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Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
In dieser Arbeit wurden Interaktionen zwischen Tumorzellen und Fibroblasten und die Rolle von MMPs auf Tumorwachstum und Invasion untersucht. Die Studien erfolgten in dem in vitro Modell der organotypischen Zellkulturen, in dem eine Haut-ähnliche Situation rekonstruiert wird. Hierbei wachsen maligne Epithelzellen auf einer extrazellulären Matrix (Kollagen Typ I) in enger Nachbarschaft zu hierin eingebetteten Fibroblasten und bilden ein mehrschichtiges Epithel. Dabei sind Epithelien von malignen Keratinozyten durch ein Fehlen einer definierten Struktur und Polarität charakterisiert. Im HaCaT-Tumormodell konnte der essentielle Beitrag des Tumorstromas zur Tumorprogression nachgewiesen werden da eine Steigerung der Malignität von HaCaT-Tumorzellen bis hin zur Metastasierung nur durch Wachstum in der in vivo Umgebung der Nacktmaus nicht aber durch Selektion in vitro induzierbar war. In der vorliegenden Arbeit wurden humane Fibroblasten und ihre Interaktion mit den prämalignen HaCaT Zellen in vitro analysiert. Interessanterweise, kam es nur in der Anwesenheit von Fibroblasten zu einer Kollagengel-Degradierung. Diese Beobachtungen gingen mit einer Expressionsänderung von MMPs sowie von angiogenen Faktoren, wie VEGF und PDGF, einher. Ferner zeigte sich, dass in der OTK in der Abwesenheit von Fibroblasten MMP-2 geringer exprimiert wurde und vorwiegend in den oberen Zellschichten des Epithels zu detektieren war. Parallel dazu konnte in diesen Zellschichten eine gesteigerte Proliferationsaktivität nachgewiesen werden. In Anwesenheit von Fibroblasten jedoch wurde MMP-2 vorgefunden. Die Kollagengel-Degradierung in der Anwesenheit der Fibroblasten korrelierte auch mit einer verringerten TIMP-1/TIMP-2-Expression. Die geringe TIMP-2-Expression führt zu einem Anstieg von MMP-2, welches direkt den Prozess der Kollagengel-Degradierung in der OTK fördert. TIMPs spielen nicht nur in die Regulation der MMP Expression sondern auch in der anderer Wachstumsfaktoren, wie VEGF und PDGF, eine Rolle. Während wir in der OTK keinen Zusammenhang zwischen einer VEGF- und TIMP-Expression detektieren konnten, wurde PDGF in der OTK in der Abwesenheit der Fibroblasten stärker exprimiert. In Folge einer MMP-Inhibition mit einem MMPI (Ro28-2653) der selektiv MMP-2/MMP-9 hemmt, konnte die Kollagengel-Degradierung aufgehalten werden. Nach der Behandlung mit Ro28-2653 wurden die Expression der Proteine MMP-1/MMP-2 signifikant herrunterreguliert. Dagegen war eine Verringerung der MMP-9-Expression nur zu Beginn der Behandlung detektierbar. In der OTK wurde zusätzlich initial VEGF in Folge einer MMP-Inhibition herunterreguliert. Ab der dritten Woche war die VEGF-Expression in behandelten und unbehandelten Proben vergleichbar hoch. PDGF wurde zunächst herunterreguliert, später ab der zweiten Woche signifikant hochreguliert. PDGF ist in der Lage eine TIMP-1-Expression zu induzieren. In der OTK trifft dies für TIMP-1 und TIMP-2 zu. ECM und BM Degradierung sind eine der Vorraussetzungen für Gefäßsprossung. Es kam in vivo bei malignen HaCaT-ras-A-5RT3-Tumoren in Folge einer MMP-Inhibition (Ag3340) zu einer Induzierung der Gefäßreifung und der Zerstörung kleiner, unreifer Blutgefäße. Zusätzlich ließ sich mit MRT und Hochfrequenzsonographie eine Reduzierung der Tumorgröße; des relativen Blutvolumens und ein Anstieg des mittleren Gefäßdurchmessers bei therapierten Tieren detektieren. Dieser Anstieg des mittleren Gefäßdurchmessers, quantifiziert mittels „Vessel Size Imaging“, unterstützt die Annahme, dass eine MMP-Inhibition vorwiegend die kleinen unreifen Gefäße zerstört. Die großen und reifen Gefäße sind gegen eine anti-angiogene Therapie resistent. Immunhistologische Analysen verifizierten diese Ergebnisse. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Fibroblasten bei der Tumorinvasion von malignen Keratinozyten eine fundamentale Rolle spielen. Nur in der Anwesenheit der Fibroblasten war eine MMP-2-Expression nachweisbar Wahrscheinlich stimulieren Tumorzellen Fibroblasten - über parakrine Mechanismen - MMP-2 zu synthetisieren. In vivo spielen MMPs und TIMPs und Wachstumsfaktoren, wie VEGF und PDGF, eine wichtige Rolle beim Prozess der Angiogenese. Dies ließ sich mit nicht-invasiver Bildgebung bei HaCaT ras A 5RT3 Tumoren unter MMP-Inhibition anhand des Nachweises einer zunehmenden Gefäßreifung und des Rückgangs der kleinen, unreifen Gefäße zeigen.
In der vorliegenden Arbeit sollten die in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Splice- Varianten des murinen ARVCF (mARVCF) cloniert und charakterisiert werden. Es wurde gezeigt, daß alle 8 putativen Isoformen im gleichen Maße mit den Zelladhäsions-Molekülen M-, E- und N-Cadherin interagieren können und mit diesen an der Plasmamembran bzw. den Zell-Zellkontakten colocalisieren. Dabei nimmt N-Cadherin eine Sonderstellung ein. Zum einen ist die Interaktion mit endogenem N-Cadherin abhängig vom Zellkontext und zum anderen konnte mit Hilfe des MOM recruitment assays gezeigt werden, daß, im Gegensatz zu MOM-M- und MOM-E-Cadherin, eine Assoziation von mARVCF und MOM-N-Cadherin nicht in jeder Zelle stattfindet. Eine mögliche Konkurrenz von mARVCF mit dem nahe verwandten armadillo repeat Protein p120(ctn) um die Bindestelle in N-Cadherin konnte dabei als Ursache ausgeschlossen werden. Als nächstes wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, daß mARVCF eine duale Lokalisation an der Plasmamembran und im Zellkern aufweist. Dabei unterliegt mARVCF einem effektiven Exportmechanismus. Dieser Export kann durch Leptomycin B inhibiert werden, scheint somit also CRM1/exportin1-vermittelt zu sein und wird offenbar durch zwei verschiedene NES (nuclear export signal)-Sequenzen in mARVCF reguliert. Das in der p120(ctn) Subfamilie (zu der auch mARVCF gehört) konservierte NLS (nuclear localisation signal) konnte als für den Protein-Import unwirksam charakterisiert werden. Weiterhin wurde das LIM-only Protein FHL2 als neuer Interaktionspartner von mARVCF identifiziert. Dabei wirkt mARVCF als Mediator zwischen dem Cadherin- Catenin Komplex an der Plasmamembran und dem Interaktionspartner der Integrine FHL2. mARVCF ist in der Lage, FHL2 aus den Fokalkontakten zum Cadherin- Catenin Komplex an der Membran zu translozieren und in den Komplex einzubinden.
Prion-Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Fehlfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc verursacht werden. Welche zellulären Mechanismen an dieser Fehlfaltung oder der Pathogenese beteiligt sind, ist bis heute nur teilweise geklärt. Einerseits wird vermutet, dass z.B. eine toxische cytosolische Form des PrPC aufgrund einer Störung des Proteasoms akkumulieren könnte und spontan in PrPSc umgewandelt wird. Andererseits konnte gezeigt werden, dass viele Signalwege, wie die MAPK-Signalwege am Prozess der Neurodegeneration beteiligt sein könnten.
Ziel dieser Arbeit war daher zum einen die Untersuchung der morphologischen Veränderung einer Zelllinie, die cytosolisches PrP exprimiert, und zum anderen die Identifikation weiterer Signalwege, die an der Prionpathogenese beteiligt sein könnten, was mittels Analysen des (Phospho)proteoms Prion-infizierter Zellen und Mäusegehirne durchgeführt werden sollte.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden murine Neuroblastoma Zellen charakterisiert, die eine cytosolische Form des Prion Proteins (CyPrP) exprimierten. Diese Zellen zeigten zwar keine cytotoxischen Merkmale, jedoch wiesen sie dramatische morphologische Veränderungen auf. Weiterhin wurde herausgefunden, dass diese Zellen vermutlich eine Isoform des cytosolischen PrP (CyPrPmod) exprimierten, die sowohl glykosyliert als auch auf der Zelloberfläche verankert war und somit Eigenschaften des Volllängen-PrP aufwies. Die Glykosylierung des CyPrPs wurde in Western Blots nachgewiesen, während die Verankerung des CyPrPs in der Plasmamembran anhand der Durchflusszytometrie untersucht wurde. Der vermutete Zusammenhang zwischen der CyPrPmod-Expression und der morphologischen Veränderung der Zellen wurde mittels Herunterregulation von CyPrP untersucht. Jedoch resultierte dies nicht in der erwarteten Reversion der morphologischen Effekte. Die Wiederholung der stabilen Transfektion in den parentalen N2a Zellen und anderen Zelllinien führte außerdem weder zu einer veränderten Morphologie noch zur Expression von CyPrPmod. Somit sind diese Veränderungen auf unspezifische Prozesse während der ersten stabilen Transfektion der N2a Zellen mit CyPrP zurückzuführen.
Um neue Therapien oder Biomarker bei Prion-Erkrankungen zu entwickeln, ist die Untersuchung von Signalwegen, die die Prionpathogenese beeinflussen können, wichtig. Oft werden zelluläre Signalwege über die Phosphorylierung von Proteinen gesteuert, allerdings gab es bisher in der Prionenforschung keine Untersuchungen des Phosphoproteoms von Prion-infizierten Zellen in vivo oder in vitro. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher das Phosphoproteom eines Prionen-replizierenden Zellkultursystems näher untersucht. In einer SILAC-Analyse von nicht infizierten und Prion-infizierten Zellen wurden über 100 Phosphoproteine identifiziert und quantifiziert, von denen drei in Western Blots validiert wurden. Die Phosphorylierung von Stathmin und Cdc2 an spezifischen Phosphorylierungsstellen war in den Prion-infizerten Zellen vermindert, während Cofilin eine erhöhte Phosphorylierung aufwies. Diese Proteine sind an der Regulation des Zellzyklus und des Zytoskeletts beteiligt und könnten eine Rolle in der Prionpathogenese spielen. Außerdem wurde nach 2D-Analysen des Proteoms Prion-infizierter Mäusegehirne eine Hochregulation des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 6 (PRDX6) festgestellt. Auch im Prionen-replizierenden Zellkultursystem konnte dieses Protein in erhöhten Mengen nachgewiesen werden. Experimente zur Unterdrückung bzw. Überexpression von PRDX6 ergaben, dass seine Phospholipase A2-Aktivität Signalkaskaden beeinflussen könnte, die vermutlich die Expression von PrPC und somit die Prion-Replikation regulieren können. Weitere Untersuchungen der PRDX6-abhängigen Signalwege in der Prionpathogenese sowie Inokulationen PRDX6-defizienter Mäuse mit Prionen, könnten erste Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien bei Prion-Erkrankungen sein.
Die G/F-Transition zytoskelettärer Elemente bildet die molekulare Basis zur Kontrolle der Zellform, Motilität, Migration und Invasivität von Zellen. Die Änderungen der Filamentlängen werden durch bindende Proteine kontrolliert, wodurch sich die viskoelastischen Eigenschaften des Zytoplasmas ändern. Die Kenntnis der mechanischen Eigenschaften der einzelnen Zytoskelettelemente in vitro (mit und ohne bindende Proteine) ist die Grundlage zum Verständnis der Zellmechanik. Daher wurde eine nicht destruktive Methode zur Bestimmung viskoelastischer Eigenschaften von Gelen und Flüssigkeiten entwickelt. Als Viskositätssensor dient ein kleines Glasstäbchen, welches in der zu untersuchenden Flüssigkeit in seiner Resonanzfrequenz schwingt. Aufgrund der Zähigkeit der Flüssigkeiten kommt es zur Mitbewegung angrenzender Flüssigkeitsschichten. Die Eindringtiefe der erzeugten Scherwellen ist eine Funktion der Viskosität und der Dichte der Flüssigkeit. Die extrem kleinen Auslenkungen (1100 nm) des Sensors werden von einem phasensensitiven akustischen Mikroskop detektiert, welches gleichzeitig die Detektion des Elastizitätsmoduls der Flüssigkeit ermöglicht. Nach Aufbau und Weiterentwicklung des Gerätes wurde die Viskoelastizität während der Polymerisation von Aktin, Tubulin und Neurofilamentprotein gemessen sowie während der Interaktion der Polymere mit einer Reihe spezifisch bindender Proteine, wie z.B. aAktinin, Profilin, Glykolyseenzyme, MAPs bzw. Zellgiften wie Cytochalasin D, Phalloidin, Colchizin und Taxol. Im Vergleich zu FAktinlösungen ist die dynamische Viskosität von Mikrotubulilösungen um eine Zehnerpotenz und die Schallgeschwindigkeit um etwa 100 m/s höher. Die Viskoelastizität von Nicht-Muskelaktin ist im Vergleich zu Muskelaktin etwa dreimal höher. Die steadystate-Viskositäten von F-Aktin und Mikrotubulilösungen nähern sich mit steigender Proteinkonzentration einem Maximalwert an, wohingegen die Elastizitäten sich einem Minimalwert annähern, was auf eine nematische Phasentransition zurückzuführen ist. Der Schallgeschwindigkeitsverlauf während der Polymerisation von Aktin und Tubulin ist biphasisch: er nimmt zunächst vor messbaren Viskositätsänderungen zu, was hinsichtlich des Aktins auf eine Zunahme steifer Aktinprimer und hinsichtlich des Tubulins auf die Bildung oligomerer Strukturen mit hoher intrinsischer Steifigkeit zurückzuführen ist. Für Proteinkonzentrationen >20 µM fällt dann die Schallgeschwindigkeit nach dem Erreichen des Viskositätsmaximums ab, was durch eine erhöhte Volumenkompressibilität infolge zunehmender Hydratation der Polymere begründet ist. Versuche mit polymerisationsfördernden bzw. depolymerisierenden Agenzien wie Taxol bzw. Colchizin und Kalzium zeigen, dass die hohe Elastizität von Mikrotubulilösungen durch die intrinsische Elastizität der Tubulinoligomere dominiert wird. Die Viskosität von Mikrotubuli mit assoziierten MAPs (MTP) ist im Vergleich zu FAktin ungefähr doppelt so hoch und im Vergleich zu PC-Tubulin ungefähr dreimal niedriger. Die Elastizität von MTP ist im Vergleich zu FAktin durchschnittlich 4 % höher und 3 % niedriger im Vergleich zu MAP-freien Mikrotubuli. Die Assoziationen von Neurofilamenten an Mikrotubuli induzierte einen Viskositätsanstieg, während die Elastizität fiel, was auf eine Destabilisation der Mikrotubuli während der Interaktion zurückzuführen ist. Die Destabilisation ist möglicherweise eine Folge einer GTP-Hydrolyse durch die an den Neurofilamenten assoziierte GTPase. Neben den zeitlich voneinander unabhängigen Verläufen der Schallgeschwindigkeit und der Viskosität konnte mit Hilfe der Detektion der Schalldämpfung während der Polymerisation von Aktin eine weitere zeitlich unabhängig verlaufende Kinetik bestimmt werden, welche mit der Quervernetzung und der Filamentlänge zusammenhängt. Die Schalldämpfung von Neurofilamenten ist im Vergleich zu F-Aktin etwa 10mal höher. Während der Polymerisation von Tubulin, mit und ohne MAPs, konnte aufgrund hoher Schallreflektionen, bedingt durch die festkörperähnlichen Strukturen, keine klar definierte Schalldämpfungskinetik bestimmt werden. Die Elastizität von Aktingelen (1 mg/ml) hängt nicht mit der Deformationsfrequenz (0,0533 kHz) zusammen. Nach der Zugabe von a-Aktinin steigt jedoch die Elastizität mit der Frequenz gemäß dem Verhalten eines elastischen Körpers an. Auch durch die Zugabe hoher ATP-Konzentrationen (2 mM) kann die Elastizität von Aktin erhöht werden. Impulsartige Modulationen der Schwingungsamplitude von ± 30 nm senkten die Viskosität von Aktingelen (< 25 µM) um 50 %, was auf ein Zerschlagen und Umorientieren von Filamenten zurückzuführen ist. Durch die Zugabe von aAktinin waren diese Viskositätsänderungen siebenmal niedriger. Die Viskosität von Aktingelen > 50 µM konnte durch impulsartige Erhöhungen der Schwingungsamplitude (> 40 nm) nicht verringert werden. Ebenso wurden die Viskositäten von Tubulingelen (15100 µM) und Neurofilamentlösungen (> 0,5 µM) durch impulsartige Deformationen im Nanometerbereich (10100 nm) nicht beeinflusst. Niedrige Profilinkonzentrationen (Aktin:Profilin 1) fördern die Polymerisation von Mg 2 bgGAktin. Ebenso führt die Zugabe von Profilin (Aktin:Profilin = 1:1) zu bereits polymerisiertem Aktin zu einer Viskositätszunahme. Profilin im Überschuss (Aktin:Profilin = 1:5) hemmt die Polymerisation von Mg 2 bgG Aktin. Im Gegensatz zu Muskelaktin verliert NichtMuskelaktin nach einiger Zeit (> 40 Minuten) seine Elastizität. Dieser Elastizitätsverlust kann durch die Zugabe von Profilin verzögert werden. Nach der Zugabe geringer Profilinkonzentrationen zu bgAktin wurde anhand von EM-Aufnahmen vermehrt nicht filamentöse Aktin-Aggregate gezeigt, welches besonders hohe Elastizitätswerte aufwies. Zusammen mit den rheologischen Befunden für Aktin und Mikrotubulilösungen kann geschlossen werden, dass nicht filamentöse Formen zytoskelettärer Elemente (Tubulinoligomere, Aktintrimere, GAktincluster) in hohem Maße zur Elastizität von Zellen beitragen. Hexokinase fördert die Polymerisation von Aktin. In Gegenwart hoher ATP-Konzentrationen wirkt sie durch Fragmentierung von Aktinfilamenten elastizitätsmindernd. In Gegenwart von Glukose wird dieser Effekt aufgehoben. LDHH 4 fördert in Gegenwart ihres Coenzyms NADH die Polymerisation von Aktin. Gibt man zusätzlich Pyruvat hinzu, so wird dieser Effekt nahezu umgekehrt. Unter diesen Bedingungen ist ferner die Enzymaktivität der LDHH 4 eingeschränkt. Umgekehrt fördert die LDHH 4 in Gegenwart von Laktat und NAD die Polymerisation von Aktin, wobei gleichzeitig die Enzymaktivität der LDHH 4 erhöht ist. Diese Befunde sprechen für eine deutliche Reziprozität zwischen LDHH 4 und Aktin. Aldolase reduziert deutlich die Viskoelastizität von F-Aktin, was in der Bildung von F-Aktin-Aldolase Parakristallen begründet ist. Die Zugabe des Substrates FBP erhöht hingegen die Viskoelastizität von F Aktin. Der Effekt hängt jedoch davon ab, ob Magnesium-Ionen an den Aldolase-G-Aktin-Komplex binden. Wird Aldolase zu polymerisierendem Aktin zugegeben, so bleibt die Viskosität der Lösung unverändert, während die Elastizität zunimmt. In diesem Falle wird die Steifigkeit der Filamente durch die Anla gerung der Aldolase erhöht. Zytosolische, nichtmembrangebundene Enzyme, wie die Aldolase, Hexokinase und LDH binden demnach an F-Aktin und modulieren seine Mechanik. Das Ausmaß der Modulation hängt von der Konzentration der Enzyme sowie der Gegenwart der jeweiligen Substrate ab. Ferner moduliert Aktin reziprok die Aktivität der Enzyme.
Die Brustdrüse (glandula mammaris) bietet ein einzigartiges Modellsystem zum Studium der adulten Stammzellen und der molekularen Signalwege, welche die Selbsterneuerung dieserZellen sowie die Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen kontrollieren. Die Brustdrüse besteht aus dem Brustepithel und dem Stroma, das zum größten Teil aus dem Fettgewebe gebaut ist. Es enthält auch andere Zelltypen z. B. Fibroblasten und Makrophagen. Die Entwicklung der Brustdrüse findet hauptsächlich nach der Geburt, während der Pubertät, Schwangerschaft und Laktation statt. Ein funktionelles Brustepithel wird während der aufeinander folgenden Zyklen von Schwangerschaft, Laktation und Abstillen auf- und wieder abgebaut. Diese Regenerations-Kapazität kann für die Organrekonstitution genutzt werden. Die Transplantation der kleinen Anzahl von Brustepithelzellen oder des Drüsenfragments in das Fettgewebe einer Empfängermaus, deren eigenes Brustepithel entfernt wurde (cleared fat pad), führt zur vollständigen Epithelregeneration. Die zyklische Entwicklung und Regenerations-Fähigkeit des Epithelgewebes lässt auf die Existenz von Stammzellen schließen, die im Verbund der Epithelzellen überdauern. Diese gewebespezifischen Stammzellen sind in der Lage sich durch asymmetrische Zellteilung zu erneuern (self-renewal) und gleichzeitig die differenzierenden Vorläuferzellen zu bilden. Die während der Pubertät und Schwangerschaft erhöhten systemischen Hormone, lokalen Wachstumsfaktoren und Zytokine kontrollieren die Stammzellen-Proliferation und die Differenzierung der Vorläuferzellen in den verschiedenen Brustepithel-Zelllinien: Myoepithel-, Luminal- und Alveolarzellen. Aufgrund der Tatsache, dass die Entstehung von Brustkrebs mit aberranten Proliferations- und Differenzierungsprogrammen in malignanten Stamm-/ Vorläuferzellen (cancer stem cells) einhergeht, ist die Identifizierung der Signalwege, die diese Prozesse regulieren, für die Stammzellen- und Krebs-Forschung sehr bedeutend. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden im Rahmen des vorliegenden Projektes die Methoden zur genetischen Manipulation von nicht-angereicherten Brustdrüsen-Stammzellen entwickelt. Durch effiziente lentivirale Transduktion von adhärenten Primärzellen wurden nahezu 90% der Zellen, einschließlich der Stammzellen, transduziert. Diese Optimierung erfolgte durch 1) die Anwendung von konzentrierten Lentiviren mit hoher Qualität, 2) Passagierung der Primärzellen und Entfernung von Gewebeklumpen von den VIII Primärzellkulturen, und besonders 3) durch die Reduzierung der Zelldichte während der viralen Transduktion. Für Brust-Stammzellen sind keine spezifischen Oberflächen-Marker bekannt und daher ist ihre Isolierung deutlich erschwert. Man konnte sie bis jetzt nur anhand der moderaten Expression von CD24 (hitzestabilen Antigen) und hoher Expression von CD49f oder CD29 (α6- oder β1-Integrin) ungefähr 10-fach anreichern. Allerdings haben andere Studien gezeigt, dass die Transplantation der FACS-sortierten Stammzellen zu einer Schädigung der Stammzellen und folglich zu einer Reduktion der Repopulation-Frequenz führen kann. Aus diesem Grund wurden die genetisch modifizierten Stammzellen nicht sortiert. Durch die Transplantationen der transduzierten Primärzellen wurde ihr Stammzellen-Anteil in ihrer natürlichen Nische (cleared fat pad) selektiert. Die transplantierten Stammzellen sind in der Lage duktale Auswüchse zu entwickeln. Mit dieser Strategie konnten Transplantate mit homogener Expression von Fluoreszenz-Markergenen, wie z. B. GFP, erzielt werden. FACS Analysen der Zellen, die aus Transplantaten isoliert werden, haben gezeigt, dass alle drei Brustepithelzell-Populationen, nämlich Luminal-, Basal- und Stammzellen, transduziert waren und GFP exprimierten und daher aus transduzierten Zellen hervor gingen. Die Transplantationen einer Mischung der unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Stammzellen ergaben einzelne verzweigte Auswüchse, in denen jeweils nur ein Fluoreszenz-Markerprotein exprimiert wurde. Sie stammen sehr wahrscheinlich von einzelnen transduzierten Stammzellen ab und wachsen jeweils in einem begrenzten Bereich des Brustfettgewebes aus. Die Immun-Antwort der Empfängermäuse gegen Fluoreszenz- Markerproteine könnte das Auswachsen der Transplantate inhibieren. Brustepithelium-Rekonstitutionen waren daher in den Rag2-/-γc-/- Empfängermäusen mit geschwächtem Immunsystem besonders effiziert. Die lentivirale Manipulation von Stammzellen und deren Einsatz in Brustepithelium-Rekonstitutionen kann als alternative Methode zur gewebsspezifischen Knockout-Technik angesehen werden. Für die Etablierung dieser Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zentraler Transkriptionsfaktor in der Brustentwicklung, signal transducer and activator of transcription 5 (Stat5), untersucht. (...)
Mitochondria are dynamic organelles indispensible for viability of eukaryotic cells. Diffusion of proteins in mitochondrial membranes is a prerequisite for the correct functionality of the organelles. However, its study is made complicated due to the nontrivial geometry, small size and positional instability of the organelle, restricting the usability of regular experimental methods and theoretical understanding of acquired data. Therefore, here the molecular transport along the main mitochondrial axis was investigated using highly accurate computational methods combining them with traditional experimental approaches. Using recently reported electron microscopic tomography data concerning the constitution of mitochondria [Fre02], a lattice model of the inner mitochondrial membrane (IM) reproducing its structure in great details was built up. With Monte Carlo (MC) simulations of particle dynamics on this model, it was found that the membrane geometry induces nonlinear effects in the motion of molecules along the mitochondrial axis, which in turn lead to a transient violation of the 2nd Fick?s equation. We show that mere curvature of the IM resulting from the presence of cristae is sufficient for the emergence of transient anomalous diffusion (TAD) in the membrane. The MC calculations have enabled an accurate estimation of regularities in the extent of deviations from the normal regime, therefore allowing us to propose non-homogenous power law as a suitable generalization of the current approach to the analysis of experimental data for the transient dynamics. The general cause of TAD resulting from the membrane curvature alone, without any involvement of specific inter-particle interactions prompted us to predict the similar dynamical effect also for other curved cellular membranes, be it diffusion in endoplasmic reticulum or in plasma membrane of cells possessing dense microvilli. The data indicate that the geometry-induced anomalous diffusion should be easily detectable with current experimental methods, but only in the restricted range of time scales corresponding to high temporal resolution. Until now, experimental measurements of molecular diffusion in biological membranes indiscriminately assumed either pure normal or pure anomalous diffusion schemes for the analysis of data acquired in very wide range of temporal resolutions, which often lead to ambiguities in the interpretation of diffusion parameters. The MC calculations have clearly illustrated the necessity for a more subtle treatment of experimental conditions: the assumption of pure Gaussian diffusion model is justified only if the applied temporal resolution is sufficiently low (as is often the case when using scanning techniques exemplified further); otherwise, the transient regime should be tested for by means of the non-homogenous power function. In the second part of the study the Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) with the laser scanning microscope is introduced as a method of choice for studying protein mobility within mitochondrial membranes. The conventional FRAP methodology [Axe76] was extended to enable its application for the determination of confined diffusion with conventional laser scanning microscopes which allowed us to communicate for the first time the direct measurement of protein diffusion in mitochondrial membranes of living cells. This is achieved through adaptation of FRAP data analysis to account for the spatial dimensions of the organelle and the spatiotemporal pattern of light pulses induced by the microscope. The experimental circumstances existing during the particular measurement session are computationally recreated and this way the best suited values of diffusion parameters are found. The method is validated experimentally for four FP-tagged mitochondrial membrane proteins: the IM OxPhos complexes F1F0 ATPase and cytochrome c oxidase and for Tom7 and hFis1 - components of the mitochondrial protein import and fission machineries respectively localized in the outer membrane. We find that for all proteins simple normal diffusion is not a sufficient description. In the inner membrane, diffusion coefficient of F1F0 ATPase expressed in HeLa cell line is found to be 0.2 ?m2/s, with more than 1/3 of the protein molecules being immobilized, while cytochrome c oxidase (in CEF primary cells) demonstrated a similar diffusivity pattern (0.4 ?m2/s, 30% immobile). In the outer membrane, the D (0.7 ?m2/s) and immobile fraction (7-8%) of GFP-Tom7 and GFP-hFis1 (both in HeLa cells) are identical, which designates a substantial difference in comparison to the IM protein mobility. Diffusion coefficients of mitochondrial membrane proteins studied here lay in the intermediate region between those measured in artificial bilayers and in plasma membranes. Protein crowding and intermolecular interactions will be among the major causes responsible for the detected slowdown of diffusion.
Die verschiedenen Typen von Nervenzellen sind durch die differentielle Expression terminaler Differenzierungsgene charakterisiert. Dies sind z.B. Gene, deren Produkte die Synthese und den Transport der verwendeten Neurotransmitter gewährleisten. Die Expression dieser Gene wird während der Entwicklung durch spezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren reguliert. In der Entwicklung sympathischer Nervenzellen sind Mitglieder aus der Familie der basic Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Transkriptionsfaktoren und der paired-Homöodomänen-Faktoren identifiziert worden, deren Expression in Vorläuferzellen aus der Neuralleiste durch das Signalmolekül BMP4 induziert wird und die an der Regulation des sympathischen Phänotyps beteiligt sind. Nullmutanten des bHLH-Faktors Mash1 und des Homöodomänen-Faktors Phox2b zeigen eine stark gestörte Entwicklung der sympathischer Nervenzellen. Weitere bHLH-Faktoren, dHand und eHand, vermögen in vitro die Expression noradrenerger Differenzierungsgene in Neuralleistenzell-kulturen zu induzieren. Ob diese Faktoren in vivo eine Rolle in der entwicklungsabhängigen sympathischen Differenzierung spielen, kann im Mausmodell nicht untersucht werden, da die Nullmutanten noch vor der Sympathogenese sterben. Das Huhnembryo bietet das ideale Modellsystem, die Rolle von Transkriptionsfaktoren in vivo zu untersuchen und durch Kopplung embryologisch-experimenteller und molekularer Verfahren die Faktoren gezielt in bestimmten Geweben zu exprimieren. In dieser Arbeit werden Experimente dargestellt, welche die Rolle dieser Transkriptionsfaktoren genauer definieren. Durch die viral induzierte Expression von Phox2a und Phox2b im Huhnembryo wird gezeigt, dass die Expression dieser Faktoren ausreicht, in multipotenten Vorläuferzellen des Brachialnervs und des Hinterwurzelganglions die Differenzierung sympathischer Nervenzellen zu induzieren. Dieser Phänotyp umfasst neben der Expression typisch noradrenerger und panneuronaler Gene ebenfalls die Expression der Transkriptionsfaktoren Phox2a und -b, dHand und Cash1. Es wird gezeigt, dass dHand im Laufe der sympathischen Entwicklung noch vor den noradrenergen und panneuronalen Differenzierungsgenen exprimiert wird. Auch dHand ist in der Lage, nach viraler Misexpression in multipotenten Vorläuferzellen des Embryos Differenzierung zu sympathischen Nervenzellen auszulösen. Weiter wird gezeigt, dass die Überexpression von BMP4 im Huhnembryo dazu führt, dass undifferenzierte Vorläuferzellen im Brachialnerv zu sympathischen Nervenzellen differenzieren. Mash1 vermag nach Überexpression die Expression neuronaler Gene im Brachialnerv und umliegenden Mesoderm zu induzieren. Die Bildung sympathischer Nervenzellen im Bereich des Brachialnervs wird ebenfalls induziert. Diese exprimieren wiederum neben den noradrenergen und panneuronalen Genen auch die Transkriptionsfaktoren Phox2a/b und dHand. Die Ergebnisse zeigen überzeugend das Vermögen der Transkriptionsfaktoren Phox2a/b, dHand und Mash1 den komplexen sympathischen Phänotyp in multipotenten Vorläuferzellen aus der Neuralleiste zu induzieren. Besonders wichtig sind hierbei die Ergebnisse nach dHand-Überexpression. Hiermit wird erstmals gezeigt, dass dieser bHLH-Transkriptionsfaktor in vivo eine hervorragende Rolle innerhalb der Regulation noradrenerger und neuronaler Gene einnimmt. Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen zeigen darüber hinaus, dass während der Normalentwicklung in Vorläuferzellen des peripheren Nervensystems die Expression einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren induziert wird. Deren Mitglieder werden in einer festgelegten zeitlichen und epistatischen Reihung exprimiert. Jeder Einzelne dieser Transkiptionsfaktoren ist ausreichend, in Vorläuferzellen die Entstehung sympathischer Nervenzellen auszulösen. Dabei wird die Expression der anderen Mitglieder dieser Gruppe induziert. Es handelt sich also nicht um eine lineare Kaskade von Transkriptionsfaktoren, sondern um ein Netzwerk von Faktoren, die ihre Expression gegenseitig regulieren und vermutlich gemeinsam die Expression terminaler Differenzierungsgene steuern.
In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Glykolyseenzymen in Kulturzellen unter normalen und die Glykolyse stimulierenden und hemmenden Bedingungen untersucht. Die Hauptfunktion, die der Strukturbindung und -Bildung von Glykolyseenzymen zugeschrieben wird, ist das so genannte metabolite-channelling bzw. substratechannelling, also die effiziente, lokale Bereitstellung von ATP. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen stand Aldolase (EC 4.1.2.13). Unter allen Bedingungen liegt Aldolase, wie die meisten anderen Glykolyseenzyme gleichzeitig sowohl in strukturgebundener, als auch in gelöster Form im Cytoplasma vor. Unter normalen Kulturbedingungen wurde die strukturgebunde Aldolase an Stressfasern sowie dem fibrillären Aktin-Netzwerk des Zellkortex vorgefunden. Diese Beobachtungen wurden an fixierten Zellen gemacht; an lebenden Zellen konnte die Bindung an Stressfasern durch Mikroinjektion fluorochromierter Aldolase direkt nachgewiesen werden. Ferner wurde beobachtet, dass Aldolase selbst, unabhängig vom Vorhandensein von Aktin in der Zelle netzwerkartige Strukturen bilden kann. Das Hinzufügen von Aldolase zu in vitro polymerisierten Aktinfilamenten führte zu einer Bündelung der Aktinfilamente, die wahrscheinlich auf eine quervernetzende Wirkung dieses Enzyms zurückzuführen ist. Durch Injektionen mit Gemischen unterschiedlich markierter Glykolyseenzyme konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme auch in gelöster Form nicht völlig homogen in den Zellen verteilt sind. In Gegenwart hoher Substratkonzentrationen wurde entdeckt, dass Aldolase in großem Ausmaß an Intermediärfilamente gebunden wird. Da dieses Verhalten zwar unabhängig von der Präparationsmethode auftrat, in vitro durch Kosedimentation aber nicht bestätigt werden konnte, ist anzunehmen, dass neben dem Substrat weitere Faktoren bei diesem Phänomen eine Rolle spielen. Die Applikation von Insulin führte zu keinerlei mikroskopisch beobachtbaren Änderungen im Bindungsverhalten der Aldolase. Dennoch konnte eine geringe Steigerung der Aktivität in der unlöslichen Fraktion des Zellproteins nachgewiesen werden. Die Mikroinjektion unphysiologisch hoher Mengen von Aldolase führte zu einem drastischen Abbau von Aktinfilamenten und Stressfasern in den injizierten Zellen. Andere Glykolyseenzyme (GAPDH, PGM, LDH und TIM) zeigten dagegen keinerlei Wirkung. Der selbe Effekt ist bereits für PFK beschrieben worden, wo er durch eine starke Assoziation der PFK mit Gelsolin hervorgerufen wird. Der Wirkungsmechanismus bei der Aldolase ist dagegen bislang nicht bekannt. Durch die Inkubation fixierter Zellen mit fluorochromierter Aldolase wurden eine große Zahl freier Bindungsstellen an Mikrotubuli entdeckt. Allerdings konnten keine Bedingungen ermittelt werden, unter denen die intrazelluläre Aldolase an Mikrotubuli bindet. Weiterhin wurde ein Experiment entworfen, um die lokale Bereitstellung von Energie in Form von ATP und metabolite-channelling nachzuweisen. Dazu wurden Monolayerkulturen durch Hemmung von Atmung und Glykolyse ATP-entleert und durch Permeabilisierung alle löslichen Bestandteile freigesetzt. Die Gabe verschiedener ATP-Konzentrationen führte in diesem Fall zu einer Kontraktion der verbleibenden Zellbestandteile, wobei die Kontraktionsgeschwindigkeit abhängig von der gegebenen ATPKonzentration war. Durch die Gabe von FBP und ADP konnte diese Kontraktion ebenfalls ausgelöst werden, was für die Konversion von ADP zu ATP wodurch ein von FBP und den strukturgebundenen Enzymen unterhaltener glykolytischen FluSS und somit metabolite-channelling nachgewiesen wurde.
Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.