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Neue Osteotomiemethoden wie die Laser- oder piezoelektrische Osteotomie haben Vorteile gegenüber klassischen Methoden, wie z.B. oszillierende Säge oder rotierende Instrumente. Verschiedene Indikationen zur Knochenpräparation stellen unterschiedliche Anforderungen an Methoden der Osteotomie. Demzufolge ist der Knochenverlust und die hinterlassene Oberfläche nach Präparation wichtig, um verschiedene Methoden aufgrund ihrer Effizienz und Invasivität zu beurteilen. Im Zuge dieser Studie wurden sechs Methoden untersucht. Unter diesen waren rotierende Instrumente wie diamantierte Trennscheiben oder eine Lindemannfräse, eine oszillierende Säge, ein Er:YAG-Laser, ein Er,Cr:YSGG-Laser und die piezoelektrische Osteotomie. Sechs Schnitte mit einer Tiefe von 3-5 mm wurden pro Methode in Schweinerippen präpariert. Die Breite der Schnitte wurde mit Hilfe der Auflichtmikroskopie ermittelt und nach Trocknung der Knochenproben die Oberfläche rasterelektronenmikroskopisch beurteilt. Bei allen Instrumenten waren Unterschiede bezüglich der Breite am Boden und im obersten Bereich eines Schnittes zu notieren. Je tiefer ein Schnitt war, desto schmaler wurde er. Gründe dafür waren Probleme bei der Handhabung und Probleme, einen präzisen Schnitt durchzuführen. Die Ränder des Knochens nach der piezoelektrischen Osteotomie zeigten eine zerrüttelte Oberfläche, die von Rissen dominiert wurde. Sowohl bei der Laser-, als auch bei der piezoelektrischen Osteotomie kam es im Bereich der Spongiosa zu Einschmelzungen, da die Kühlung zur Vermeidung von Hitzeentwicklungen in der Tiefe des Schnittes nicht ausreichend war.
Stickstoff (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Schwefelwasserstoff (H2S) gehören zur Gruppe der Gasotransmitter. Dabei handelt es sich um kleine gasförmige Signalmoleküle, welche innerhalb des Körpers gebildet werden und dort wichtige physiologische Funktionen bei der Regulation der Apoptose, der Proliferation, der Entzündungsreaktion und der Genexpression übernehmen. Aufgrund ihrer Membranpermeabilität ist die Wirkung der Gasotransmitter nicht an die Interaktion mit spezifischen membranständigen Rezeptoren gebundenen. Je nach Organ, Gewebe und Konzentration können diese Mediatoren unterschiedliche Prozesse beeinflussen und teils sogar gegenteilige Wirkungen hervorrufen.H2S beispielsweise kann im Verlauf der Leukozytenadhäsion im Epithelium anti-inflammatorisch, bei Brandwunden oder rheumatischen Erkrankungen jedoch pro-inflammatorisch wirken. Im Kreislaufsystem hingegen bewirkt H2S durch die Aktivierung von ATP-abhängigen K+-Kanälen und die damit zusammenhängende Vasorelaxion der glatten Muskelzellen einen eindeutig protektiven Effekt.
H2S kann je nach Substrat und Zelltyp durch eines von 3 Enzymen gebildet werden. Die Cystathionin-γ-Lyase (CSE) und die Cystathionin-β-Synthase (CBS) nutzen L-Cystein als Substrat für die Synthese von H2S. Das dritte H2S-bildende Enzym, die 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3-MST) verwendet α-Ketoglutarat als Substrat, welches zuvor von der Cystein-Aminotransferse (CAT) aus L-Cystein synthetisiert wurde. Während die beiden Enzyme CSE und CBS im Zytosol der Zelle zu finden sind, ist die 3-MST hauptsächlich in den Mitochondrien der Zelle zu finden. Im Gegensatz zur CBS, welche eher ein konstitutiv exprimiertes Protein ist, wird die Expression der CSE auf der Transkriptionsebene durch u.a. Entzündungsmediatoren wie TNF-α oder Wachstumsfaktoren wie PDGF-BB induziert.
Ein Ziel der Arbeit war es, die Wirkung von H2S bei der Wundheilung, bei entzündlichen glomerulären Erkrankungen der Niere und beim Schlaganfall zu untersuchen. Für diesephänotypische Analysen stand ein Knockoutmodell für die CSE zur Verfügung.
Zudem wurden in dieser Arbeit Untersuchungen mit einem Knockoutmodell für das zytoskeletäre Protein durchgeführt. Bei Clp36 (PDLIM1) handelt es sich um ein PDLIM-Protein (PDZ and LIM domain protein),welches durch die Gasotransmitter NO und H2S auf transkriptioneller und translationaler Ebene reguliert wird ist und aufgrund seiner Assoziation mit dem Zytoskelett dynamische Vorgänge der Zelle moduliert. Es ist bereits bekannt, dass Clp36 ein negativer Regulator des Glykoprotein VI (GPVI), welches eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten spielt, ist.
Beide Knockoutmodelle wurden in murinen Mesangiumzellen der Niere und in Krankheitsmodellen der Haut (kutane Wundheilung)und des Gehirns (Schlaganfall mit dem MCAO-Modell) analysiert.
Neben nicht signifikanten Effekten im MCAO-Modell, konnten sowohl Effekte des CSE-, als auch des CLP36-KOs auf die Migration und Proliferation und im Falle der CSE auch auf die Adhäsion der murinen Mesangiumzellen beobachtet werden. Die Depletion von Clp36 führte zu einer Verringerung der Migrations- und einer Erhöhung der Proliferationsrate, wohingegen die Depletion der CSE zu einer Erhöhung der Migrations-, Proliferations- und Adhäsionsrate führte. Die vielversprechendsten Ergebnisse konnten im Tiermodell der kutanen Wundheilung generiert werden. Untersucht wurde die Expression der H2S-produzierenden Enzyme CSE, CBS und 3-MST. Alle drei Enzyme zeigten im Tiermodell keine transkriptionelle Regulation und blieben auch während der akuten Entzündungsphase und der proliferativen Phase der Wundheilung unverändert. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Expression der CSE in der späten Phase der Wundheilung signifikant anstieg, wenn die Proliferation innerhalb des Granulationsgewebes und der Neoepidermis geringer wurde. Die Vermutung, dass H2S in dieser Phase eine wichtige Rolle spielt, konnte durch die Analyse der CSE-KO Mäuse bekräftigt werden, da dort der Verlust der CSE offenbar durch die CBS kompensiert wurde.
In immunhistochemischen Untersuchungen konnten insbesondere follikuläre Keratinozyten der Neo-Epidemis als Quelle der CSE-Expression identifiziert werden. Durch in-vitro Studien auf mRNA und Proteinebene in HaCaT Zellen wurde gezeigt, dass H2S die Keratinozyten-Differenzierung beeinflusst. Der langsam freisetzendeH2S-Donor GYY4137 konnte in humanen Keratinozyten zu einer signifikanten Erhöhung der Ca2+- induzierten Expression der frühen Keratinozyten-Differenzierungsmarker Cytokeratin 10 (CK10) und Involucrin (IVN) beitragen.
Im Laufe dieser Arbeit konnte der molekulare Mechanismus hinter diesen Beobachtungen noch nicht geklärt werden.
Durch weitere Versuche meiner Arbeitsgruppe konnte jedoch gezeigt werden, dass die GYY4137-abhängige Induktion der CK10-Expression durch eine verstärkte Bindung der RNA-Polymerase II an den CK10 Promotor zustande kommt.
Die Hämophilie A und B, die häufigsten plasmatischen Gerinnungsstörungen, beruhen auf dem Defekt des Gerinnungsfaktors VIII bzw. IX. Eine Ausbildung von FVIII- bzw. FIX neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren) ist heute die bedeutendste und schwerwiegendste Nebenwirkung bei der Behandlung der Patienten mit FVIII/FIX-Präparaten. Ungefähr 25-30% der schwer erkrankten Hämophilie A-Patienten (FVIII-Aktivität < 1%) entwickeln Inhibitoren. Bei der Hämophilie B sind nur ca. 1-3% der Patienten von Inhibitoren betroffen. Ziel der Arbeit war es, die Einflußfaktoren der Inhibitorentwicklung zu ermitteln und mit anderen Studien zu vergleichen. Die für die Substitutionstherapie eingesetzten FVIII-Präparate werden entweder aus Spenderplasma gewonnen oder gentechnisch (rekombinant) hergestellt und durch verschiedene Verfahren virusinaktiviert. Eine Charakterisierung der Präparate zeigte leichte, aber unerhebliche Unterschiede zwischen einzelnen Chargen desselben Präparates. Unter Verwendung der FVIII-/FIX-Präparate wurde die Inhibitorwirkung qualitativ und quantitativ nachgewiesen. Es wurde der Verlauf von Inhibitoren zum Schweregrad der Hämophilie, zur Art der verabreichten Präparate, zu der substitutierten Menge- auch bezogen auf das Körpergewicht- und zur Substitutionsfrequenz korreliert. Es konnte gezeigt werden, daß der Mutationstyp, die Dosierung und das Alter der Erstbehandlung die Inhibitorbildung beeinflussen können. Die Intron 22-Inversion verursacht in den meisten Fällen eine schwere Hämophilie A, und dabei werden auch am häufigsten Inhibitoren gebildet. Bei der Hämophilie B verursachen ausschließlich die große Deletion und Nonsensemutationen die Inhibitorentwicklung. Bei einem Vergleich der Inhibitorinzidenzen von r- und pdFVIII-Präparaten konnte kein signifikanter Unterschied gefunden werden, wie auch andere Studien zeigten. Eine Ausnahme stellt eine erst kürzlich vorgetragene retrospektive Studie aus Frankreich dar (Rothschild 2003). Durch Epitopemapping mit rekombinanten FVIII-Fragmenten konnten bestimmte Domänen des Proteines als ,,targetU der neutralisierenden und nicht-neutralisierenden Antikörper identifiziert werden. Auf der schweren Kette des FVIII-Proteines waren die Antikörper gegen die A2- und die Alal-Domänen gerichtet. Auf der leichten Kette waren die Antikörper gegen die C2-, a3A3- und C1-Domänen gerichtet. Zudem konnte gezeigt werden, dass inhibitorische und nicht-inhibitorische Antikörper vorwiegend gegen die schwere Kette (HC) des FVIII-Proteines gerichtet waren. 77 % der untersuchten Patienten zeigten eine Intron 22-Inversion. Dies verdeutlicht, daß diese Mutation einen hohen Risikofaktor hinsichtlich Inhibitor- und Antikörperbildung darstellt.
Das Hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist die sechsthäufigste Krebsart mit der zweithäufigsten krebsbedingten Letalität. Sorafenib ist bereits seit über 10 Jahren die einzige verfügbare und zugelassene systemische Chemotherapie. Allerdings zeigen Patienten oft eine Resistenz gegenüber Sorafenib.
In zahlreichen Krebsarten konnte bereits gezeigt werden, dass Sphingolipide bei der Tumorentwicklung und Chemoresistenz eine wichtige Rolle spielen. Sphingolipide sind bioaktive Lipidmoleküle, welche unteranderem für die Beeinflussung verschiedener Signalwege intra- und extrazellulär verantwortlich sind. So konnte gezeigt werden, dass das Verhältnis zwischen Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und Ceramiden eine wichtige Rolle für das Überleben von Zellen spielt, wobei eine Verschiebung des Verhältnisses zugunsten des S1P meist eine proliferative Wirkung auf Zellen hat. Für die Phosphorylierung des Sphingosins zu S1P sind die zwei Enzyme Sphingosinkinase 1 und 2 (SPHK1/2) verantwortlich.
Es gibt bereits Studien, die nachweisen konnten, dass diese Enzyme gerade in Tumorzellen verstärkt exprimiert werden. Auf der anderen Seite kann eine verstärkte Bildung von Ceramiden die Apoptose der Tumorzellen verstärken. Daher ist es nicht verwunderlich, dass der Sphingolipid-Stoffwechsel einen interessanten Angriffspunkt für die Krebstherapie darstellt. Aus diesem Grund sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst untersucht werden, ob Sorafenib einen Einfluss auf den Sphingolipid Stoffwechsel hat. Weiter sollte untersucht werden, ob die Beeinflussung des Sphingolipid-Stoffwechsels die Effekte von Sorafenib potenzieren könnte.
Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Sorafenib die mRNA-Expression verschiedener Enzyme, die das Verhältnis zwischen Ceramiden und S1P regulieren, beeinflussen kann. Es wurde weiter untersucht, wie sich der Ceramidsynthase Inhibitor FB1 auf die Proliferation und die Induktion der Apoptose auswirkt. Dies wurde ebenfalls mit SLP (SPHK1 Inhibitor), SLM (SPHK2 Inhibitor) und SKI II, einem unspezifischen Inhibitor beider Sphingosinkinasen, untersucht. Es wurden weiter die Einflüsse aller verwendeten Substanzen auf die Bildung verschiedener Sphingolipide untersucht.
Hierbei konnte gezeigt werden, dass Sorafenib in der Lage ist, die Proliferation der Zellen zu hemmen und die Apoptose-Induktion zu fördern. Weiter führte Sorafenib zu einer Akkumulation der Dihydroceramide. Was wiederrum weder mit SKI II, FB1; SLP noch SLM beobachtet werden konnte. Der signifikante Anstieg der Dihydroceramid-Konzentrationen konnte mit dem durch Sorafenib induzierten oxidativen Stress in Verbindung gebracht werden.
SLP und SLM waren nicht in der Lage, die Effekte von Sorafenib auf die Proliferation zu potenzieren. Die Kombination von Sorafenib mit SLP oder SLM führte jedoch in den Huh7.5 Zellen zu einer drastischen Reduktion des S1P-Spiegel.
FB1 und SKI II führten zu einer stärkeren Hemmung der Proliferation als Sorafenib. Wobei gezeigt werden konnte, dass beide Substanzen die Ceramid-Spiegel tendenziell eher vermindern und die S1P-Spiegel erhöhen. Durch die Stimulation mit FB1 kam es sogar zu einer signifikanten Erhöhung der S1P-Spiegel. Es scheint, dass der Einfluss von FB1 und SKI II auf die Proliferation der Zellen unabhängig vom Sphingolipid-Stoffwechsel ist. Diese scheinen eher über andere Mechanismen zu wirken. Es könnte von Interesse sein, gerade diese Signalwege von SKI II im HCC weiter zu untersuchen, da SKI II bereits in Mausmodellen anderer Krebsarten vielversprechende Ergebnisse zeigte.
NO ist ein gasförmiges Molekül, das durch drei verschiedene NO-Synthasen hergestellt werden kann. Die Signalkaskaden von NO sind multipel und sehr stark von der jeweiligen Konzentration abhängig. In niedrigen Dosen ist NO an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt, wohingegen hohe NO-Spiegel, wie sie von der induzierbaren NO Synthase (iNOS) im Verlauf von entzündlichen Erkrankungen produziert werden, zytotoxische Effekte wie Apoptose und Nekrose bedingen können. Der Wachstumsfaktor PDGF kann durch Inhibition der iNOS Expression, dieser hohen NO Produktion entgegen wirken. Ob NO im Gegenzug auch eine Wirkung auf das PDGF-System aufweist, sollte mit dieser Arbeit geklärt werden. Da die Aktivität von PDGF letztendlich von der Rezeptormenge abhängt, wurde die expressionsmodulatorische Wirkung von NO auf der PDGF-Rezeptorebene untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit wurden MZ mit dem NO-Donator DETA-NO stimuliert. Mittels PCR-Analyse konnte gezeigt werden, dass NO die PDGFR-α-mRNA Expression zeit- und dosisabhängig induziert. Die Expression von PDGFR-β wird hingegen nicht wesentlich beeinflusst. Western-Blot-Analysen (WB) bestätigten die Regulierbarkeit des PDGFR-α auch auf Translationsebene. Als nächstes sollte geprüft werden, ob die durch exogene Applikation eines NO-Donatoren hervorgerufene Induktion des PDGFR-α auch durch eine endogene NO-Produktion imitiert werden kann. Hierzu wurden MZ mit dem Zytokin IL-1β inkubiert. IL-1β steigert die iNOS und auch die PDGFR-α-Expression durch Induktion von Transkriptionsfaktoren. Die IL-1β bedingte PDGFR-α-Expression könnte dabei über zwei Mechanismen reguliert werden: Einerseits über die gesteigerte Synthese von NO durch iNOS und andererseits durch direkte Interaktionen der IL-1β-induzierten Transkriptionsfaktoren mit dem PDGFR-α-Promotor. Um die NO bzw. iNOS-vermittelte von der Promotor-vermittelten Wirkung zu unterscheiden, wurden MZ zusätzlich mit dem NOS-Inhibitor L-NMMA inkubiert. L-NMMA war im Stande die durch IL-1β hervorgerufene Erhöhung der PDGFR-α Proteinmenge signifikant auf 60% zu reduzieren, was die Beteiligung der iNOS bzw. von NO an der IL-1β vermittelten Regulation des PDGFR-α impliziert. NO entfaltet seine Wirkung über verschiedene Signalkaskaden. Der klassische Weg verläuft über die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC). Um die Beteiligung der sGC an der NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α zu untersuchen, wurden DETA-NO stimulierte MZ zeitgleich mit ODQ, einem Inhibitor der sGC inkubiert. Die durch NO verursachte Erhöhung der PDGFR-α-Proteinmenge konnte durch die gleichzeitige Zugabe von ODQ komplett gehemmt werden. Die Behandlung von MC mit dem sGC-Aktivator YC-1 imitierte andererseits den NO-Effekt. Beide Versuche zusammengenommen beweisen die Notwendigkeit der sGC-Aktivierung zur NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α. Da viele Gene schon auf Transkriptionsebene durch NO beeinflusst werden, wurde der an einen Vektor gebundene PDGFR-α-Promotor vor das Luziferase-Gen kloniert und MZ mit diesem Konstrukt transfiziert. Die transfizierten MZ wurden mit DETA-NO oder 8-BromocAMP stimuliert. cAMP erhöht die Aktivität des PDGFR-α-Promotors und diente somit als Positivkontrolle. Die Promotoraktivität wurde indirekt über das Luziferase-Renilla-System bestimmt. Da NO im Gegensatz zu 8-Bromo-cAMP die Promotoraktivität nicht erhöhte, ist davon auszugehen, dass die NO-abhängige Induktion des PDGFR-α posttranskriptionell erfolgt oder, dass das NO-responsive Element nicht in unserem Konstrukt enthalten war.
Im letzten Abschnitt meiner Arbeit wurde die Funktionsfähigkeit des neusynthetisierten PDGFR-α Proteins bestätigt. Hierzu wurde die Phosphorylisierung vom PDGFR-α und von einem weiteren in der PDGF-Signalkaskade angeordneten Enzym, der antiapoptotisch wirksamen Proteinkinase B (PKB) untersucht. Mit DETA-NO vorbehandelte MZ wurden mit PDGF-BB stimuliert und eine Nachweisanalyse mit einem Phospho-spezifischen Antikörper der gegen pTyr720-PDGFR-α (pPDGFR-α) gerichtet ist, durchgeführt. Der Vergleich mit nichtvorbehandelten MZ belegt eindeutig, dass die NO vermittelte Erhöhung der basalen PDGFR-α-Proteinmenge auch zu einer Zunahme an detektierbarem pPDGFR-α führt, die dann wiederum eine Verstärkung der Signaltransduktion zur Folge hat. So konnten in DETANO vorbehandelten MZ, die mit dem α-Rezeptor spezifischen Liganden PDGF-AA stimuliert wurden, eine vergleichsweise erhöhte PKB-Phosphorylierung festgestellt werden. In einer Kooperation mit Dr. L. Schäfer (Universität Münster) konnte ferner gezeigt werden, dass die NO-Abhängigkeit der PDGFR-α Proteinexpression auch im Krankheitsverlauf eines experimentellen Glomerulonephritismodells, zu beobachten ist. Durch WB-Analysen und immunhistologischen Färbungen konnte dargelegt werden, dass die Vorinjektion des iNO-Sspezifischen Inhibitors L-NIL die Produktion von phosphoryliertem und unphosphoryliertem PDGFR-α Protein in Anti-Thy.1.1-behandelten Ratten signifikant hemmt. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass NO über eine Aktivierung der sGC, die Produktion von funktionsfähigem PDGFR-α- Protein in vitro und in vivo steigert. Die pathophysiologische Bedeutung der NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α im Krankheitsprozess der GN, wird gegenwärtig in weiteren in vivo Experimenten untersucht.
Das Gleichgewicht zwischen den Sphingolipiden Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt eine entscheidende Rolle für das Schicksal einer Zelle. Es ist bekannt, dass Ceramid proapoptotisch wirkt, wohingegen S1P antiapoptotische und entzündungshemmende Signalwege induziert [6]. Eine Beeinflussung der Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme sowie eine daraus resultierende gestörte Balance zwischen Ceramid und S1P ist somit ein Merkmal diverser entzündlicher Krankheiten wie der Asthma bronchiale, der Colitis ulcerosa [148] oder auch verschiedenen Arten von Tumoren [199]. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Ceramid-abbauenden neutralen Ceramidase (NCDase) und der S1P-synthetisierenden Sphingosinkinase 1 (SK1) in verschiedenen Nierenzellen. Ein Fokus wurde dabei auf die Regulierung dieser Enzyme durch entzündungshemmende Corticosteroide in Ratten Mesangiumzellen gelegt, wobei diese Zellen entscheidend in der Entstehung entzündlicher Nierenerkrankungen wie einer Glomerulonephritis sind. Weiterhin wurde der Einfluss der Mutation putativer Phosphorylierungsstellen der NCDase auf die Regulierung dieses Enzyms in HEK293 Zellen untersucht und in einem dritten Teil der Arbeit schließlich die Expression und die Funktion der SK1 in der humanen Niere im Vergleich zum Nierenzellkarzinom analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide (GCs) Mesangiumzellen durch eine Steigerung der intrazellulären S1P-Konzentrationen vor durch Stress induzierter Apoptose schützen. Diese Beeinflussung des Sphingolipid-Rheostats beruhte auf einer gesteigerten mRNA- und Proteinexpression der Sphingosinkinase 1 (SK1) und der neutralen Ceramidase (NCDase). Außerdem wurde nachgewiesen, dass der Promotor der NCDase durch GCs aktivierbar ist und dass zwei Glucocorticoid-responsive-Elemente (GREs) innerhalb der Promotorsequenz durch die Bindung von Glucocorticoidrezeptoren (GRs) diese Aktivierung bewirken. In vivo Experimente mit isolierten Glomeruli, die aus mit Dexamethason behandelten Mäusen gewonnen wurden, zeigten ebenfalls eine Erhöhung der mRNA-Expression und Aktivität der SK1 sowie eine gesteigerte Proteinexpression der NCDase. Somit wurde erstmals ein direkter Einfluss von GCs auf den Sphingolipidmetabolismus in Mesangiumzellen beschrieben.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation zweier putativer Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen (T253A und T420/23A) in der Sequenz der murinen NCDase zu einem verlangsamten Reifungsprozess dieses Enzyms führt. Western Blot-Analysen ergaben, dass der überexprimierte NCDase-WT zwei unterschiedlich glykosylierte Isoformen mit einem Molekulargewicht von 120 und 130 kDa exprimiert, welche stetig durch einen aktiven Prozess sezerniert werden. Im Gegensatz dazu war in den Mutanten ausschließlich die 130 kDa-Form im Zellkulturüberstand und die 120 kDa-Form im Lysat zu finden. Im Gegensatz zum WT lokalisierten die Mutanten lediglich an intrazellulären Membranen und nicht zusätzlich an der Plasmamembran. In Lysaten von Zellen die die Mutanten exprimierten, konnte eine verringerte relative Aktivität gemessen werden, die der sezernierten mutierten Formen hingegen war erhöht. Daher wurde vermutet, dass die 130 kDa-Form die reife Plasmamembran-gebundene und anschließend sezernierte, aktivere Isoform der NCDase darstellt. Die Inkubation von Mesangiumzellen mit Zellkulturüberständen, die den sezernierten NCDase-WT enthielten, führte zum Schutz vor durch Stress induzierter Apoptose. Somit kann eine auto- bzw. parakrine Funktion der sezernierten NCDase angenommen werden.
Dem dritten Teil der Arbeit lag die erstmalige Beschreibung der SK1-Expression in der gesunden humanen Niere zugrunde. Es konnte gezeigt werden, dass diese im Zytoplasma sowie an Membranen von Zellen des proximalen Tubulus sowie in geringerem Maße in Podozyten und Mesangiumzellen des Glomerulus exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wurde die SK1 in Biopsien von Patienten mit Nierentumor im Nukleus gefunden. Die Untersuchung der SK1-Expression in 5 verschiedenen Nierentumorzelllinien im Vergleich zu Epithelzellen des proximalen Tubulus (Human Kidney 2 - HK2-Zellen) ergaben, dass sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expression der SK1 in Föhn-Zellen stark erhöht, in ACHN3-Zellen hingegen signifikant niedriger war. Zudem konnte auch in den Föhn-Zellen eine nukleäre Expression der SK1 nachgewiesen werden. Die Behandlung von HK2-, ACHN3- und Föhn-Zellen mit dem Transforming Growth Factor-ß2 (TGF-ß2) resultierte in einer transkriptionellen Steigerung der SK1-Expression. Die Herunterregulierung der SK1 in diesen Zellen führte zu einem Arrest der Zellen in der S Phase, wohingegen die Überexpression der SK1 in den ACHN3-Zellen zu einem signifikanten Schutz vor Apoptose führte.
Zusammenfassend sind die Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme NCDase und SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit pathologischen Prozessen wie Entzündung, Apoptose und Proliferation einhergehen, wie es bei Glomerulonephritiden und bei Nierentumoren der Fall ist.
During the past several years, ceramide has emerged as an important second messenger triggering cell responses including proliferation, differentiation, growth arrest and apoptosis. This thesis has focused on the regulation of neutral ceramidase which critically determines, in concert with ceramide generating sphingomyelinases, the intracellular ceramide levels. In the first part it is reported that besides a rapid and transient increase in neutral sphingomyelinase activity a second delayed peak of activation occurs after hours of IL-1beta treatment. This second phase of activation is first detectable after 2 h of treatment, and steadily increases over the next two hours reaching maximal values after 4 h. In parallel, a pronounced increase in neutral ceramidase activity is observed, which accounts for a constant or even decreased level of ceramide after long-term IL-1beta treatment, despite continuous sphingomyelinase activation. The increase in neutral ceramidase activity is due to expressional up-regulation, as detected by an increase in mRNA level and enhanced de novo protein synthesis. The increase of neutral ceramidase protein levels and activity can be blocked dosedependently by the p38- mitogen-activated protein kinase (p38-MAPK) inhibitor, SB 202190, whereas the classical MAPK pathway inhibitor U0126, and the PKC inhibitor Ro 31-8220 were ineffective. Moreover, co-treatment of cells for 24 h with IL-1~ and SB 202190 leads to an increase in ceramide formation. Interestingly, IL-1beta-stimulated neutral ceramidase activation is not reduced in mesangial cells isolated from mice deficient in MAPK-activated protein kinase 2 (MAPKAPK-2), which is one possible downstream substrate of the p38-MAPK, thus suggesting that the p38-MAPK-mediated induction of neutral ceramidase occurs independently of MAPKAPK-2. The results suggest a biphasic regulation of sphingomyelin hydrolysis in cytokine-treated mesangial cells with a delayed de novo synthesis of neutral ceramidase counteracting sphingomyelinase activity and apoptosis. Neutral ceramidase may thus represent a novel cytoprotective enzyme for mesangial cells exposed to inflammatory stress conditions. In a second part, the effect of NO on neutral ceramidase was studied. Ceramide levels are strongly increased in a delayed fashion by stimulation of renal mesangial cells with NO. This effect is due to a dual action of NO, comprising an activation of sphingomyelinases and an inhibition of ceramidase activity. The inhibition of neutral ceramidase activity correlates with the decrease of neutral ceramidase protein. A complete loss of neutral ceramidase protein is obtained after 24h of NO stimUlation. Moreover, the NO-induced degradation is reversed by the protein kinase C (PKC) activator, 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) , but also by the physiological PKC activators platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), angiotensin II and ATP, resulting in a normalisation of neutral ceramidase protein as well as activity. In vivo phosphorylation studies using 32Pj-labelled mesangial cells, reveal that TPA, PDGF-BB, angiotensin II and ATP trigger an increased phosphorylation of the neutral ceramidase, which is blocked by the broad-spectrum PKC inhibitor Ro-31 8220, but not by CGP 41251, which has a preferential action on Ca2+-dependent PKC isoforms, thus suggesting the involvement of a Ca2+-independent PKC isoenzyme. In vitro phosphorylation assays using recombinant PKC isoenzymes and neutral ceramidase immunoprecipitated from unstimulated mesangial cells, show that particularly the PKC-alpha isoform, and to a lesser extent the PKC-a isoform, are efficient in directly phosphorylating neutral ceramidase. The data show that NO is able to induce degradation of neutral ceramidase thereby promoting accumulation of ceramide in the cell. This effect is reversed by PKC activation, most probably by the PKC-delta isoenzyme, which may directly phosphorylate and thereby, prevent neutral ceramidase degradation. In the third chapter it is demonstrated that the NO-triggered degradation of neutral ceramidase involves activation of the ubiquitin/proteasome complex. The specific proteasome inhibitor, lactacystin, completely reverses the NO-induced degradation of ceramidase protein and neutral ceramidase activity. As a consequence, the cellular amount of ceramide, which drastically increases by NO stimulation, is reduced in the presence of lactacystin. Furthermore, ubiquitinated neutral ceramidase accumulates after NO stimulation. The data clearly show that the ubiquitin/proteasome complex is an important determinant of neutral ceramidase activity and thereby regulates the availability of ceramide. In a last part, the cellular localisation of neutral ceramidase was investigated using green fluorescent protein (GFP) as fusion protein to examine cellular distribution and translocation of neutral ceramidase. Unstimulated HEK 293 cells reveal after transient transfection experiments that neutral ceramidase is preferentially localized in the cytoplasm. PKC activation led to an accumulation of neutral ceramidase at the nuclear membrane. In summary, this work demonstrates that the neutral ceramidase is a fine regulated protein that plays a critical role in regulating intracellular ceramide levels and thereby the cell's fate to undergo apoptosis or survive. Regulation of neutral ceramidase can be achieved on all levels, i.e. on the mRNA level, the protein level or posttranslationally by phosphorylation and subcellular translocation. Future work will reveal whether neutral ceramidase can serve as a therapeutic target in the development of novel antiinflammatory and anti-tumour drugs.
Caspase-2 is the evolutionary most conserved member of the caspase family and was shown to be involved in genotoxic stress induced apoptosis, control of aneuploidy, and ageing related metabolic changes. However, its role in apoptosis seems redundant due to the observation, that knockout does not inhibit apoptotic signalling exclusively. Instead, knockout of caspase-2 leads to tumor susceptibility in vivo, which led to the assumption, that caspase-2 has non-apoptotic functions and can act as a tumor suppressor. The underlying mechanism of the tumor suppressor activity of caspase-2 has not been clarified so far. Furthermore, caspase-2, has a prominent, and as pro-enzyme exclusive localisation in the nucleus and other subcellular compartments, implicating a distinct and location specific role.
In this study, a novel caspase-2 specific substrate, termed p54nrb, was identified. P54nrb is harbouring a caspase-2 specific cleavage site at the aspartate residue D422, and cleavage of p54nrb leads apparently to disruption of its putative DNA binding domain at the C-terminus.
P54nrb is a nuclear multifunctional RNA and DNA binding protein, known for roles in transcriptional regulation, DNA unwinding and repair, RNA splicing, and retention of defective RNA. Overexpression of p54nrb has been observed in several human cancers, such as cervix carcinoma, melanoma, and colon carcinoma.
Data from this study revealed, that depletion of p54nrb in tumor cell lines results in a loss of resistance to drug induced cell death and to reduced capability of anchorage independent growth, which is functionally equivalent to a reduced tumorigenic potential. Meanwhile, p54nrb depletion alone is not cytotoxic.
The investigation of p54nrb dependent gene regulations by high resolution quantitative proteomics uncovered an altering expression of multiple tumorigenic genes. For two of these candidates, the tumorigenic protease cathepsin-Z and the anti-apoptotic gelsolin, p54nrb dependent expression was detected universally in all three investigated tumor cell lines, cervix carcinoma, melanoma, and colon carcinoma. Additionally, a direct interaction of p54nrb with the cathepsin Z and gelsolin encoding DNA, but not with their corresponding mRNA, could be demonstrated.
Conjointly, this study unveils a novel mechanistic feature of caspase-2 as a tumor suppressor. The caspase-2—p54nrb axis can orchestrate the levels of several tumorigenic proteins and thereby determine the cell death susceptibility and long-term tumor survival. These findings might be of great value for future therapeutic interventions and for overcoming drug resistance of tumors.