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In optogenetischen Anwendungen, welche die Manipulation von zellulären Aktivitäten durch Licht ermöglichen, werden die Eigenschaften von mikrobiellen Rhodopsinen, einer Familie natürlich vorkommender lichtgesteuerter Proteine, ausgenutzt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die einwärts transportierende Protonenpumpe NsXeR, sowie die auswärts Natriumionenpumpe KR2 untersucht. Des Weiteren wurden Tandem Proteine betrachtet, die mikrobielle Rhodopsine kombinieren mit dem Chemokinrezeptor CXCR4, der durch SDF1 aktiviert und anschließend in Endosomen internalisiert wird.
Für die Untersuchung des Mechanismus, der die Vektorialität in NsXeR bestimmt, wurde eine umfassende elektrophysiologische Studie durchgeführt. In Patch Clamp Messungen an NsXeR exprimierenden NG108-15 Zellen wurden bei kontinuierlicher 561 nm Beleuchtung aktive Einwärtsströme entgegen eines elektrochemischen Gradienten gemessen. Ein Einfluss des intrazellulären pHs auf die steady-state Ströme und deren Abfallkinetik konnte nicht festgestellt werden. Der Vergleich der exponentiellen Abfallrate k2 mit den Übergängen im NsXeR Photozyklus, lässt den Schluss zu, dass der ratenlimitierende Schritt der MII Zerfall ist.
Die elektrogenen Schritte im NsXeR Photozyklus wurden mit elektrischen Messungen an der black lipid membrane (BLM) an NsXeR Proteoliposomen bestimmt. Die Belichtung mit 20 ns Lichtpulsen bei 556 nm rufen Spannungssignale hervor, die exponentiell gefittet wurden, wobei drei elektrogene Schritte identifiziert werden konnten. Bei pH 7.4 betrugen die ermittelten Zeitkonstanten etwa 220 µs, 1 ms und 15 ms, denen 42%, 10% und 48% an der Gesamtladungsverschiebung zugeordnet wurden. Die elektrogenen Schritte konnten den Übergängen im Photozyklus zugeordnet werden, wobei der erste Schritt mit t1 dem MI Aufbau (Deprotonierung Schiff’sche Base, Protonenabgabe zur intrazellulären Seite) zugeschrieben wurde. t2 wurde dem MI→MII Übergang (Switch, Zugänglichkeitsänderung vom Intra- zum Extrazellulären) zugeordnet und t3 korreliert mit dem MII Zerfall (Reprotonierung Schiff’sche Base, Protonenaufnahme von der extrazellulären Seite).
Die Kinetik und der Ladungstransportanteil des zweiten elektrogenen Schritts haben keine starke pH Abhängigkeit, was sich dadurch erklären lässt, dass t2 durch eine Konformationsänderung bestimmt wird. t1 und t3 werden bei höheren pH Werten beschleunigt, was sich bei t1 mit einer erleichterten intrazellulären Protonenabgabe erklären lässt. Für t3 wurde eine Reprotonierung durch eine Donor Gruppe Asp76 vorgeschlagen. Die pH-sensitive Änderung der relativen Ladungstransferanteile des ersten und dritten elektrogenen Schrittes (∆ΨI und ∆ΨIII) wurden durch eine mögliche Verzögerung der frühen Protonenabgabe bei niedrigen pH Werten erklärt.
Der mutmaßliche Protonenakzeptor Asp220 wurde gegen Asn und Glu ausgetauscht und in Patch Clamp sowie UV-Vis Spektroskopie Messungen untersucht. Für D220N wurden keine Pumpströme und kein Einfluss auf die maximale Absorptionswellenlänge λmax festgestellt. D220E dagegen führte zu einer Erniedrigung des pKa-Werts der Schiff’schen Base und zu einer Verminderung der Iss-Abfallsrate k2 in Patch Clamp Dauerbelichtungsmessungen (D220E k2 = 27.1 ± 1.8 Hz, Wildtyp k2 = 83.1 ± 2.6 Hz). Daraus konnte geschlossen werden, dass Asp220 wesentlich für den Protonentransport ist und nicht als Gegenion für die protonierte Schiff’sche Base dient.
In Patch Clamp Experimenten bei 561 nm Dauerbelichtung und zusätzlicher gepulster Belichtung bei 355 nm wurde der Blaulichteffekt an NsXeR untersucht, bei dem Proteine im M Intermediat ein Photon absorbieren und unter Reprotonierung der Schiff’schen Base in den Grundzustand zurückkehren.
Für NsXeR konnte eine Potentialabhängigkeit für die Richtung der transienten Ströme, die durch die
355 nm Belichtung hervorgerufen wurden, festgestellt werden. Beim NsXeR Blaulichteffekt scheint eine
Reprotonierung der Schiff’schen Base von beiden Seiten möglich zu sein, was auf die unterschiedlichen Zugänglichkeiten in den beiden M Zuständen MI und MII zurückgeführt wurde. Es wurde ein Modell vorgeschlagen, welches auf einem potentialabhängigen Gleichgewicht zwischen MI und MII basiert.
In Patch Clamp Messungen an KR2 exprimierenden NG108-15 Zellen wurden die Pumpströme untersucht, die durch den auswärts Transport von Na+ und H+ hervorgerufen wurden. Die Na+-Konzentrationen der intra- und extrazellulären Lösungen wurden symmetrisch variiert und die steady-state Ströme Iss bei 532 nm Dauerbelichtung betrachtet. Mit steigender Na+-Konzentration zeigte sich ein Übergang von einer linearen Potentialabhängigkeit der Iss, zu einem sättigungsähnlichen Verhalten bis hin zu einer fast glockenförmigen Form. Da die exponentielle Abfallrate der steady-state Ströme k2 in ihrer Potentialabhängigkeit mit den Iss korrelierte, konnte geschlossen werden, dass die Ströme überwiegend kinetisch limitiert sind. Die Erhöhung der Rate k2 mit steigender Na+-Konzentration zwischen -120 mV und -60 mV deutet darauf hin, dass die Na+-Aufnahme von der intrazellulären Seite bei diesen Bedingungen die Limitierung für die Pumpe darstellt.
Unter Na+-“freien” Bedingungen wurde der Einfluss des intrazellulären pHs untersucht. Für die Rate k2 wurde eine Erhöhung bei niedrigen pH Werten festgestellt und die Potentiale E0 (Iss = 0 pA) verschoben bei niedrigem intrazellulärem pH zu hyperpolarisierenden Potentialen. Daraus lässt sich schließen, dass die steady-state Ströme durch den Transport von Protonen hervorgerufen wurden.
In Messungen mit gepulster 530 nm Belichtung wurden die transienten Pumpströme gemessen und durch exponentielles Fitten des Stromabfalls drei elektrogene Schritte identifiziert. Eine Abhängigkeit vom Potential und der Na+-Konzentration konnte nur für den dritten Schritt mit der Rate 1/τ3 festgestellt werden, wobei 1/τ3 mit der Na+-Konzentration und bei positiveren Potentialen steigt. Unter Na+-“freien” Bedingungen steigt 1/τ3 auch mit niedrigeren intrazellulären pH Werten. Die elektrogenen Schritte wurden dem KR2 Photozyklus zugeordnet, wobei ein Modell angewendet wurde, das einen M1→M2 Übergang einführt. Diesem wurde der zweite elektrogene Schritt zugeordnet. Die relativen Ladungstransportanteile Q2 und Q3 des zweiten und dritten elektrogenen Schrittes sind sowohl potential- als auch Na+-abhängig. Um dieses Verhalten zu erklären, wurde ein Modell vorgeschlagen, bei dem ein Ausgleichsladungstransfer in Form von einer Protonenabgabe und -wiederaufnahme während des Photozyklus eingeführt wurde.
In Patch Clamp Messungen wurde die erhaltene Funktionalität der ChR2 Mutante ChR2(L132C) mit erhöhter Ca2+-Permeabilität im Tandem Protein tCXCR4/CatCh nachgewiesen. Auch die Internalisierung von tCXCR4/CatCh konnte anhand der zeitabhängigen Abnahme des CatCh-Signals nach der CXCR4-Aktivierung durch SDF1 in Strommessungen beobachtet werden. Für tCXCR4/Arch, ein Tandem Protein mit einer Protonenpumpe, wurde die SDF1-induzierte Internalisierung mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie betrachtet und eine Kolokalisierung der Fluoreszenz des im Tandem exprimierten YFP und der eines gelabelten CXCR4-spezifischen Antikörpers in intrazellulären Vesikeln beobachtet. Bei Behandlung mit dem CXCR4 Antagonisten AMD3100 wurde die Kolokalisierung hauptsächlich in der Zellmembran festgestellt, da die Internalisierung blockiert war. Die Tandem Protein könnten als in intrazellulären Organellen wirkende optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden für z.B. die Manipulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration.
Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von molekularen Systemen, die aus mehreren Chromophoren bestehen und über einen Zweiphotonen-Prozess aktiviert werden können.
Die Zweiphotonen-Absorption (2PA) beschreibt die nahezu simultane Absorption zweier Photonen, deren Summe die Energie ergibt, die für den entsprechenden elektronischen Übergang nötig ist. Da für die Anregung somit zwei niederenergetische Photonen benötigt werden, kann für die 2PA Nahinfrarot-Licht (NIR-Licht) verwendet werden, welches eine geringe Phototoxizität aufweist und eine tiefe Gewebedurchdringung ermöglicht. Weiterhin wird durch die intrinsische dreidimensionale Auflösung der 2PA eine hohe Ortsauflösung der Photoaktivierung erzielt.
Photolabile Schutzgruppen (PPGs) bzw. Photocages sind chemische Verbindungen, die der vorübergehenden Maskierung der biologischen Funktion eines (Makro-)Moleküls dienen. Sie können durch Licht geeigneter Wellenlängen abgespalten werden (uncaging), wodurch die Aktivität des geschützten Substrats wiederhergestellt wird. Leider weisen viele der etablierten PPGs schlechte Zweiphotonen-Eigenschaften auf. Um die 2P-Aktivität einer PPG zu erhöhen, kann sie kovalent mit einem guten Zweiphotonen-Absorber verknüpft werden, der bei Bestrahlung das Licht über einen Zweiphotonen-Prozess absorbiert und anschließend mittels Energietransfer auf die photolabile Schutzgruppe überträgt. Dies führt schließlich zur Uncaging-Reaktion.
Im Zuge von Projekt I dieser Dissertation wurde eine solche molekulare Dyade für verbessertes Zweiphotonen-Uncaging bestehend aus einem Rhodamin-Fluorophor als Zweiphotonen-Absorber und einem Rotlicht-absorbierenden BODIPY als photolabile Schutzgruppe hergestellt und charakterisiert. Die Zweiphotonen-Aktivität des Fluorophors wurde mittels TPEF-Messungen (two-photon excited fluorescence) untersucht. Anschließend wurde das Rhodamin an einen 3,5-Distyryl-substituierten BODIPY-Photocage gekuppelt. Der Energietransfer innerhalb dieser Dyade wurde mithilfe von transienter Ultrakurzzeit-Spektroskopie und quantenmechanischen Berechnungen untersucht. Die Freisetzung der Abgangsgruppe para-Nitroanilin (PNA) bei Belichtung der Dyade konnte sowohl nach Einphotonen-Anregung des Rhodamins als auch des BODIPYs mithilfe von UV/vis-Absorptionsmessungen qualitativ nachgewiesen werden.
Da die Uncaging-Reaktion allerdings nicht besonders effektiv war, wurde für die Weiterführung des Projekts ein neuer BODIPY Photocage, der eine verbesserte Photolyse-Effizienz und eine höhere Photostabilität aufwies, verwendet und erneut an einen Rhodamin-Fluorophor geknüpft. Anhand dieser optimierten Dyade konnte die Einphotonen-Photolyse quantifiziert, d.h. eine Uncaging-Quantenausbeute für die Freisetzung von PNA bestimmt werden. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Photolyse der Dyade mit einer deutlichen Änderung ihrer Fluoreszenzeigenschaften einherging. Dies ermöglichte einen Nachweis des Zweiphotonen-Uncagings mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Die Dyaden-Moleküle wurden zur Immobilisierung in Liposomen eingeschlossen und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop belichtet. Sowohl nach Einphotonen- als auch nach Zweiphotonen-Anregung der Rhodamin-Einheit konnte die gewünschte Fluoreszenzänderung beobachtet und somit das Uncaging bestätigt werden.
In Projekt II der Dissertation wurde ein photoaktivierbarer Fluorophor (PAF) hergestellt. PAFs liegen in ihrer geschützten Form dunkel vor. Durch die Aktivierung mit Licht können sie Fluoreszenzsignale emittieren. Sie liefern somit ein direktes Feedback über die Lichtverteilung und –intensität innerhalb einer Probe und werden somit unter anderem für die Charakterisierung und Optimierung von Belichtungsapparaturen verwendet. Besonders wünschenswert ist hierbei eine Fluoreszenzaktivierung mit sichtbarem Licht bzw. mit NIR-Licht über einen Zweiphotonen-Prozess.
Im Zuge der Arbeit wurde ein Rhodamin-Derivat synthetisiert, das durch die Anbringung eines DEACM450-Photocages in seine nichtemittierende Form gezwungen wurde. Bei Bestrahlung mit 455 nm konnte die Abspaltung der Cumarin-Schutzgruppe und der damit verbundene Anstieg der Rhodamin-Fluoreszenz beobachtet und eine Uncaging-Quantenausbeute bestimmt werden. Für die Untersuchung der Zweiphotonen-Photolyse wurde der geschützte Fluorophor in einem Hydrogel immobilisiert und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Anschließend wurden Fluoreszenzbilder vor und nach Photoanregung von bestimmten Regionen des Hydrogels aufgenommen. Durch das Uncaging der Probe konnten helle, definierte Muster geschrieben und ausgelesen werden. Die Photoaktivierung führte dabei sowohl über die Einphotonen-Anregung mit blauem Licht (488 nm) als auch über die Zweiphotonen-Anregung mit NIR-Licht (920 nm) zur Generierung von stabilen, gleichmäßigen Fluoreszenzmustern mit hohem Kontrast.
Verschiedene physikalische Effekte erlauben es Licht so zu führen und zu verändern, dass es Einblicke in für Menschen sonst unzugängliche Bereiche gewährt. Eines von insgesamt drei Elementen dieser Dissertationsschrift ist der Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops. Dieses fortschrittliche Werkzeug erweitert das zur Verfügung stehende Instrumentarium um verschiedene Analysemethoden, allen voran die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch geringfügige Modifikationen können auch weitere Methoden, wie beispielsweise stimulierte Raman-Streuung realisiert werden.
Insbesondere die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie war für das zweite Element dieser Dissertationsschrift von großer Bedeutung. In dieser Studie wurde das Bleichverhalten von Spinach bei 2-Photonen-Absorption untersucht, sowohl an frei in Lösung befindlichen als auch auf einem Träger immobilisierten Spinach-Komplexen. Die Ergebnisse zu den frei in Lösung befindlichen Spinach-Komplexen zeigen, dass die Verstärkung der Fluoreszenz von DFHBI grundsätzlich auch im Fall der 2-Photonen-Absorption eintritt. Dabei wurde ein Ausbleichen der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz für frei in Lösung befindliche Spinach-Komplexe erst bei außerordentlich hohen Intensitäten der Anregungsstrahlung beobachtet. Dieser Befund kann zumindest teilweise auf das Eindiffundieren fluoreszenter Spinach-Komplexe in das sehr kleine Fokalvolumen innerhalb der 2-Photonen-Anregung stattfindet zurückgeführt werden. Für immobilisierte Spinach-Komplexe konnte gezeigt werden, dass eine kontinuierliche Bildaufnahme gegenüber einer Bildaufnahme in Intervallen mit jeweils zusätzlichen Dunkelphasen zur Erholung des reversiblen Bleichens der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz, sowie der generelle Verzicht auf spezielle Belichtungsschemata und Methoden der Datenakquise mit keinen besonderen Nachteilen verbunden ist. Abschließend betrachtet erweist sich Spinach bei 2-Photonen-Anregung als ausgesprochen resistent gegenüber einem irreversiblem Ausbleichen des Fluoreszenzsignals.
Als drittes Element dieser Dissertationsschrift wurde die Dynamik von Chrimson, einem Kanalrhodopsin mit rot-verschobener Absorption mittels zeitaufgelöster Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Sowohl die Anregungswellenlänge als auch der pH-Wert bzw. der Protonierungszustand des Gegenions haben einen messbaren Einfluss auf die Primärreaktion. Diese verlangsamt sich, sobald der pH-Wert abgesenkt oder die Anregungswellenlänge rot-verschoben wird. Darüber hinaus führt eine Rot-Verschiebung der Anregungswellenlänge zu einer geringeren Effizienz der Isomerisation des Retinal-Chromophors. Die Primärreaktion von Chrimson entspricht dabei einem Reaktionsmodell mit einer Verzweigung des Reaktionspfades auf der Energiehyperfläche des angeregten Zustandes. Ein Reaktionspfad führt dabei durch ein lokales Minimum, welches in seiner Ausprägung stark von der elektrostatischen Umgebung des Retinal-Chromophors abhängt. Je nach ursprünglichem Protonierungszustand des Gegenions der Retinal-Schiff-Base wurden große Unterschiede hinsichtlich der beobachteten transienten Absorptionsmuster für den im Anschluss von Chrimson durchlaufenen Photozyklus gefunden. Bei pH 6,0 weist der Photozyklus von Chrimson eine insgesamt deutlich schnellere Kinetik auf, als es für den Photozyklus bei pH 9,5 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, dass in elektrophysiologischen Messungen für beide Photozyklen eine Öffnung des Ionenkanals gefunden wurde. Die Kanalfunktion von Chrimson ist somit grundsätzlich nicht vom Protonierungszustand des Gegenions abhängig, wenngleich die Kinetik des Ionenkanals durchaus davon beeinflusst wird. Dies deutet auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen dem Ionenkanal und dem Gegenion der Retinal-Schiff-Base hin.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die schnelle Energietransfer- (EET) und Elektronentransfer (ET)-Dynamik unterschiedlichster Quantenpunkte (QD) spektroskopisch untersucht. Die untersuchten Systeme bestanden in den meisten Fällen aus Donor-Akzeptor-Paaren, bei denen die Halbleiternanokristalle als Donor fungierten. Der Fokus lag dabei auf der gezielten Anpassung des Donors, um die optimale Funktionalität zu erreichen. Die Untersuchung der Nanokristalle erstreckte sich daher von einfachen Kernen über verschiedene Kern-Schale-Partikel bis hin zu völlig anderen Strukturen wie Nanoplatelets (NPL). Als Akzeptor wurden eine Vielzahl von Molekülen verwendet, die sich als Elektronen- und/oder Energieakzeptoren für die verschiedenen QDs eignen.
Die Steuerung biochemischer Prozesse oder die Verbesserung von Materialien erfordert zunächst ein tiefgründiges Verständnis über die zugrundeliegenden Systeme. Zur Untersuchung eignet sich Licht als ideales Werkzeug, da hiermit nützliche Informationen über die chemische Struktur, ihre Eigenschaften sowie den zusammenhängenden, schnellen Reaktionsabläufen erhalten werden können. Um die Aufklärung zu erleichtern können kleine, chemische Verbindungen eingeführt werden, welche beispielsweise ein Fluoreszenzmarker, eine photolabile Schutzgruppe oder eine photoschaltbare Verbindung sein können. Von jeweils einem Vertreter dieser Moleküle wurden unterschiedliche Studien durchgeführt, dessen Ergebnisse in dieser Arbeit in insgesamt drei Projekten zusammengefasst werden.
Zunächst wurde die Funktionalität der Helikase RhlB untersucht, die der Familie der DEAD-Box Proteine zugeordnet wird, und RNA-Duplexe in ihre Einzelstränge entwindet. Als RNA-Modellduplex diente JM2h, an dem ein RNA-Einzelstrang fluoreszenzmarkiert war (M2AP6). Die Einführung dieses Markers ermöglichte die Durchführung von statischen Fluoreszenzmessungen sowie von Mischexperimenten, die mit Hilfe der stopped-flow-Technik durchgeführt wurden. In den einleitenden Studien wurde die Helikase weggelassen, wodurch der Fokus auf den Fluoreszenzeigenschaften der RNA gelegt wurde. Die Ergebnisse hierzu zeigten, dass die Fluoreszenzintensität des Einzelstrangs durch Zugabe des komplementären Strangs deutlich abnimmt, wobei das Minimum bei einem äquimolaren Verhältnis erreicht wird. Die dazugehörigen stopped-flow-Messungen zeigten eine Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion, wenn höhere Konzentrationen des Gegenstrangs in der Lösung vorhanden waren. Nach anschließender Zugabe der Helikase zur Lösung wurde ein Anstieg der Fluoreszenzintensität erwartet, der vom separierten Einzelstrang M2AP6 herrühren sollte. Dieser Anstieg wurde jedoch erst nach weiterer Zugabe von ATP beobachtet, der auf eine ATP-Abhängigkeit der Entwindungsreaktion von RhlB hindeutet. Diese Abhängigkeit wurde auch bereits für andere Helikasen der DEAD-Box Familie entdeckt. Die korrekte Funktionalität sowie die ATP-Abhängigkeit wurden in stopped-flow-Messungen verfiziert, bei denen der Fluoreszenzanstieg auch zeitaufgelöst betrachtet werden konnte. Für die spektralen Korrekturen der Fluoreszenzspektren wurde ein selbstgeschriebenes MATLAB-Programm namens FluCY verwendet (engl.: Fluorescence Correction & Quantum yield), welches eine schnelle und fehlerfreie Verarbeitung des Datensatzes ermöglichte.
Die zwei im folgenden beschriebenen Projekte handeln von photoaktivierbaren Molekülen. Zum einen photolabile Verbindungen, welche die Funktion z.B. eines Biomoleküls durch eine chemische Modifikation deaktivieren können. Durch eine lichtinduzierte Reaktion kommt es zur Abspaltung der Modifikation und die Funktion ist wiederhergestellt. In dieser Arbeit wurden verschiedene photolabile Schutzgruppen untersucht, die denselben Chromophor BIST (BIsStyryl-Thiophen) tragen. Durch die Einführung dieses Chromophors absorbierten sämtliche untersuchte Verbindungen sehr effizient sichtbares Licht (epsilon(445)=55.700 M^(-1) cm^(-1)), wodurch der photoinduzierte Bindungsbruch mit Wellenlängen durchgeführt werden, die bei einer biologischen Anwendungen keinen Schaden an der Zelle anrichten würden. Hieraufhin wurden in statischen und zeitaufgelösten Absorptionsmessungen Teilschritte der Freisetzungsreaktion untersucht, indem nach Photoanregung die Absorptionsänderungen auf verschiedenen Zeitskalen analysiert wurden. Die ultraschnelle Dynamik im Piko- bis Nanosekundenbereich (10^(-12)-10^(-9) s) wird durch eine spektral breite, positive Absorptionsänderng dominiert. Diese impliziert, dass die Deaktivierung über den Triplettpfad abläuft, der die vergleichsweise niedrigen Freisetzungsausbeuten erklärt (phi(u) < 5). Aufgrund des hohen Extinktionskoeffizienten reichen dennoch bereits niedrige Strahlungsdosen aus, um eine Freisetzung zu initiieren. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieser Reaktion ist dem Zerfall des aci-nitro Intermediats zugeordnet. Für ein sekundäres Amin, welches mit BIST geschützt wurde, ist eine Lebensdauer des Intermediats von 71 µs gefunden worden.
In einigen Fällen ist es erwünscht, eine vorliegende Aktivität nicht nur ein-, sondern auch ausschalten zu können, wofür photochrome Verbindungen (oder Photoschalter) verwendet werden. Die in dieser Arbeit untersuchte Verbindung ceCAM ist ein Alken-Photoschalter und vollführt bei Bestrahlung mit Licht eine cis/trans-Isomerisierung. ceCAM ist das Cyanoester-Derivat (ce) von Cumarin-substituierten Allylidenmalonat, von denen beide Konformere sehr effizient sichtbares Licht absorbieren trans: epsilon(489)=50.300 M^(-1) cm^(-1); cis: epsilon(437)=18.600 M^(-1) cm^(-1)). Andere photophysikalische Eigenschaften umfassen u.a. hohe thermische und photochemische Stabilität. Letztere wurde über ein Experiment nachgewiesen, bei dem die lichtinduzierte Isomerisierung alternierend durchgeführt wurde und selbst bei über 250 Zyklen keine signifikate Abnahme der Absorption beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte die Reaktion mit Quantenausbeuten von 39% (trans) und 42% (cis) induziert werden, wobei im photostationären Gleichgewicht auch hohe Isomerenverhältnisse mit bis zu 80% (trans) und 96% (cis) akkumuliert werden konnten. Die Geschwindigkeit der Reaktion wurde mit Hilfe der Ultakurzzeit-Spektroskopie untersucht. Die Dynamik im Zeitbereich von ps-ns zeigte, dass die trans/cis-Isomerisierung unterhalb von 0,5 ns und die umgekehrte Reaktion noch viel schneller (wenige ps) abgeschlossen ist. Durch die Untersuchungen in dieser Arbeit an den BIST-Verbindungen und ceCAM sind viele vorteilhafte, photophysikalische Eigenschaften charakterisiert worden, wodurch sie als verbesserte Alternative zu den bisher bekannten photolabilen Schutzgruppen oder Photoschaltern anzusehen sind.
The membrane protein Green Proteorhodopsin (GPR), found in an uncultured marine γ-proteobacterium, is a retinal binding protein and contains a conserved structure of seven transmembrane helices (A-G). The retinal is bound to a conserved lysine residue (K231) in helix G via Schiff base linkage. It belongs to the widespread family of microbial rhodopsins and functions as a light dependent outward proton pump that bacteria may utilize for establishing a proton gradient across the cellular membrane. Proton pumping takes place after photon absorption, where GPR goes through a series of conformational changes, termed photocycle, causing the proton to be transported across the cellular membrane from the intra-cellular to the extracellular space. It is further mediated by the highly conserved functional residues D97 and E108, which function as the primary proton acceptor and primary proton donor for the protonated Schiff base, respectively. Another functionally important residue is the highly conserved H75 in helix B. It forms an intra-molecular cluster with D97 and is responsible for the high pKa value of the primary proton acceptor, stabilized by a direct interaction between D97 and H75.
Different Proteorhodopsin variants are globally distributed and colour tuned to their environment, depending on the water depth in which they occur. A single residue in the retinal binding pocket at position 105 is responsible for determining the absorption wavelength of the protein. GPR (from eBAC31A08) contains a leucine at position 105, while BPR (blue proteorhodopsin, from Hot75m4) in deeper waters possesses a glutamine. Although GPR shows 79% sequence identity with BPR, a single amino acid substitution (L105Q) in GPR is able to switch the absorption maximum to the one of BPR.
Protein oligomerisation describes the association of subunits (protomers) through non-covalent interactions, forming macromolecular complexes. It is an important structural characteristic of microbial rhodopsins, contributing to structural stability and promoting tight packing of the protomers in the bacterial membrane. GPR was shown to assemble into radially arranged oligomers, mainly pentamers and hexamers. No high resolution crystal structure of the whole GPR complex is available, but the structurally related BPR (Hot75m4) was successfully crystallized, showing pentameric oligomers.
The BPR crystal structure model reveals detailed information about complex assembly of the whole proteorhodopsin family. It reveals the oligomeric structures and shows residues that are part of the protomer interfaces, forming cross-protomer contacts, which is valuable information for the elaborate analysis of cross-protomer interactions of GPR oligomers.
Based on the knowledge of GPR and BPR oligomeric complexes, the aim of this study is to analyse specific cross-protomer contacts and to characterize the functional role of GPR oligomerisation. This includes the identification of residues, which are part of charged cross-protomer contacts and play an important role for the formation of the GPR oligomeric complex. Furthermore, this study deals with a detailed characterization of a potentially functional cross-protomer triad between the residues D97-H75-W34, which was detected in the BPR structural model. Hereby, the focus lies especially on the functional role H75, which is highly conserved and is positioned in between the primary proton acceptor D97 and W34 across the protomer interface. In summary, this study addresses GPR oligomerisation via specific cross-protomer contacts and its potential role for the functional mechanism of the protein.
The fundamental technique used in this study is solid-state NMR. Furthermore, an elaborate characterization of GPR oligomerisation was executed using a variety of biochemical methods and mutational approaches. Solid-state NMR is a powerful biophysical method to analyse membrane proteins in their native lipid environment and can be used to obtain diverse information about structure, molecular dynamics and orientation of the protein in the lipid bilayer.
Solid-state NMR naturally has a low sensitivity. In order to detect the low number of spins, DNP signal enhancement is of particular importance in this study. It is exhibited under cryogenic conditions and allows to drastically enhance the solid-state NMR signal by transferring magnetization from highly polarized electrons to the nuclear spins.
By applying these methods and techniques on GPR oligomers, this study reveals new insights in specific cross-protomer interactions in the complex. First the oligomeric states of GPR were determined for the specific experimental conditions used in this study. LILBID-MS, BN-PAGE and SEC analysis identified the pentameric state to be dominant for GPR. Furthermore, specific interactions across the protomer interface, which drive GPR oligomerisation, were identified. This was conducted by creating mixed 13C-15N labelled complexes. These mixed complexes show a unique isotope labelling pattern across their protomer interfaces. Solid-state NMR 13C-15N-correlation spectroscopy (TEDOR) was used to identify through-space dipole-dipole couplings, which indicate specific cross-protomer contacts. The results indicated that the residues R51, D52, E50 and T60 are important for GPR oligomerisation, and further analysis via single mutations of these residues showed a severe impact of the GPR oligomerisation behaviour.
The functional importance of GPR oligomerisation was analysed by DNP-enhanced solid-state NMR on the cross-protomer D97-H75-W34 triad. The DNP cryogenic conditions allowed to trap GPR in distinct stages of the photocycle. It could be shown that trapping GPR in a specific intermediate leads to a drastic conformational effect for the highly conserved H75 residue. Furthermore, DNP-enhanced solid-state NMR was used to characterize the cross-protomer contact between H75 and W34. Mutations of W34 could show that the cross-protomer interaction is highly important for the functionality of the protein, as negative mutants such as W34E showed a reverse proton transport across the bacterial membrane.
In summary this study represents a detailed analysis of GPR cross-protomer interactions and sheds light into the cause and functional importance of oligomeric complex formation in the microbial rhodopsin.
Many processes in living cells involve interaction and cooperation of multiple proteins to fulfill a specific function. To understand biological processes in their full complexity, it is not sufficient to only identify the molecules being involved but also to understand the kinetic aspects of a reaction. Mass spectrometry (MS) is a very powerful tool which allows to precisely identify the molecules of a reaction. Usually this is done with tandem-MS experiments for purpose of de-novo peptide sequencing. However, since this involves protein digestion, a statement of the in-vivo constitution of non-covalently bound protein complexes is not possible. In order to detect an intact protein complex it is necessary to analyze the biological system softly and in a near-native environment with native MS. Native MS allows the non-destructive analysis of these non-covalent protein complexes as well as to detect their components. However, up to now native MS does not offer a possibility to resolve the timing of the constitution of protein complexes on a fast time-scale. Therefore, the progress of reactions on fast time-scales is invisible. However, a method which delivers both types of information - identification of the components of a protein complex, as well as time-resolving their interaction - would be of high interest.
A suitable ionization technique for native MS is laser-induced liquid-bead ion desorption (LILBID). LILBID employs well-defined droplets which are irradiated by IR laser pulses to generate gas phase ions. The not-continuous, repetitive nature of ion generation offers itself to the development of a time-resolved (TR) native MS system which is able to investigate protein complexes on a fast time scale. The LILBID-droplets can serve as reaction vessels if they are levitated in an electrodynamic Paul-trap. This new setup would allow sample manipulation and MS analysis on precise and fast reaction time-scales. The first part of this dissertation presents the construction and characterization of a setup for TR-LILBID-MS.
An example for a complex biological system is the self-assembly of beta-amyloid (Aβ). This small peptide is the major component in plaques related to Alzheimer’s disease. Clinically relevant is especially the 42 amino acid peptide Aβ42 which aggregates from monomers to oligomers through to fibrils. The oligomers are the neurotoxic species in this process and thus of high interest. Nevertheless, standard analytical techniques are unable to detect those oligomers which makes MS an optimal tool to study the oligomerization process of Aβ with the focus on disease relevant oligomers. TR-LILBID-MS allows to follow the oligomerization of Aβ enabling to study molecules which influence this kinetic. Combining MS with ion-mobility spectrometry adds an additional dimension - the collision cross section - to the mass-to-charge ratio obtained from MS. Therewith structural alterations induced by ligands can be correlated to differences in the aggregation kinetic. This allows to draw a picture of the aggregation process of Aβ for the development of disease-relevant small oligomers on a molecular level.
The most versatile tool for visualizing endogenous RNA is molecular beacons (MBs). MBs are modified oligonucleotides that consist of a stem-loop structure equipped with a fluorophore and a quencher at the opposite ends. They only give a fluorescent signal when hybridized to the target RNA. Here we present our recent efforts to enhance the spatiotemporal resolution of RNA visualization by refining MBs.
We first asked if we could refine MBs to visualize defined subcellular populations of RNA in living neurons. To achieve this, we utilize visible light-activatable Q-dye MBs to allow only a subcellular fraction to be activated. Here, the fluorophore at the 5’-end was linked to a second quencher via a photolabile coumarin protecting group. Therefore, the MB only gives a fluorescent signal, when activated with visible light and hybridized to the target. This architecture allowed local activation of a hybridized subpopulation in a defined area of the cell. Knowing the exact origin of the activated RNA, we were able to increase the available monitoring time for neuronal mRNA from several minutes (literature known MBs) to more than 14 hours.
We next asked if it would be possible to gain spatiotemporal control over where the MB hybridization events occur. Therefore, we developed photo-tethered MBs where two phosphates in the loop backbone are covalently linked to each other via two photocages. This prevents the MB from hybridization to the target RNA. Only when light is applied, the photo-tethers are cleaved, and the inherent hybridization function of the MB is activated. This architecture allowed us to control the hybridization of photo-tethered MBs in primary cultured neurons.
In dieser Arbeit wird sowohl das Potenzial von molekularen Photoschaltern als lichtempfindliche Komponenten für photopharmakologische Anwendungen als auch das von künstlichen RNA-Aptameren als regulatorische Schalteinheiten für die Entwicklung von funktionellen Riboschaltern untersucht. Verschiedene wesentliche Aspekte beider Anwendungs-felder wurden eingehend einzeln untersucht und die beiden Schaltsysteme schließlich durch das Design eines synthetischen RNA-Aptamers kombiniert, dessen Ligandbindung durch licht-induzierte Isomerisierung seines Photoschalterliganden reguliert werden kann.
Molekulare Photoschalter wie Azobenzole und Spiropyrane haben sich als vielversprechende photochemische Werkzeuge erwiesen, um lichtgesteuert reversible und biochemisch nutzbare Effekte erzeugen. Spiropyrane bergen aufgrund der drastischen Veränderungen ihrer molekularen Eigenschaften infolge der Photoisomerisierung zum Merocyanin (MC) ein enormes Anwendungs-potenzial. Von den hier untersuchten wasserlöslichen Pyridin- (Py-) und Nitro-BIPS-Derivaten zeigt insbesondere die Py-BIPS-Verbindung 2 ein außerordentlich vielseitiges Verhalten. Im Vergleich zu anderen Vertretern dieser Photoschalterklasse wird ein deutlich höherer MC-Anteil von etwa 50% thermisch innerhalb von wenigen Minuten akkumuliert. Durch lichtinduzierten Ringschluss zum reinen Spiropyran (SP) und thermische Wiederherstellung des Gleichgewichts, kann diese hohe Schaltamplitude über mehrere Zyklen ohne signifikante Zersetzung beibehalten werden. Der Einsatz von schädlichem UV-Licht kann somit vermieden werden, was zusätzlich sehr vorteilhaft für einen möglichen Einsatz in einem biochemischen Kontext ist.
Verbindung 2 weist zudem mehrere Protonierungsstellen auf, die ihr in Abhängigkeit des pH-Wertes faszinierende photosaure Eigenschaften verleihen. Das einfach protonierte HMC Isomer ermöglicht eine lichtstimulierte reversible Kontrolle des pH-Wertes in einem Bereich von etwa 4,5 bis 7,5, mit möglichen pH-Sprüngen von bis zu 1,5 Einheiten. Durch transiente Absorptionsstudien wurde ein Mechanismus für die Protonenfreisetzung nachgewiesen, der lediglich auf der Veränderung des pKs-Wertes der N-protischen Position infolge des lichtinduzierten Ringschlusses beruht. Im Gegensatz dazu wird das phenolische Proton des doppelt protonierten HMCH Isomers innerhalb von 1-2 Pikosekunden nach Anregung aus dem angeregten Zustand an das Lösemittel übertragen. Durch eingehende Ultrakurzzeitmessungen der Freisetzung des phenolischen Protons, konnten die protonierten Spezies der Py- und Nitro-Merocyanine als Superphotosäuren etabliert werden. Sie können somit als ultraschnelle Auslöser für protonenvermittelte Prozesse eingesetzt werden, die zu den fundamentalsten Reaktionen in der Natur gehören.
Was potenzielle pharmakologische Zielsysteme betrifft, so dürfte RNA eine große Zukunft bevorstehen, da sie einfach zu synthetisieren ist und Zugang zu verschiedenen Ebenen zellulärer Regulationsmechanismen bietet. Insbesondere RNA-Aptamere, die in der Lage sind, niedermolekulare Liganden mit außergewöhnlich hoher Affinität und Spezifität zu binden, sind für die Entwicklung von künstlichen Riboschaltern hoch interessant. Während künstliche Aptamere für beliebige Liganden durch einen in vitro Selektionsprozess generiert werden können, ist nicht zur Gänze geklärt warum nur wenige von ihnen als aktive in vivo Riboschalter funktionieren. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen die Bedeutung der konformationellen Aptamerdynamik während der Ligandenbindung für das Regulationspotential. Die Mg2+-abhängigen Bindungsstudien des hochfunktionellen Tetrazyklin (TC) -Aptamers zeigen, dass zweiwertige Kationen nicht nur für die korrekte Vorfaltung des Aptamers wichtig sind, sondern auch an der Ligandenbindung und RNA-Strukturanpassung selbst beteiligt sein können. Nach der Assoziation von TC an die Bindungstasche pflanzt sich eine Konformationsanpassung zur entfernten Dreifachhelixregion fort, wo Mg2+ zusätzlich für die Ausbildung endgültig gebundenen Zustandes benötigt wird.
Neben dem Einfluss von Mg2+, zeigen zeitaufgelöste Ligandenbindungsstudien von drei Ciprofloxacin (CFX) -Aptameren eine klare Korrelation zwischen der Kinetik des Struktur-anpassungsschrittes der RNA an den Liganden und dem beobachteten Regulationspotenzial in parallel durchgeführten in vivo Assays. Es wird geschlussfolgert, dass eine beschleunigte und irreversible RNA-Anpassung auf eine Konformationsänderung hindeutet, die ausgeprägt genug ist, um eine Aktivität als Riboschalter zu ermöglichen. Diese Erkenntnisse werden durch die berichteten Ligandenbindungskinetiken von anderen künstlichen Aptameren und auch von natürlichen Riboschaltern bestätigt und sollten weitreichende Implikationen für die Optimierung von Selektionsprotokollen für funktionelle Aptamere haben.
Schließlich wird ein lichtempfindliches RNA-Aptamer vorgestellt, dessen Ligand auf dem Antibiotikum Chloramphenicol (Cm) basiert, welches synthetisch mit einem Azobenzolfragment versehen wurde (azoCm). Durch systematische Optimierung von in vitro Selektionsprotokollen und die erfolgreiche Implementierung eines Belichtungsschrittes zur Isomerisierung des Liganden konnten Aptamere erhalten werden, die spezifisch an die trans-Form von azoCm binden. Bindungsaffinitätsstudien bestätigen diese Selektivität und durch Zirkulardichroismusstudien konnte zudem eine lichtinduzierte reversible Dissoziation des von cis-azoCm gezeigt werden. Damit wird hier eine erfolgreiche Entwicklungsstrategie für lichtabhängige RNA-Aptamer – Ligandsysteme dargelegt, welche wiederum fundamental neuartige Ansätze für die Erschließung lichtstimulierter biologischer Regulationswege zugänglich machen.
Probing the photointermediates of light-driven sodium ion pump KR2 by DNP-enhanced solid-state NMR
(2021)
KR2 is a light-driven sodium ion pump found in marine flavobacterium Krokinobacter Eikastus. The protein belongs to the microbial rhodopsin family, which is characterized by seven transmembrane helices and a retinal cofactor covalently bound to a conserved lysine residue through a Schiff base linkage. Specific features of KR2 and other sodium pumping rhodopsins are the NDQ motif, the N-terminal helix capping the protein at the extracellular side, and the sodium ion bound at the protomer interface in the pentameric structure. The ability to pump sodium ions was a surprising discovery since the positive charge at the Schiff base was long thought to hinder the transport of non-proton cations and the Grotthuss mechanism could not be applied to explain the Na+ transport. The photocycle of KR2 revealed by flashed photolysis and ultrafast femtosecond absorption spectroscopy consists of consecutive intermediates, named K, L, M, and O.
Here, DNP-enhanced ssNMR was used to analyze various aspects of these intermediate states. The K/L-state can be generated and trapped by in-situ illumination inside the magnet at 110 K. The trapping of L-state together with the K-state at this temperature is unexpected as this usually leads to the trapping of only K-state in bacteriorhodopsin (BR), proteorhodopsin (PR), and channelrhodopsin 2 (ChR2). This observation suggests a lower energy barrier between K- and L-state in KR2. For the O-state, the intermediate was generated by illuminating outside the magnet, followed by rapid freezing in liquid nitrogen and transfer to the magnet. Based on these procedures, the retinal conformation, and the electrostatic environment at the Schiff base in KR2 dark, K-, L- and O-intermediates were probed using 13C-labeled retinals bound to 15N-labeled KR2 by both 1D and 2D magic angle spinning (MAS) NMR experiments.
The obtained data show an all-trans retinal conformation with the distortion of 150° at H-C14-C15-H in the dark state whereas the retinal has a 13-cis, 15-anti conformation in the K- and L-state after light activation. Differences between K- and L-intermediates were observed. The retinal chemical shifts of the K-state show a large deviation from the model compound behavior between the middle and end part of the polyene chain. In the L-state, these differences are much less pronounced. These observations indicate that the light energy stored in the K-state dissipates into the protein in the subsequent photointermediate states. Furthermore, an additional shielding observed for C14 in L-state indicates the slight rotation toward a more compact 13-cis, 15-syn conformation. The distortion of the H-C14-C15-H angle in the L-state (136°) is larger than in the dark state. This twist of the retinal in the L-state would play an important role in lowering the pKa of the Schiff base, which is a prerequisite for the proton transfer from the Schiff base to the proton acceptor (D116). The electrostatic environments at the Schiff base in K- and L-states cause a de-shielding of the 15N nitrogen compared to the dark state. This indicates a stepwise stronger interaction with the counterion as the Schiff base proton moves away from the Schiff base and comes closer to the D116 in the transition from K- to L-state and approaches the proton transfer step during the M-state formation. In the O-state, the retinal was found to be in the all-trans conformation but differed to the dark state in the C13, C20, and Schiff base nitrogen chemical shifts. The largest effect (9 ppm) was observed for the Schiff base nitrogen, which could be explained by the effect of the positive charge of bound Na+ near the Schiff base in the O-state, coordinated by N112 and D116 as observed in the O-state crystal structure in the pentameric form.
The structural change at the opsin followed the retinal isomerization and the energy transfer from the chromophore to the surrounding were also investigated in this thesis using various amino acids labeling schemes. Moreover, 1H-13C hNOE in combination with CE-DNP was applied to probe the dynamics of retinylidene methyl groups and 23Na MAS NMR was employed to detect the bound sodium ion at the protomer interface in KR2 dark state.