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g/d TLymphozyten stellen beim Menschen ca. 15% der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten. Die physiologische Funktion der g/d TZellpopulation ist ungeklärt. Auf grund ihrer Akkumulation in mukosalen Oberflächen scheinen sie eine Komponente der ''ersten Verteidigungslinie" zu bilden. Das d TZell Rezeptor (TCR) Repertoire gesunder Erwachsener ist oligoklonal, streng individuenspezifisch und zeitlich stabil. Zudem besteht eine charakteristische Kompartimentierung, d.h. im Intestinum liegt ein anderes d TCRRepertoire vor als im peripheren Blut. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob das intestinale d TCRRepertoire einer entwicklungsabhängi gen Dynamik unterliegt. Hierzu wurde die Diversität der antigenbindenden (CDR3) Domäne intestinaler dKettentranskripte von Feten, Neugeborenen, Kindern und Erwachsenen mittels denaturierender PAGE und DNASequenzierung molekular biologisch analysiert. Unsere Studien dokumentieren, daß im Verlauf der Reifung vom Fetus zum adulten Individuum gravierende Veränderungen stattfinden. Das fetale d TCRRepertoire ist stark eingeschränkt und zeichnet sich durch niedrige Komplexität der dKettentrans kripte aus was darauf beruht, daß innerhalb der CDR3Domänen kaum matrizen unabhängige ''N"Nukleotide existieren und zudem homologieabhängige Rekombina tionsereignisse stattfinden. Die Tatsache, daß verschiedene Feten teilweise identi sche dKettentranskripte exprimieren kann jedoch nicht allein auf obige Mechanis men zurückgeführt werden. Somit bleibt unklar, ob das fetale d TCRRepertoire vorprogrammiert ist oder Selektionsprozessen unterliegt. Im Gegensatz zu Feten ist das d TCRRepertoire Neugeborener polyklonal. Wie bei Erwachsenen weisen die CDR3Domänen ihrer dKettentranskripte zahlreiche ''N"Nukleotide auf. Da das d TCRRepertoire bereits im Alter von 14 17 Jahren starke Einschränkungen seiner Diversität zeigt und mit demjenigen siebzigjähriger Personen vergleichbar ist wird angenommen, daß die klonalen Expansionen eine Folge kontinuierlicher Selektions prozesse darstellen, die z.B. durch HSP verwandte Eigenantigene vermittelt werden. Vergleichbar dem Intestinaltrakt bildet auch die Haut eine bedeutende Grenzfläche des Organismus zu seiner Umgebung. Möglicherweise spielen kutane g/d TZellen ebenfalls eine Rolle im Rahmen einer ''ersten Verteidigungslinie". Wir wiesen anhand gesunder Erwachsener nach, daß das kutane d TCRRepertoire analog zum Intesti num oligoklonal ist und sich signifikant vom peripheren d TCRRepertoire unter scheidet. Da in multiplen Hautbiopsien identische dKettentranskripte gefunden wer den, sind dominante g/d TZellklone offenbar weiträumig in der Haut verteilt. Weiterhin wurde untersucht, ob spezifisch aktivierte g/d TLymphozyten an der Patho genese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt sind. Im Fall der ange nommenen antigenvermittelten Aktivierung müßten klonale Expansionen einzelner g/d TZellpopulationen zu charakteristischen Verschiebungen des d TCRRepertoires innerhalb entzündlich veränderter Darmareale führen. Vergleichende Analysen der läsionalen und nichtläsionalen Darmabschnitte von M.CrohnPatienten lassen jedoch keine krankheitsassoziierten Repertoireverschiebungen erkennen. Vielmehr weisen entzündliche und nichtentzündliche Areale nahezu identische d TCRRepertoires auf. Da dies auch im Fall der bakteriell verursachten Divertikulitis gilt, werden g/d TLym phozyten vermutlich generell indirekt oder über TCRunabhängige Mechanismen (z.B. Zytokine) aktiviert. Alternativ wird eine Erkennung streßinduzierbarer Eigenanti gene durch intestinale g/d TZellen diskutiert. Beide Vorgänge würden zu keiner Beeinflussung des d TCRRepertoires führen und in Einklang mit den nachgewiese nen Expansionen einzelner weniger Rezeptorspezifitäten stehen. Da vermutlich auch die BLymphozyten der intestinalen Lamina propria an der ''ers ten Verteidigungslinie" beteiligt sind nahmen wir an, daß die Ig H Transkripte IgA bzw. IgM exprimierender BZellen ebenfalls Einschränkungen ihres Rezeptor Repertoires aufweisen. Wir fanden, daß die kleinen V H 5, V H 6 und V H 7Familien intestinaler B Zellen oligoklonale Expansionen zeigen, während das Repertoire der dominierenden V H Familien deutlich diverser ausfällt. Durch Subklonierung lassen sich jedoch bei sämtlichen VH Familien klonal verwandte IgATranskripte in weit voneinander ent fernten Darmabschnitten identifizieren. Zudem stellen ~ 75% aller Basensubstitutio nen stille Mutationen dar oder führen zum Ersatz durch Aminosäuren vergleichbarer Eigenschaften, was auf einen starken Selektionsdruck schließen läßt. Da kaum Hin weise auf Isotypwechsel vorliegen, stellen intestinale IgM und IgAImmunozyten ver mutlich divergente Zellinien dar. Das V H Repertoire peripherer BZellen ist stark limitiert, wobei kaum Überlappungen mit intestinalen IgVH Repertoires bestehen. Aufgrund der partiellen Einschränkung des V H Repertoires ist anzunehmen, daß Teile der humoralen Immunabwehr konservierte Antigene erkennen, wobei es sich im Gegensatz zu TZellen wahrscheinlich nicht um Eigenantigene, sondern um Oberflächenstrukturen symbiontischer Mikroorganismen handelt. Unsere Resultate zeigen, daß die Begrenzung des Rezeptor Repertoires ein Charak teristikum von B und TLymphozyten darstellt. Übereinstimmend hiermit wurden von anderen Arbeitsgruppen klonale Expansionen auch bei a/b TZellen nachgewiesen. Vermutlich wird die Expansion einzelner Zellklone durch permanente Wechselwirkun gen mit ''Schlüsselantigenen" induziert, wobei es sich um invariante Fremdantigene oder konservierte Eigenantigene handeln dürfte.
Osteoarthrose ist eine degenerative Gelenkerkrankung, die in einem schleichenden Prozeß zur Zerstörung des Knorpels in den gewichttragenden Gelenken insbesondere der Hüfte und des Knies führt. Chronische Behinderungen sind die Folge. Die hohe Prävalenz in der vorwiegend älteren Bevölkerung hat zur Bezeichnung als Volkskrankheit geführt. Die genauen Ursachen der Osteoarthrose sind weitgehend unbekannt, jedoch wird davon ausgegangen, daß eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen anabolen und katabolen Prozessen, die am normalen Knorpelmetabolismus beteiligt sind, zugunsten des Katabolismus stattfindet. Ein Charakteristikum der Krankheit ist die verstärkte Degradation des Proteoglykans Aggrekan, einem der Hauptbestandteile der Knorpelmatrix. Dafür verantwortlich ist besonders im frühen Krankheitsstadium die Enzymaktivität ''Aggrekanase", in späteren Phasen sind auch verschiedene MatrixMetalloproteasen (MMPs) beteiligt. Die Enzymaktivität Aggrekanase blieb lange Zeit unentdeckt und wurde unter den Mitgliedern der MMPFamilie vermutet. Jedoch weisen MMPs und Aggrekanase eine unterschiedliche Spezifität für Aggrekan auf, da MMPs die interglobuläre Domäne des Aggrekans bevorzugt zwischen N 341 und F 342 spalten (MMPSchnittstelle), Aggrekanase dagegen nur zwischen E 373 und A 374 (Aggrekanase Schnittstelle). Daß es sich bei MMPs und Aggrekanase um distinkte Aktivitäten handelt, zeigt die jüngste Klonierung zweier Aggrekanasen, die der Familie der ADAMTSProteasen angehören. Trotz der Identifikation dieser zwei Aggrekanasen, die über eine Metalloprotease, Disintegrin und ThrombospondinDomäne verfügen, sind viele EnzymCharakteristika noch ungeklärt, und auch die Frage, welches dieser beiden Enzyme oder welches noch unentdeckte Enzym in der Pathophysiologie der Osteoarthrose die bedeutendste Rolle spielt, ist noch offen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung der noch weitgehend ungeklärten Substratspezifität der Aggrekanase. Besonderes Interesse bestand in der Frage, welche minimalen Anforderungen ein Substrat erfüllen muß, um von Aggrekanase als solches akzeptiert zu werden, da Hinweise existieren, daß kurze Peptide, die die Schnittstelle in nativem Aggrekan repräsentieren, nicht als AggrekanaseSubstrat erkannt und gespalten werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß tatsächlich Sequenzbereiche des Aggrekans distal zur AggrekanaseSchnittstelle für eine effiziente Spaltung durch Aggrekanase notwendig sind. Durch Mutations und Deletionsstudien mit einem funktionalen rekombinanten Substrat, das die gesamte interglobuläre Domäne des Aggrekans mit der AggrekanaseSchnittstelle beinhaltet, wird gezeigt, daß die Substratregion der MMPSchnittstelle, insbesondere deren N terminale Hälfte, wichtig ist für eine effiziente Spaltung an der AggrekanaseSchnittstelle 32 Aminosäuren weiter Cterminal. Dieses Ergebnis weist auf die Möglichkeit hin, Aggrekanase trete über eine zweite, von der eigentlichen Schnittstelle distinkten Interaktionsstelle mit dem Substrat in Wechselwirkung. Diese Substratspezifität ist in verschiedenen zellulären und nicht zellulären sowie rekombinanten AggrekanaseSystemen reproduzierbar und somit für Aggrekanase charakteristisch. Die membrangebundene MMP14, die unter bestimmten Bedingungen in der Lage ist, eine Proteolyse der AggrekanaseSchnittstelle zu erzeugen, teilt diese Eigenschaft nicht und ist deshalb als Kandidat für die pathologische Aggrekanase Aktivität unwahrscheinlich. Desweiteren wurde die Rolle der Substratglykosylierung für die Degradation durch Aggrekanase untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß die N und OGlykosylierungen des rekombinanten Substrats dessen Spaltung durch Aggrekanase negativ beeinflussen. Einen zusätzlichen Aspekt der AggrekanaseCharakterisierung stellt die Inhibition der Enzymaktivität durch das Mukopolysaccharid Heparin dar. Heparin bindet vermutlich an Enzymdomänen außerhalb der katalytischen Domäne und hemmt so die für eine effiziente Spaltung nötigen Interaktionen zwischen diesen Domänen und dem Substrat. Die Charakterisierung der Enzymaktivität Aggrekanase, die in dieser Arbeit beschrieben ist, führt zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Aggrekan Degradation und kann zur Entwicklung neuer Ansätze zur Inhibition des Enzyms im Zuge der Osteoarthrosebekämpfung beitragen.