteilungsmuster des neuen Proteins in Mikrosomen unterschiedlicher Dichte dokumentiert werden. Durch die andauernde Expression von SV31-RFP in stabil transfizierten PC12-Zellen kommt es außerdem zur Beeinflussung des Expressionsmusters zahlreicher Markerproteine und damit einhergehend zu einer Dichteverschiebung somatischer Organellen (3.3.1 - 3.3.3). Kolokalisationsstudien von SV31 mit Markerproteinen zahlreicher Zellorganellen ergaben partielle Fluoreszenzüberlagerungen mit synaptischen Vesikelproteinen sowie eine Anreicherung von SV31 in Nähe der Plasmamembran. In diesem Zusammenhang zeigt sich ebenfalls eine Übereinstimmung der Lokalisation von SV31 mit den SNAREProteinen SNAP25 und Syntaxin1A (3.4.1 - 3.4.3). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erweitern nicht nur das Wissen um die funktionellen Eigenschaften von SV31, sie geben auch Anlass zum Nachdenken über mögliche Interaktionspartner des neuen Vesikelproteins. Die Fähigkeit zur Zinkbindung und -akkumulation auf präsynaptischer Seite rückt SV31, im Hinblick auf neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, auch in einen medizinisch relevanten Kontext. Durch Deduktion der hier aufgezeigten Ergebnisse entsteht ein erweitertes Verständnis der Relevanz von SV31 als funktionelle, zinkbindende Einheit im Rahmen der synaptischen Transmission.
Das Applikationssystem Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein innovatives System für die Applikation von Pharmaka während elektrophysiologischer Experimente entwickelt und getestet. Das AchtkanalApplikationssystem eignet sich hervorragend für Experimente an Hirnschnitten und kann durch folgende Eigenschaften charakterisiert werden: - Das System ist durch die Verwendung von DruckluftVentilen nahezu frei von elektromagnetischen Störfeldern. - Aufgrund der geringen Dimensionen der Applikationspipette (Spitzendurchmesser = 250 µM) können gezielt unterschiedliche Regionen einer Zellkultur oder eines Hirnschnittes beeinflusst werden. - Die geringen Dimensionen des Systems ermöglichen einen kostengünstigen Betrieb, da nur kleine Mengen an Pharmaka benötigt werden. - Das System schaltet exakt und zuverlässig. Alle 8 Kanäle schalten in guter Übereinstimmung, und zwischen den einzelnen Kanälen kann dank eines zentralen Spülkanals akkurat und sicher gewechselt werden. - Mit dem System können Substanzen auf zwei Arten appliziert werden. Es besteht zum einen die Möglichkeit der sogenannten SpitzenApplikation. Die SpitzenApplikation eignet sich besonders für Experimente an Zellkulturen, isolierten Zellen oder Membranstücken, und zeichnet sich bei dieser Art der Anwendung durch einen schnellen Konzentrationsaufbau (< 1 s) aus. Weiterhin können Substanzen mittels der sogenannten PulsApplikation appliziert werden. Die PulsApplikation bietet einerseits den Vorteil einer kontinuierlichen Applikation ohne Druckschwankungen, und ermöglicht andererseits die schnell aufeinanderfolgende Applikation mehrerer Substanzen. Demgemäß eignet sich die PulsApplikation hervorragend für Experimente an Hirnschnitten. Ionotrope GlutamatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war eine tiefergehende Beschreibung der ionotropen, nonNMDARezeptoren bei Neuronen der LSO des auditorischen Hirnstammes der Ratte. Im Vergleich hierzu wurden entsprechende Untersuchungen auch an MNTBNeuronen durchgeführt. Von besonderem Interesse war dabei der Nachweis funktioneller Kainat Rezeptoren. Im Gegensatz zu RNA oder ProteinNachweisen einzelner Rezeptor Untereinheiten wurden funktionelle Rezeptoren elektrophysiologisch, mit Hilfe der Patch ClampTechnik, charakterisiert. Mit Hilfe von spezifischen Agonisten, Antagonisten und Modulatoren konnten folgende Sachverhalte nachgewiesen werden: - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle AMPARezeptoren. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR2 ist Bestandteil von AMPARezeptoren bei LSONeuronen. - Funktionelle AMPARezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Abschnitt der Entwicklung ist die Größe der AMPA Rezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere. - LSO und MNTBNeurone exprimieren funktionelle KainatRezeptoren. - Im Hinblick auf die KainatRezeptoren gibt es jeweils zwei Klassen von LSO bzw. MNTBNeuronen. LSONeurone lassen sich in eine Klasse, die sich durch schnelle KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, und eine Klasse, die sich durch langsame KainatRezeptor vermittelte Ströme auszeichnet, unterteilen. Den beiden Klassen liegen sehr wahrscheinlich unterschiedliche Rezeptordichten und / oder Unterschiede in der Untereinheitenzusammensetzung zugrunde. MNTBNeurone lassen sich in Zellen, die KainatRezeptoren besitzen, und Zellen, die diesen Typ von Rezeptor nicht besitzen, unterscheiden. - Die GlutamatRezeptor Untereinheit GluR5 ist Bestandteil von KainatRezeptoren bei LSO und MNTBNeuronen. - Funktionelle KainatRezeptoren werden zwischen P3 und P10 von LSO und MNTB Neuronen exprimiert. In diesem Zeitraum ist die Größe der KainatRezeptor vermittelten Ströme unabhängig vom Alter der Tiere.
In the present study the cryo-immunogold technique was used and optimized for investigating the ultrastructure and immunolabeling of synaptic proteins. It is evidently a suitable method for the localization of membrane proteins since the antigens are not treated with any chemical denaturation before immunolabeling except for the fixation and since the antigens are directly exposed to the surface of the cryo-ultrasections. The v-SNARE VAMP II and the vesicle-associated proteins SV2 and Rab3A were detected extensively at small vesicles in the mossy fiber terminals. The t-SNARE SNAP-25, and N-type and P/Q type Ca2+ channels were allocated to the plasma membrane both at the active zone and outside the active zone. SNAP-25 and N-type Ca2+ channels appeared also at synaptic vesicles. A significantly increased immunolabeling of VAMP II, SV2, Rab3A, SNAP-25 and N-type Ca2+ channels was found at the active zones of fast synapses, indicating a concentration of these proteins at sites of exocytosis. The widespread distribution of the t-SNARE SNAP-25 at the axonal plasma membrane reveals that membrane-targeting specificity cannot be determined solely by v/t-SNARE interactions. Additional control components are required to assure the docking and exocytosis of the synaptic vesicles at active zones. The novel protein Bassoon was only found at active zones of central synapses and showed the highest specific labeling among all proteins investigated. Its labeling pattern implies an association of Bassoon with the presynaptic dense projections, the structural guide for vesicle exocytosis. The involvement of Bassoon in the organization of the neurotransmitter release site suggests that Bassoon may play an important role in determining the specificity of vesicle docking and fusion. In the neurosecretory endings of neurohypophysis the synaptic proteins VAMP II, SNAP- 25, SV2, Rab3A, and the N-type Ca2+ channels showed a preferential labeling over microvesicles. Moreover, the immunolabeling intensity of these proteins over microvesicles corresponded closely to that over synaptic vesicles. This suggests that these synaptic proteins share an identical association with synaptic vesicle and microvesicles. A significant labeling of SNAP-25, the N-type Ca2+ channels and VAMP II was also detected at the plasma membrane near the clustered microvesicles, indicating the competence of microvesicles for docking and exocytosis along the plasma membrane in the absence of active zones. No significant labeling of VAMP II, SNAP-25, SV2 and N-type Ca2+ channel was observed at the membrane of neurosecretory granules. This is in agreement with the notion that synaptic vesicles and microvesicles possess regulatory mechanisms for exocytosis different from those of granules. In contrast, a/ß-SNAP and NSF were found on the granules, and Rab3A and the P/Q-type Ca2+ channels on granules in a subset of terminals. Rab3A is associated specifically with the oxytocin-containing granule population. Interestingly, some plasma membrane proteins, such as SNAP-25 and even N-type Ca2+ channels and P/Q-type Ca2+ channels, were observed not only at the plasma membrane but also at the vesicular organelles. This suggests that these vesicular organelles may be involved in transporting newly synthesized proteins from the soma to the plasma membrane of the terminal. Furthermore, the vesicular pool of the Ca2+ channels may serve in the stimulationinduced translocation into the plasma membrane when required. Using the conventional preembedding method with Epon and the post-embedding method with LR Gold, VAMP II was localized at vesicular organelles of varying size and on horseradish peroxidase filled endocytic organelles in cultured astrocytes, with and without stimulation in the presence of the horseradish peroxidase. This indicates that VAMP II is involved in the cycle of vesicular exocytosis and endocytosis in astrocytes. U373 cells are capable of expressing all three members of the synaptic SNARE complex (v-SNARE VAMP II, t-SNARE syntaxin I and SNAP25). This indicates the competence of U373 to carry out regulated exocytosis by means of the classical SNARE mechanism. In addition, the ubiquitous v-SNARE cellubrevin and the endosome-associated small GTPbinding protein Rab5 could be expressed in U373 cells. All recombinant synaptic proteins investigated in U373 cells revealed a punctuate cellular distribution under the fluorescence microscope, suggesting that they are mainly associated with intracellular compartments. The cryo-electron microscopy provided direct evidence for the association of all expressed proteins with electron-lucent vesicular organelles. It further supports the potential of U373 MG cells to release low molecular weight messengers by a regulated exocytosis mechanism. In addition, myc-VAMP II was found on dispersed granules. Probably, VAMP II also participates in the exocytosis event of granules in U373 cells. Gold labeling for the two presumptive t-SNAREs syntaxin I and SNAP-25 in U373 cells was confined to the vesicular organelles. At the ultrastructural level no significant labeling was identified at the plasma membrane. The high level of colocalization of the two SNARE proteins VAMP II and syntaxin I in the cell body and in cell processes suggests that the two proteins are mostly sorted into identical vesicular organelles. A partial colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was observed under the fluorescence microscope. At the ultrastructural level, a colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was found on some clustered vesicles. The partial colocalization of VAMP II and cellubrevin implies that they similarly function as v-SNAREs. The partial colocalization of Rab5 with VAMP II in U373 cells suggests that the endosomal protein Rab5 is associated with VAMP II-containing organelles during some stages of their life cycle.
Das sympathische Nervensystem entsteht aus Vorläuferzellen der Neuralleiste, die an die dorsalen Aorta gelangen und dort die primären sympathischen Ganglien bilden. Der Entwicklungsverlauf dieser Zellen hängt von den Signalen ab, welche sie während ihrer Wanderung empfangen. Die Differenzierung der Vorläuferzellen wird an der dorsalen Aorta angeregt. Als Signalmoleküle dienen die BMPs, die von der dorsalen Aorta gebildet und sezerniert werden. Die BMPs induzieren in den Vorläuferzellen die Expression der Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, die notwendig für den weiteren Differenzierungsprozess sind. Diese Transkriptionsfaktoren steuern direkt oder indirekt die Expression der terminalen Differenzierungsgene TH, DBH, SCG10 und NF160. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren Gata2 und Gata3 ebenfalls eine essentielle Funktion in der Entwicklung sympathischer Neurone ausüben. Im Huhnembryo wird, im Gegensatz zur Situation in der Maus, in den sympathischen Vorläuferzellen nur Gata2 exprimiert. Gata2 wird nach den Transkriptionsfaktoren Mash1, Phox2b, Hand2 und Phox2a, jedoch vor den noradrenergen Markergenen TH und DBH exprimiert. Die Expression von Gata2 ist BMP-abhängig, wie durch BMPÜberexpression und BMP-Funktionsblockierung gezeigt wird. Die Überexpression von Mash1, Phox2b und Hand2 in Vorläuferzellen führt zur Expression von Gata2. In der Phox2b-Nullmutante sind Gata2 und Gata3 nicht exprimiert. Damit ist Gata2/3 unterhalb von Mash1, Phox2b und Hand2 in der BMP-induzieren Signalkaskade einzuordnen. Die Funktionsblockierung von Gata2 im Huhnembryo und die Eliminierung des Gata3-Gens in der Maus ergaben eine starke Reduktion in der Größe der sympathischen Ganglien. Zusätzlich war die Expression des noradrenergen Markergens TH stark reduziert. Die Überexpression von Gata2 in Neuralleistenvorläuferzellen führt vorwiegend zur Entstehung von Neuronen, die keine autonomen Eigenschaften aufweisen und TH-, Phox2b- und Mash1-negativ sind. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Gata2 im Huhn und Gata3 in der Maus Mitglieder des regulatorischen Netzwerks von Transkriptionsfaktoren sind, das essentiell für die Entwicklung sympathischer Neurone ist. Die Funktion der Gata-Faktoren in der noradrenergen Differenzierung autonomer sympathischer Neurone scheint jedoch von der Interaktion mit Koregulatoren abhängig zu sein, die in sympathischen Vorläuferzellen vorhanden sind. In Vorläuferzellen, welche diese Kofaktoren nicht erhalten, induziert Gata2 nahezu ausschließlich nicht-adrenerge Neurone. Gata2 könnte mit Phox2a/b und Hand2 interagieren, oder mit anderen unbekannten Faktoren die in den sympathischen Vorläuferzellen exprimiert sind. Die Entwicklung sympathischer und parasympathischer Neurone wird von BMPs sowie von den Transkriptionsfaktoren Mash1 und Phox2b gesteuert. Der Differenzierungsprozess in sympathischen und parasympathischen Ganglien führt zu unterschiedlichen Transmitterphänotypen. Sympathische Ganglien bestehen vorwiegend aus noradrenergen, parasympathische Ganglien dagegen aus cholinergen Neuronen. Hand2 wird in sympathischen Neuronen und nicht in parasympathischen Ziliarneuronen exprimiert und gilt als Transkriptionsfaktor der den noradrenergen Transmitterphänotyp spezifiziert. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass auch die Transkriptionsfaktoren Gata2/3 nicht in parasympathischen Ziliarganglien exprimiert werden. Die Expressionsanalysen an mehreren parasympathischen Ganglien zeigte jedoch, dass die Expression von Gata2/3- nicht vollständig mit der noradrenergen Genexpression korreliert. Die Analyse der Gata2/3- Expression im Locus ceoruleus, dem wichtigsten noradrenergen Zentrum im Gehirn ergab, dass Gata2 und Gata3 im LC des Huhnembryos nicht exprimiert werden. Die Expression von Gata2/3 hängt somit nicht zwingend mit den noradrenergen Phänotyp zusammen. Die selektive Funktion von Gata2/3 in der Entwicklung peripherer noradrenerger Neurone zeigt zudem, dass der noradrenerge Phänotyp in den peripheren und zentralen Neuronen unterschiedlich reguliert wird.
Die Rolle des cAMP/CREB-Signalwegs in der noradrenergen Differenzierung sympathischer Nervenzellen
(2006)
Um die sympathische Differenzierung in Abwesenheit von CREB zu untersuchen, wurden zunächst Embryonen von CREB-Null-Mäusen analysiert. In diesen Mäusen wiesen die sympathischen Ganglien an Embryonaltag E10,5 und E12 keine Unterschiede in der Differenzierung zu heterozygoten und wildtyp-Ganglien auf. Es wurde deshalb vermutet, dass die mit CREB interagierenden Transkriptionsfaktoren CREM und ATF1 den Verlust von CREB im sympathischen Ganglion funktionell kompensieren. Da Mäuse mit einem Knock-out von CREB und CREM bereits vor E10 sterben, konnte die Entwicklung sympathischer Ganglien in diesen Mäusen nicht weiter untersucht werden. Durch Immunfärbung gegen ATF1 in CREB-deletierten Mäusen und in situ-Hybridisierung gegen CREM und ATF1 wurde gezeigt, dass im Rumpf der CREB-KO-Maus keine drastische Hochregulation der Expression beider Gene stattfindet. Eine geringfügige Hochregulation konnte aber nicht ausgeschlossen werden kann. Um die cAMP/CREB-Signaltransduktion in Ganglienvorläuferzellen auszuschalten, und Kompensation durch CREM und ATF1 zu umgehen, wurden die dominant-negative Effektoren ACREB und PKA-R(I)mut verwendet. ACREB blockiert die Funktion von CREB, CREM und ATF1 (Ahn et al., 1998). Durch PKA-R(I)mut sollte die Aktivität von PKA inhibiert werden. Die Funktionalität beider Effektoren wurde in differenzierenden Zellkulturen bestätigt. Um in vivo geeignete Expression der Inhibitoren zu erzielen, wurden verschiedene Methoden des Gentransfers im Huhnembryo erprobt. Durch Infektion der Neuralplatte des Embryos mit Retroviruskonzentrat konnte frühe embryonale Expression der dominant-negativen Effektoren in Neurallleistenzellderivaten erzielt werden. Die Expression von ACREB im Embryo zeigte, dass CREB in der initialen adrenergen Differenzierung bis E4 erforderlich ist, die sympathischen Ganglien wiesen reduzierte adrenerge Genexpression auf. In späteren Embryonalstadien ist dieser Effekt nicht mehr nachzuweisen. Im Gegensatz zur Inhibition von CREB, hatte die Inhibition von PKA durch PKAR(I)mut keine Auswirkungen auf die Ganglienentwicklung in vivo. Durch pharmakologische Inhibition von PKA wurden kleinere Ganglien erzielt, ein selektiver Effekt auf die adrenerge Differenzierung wurde auch in diesem in vivo Experiment nicht beobachtet. Dies widerspricht den Hinweisen aus Zellkultur auf die selektive Funktion von PKA in der adrenergen Differenzierung. Der Befund, dass die Funktion von CREB in vivo auf die initiale adrenerge Differenzierung sympathischer Neurone beschränkt ist, und nicht für den Erhalt adrenerger Differenzierung erforderlich ist, wurde in vitro in differenzierten sympathischen Neuronen des Embryo bestätigt. ACREB und PKA-R(I)mut hatten keine bzw. nur geringe Auswirkungen auf den Anteil TH-positiver Neurone in Kulturen sympathischer Neurone aus Embryonen der Embryonaltage E7 und E12. Somit konnte erstmals in vivo eine physiologische Rolle für CREB in der Differenzierung sympathischer Neurone gezeigt werden: CREB ist für die initiale Expression von TH erforderlich.
ATP ist ein weit verbreitetes Signalmolekül im ZNS. Seine Hauptfunktionen betreffen die präsynaptische Modulation der Transmitterfreisetzung und die schnelle exzitatorische Transmission. Die Aktivierung ionotroper P2X-Rezeptoren durch ATP beinhaltet den Einstrom von Kalzium in die Zelle. Unter pathologischen Bedingungen, wie bei Epilepsie oder Ischämie, ist die ATP-Freisetzung erhöht und könnte einen neuronalen Zelltod induzieren. Eine anhaltender Aktivierung von NMDA-Rezeptoren und der dadurch erhöhte Einstrom von Kalzium in die Zelle stellt dabei den primären Effektor der Neurotoxizität dar. Dieses, als Exzitotoxizität bezeichnete Phänomen, ist an vielen neurologischen Krankheiten beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von ATP und anderen Purin- und Pyrimidin-Nukleotiden und von Adenosin auf die Überlebensrate von Neuronen bei induzierter Toxizität in hippokampalen Primärkulturen untersucht. Neurotoxizität wurde durch die Applikation der Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA (30 μM) oder Kainat (300 μM) und durch Applikation von KCl (30 mM) induziert. Purin- und Pyrimidin-Nukleotide wurden in verschiedenen Konzentrationen von 10 μM – 1000 μM koappliziert. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensrate der Neurone mit der Methode des Neuronen-spezifischen zellulären ELISA quantifiziert. Applikation von NMDA reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 56 ± 3%. Der NMDARezeptor-Antagonist MK-801 verhinderte die NMDA-induzierte Toxizität. Die Koapplikation von ATP (0,01-1 mM) schwächte die zytotoxischen Wirkung von NMDA konzentrationsabhängig ab. Die Purine ITP und GTP zeigten ebenfalls eine protektive Wirkung und reduzierten die NMDA-induzierte Toxizität, wohingegen die Pyrimidin-Nukleotide UTP und CTP keinen protektive Wirkung zeigten. Weitere getestete P2-Rezeptor-Agonisten, wie ADP, AMP, Adenosin, α,β-meATP, 2MeSATP, das Dinukleotid Ap4A, α,β-meADP und BenzoylATP waren unwirksam. Der P2-Rezeptor-Antagonist Reactive Blue 2 (100 μM) inhibierte die Wirkung von ATP. Suramin und PPADS (100 μM) verhinderten die protektive Wirkung von ATP nicht. Applikation von Kainat reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 37 ± 0,3%. Der Antagonist CNQX (100 μM) verhinderte die Kainat-induzierte Toxizität. Weder ATP noch GTP zeigten eine protektive Wirkung nach Kainat-induzierter Toxizität. Dies steht im Gegensatz zu ihrer protektiven Wirkung nach NMDA-vermittelter Toxizität. Applikation von KCl reduzierte den Anteil lebender Zellen auf 61 ± 4%. Die Purin- und Pyrimidin-Nukleotide (1 mM) zeigten bei K+-Depolarisation ein völlig anderes Wirkungsspektrum als bei Applikation von NMDA: GTP > ITP > ATP > ADP > CTP > α,β-meATP > UTP > AMP. 2MeSATP, α,β-meADP, Ap4A, BenzoylATP und Adenosin veränderten die Überlebensrate der Zellen nach KCl-induzierter Toxizität nicht. Weder Suramin noch PPADS (100 μM) inhibierten die protektive Wirkung von ATP. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die protektive Wirkung von ATP, GTP und ITP weder P2- noch Adenosin-Rezeptor-vermittelt war. Zudem schienen sie spezifisch für eine NMDARezeptor-vermittelte Toxizität, da ATP und GTP nach Kainat-Applikation keine Wirkung erzielten und die alleinige Applikation der verwendeten P2-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten (Kontrollen) keine Wirkung auf das Überleben von Neuronen hatte. Deshalb wurde eine direkte Inhibition des NMDA-Rezeptors durch ATP postuliert. In einer Kooperationsarbeit führte Dr. Bodo Laube vom Max-Planck-Institut für Hirnforschung in Frankfurt am Main elektrophysiologische Messungen an Oozyten und hippokampalen Neuronen zur Bestätigung dieser Hypothese durch. ATP inhibierte in Oozyten NMDA-induzierte Einwärtsströme kompetitiv durch Bindung an die NR2B-Rezeptor-Untereinheit. ITP, GTP, AMP waren an dieser rekombinanten NR1/NR2BRezeptorkombination ebenso effektiv, wohingegen UTP, CTP, ADP und Adenosin nur schwache inhibitorische Wirkungen zeigten. In kultivierten hippokampalen Neuronen inhibierte ATP auch NMDA-induzierte Ströme, nicht jedoch Kainat-induzierte Ströme. Die Expression der beiden NMDA-Rezeptor-Untereinheiten NR1 und NR2B wurde durch immunzytochemische Untersuchungen in den hippokampalen Neuronen bestätigt. Die Resultate zeigten, daß ATP direkt NMDA-Rezeptoren mit einer bestimmten Untereinheitenzusammensetzung inhibierten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, daß ATP und andere Purinund Pyrimidin-Nukleotide durch Inhibition des NMDA-Rezeptors neuroprotektive Wirkungen vermitteln können. Dies ist eine neue Funktion von ATP zu der bereits beschriebenen direkten Aktivierung von postsynaptischen P2X-Rezeptoren und zu seiner Rolle als eine extrazelluläre Quelle des synaptischen Modulators Adenosin an glutamatergen Synapsen.