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Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
In optogenetischen Anwendungen, welche die Manipulation von zellulären Aktivitäten durch Licht ermöglichen, werden die Eigenschaften von mikrobiellen Rhodopsinen, einer Familie natürlich vorkommender lichtgesteuerter Proteine, ausgenutzt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die einwärts transportierende Protonenpumpe NsXeR, sowie die auswärts Natriumionenpumpe KR2 untersucht. Des Weiteren wurden Tandem Proteine betrachtet, die mikrobielle Rhodopsine kombinieren mit dem Chemokinrezeptor CXCR4, der durch SDF1 aktiviert und anschließend in Endosomen internalisiert wird.
Für die Untersuchung des Mechanismus, der die Vektorialität in NsXeR bestimmt, wurde eine umfassende elektrophysiologische Studie durchgeführt. In Patch Clamp Messungen an NsXeR exprimierenden NG108-15 Zellen wurden bei kontinuierlicher 561 nm Beleuchtung aktive Einwärtsströme entgegen eines elektrochemischen Gradienten gemessen. Ein Einfluss des intrazellulären pHs auf die steady-state Ströme und deren Abfallkinetik konnte nicht festgestellt werden. Der Vergleich der exponentiellen Abfallrate k2 mit den Übergängen im NsXeR Photozyklus, lässt den Schluss zu, dass der ratenlimitierende Schritt der MII Zerfall ist.
Die elektrogenen Schritte im NsXeR Photozyklus wurden mit elektrischen Messungen an der black lipid membrane (BLM) an NsXeR Proteoliposomen bestimmt. Die Belichtung mit 20 ns Lichtpulsen bei 556 nm rufen Spannungssignale hervor, die exponentiell gefittet wurden, wobei drei elektrogene Schritte identifiziert werden konnten. Bei pH 7.4 betrugen die ermittelten Zeitkonstanten etwa 220 µs, 1 ms und 15 ms, denen 42%, 10% und 48% an der Gesamtladungsverschiebung zugeordnet wurden. Die elektrogenen Schritte konnten den Übergängen im Photozyklus zugeordnet werden, wobei der erste Schritt mit t1 dem MI Aufbau (Deprotonierung Schiff’sche Base, Protonenabgabe zur intrazellulären Seite) zugeschrieben wurde. t2 wurde dem MI→MII Übergang (Switch, Zugänglichkeitsänderung vom Intra- zum Extrazellulären) zugeordnet und t3 korreliert mit dem MII Zerfall (Reprotonierung Schiff’sche Base, Protonenaufnahme von der extrazellulären Seite).
Die Kinetik und der Ladungstransportanteil des zweiten elektrogenen Schritts haben keine starke pH Abhängigkeit, was sich dadurch erklären lässt, dass t2 durch eine Konformationsänderung bestimmt wird. t1 und t3 werden bei höheren pH Werten beschleunigt, was sich bei t1 mit einer erleichterten intrazellulären Protonenabgabe erklären lässt. Für t3 wurde eine Reprotonierung durch eine Donor Gruppe Asp76 vorgeschlagen. Die pH-sensitive Änderung der relativen Ladungstransferanteile des ersten und dritten elektrogenen Schrittes (∆ΨI und ∆ΨIII) wurden durch eine mögliche Verzögerung der frühen Protonenabgabe bei niedrigen pH Werten erklärt.
Der mutmaßliche Protonenakzeptor Asp220 wurde gegen Asn und Glu ausgetauscht und in Patch Clamp sowie UV-Vis Spektroskopie Messungen untersucht. Für D220N wurden keine Pumpströme und kein Einfluss auf die maximale Absorptionswellenlänge λmax festgestellt. D220E dagegen führte zu einer Erniedrigung des pKa-Werts der Schiff’schen Base und zu einer Verminderung der Iss-Abfallsrate k2 in Patch Clamp Dauerbelichtungsmessungen (D220E k2 = 27.1 ± 1.8 Hz, Wildtyp k2 = 83.1 ± 2.6 Hz). Daraus konnte geschlossen werden, dass Asp220 wesentlich für den Protonentransport ist und nicht als Gegenion für die protonierte Schiff’sche Base dient.
In Patch Clamp Experimenten bei 561 nm Dauerbelichtung und zusätzlicher gepulster Belichtung bei 355 nm wurde der Blaulichteffekt an NsXeR untersucht, bei dem Proteine im M Intermediat ein Photon absorbieren und unter Reprotonierung der Schiff’schen Base in den Grundzustand zurückkehren.
Für NsXeR konnte eine Potentialabhängigkeit für die Richtung der transienten Ströme, die durch die
355 nm Belichtung hervorgerufen wurden, festgestellt werden. Beim NsXeR Blaulichteffekt scheint eine
Reprotonierung der Schiff’schen Base von beiden Seiten möglich zu sein, was auf die unterschiedlichen Zugänglichkeiten in den beiden M Zuständen MI und MII zurückgeführt wurde. Es wurde ein Modell vorgeschlagen, welches auf einem potentialabhängigen Gleichgewicht zwischen MI und MII basiert.
In Patch Clamp Messungen an KR2 exprimierenden NG108-15 Zellen wurden die Pumpströme untersucht, die durch den auswärts Transport von Na+ und H+ hervorgerufen wurden. Die Na+-Konzentrationen der intra- und extrazellulären Lösungen wurden symmetrisch variiert und die steady-state Ströme Iss bei 532 nm Dauerbelichtung betrachtet. Mit steigender Na+-Konzentration zeigte sich ein Übergang von einer linearen Potentialabhängigkeit der Iss, zu einem sättigungsähnlichen Verhalten bis hin zu einer fast glockenförmigen Form. Da die exponentielle Abfallrate der steady-state Ströme k2 in ihrer Potentialabhängigkeit mit den Iss korrelierte, konnte geschlossen werden, dass die Ströme überwiegend kinetisch limitiert sind. Die Erhöhung der Rate k2 mit steigender Na+-Konzentration zwischen -120 mV und -60 mV deutet darauf hin, dass die Na+-Aufnahme von der intrazellulären Seite bei diesen Bedingungen die Limitierung für die Pumpe darstellt.
Unter Na+-“freien” Bedingungen wurde der Einfluss des intrazellulären pHs untersucht. Für die Rate k2 wurde eine Erhöhung bei niedrigen pH Werten festgestellt und die Potentiale E0 (Iss = 0 pA) verschoben bei niedrigem intrazellulärem pH zu hyperpolarisierenden Potentialen. Daraus lässt sich schließen, dass die steady-state Ströme durch den Transport von Protonen hervorgerufen wurden.
In Messungen mit gepulster 530 nm Belichtung wurden die transienten Pumpströme gemessen und durch exponentielles Fitten des Stromabfalls drei elektrogene Schritte identifiziert. Eine Abhängigkeit vom Potential und der Na+-Konzentration konnte nur für den dritten Schritt mit der Rate 1/τ3 festgestellt werden, wobei 1/τ3 mit der Na+-Konzentration und bei positiveren Potentialen steigt. Unter Na+-“freien” Bedingungen steigt 1/τ3 auch mit niedrigeren intrazellulären pH Werten. Die elektrogenen Schritte wurden dem KR2 Photozyklus zugeordnet, wobei ein Modell angewendet wurde, das einen M1→M2 Übergang einführt. Diesem wurde der zweite elektrogene Schritt zugeordnet. Die relativen Ladungstransportanteile Q2 und Q3 des zweiten und dritten elektrogenen Schrittes sind sowohl potential- als auch Na+-abhängig. Um dieses Verhalten zu erklären, wurde ein Modell vorgeschlagen, bei dem ein Ausgleichsladungstransfer in Form von einer Protonenabgabe und -wiederaufnahme während des Photozyklus eingeführt wurde.
In Patch Clamp Messungen wurde die erhaltene Funktionalität der ChR2 Mutante ChR2(L132C) mit erhöhter Ca2+-Permeabilität im Tandem Protein tCXCR4/CatCh nachgewiesen. Auch die Internalisierung von tCXCR4/CatCh konnte anhand der zeitabhängigen Abnahme des CatCh-Signals nach der CXCR4-Aktivierung durch SDF1 in Strommessungen beobachtet werden. Für tCXCR4/Arch, ein Tandem Protein mit einer Protonenpumpe, wurde die SDF1-induzierte Internalisierung mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie betrachtet und eine Kolokalisierung der Fluoreszenz des im Tandem exprimierten YFP und der eines gelabelten CXCR4-spezifischen Antikörpers in intrazellulären Vesikeln beobachtet. Bei Behandlung mit dem CXCR4 Antagonisten AMD3100 wurde die Kolokalisierung hauptsächlich in der Zellmembran festgestellt, da die Internalisierung blockiert war. Die Tandem Protein könnten als in intrazellulären Organellen wirkende optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden für z.B. die Manipulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration.
Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von molekularen Systemen, die aus mehreren Chromophoren bestehen und über einen Zweiphotonen-Prozess aktiviert werden können.
Die Zweiphotonen-Absorption (2PA) beschreibt die nahezu simultane Absorption zweier Photonen, deren Summe die Energie ergibt, die für den entsprechenden elektronischen Übergang nötig ist. Da für die Anregung somit zwei niederenergetische Photonen benötigt werden, kann für die 2PA Nahinfrarot-Licht (NIR-Licht) verwendet werden, welches eine geringe Phototoxizität aufweist und eine tiefe Gewebedurchdringung ermöglicht. Weiterhin wird durch die intrinsische dreidimensionale Auflösung der 2PA eine hohe Ortsauflösung der Photoaktivierung erzielt.
Photolabile Schutzgruppen (PPGs) bzw. Photocages sind chemische Verbindungen, die der vorübergehenden Maskierung der biologischen Funktion eines (Makro-)Moleküls dienen. Sie können durch Licht geeigneter Wellenlängen abgespalten werden (uncaging), wodurch die Aktivität des geschützten Substrats wiederhergestellt wird. Leider weisen viele der etablierten PPGs schlechte Zweiphotonen-Eigenschaften auf. Um die 2P-Aktivität einer PPG zu erhöhen, kann sie kovalent mit einem guten Zweiphotonen-Absorber verknüpft werden, der bei Bestrahlung das Licht über einen Zweiphotonen-Prozess absorbiert und anschließend mittels Energietransfer auf die photolabile Schutzgruppe überträgt. Dies führt schließlich zur Uncaging-Reaktion.
Im Zuge von Projekt I dieser Dissertation wurde eine solche molekulare Dyade für verbessertes Zweiphotonen-Uncaging bestehend aus einem Rhodamin-Fluorophor als Zweiphotonen-Absorber und einem Rotlicht-absorbierenden BODIPY als photolabile Schutzgruppe hergestellt und charakterisiert. Die Zweiphotonen-Aktivität des Fluorophors wurde mittels TPEF-Messungen (two-photon excited fluorescence) untersucht. Anschließend wurde das Rhodamin an einen 3,5-Distyryl-substituierten BODIPY-Photocage gekuppelt. Der Energietransfer innerhalb dieser Dyade wurde mithilfe von transienter Ultrakurzzeit-Spektroskopie und quantenmechanischen Berechnungen untersucht. Die Freisetzung der Abgangsgruppe para-Nitroanilin (PNA) bei Belichtung der Dyade konnte sowohl nach Einphotonen-Anregung des Rhodamins als auch des BODIPYs mithilfe von UV/vis-Absorptionsmessungen qualitativ nachgewiesen werden.
Da die Uncaging-Reaktion allerdings nicht besonders effektiv war, wurde für die Weiterführung des Projekts ein neuer BODIPY Photocage, der eine verbesserte Photolyse-Effizienz und eine höhere Photostabilität aufwies, verwendet und erneut an einen Rhodamin-Fluorophor geknüpft. Anhand dieser optimierten Dyade konnte die Einphotonen-Photolyse quantifiziert, d.h. eine Uncaging-Quantenausbeute für die Freisetzung von PNA bestimmt werden. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Photolyse der Dyade mit einer deutlichen Änderung ihrer Fluoreszenzeigenschaften einherging. Dies ermöglichte einen Nachweis des Zweiphotonen-Uncagings mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Die Dyaden-Moleküle wurden zur Immobilisierung in Liposomen eingeschlossen und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop belichtet. Sowohl nach Einphotonen- als auch nach Zweiphotonen-Anregung der Rhodamin-Einheit konnte die gewünschte Fluoreszenzänderung beobachtet und somit das Uncaging bestätigt werden.
In Projekt II der Dissertation wurde ein photoaktivierbarer Fluorophor (PAF) hergestellt. PAFs liegen in ihrer geschützten Form dunkel vor. Durch die Aktivierung mit Licht können sie Fluoreszenzsignale emittieren. Sie liefern somit ein direktes Feedback über die Lichtverteilung und –intensität innerhalb einer Probe und werden somit unter anderem für die Charakterisierung und Optimierung von Belichtungsapparaturen verwendet. Besonders wünschenswert ist hierbei eine Fluoreszenzaktivierung mit sichtbarem Licht bzw. mit NIR-Licht über einen Zweiphotonen-Prozess.
Im Zuge der Arbeit wurde ein Rhodamin-Derivat synthetisiert, das durch die Anbringung eines DEACM450-Photocages in seine nichtemittierende Form gezwungen wurde. Bei Bestrahlung mit 455 nm konnte die Abspaltung der Cumarin-Schutzgruppe und der damit verbundene Anstieg der Rhodamin-Fluoreszenz beobachtet und eine Uncaging-Quantenausbeute bestimmt werden. Für die Untersuchung der Zweiphotonen-Photolyse wurde der geschützte Fluorophor in einem Hydrogel immobilisiert und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Anschließend wurden Fluoreszenzbilder vor und nach Photoanregung von bestimmten Regionen des Hydrogels aufgenommen. Durch das Uncaging der Probe konnten helle, definierte Muster geschrieben und ausgelesen werden. Die Photoaktivierung führte dabei sowohl über die Einphotonen-Anregung mit blauem Licht (488 nm) als auch über die Zweiphotonen-Anregung mit NIR-Licht (920 nm) zur Generierung von stabilen, gleichmäßigen Fluoreszenzmustern mit hohem Kontrast.
Photoinduzierte Energietransferprozesse und -reaktionen spielen in vielen Gebieten von Chemie, Physik und Biologie eine wichtige Rolle. Zu den prominentesten Beispielen zählen der Lichtsammelprozess in der Photosynthese und der Anregungsenergietransfer in funktionellen Materialien. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf letzterem Bereich, genauer auf organischer Elektronik und flexiblen Donor-Akzeptor-Bausteinen und Schaltern. Im Besonderen werden hier zwei verschiedene Typen von funktionellen organischen Systemen betrachtet: zum einen oligomere Fragmente organischer halbleitender Polymere wie Oligo-p-Phenylen-Vinylen (OPV) und Oligo-Thiophen (OT), welche als Bausteine für neuartige organische Solarzellen dienen, und zum anderen kleine funktionelle Donor-Akzeptor-Einheiten wie Dithienylethen-Bordipyrromethen (DTE-BODIPY). Letzteres wurde in Kooperation mit den experimentellen Gruppen von K. Rück-Braun (TU Berlin) und J. Wachtveitl (Goethe Universität) untersucht. Um die relevanten Energietransfermechanismen genauer zu verstehen, wurden an diesen Systemen elektronische Strukturrechnungen und quantendynamische Untersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden mittels ab initio-Methoden Modell-Hamiltonians parametrisiert und mit hochdimensionalen quantendynamischen oder semiklassischen Methoden kombiniert. Während die Parametrisierung für kleinere Fragmente durchgeführt wurde, lässt sich der so parametrisierte Hamiltonian ohne Weiteres auf größere Systeme erweitern. Die dynamischen Studien der betreffenden Systeme wurden mittels der Multikonfigurationellen Zeitabhängigen Hartree (MCTDH) Methode durchgeführt, welche eine vollständige quantendynamische Beschreibung des Systems zulässt. Für größere Systeme wurde die semiklassische Ehrenfest Methode in Verbindung mit dem Langevin-Ansatz zur Beschreibung von Umgebungseffekten genutzt. Hierzu wurde ein eigens für diese Methode und Systeme geschriebenes Programm eingesetzt. Im Falle der OT- und OPV-Oligomere wurde die Dynamik bei Vorliegen eines strukturellen Defekts untersucht. Ziel war es hierbei, die dynamischen Phänomene, welche durch die Photoanregung induziert werden, zu untersuchen. Des Weiteren wurde untersucht, ob das Konzept von „spektroskopischen Einheiten“, welche die Lokalisierung der Anregung durch strukturelle Defekte beschreibt, in diesen Systemen zutrifft. Hierzu wurden die Systeme in einer Frenkel-Basis definiert, welche ein auf einem Monomer lokalisiertes Elektron-Loch-Paar beschreibt. Delokalisierte elektronische Anregungen können somit als Superposition solcher Frenkel-Zustände beschrieben werden. Neben der Frenkel-Basis wurde aber auch eine verallgemeinerte Elektron-Loch-Basis verwendet, welche über zusätzliche Ladungstransferzustände eine räumliche Separation von Elektronen und Löchern erlaubt.Die Parametrisierung des OPV- und OT-Hamiltonians erfolgte mittels der Algebraischen Diagrammatischen Konstruktions (ADC(2))-Methode, welche in Kombination mit einer Übergangs-Dichte-Matrix-Analyse eine sehr akkurate Beschreibung der Frenkel- und Ladungstransferzustände basierend auf den supermolekularen Zuständen erlaubt. Um vibronische Effekte auf die Dynamik miteinzubeziehen,wurden nieder- und hochfrequente Torsions- und alternierende Bindungslängenmoden des Systems im Hamiltonian berücksichtigt. Hierzu wurden eindimensionale Schnitte der Potentialflächen entlang dieser Koordinaten berechnet und mittels einer Transformation in diabatische Potentialflächen überführt. Mit diesem Setup wurden die quantendynamischen und semiklassischen Simulationen für ein OPV/OT-Hexamer und ein 20-mer durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Simulationen zeigen, dass der Energietransfer auf einer Subpikosekunden-Zeitskala stattfindet und eine starke Abhängigkeit vom Vorliegen eines strukturellen Defekts aufweist. Des Weiteren konnte auf einer Zeitskala von 100 Femtosekunden eine Lokalisierung des Exzitons beobachtet werden. Fluktuationseffekte werden zudem über Quantenfluktuationen im Falle von MCTDH bzw. über thermische Fluktuationen im Falle des Ehrenfest-/Langevin-Ansatzes berücksichtigt. Letzterer ist jedoch nicht in der Lage, die kohärente Charakteristik der mit den Schwingungsmoden gekoppelten Exziton- und Lokalisierungsdynamik wiederzugeben. Dagegen kann dieser Ansatz erfolgreich genutzt werden, um eine fluktuationsgetriebene „Hopping“-Dynamik des quasi- stationären Zustandes auf einer längeren Zeitskala in Abhängigkeit von der Temperatur zu beschreiben. Die Beschreibung der Photodynamik der DTE-BODIPY-Dyade zielt darauf ab, experimentell beobachtete vibrationelle Schwingungen des BODIPY-Fragments zu erklären, die ohne eine direkte Anregung dieses Fragments zustande kommen. Diese wurden nach einer selektiven Anregung des DTE-Fragments in zeitaufgelösten UV/Vis Anreg-Abtast-Experimenten beobachtet. Der Fokus der Untersuchung liegt daher auf der Beschreibung der photoinduzierten intramolekulare Energieumverteilung (IVR) auf einer Subpikosekunden-Zeitskala. Die DTE-BODIPY Dyade wurde mittels eines Hamiltonians, welcher durch TDDFT Rechnungen parametrisiert wurde, dargestellt. Basierend auf den Normalmoden des Systems, wurden lokale DTE- und BODIPY-Moden konstruiert, wobei einige dieser Moden miteinander gekoppelt sind und die Photoanregung des DTE auf das BODIPY-Fragment übertragen. Hierbei zeigte sich, dass die Zeitskala und die charakteristischen Frequenzen des Experiments mittels der hochdimensionalen MCTDH-Methode gut reproduziert wurden. Aus den Simulationen ergab sich zudem, dass der beobachtete Energietransfer stark von einem Reservoir von vibrationell angeregten lokalen DTE-Moden beeinflusst wird. Der untersuchte IVR- Prozess zeigt zudem eine ausgeprägte Abhängigkeit von lokalen Kopplungen und der Kopplung an eine Umgebung.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Dynamik des Retinalchromophors in archaealen, bakteriellen sowie eukaryotischen Retinalproteinen zeitaufgelöst zu untersuchen und so Informationen über die unterschiedlichen lichtgesteuerten zyklischen Reaktionen zu erhalten. Für das bakterielle Proteorhodopsin (PR) wurde die Primärdynamik im sichtbaren Spektralbereich unter D2O-Bedingungen bei unterschiedlichen pD-Werten untersucht. Es zeigte sich, dass das isomerisierte K-Photoprodukt mit zwei Zeitkonstanten im Bereich von 1 ps und 20 ps gebildet wird. Der Vergleich mit Messungen in H2O erlaubte es den kinetischen Isotopeneffekt für die Deaktivierung des S1-Zustandes zu berechnen. Die Ergebnisse weisen dabei auf unterschiedliche Wasserstoffbrückenmuster unter sauren und alkalischen Bedingungen hin. Um diesem Resultat weiter nachzugehen, wurde die D97N-Mutante untersucht, bei der der primäre Protonenakzeptors ungeladen vorliegt. Die gefundene Primärdynamik von PR D97N läuft nur unwesentlich langsamer ab als die des Wildtyp-Proteins bei pD 6,4. Um weitergehende Einsichten in die Primärdynamik von PR zu erlangen, wurden am Wildtyp-Protein sowie der D97N-Mutante transiente Absorptionsmessungen im Bereich der C=C- und C=N-Schwingung des Retinals durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass die Quantenausbeute der K-Bildung unabhängig vom pD-Wert ist. In einem weiteren Schritt wurde der Einfluss des hochkonservierten His-75 auf die Isomerisierungsdynamik untersucht. Hierfür wurden die Mutanten H75N und H75M verwendet. Die Kurzzeitmessungen lassen keinen ausgeprägten Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik erkennen. Auch der nachfolgende Teil des Photozyklus war im Blickpunkt dieser Arbeit. Die Tieftemperaturstudien im sichtbaren Spektralbereich erlaubten das in kinetischen Messungen nicht beobachtete M-Intermediat des sauren Photozyklus nachzuweisen. Um strukturelle Einblicke in den Photozyklus zu erlangen und die am Pumpvorgang beteiligten Aminosäuren zu identifizieren, wurden nachfolgend Tieftemperaturuntersuchungen im infraroten Spektralbereich durchgeführt. Die Implementierung eines Faserspektrometers in den Strahlengang des FTIR-Aufbaus erlaubte hierbei die simultane Aufnahme der lichtinduzierten Änderungen der Bandenposition im sichtbaren Spektralbereich und der Änderungen der Proteinstruktur sowie der Seitenketten. Für den M-Zustand bei pH 5,1 konnte gezeigt werden, dass auch hier eine Aspartat- oder Glutamat-Seitenkette als Protonenakzeptor fungiert. Weiterhin konnte dargelegt werden, dass der Photozyklus von PR nicht nur vom pKa-Wert des Protonen-akzeptors Asp-97 abhängt, sondern von einem Zusammenspiel mehrerer pH-abhängiger Gleichgewichte, da schon kleinste Änderungen des pH-Werts im Bereich des pKa großen Einfluss auf die beobachteten Differenzspektren sowie die Dynamik haben. Auch für das in jüngster Vergangenheit zur optogenetischen Kontrolle neuronaler Netze eingesetzte eukaryotische Retinalprotein Channelrhodopsin-2 (ChR-2) wurden umfangreiche Photozyklusstudien durchgeführt. Mit Hilfe von transienter Absorptionsspektroskopie im Sichtbaren sowie der Fluoreszenz-aufkonvertierung konnte gezeigt werden, dass der angeregte Zustand monoexponentiell mit 0,4 ps zerfällt. Die Reaktion setzt sich mit einem Kühlprozess und kleineren Änderungen der Linienbreite des K-Photoprodukts fort. Durch die schnelle Deaktivierung des angeregten Zustands war es zudem möglich die direkten Auswirkungen der Retinalisomerisierung auf die Proteinumgebung zu beobachten. Die Vielzahl ausgeprägter Differenzbanden zeigte hierbei, dass neben der schnellen Isomerisierung auch der Energietransfer der im Retinal gespeicherten Überschussenergie an das Protein sehr effizient ist. Über Blitzlichtphotolyseexperimente konnte die Langzeitdynamik des ChR-2-Photozyklus erstmals mit einer sub-µs-Zeitauflösung charakterisiert werden. Neben der für Retinalproteine typischen Abfolge von blau- und rot-verschobenen Intermediaten, ist der Photozyklus mit einer Dauer von etwa 5 s signifikant langsamer als der gemeinhin schon langsame Zyklus der sensorischen Retinalproteine. Um die Aktivierungs-barrieren des ChR-2-Photozyklus zu untersuchen, wurden weiterhin temperaturabhängige Messungen durchgeführt. Diese ergaben, dass der Photozyklus durch entropische Faktoren bestimmt wird. In einem letzten Ansatzpunkt wurde die Imidazol-Abhängigkeit der Langzeitdynamik des ChR-2-Photozyklus untersucht. Es zeigte sich, dass die Dynamik um die De- und Reprotonierung stark von diesem externen Donor beeinflusst wird. Es wurde jedoch nicht nur eine Beschleunigung der Reprotonierungsreaktion beobachtet, sondern auch der molekulare Mechanismus scheint sich nach Zugabe von Imidazol geändert zu haben. Diese Effekte können am ehesten durch eine Verstärkung des Histidin-Donor-Effekts durch das strukturell verwandte Imidazol erklärt werden. Genau dieser Einfluss externer Donor-Moleküle stand ebenfalls in einer Kurzzeit-Studie archaealer Retinalproteine im Fokus. Vorausgegangene Studien konnten zeigen, dass die Zugabe von Azid-Anionen die Isomerisierungsdynamik sowie den nachfolgenden spektral stillen Übergang der Protonenakzeptor-mutante von SRII D75N beeinflusst. Die vorliegende Arbeit stellte heraus, dass dieser Effekt ein einzigartiges Merkmal dieser Mutante ist. Abschließend wurde überdies die Bedeutung des in der Zelle in 2:2-Stöchiometrie beobachteten Transducerkomplexes auf die Primärreaktion von SRII untersucht. Es zeigte sich, dass dieser keinen Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik aufweist, was eine wichtige Information bezüglich der Signalweitergabe sensorischer Retinalproteine ist.
Verschiedene physikalische Effekte erlauben es Licht so zu führen und zu verändern, dass es Einblicke in für Menschen sonst unzugängliche Bereiche gewährt. Eines von insgesamt drei Elementen dieser Dissertationsschrift ist der Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops. Dieses fortschrittliche Werkzeug erweitert das zur Verfügung stehende Instrumentarium um verschiedene Analysemethoden, allen voran die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch geringfügige Modifikationen können auch weitere Methoden, wie beispielsweise stimulierte Raman-Streuung realisiert werden.
Insbesondere die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie war für das zweite Element dieser Dissertationsschrift von großer Bedeutung. In dieser Studie wurde das Bleichverhalten von Spinach bei 2-Photonen-Absorption untersucht, sowohl an frei in Lösung befindlichen als auch auf einem Träger immobilisierten Spinach-Komplexen. Die Ergebnisse zu den frei in Lösung befindlichen Spinach-Komplexen zeigen, dass die Verstärkung der Fluoreszenz von DFHBI grundsätzlich auch im Fall der 2-Photonen-Absorption eintritt. Dabei wurde ein Ausbleichen der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz für frei in Lösung befindliche Spinach-Komplexe erst bei außerordentlich hohen Intensitäten der Anregungsstrahlung beobachtet. Dieser Befund kann zumindest teilweise auf das Eindiffundieren fluoreszenter Spinach-Komplexe in das sehr kleine Fokalvolumen innerhalb der 2-Photonen-Anregung stattfindet zurückgeführt werden. Für immobilisierte Spinach-Komplexe konnte gezeigt werden, dass eine kontinuierliche Bildaufnahme gegenüber einer Bildaufnahme in Intervallen mit jeweils zusätzlichen Dunkelphasen zur Erholung des reversiblen Bleichens der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz, sowie der generelle Verzicht auf spezielle Belichtungsschemata und Methoden der Datenakquise mit keinen besonderen Nachteilen verbunden ist. Abschließend betrachtet erweist sich Spinach bei 2-Photonen-Anregung als ausgesprochen resistent gegenüber einem irreversiblem Ausbleichen des Fluoreszenzsignals.
Als drittes Element dieser Dissertationsschrift wurde die Dynamik von Chrimson, einem Kanalrhodopsin mit rot-verschobener Absorption mittels zeitaufgelöster Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Sowohl die Anregungswellenlänge als auch der pH-Wert bzw. der Protonierungszustand des Gegenions haben einen messbaren Einfluss auf die Primärreaktion. Diese verlangsamt sich, sobald der pH-Wert abgesenkt oder die Anregungswellenlänge rot-verschoben wird. Darüber hinaus führt eine Rot-Verschiebung der Anregungswellenlänge zu einer geringeren Effizienz der Isomerisation des Retinal-Chromophors. Die Primärreaktion von Chrimson entspricht dabei einem Reaktionsmodell mit einer Verzweigung des Reaktionspfades auf der Energiehyperfläche des angeregten Zustandes. Ein Reaktionspfad führt dabei durch ein lokales Minimum, welches in seiner Ausprägung stark von der elektrostatischen Umgebung des Retinal-Chromophors abhängt. Je nach ursprünglichem Protonierungszustand des Gegenions der Retinal-Schiff-Base wurden große Unterschiede hinsichtlich der beobachteten transienten Absorptionsmuster für den im Anschluss von Chrimson durchlaufenen Photozyklus gefunden. Bei pH 6,0 weist der Photozyklus von Chrimson eine insgesamt deutlich schnellere Kinetik auf, als es für den Photozyklus bei pH 9,5 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, dass in elektrophysiologischen Messungen für beide Photozyklen eine Öffnung des Ionenkanals gefunden wurde. Die Kanalfunktion von Chrimson ist somit grundsätzlich nicht vom Protonierungszustand des Gegenions abhängig, wenngleich die Kinetik des Ionenkanals durchaus davon beeinflusst wird. Dies deutet auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen dem Ionenkanal und dem Gegenion der Retinal-Schiff-Base hin.
In dieser Arbeit wurden zwei Themenblöcke bearbeitet. Zum einen der Aufbau und die Charakterisierung des Kerr-Schalters, einer Anlage zur Messung von Fluoreszenz mit einer Zeitauflösung im Femtosekundenbereich. Zum anderen die Charakterisierung von pyrenmodifizierten Nukleobasen, sowie deren Anwendung in einem neomycinbindenden Aptamer.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die schnelle Energietransfer- (EET) und Elektronentransfer (ET)-Dynamik unterschiedlichster Quantenpunkte (QD) spektroskopisch untersucht. Die untersuchten Systeme bestanden in den meisten Fällen aus Donor-Akzeptor-Paaren, bei denen die Halbleiternanokristalle als Donor fungierten. Der Fokus lag dabei auf der gezielten Anpassung des Donors, um die optimale Funktionalität zu erreichen. Die Untersuchung der Nanokristalle erstreckte sich daher von einfachen Kernen über verschiedene Kern-Schale-Partikel bis hin zu völlig anderen Strukturen wie Nanoplatelets (NPL). Als Akzeptor wurden eine Vielzahl von Molekülen verwendet, die sich als Elektronen- und/oder Energieakzeptoren für die verschiedenen QDs eignen.
Die Steuerung biochemischer Prozesse oder die Verbesserung von Materialien erfordert zunächst ein tiefgründiges Verständnis über die zugrundeliegenden Systeme. Zur Untersuchung eignet sich Licht als ideales Werkzeug, da hiermit nützliche Informationen über die chemische Struktur, ihre Eigenschaften sowie den zusammenhängenden, schnellen Reaktionsabläufen erhalten werden können. Um die Aufklärung zu erleichtern können kleine, chemische Verbindungen eingeführt werden, welche beispielsweise ein Fluoreszenzmarker, eine photolabile Schutzgruppe oder eine photoschaltbare Verbindung sein können. Von jeweils einem Vertreter dieser Moleküle wurden unterschiedliche Studien durchgeführt, dessen Ergebnisse in dieser Arbeit in insgesamt drei Projekten zusammengefasst werden.
Zunächst wurde die Funktionalität der Helikase RhlB untersucht, die der Familie der DEAD-Box Proteine zugeordnet wird, und RNA-Duplexe in ihre Einzelstränge entwindet. Als RNA-Modellduplex diente JM2h, an dem ein RNA-Einzelstrang fluoreszenzmarkiert war (M2AP6). Die Einführung dieses Markers ermöglichte die Durchführung von statischen Fluoreszenzmessungen sowie von Mischexperimenten, die mit Hilfe der stopped-flow-Technik durchgeführt wurden. In den einleitenden Studien wurde die Helikase weggelassen, wodurch der Fokus auf den Fluoreszenzeigenschaften der RNA gelegt wurde. Die Ergebnisse hierzu zeigten, dass die Fluoreszenzintensität des Einzelstrangs durch Zugabe des komplementären Strangs deutlich abnimmt, wobei das Minimum bei einem äquimolaren Verhältnis erreicht wird. Die dazugehörigen stopped-flow-Messungen zeigten eine Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion, wenn höhere Konzentrationen des Gegenstrangs in der Lösung vorhanden waren. Nach anschließender Zugabe der Helikase zur Lösung wurde ein Anstieg der Fluoreszenzintensität erwartet, der vom separierten Einzelstrang M2AP6 herrühren sollte. Dieser Anstieg wurde jedoch erst nach weiterer Zugabe von ATP beobachtet, der auf eine ATP-Abhängigkeit der Entwindungsreaktion von RhlB hindeutet. Diese Abhängigkeit wurde auch bereits für andere Helikasen der DEAD-Box Familie entdeckt. Die korrekte Funktionalität sowie die ATP-Abhängigkeit wurden in stopped-flow-Messungen verfiziert, bei denen der Fluoreszenzanstieg auch zeitaufgelöst betrachtet werden konnte. Für die spektralen Korrekturen der Fluoreszenzspektren wurde ein selbstgeschriebenes MATLAB-Programm namens FluCY verwendet (engl.: Fluorescence Correction & Quantum yield), welches eine schnelle und fehlerfreie Verarbeitung des Datensatzes ermöglichte.
Die zwei im folgenden beschriebenen Projekte handeln von photoaktivierbaren Molekülen. Zum einen photolabile Verbindungen, welche die Funktion z.B. eines Biomoleküls durch eine chemische Modifikation deaktivieren können. Durch eine lichtinduzierte Reaktion kommt es zur Abspaltung der Modifikation und die Funktion ist wiederhergestellt. In dieser Arbeit wurden verschiedene photolabile Schutzgruppen untersucht, die denselben Chromophor BIST (BIsStyryl-Thiophen) tragen. Durch die Einführung dieses Chromophors absorbierten sämtliche untersuchte Verbindungen sehr effizient sichtbares Licht (epsilon(445)=55.700 M^(-1) cm^(-1)), wodurch der photoinduzierte Bindungsbruch mit Wellenlängen durchgeführt werden, die bei einer biologischen Anwendungen keinen Schaden an der Zelle anrichten würden. Hieraufhin wurden in statischen und zeitaufgelösten Absorptionsmessungen Teilschritte der Freisetzungsreaktion untersucht, indem nach Photoanregung die Absorptionsänderungen auf verschiedenen Zeitskalen analysiert wurden. Die ultraschnelle Dynamik im Piko- bis Nanosekundenbereich (10^(-12)-10^(-9) s) wird durch eine spektral breite, positive Absorptionsänderng dominiert. Diese impliziert, dass die Deaktivierung über den Triplettpfad abläuft, der die vergleichsweise niedrigen Freisetzungsausbeuten erklärt (phi(u) < 5). Aufgrund des hohen Extinktionskoeffizienten reichen dennoch bereits niedrige Strahlungsdosen aus, um eine Freisetzung zu initiieren. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieser Reaktion ist dem Zerfall des aci-nitro Intermediats zugeordnet. Für ein sekundäres Amin, welches mit BIST geschützt wurde, ist eine Lebensdauer des Intermediats von 71 µs gefunden worden.
In einigen Fällen ist es erwünscht, eine vorliegende Aktivität nicht nur ein-, sondern auch ausschalten zu können, wofür photochrome Verbindungen (oder Photoschalter) verwendet werden. Die in dieser Arbeit untersuchte Verbindung ceCAM ist ein Alken-Photoschalter und vollführt bei Bestrahlung mit Licht eine cis/trans-Isomerisierung. ceCAM ist das Cyanoester-Derivat (ce) von Cumarin-substituierten Allylidenmalonat, von denen beide Konformere sehr effizient sichtbares Licht absorbieren trans: epsilon(489)=50.300 M^(-1) cm^(-1); cis: epsilon(437)=18.600 M^(-1) cm^(-1)). Andere photophysikalische Eigenschaften umfassen u.a. hohe thermische und photochemische Stabilität. Letztere wurde über ein Experiment nachgewiesen, bei dem die lichtinduzierte Isomerisierung alternierend durchgeführt wurde und selbst bei über 250 Zyklen keine signifikate Abnahme der Absorption beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte die Reaktion mit Quantenausbeuten von 39% (trans) und 42% (cis) induziert werden, wobei im photostationären Gleichgewicht auch hohe Isomerenverhältnisse mit bis zu 80% (trans) und 96% (cis) akkumuliert werden konnten. Die Geschwindigkeit der Reaktion wurde mit Hilfe der Ultakurzzeit-Spektroskopie untersucht. Die Dynamik im Zeitbereich von ps-ns zeigte, dass die trans/cis-Isomerisierung unterhalb von 0,5 ns und die umgekehrte Reaktion noch viel schneller (wenige ps) abgeschlossen ist. Durch die Untersuchungen in dieser Arbeit an den BIST-Verbindungen und ceCAM sind viele vorteilhafte, photophysikalische Eigenschaften charakterisiert worden, wodurch sie als verbesserte Alternative zu den bisher bekannten photolabilen Schutzgruppen oder Photoschaltern anzusehen sind.
Electron tomography was used to investigate membrane proteins in a variety of contexts. A high-angle tilt holder, suitable for electron tomography was designed, constructed and characterised. 2D crystals of membrane proteins, NhaA and YidC, were examined as a resolution test, and a method established for determining planarity of crystals. A model for specific gold binding to NhaA crystals was also presented. ATP synthase, a membrane protein complex in mitochondria, were imaged in a frozen hydrated state. They were found to form ribbons of dimers at highly curved regions of the membrane. Dimers from bovine heart and rat liver were excised from the tomographic volumes and averaged. Based on the location of the dimers in the mitochondrion, a model was established whereby ATP synthase, a molecular motor driven by the proton motive force, benefits from the high curvature that it induces in the membrane. Whole yeast mitochondria, imaged by electron cryo-tomography, also contained long ribbons of dimeric ATP synthase. Multiple copies of an unknown membrane protein complex were visualised by electron cryo-tomography, excised and averaged. A general method for the identification of unknown proteins was presented to deal with this inevitable issue, as native tissues and organelles are imaged, and the structures of complexes determined in situ.
Für die Optimierung sowie Entwicklung lichtsteuerbarer Systeme für biologische Anwendungen oder neue Materialien ist ein detailliertes Verständnis der zugrunde liegenden komplexen, lichtinduzierten Prozesse eine Voraussetzung. Die Verwendung von Photoschaltern in Makromolekülen ermöglicht eine zeitliche und örtliche Kontrolle über strukturelle Änderungen sowie die entsprechend folgenden (biologischen) Funktionen durch die Verwendung von Licht als externem Auslöser.
Ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines auf Licht reagierenden Riboschalters, welcher die gezielte Kontrolle über Genexpression ermöglicht. Hierzu wurde eine spektroskopische Charakterisierung von verschiedenen Photoschaltern bezüglich einer Verwendung als biologischer Ligand sowie der Wechselwirkungen zwischen Azobenzolen und RNA, auch hinsichtlich ihrer Bindungsdynamiken durchgeführt. Zunächst wurde die hohe Abhängigkeit der (photo-)chemischen Eigenschaften der Azobenzole von der Wahl der Substituenten untersucht, wobei besonders die Anwendung in wässrigem Milieu betrachtet wurde. In einer detaillierten (zeitaufgelösten) Studie wurde der positionsabhängige Einfluss der Hydroxy-Substitution von Azobenzolen auf die Photoisomerisierung in wässriger Lösung untersucht. Für eine ortho-Substitution ergab sich hierbei ein alternativer Deaktivierungskanal nach Photoanregung, welcher stärker ausgeprägt ist als die Isomerisierung. Hierbei wird ein intramolekularer Protontransfer im angeregten Zustand (ESIPT) beobachtet, welcher mit einer Zeitkonstante von 0.3 ps beschrieben werden kann und in einer Keto-Spezies resultiert. Eine Keto-Enol-Tautomerie konnte für die para-Hydroxy-Substitution schon im Grundzustand beobachtet werden. Somit können beide Spezies gezielt adressiert werden. Durch Acetylierung der Hydroxygruppe verlangsamt sich die thermische Relaxation des cis-Isomer zu dem entsprechenden trans-Isomer signifikant ohne die Isomerisierung zu beeinträchtigen. Dementsprechend ermöglicht eine solche Acetylierung die Verwendung von bekannten Azobenzolderivaten als Photoschalter.
Zudem werden in dieser Arbeit zwei verschiedene Herangehensweisen in der Entwicklung eines Riboschalters beschrieben, welcher sich durch Licht regulieren lässt.
Diese sind durch kovalentes bzw. nicht-kovalentes Einbringen eines Azobenzolderivats in die RNA Struktur charakterisiert. Ein neuer Linker, welcher auf einer Desoxyribose-Struktur beruht, wird für die kovalente Anbindung des Azobenzols an den RNA Strang präsentiert, welcher eine licht-induzierte Dehybridisierung ermöglichen soll. Eine außergewöhnlich hohe Schaltamplitude mit einem cis-Gehalt von etwa 90% konnte für das Azobenzol im RNA Einzelstrang schon bei Raumtemperatur ermittelt werden. Zudem wurde der Einfluss des Photoschalters sowie der benachbarten Nukleotide in der RNA auf die Stabilität der RNA Doppelhelix untersucht. Die zweite Vorgehensweise beruht auf einer nicht-kovalenten Bindung zwischen einem Azobenzolderivat und einem RNA-Aptamer, welche lediglich für eines der Photoisomere ermöglicht wird, wodurch eine örtliche und zeitliche Kontrolle der Ligandenbindung der RNA erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit war es möglich zwei verschiedene photoschaltbare RNA Aptamere zu identifizieren und zu untersuchen, welche eine hohe Spezifität und Affinität aufweisen. Zudem wurde die Photoisomerisierung des Azobenzols innerhalb der RNA-Struktur sowie daraus resultierende lichtinduzierte Konformationsänderungen der RNA mittels zeitaufgelöster Anreg-/Abtastspektroskopie untersucht. Die daraus resultierende Dynamik der photoinduzierten Ligandenbindung sollte eine weitere gezielte Optimierung lichtschaltbarer biologischer Systeme erlauben.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der zeitaufgelösten Untersuchung eines photoschaltbaren Foldamers. Speziell wurde der strukturelle Übergang des OmPE-Foldamers 10-5 zwischen einer definierten helikalen und einer ungefalteten Konformation auf Grund der Photoisomerisierung der, in das Rückgrat integrierten, Azobenzole untersucht.
Dabei konnten die frühen (Ent-)Faltungsmechanismen des Foldamers im sub-Nanosekunden-Zeitbereich beobachtet werden, welche durch quantenmechanische Rechnungen unterstützt werden konnten. Darüberhinaus, war es möglich einen Anregungsenergietransfer vom PE-Rückgrat des Foldamers auf die Azobenzole nachzuweisen, welcher die Lebensdauer der angeregten Zustände des Systems signifikant verkürzt.
Diese Arbeit liefert wichtige Informationen zu den Reaktionspfaden, den gezielten Wechselwirkungen zwischen Photoschaltern und größeren organischen Molekülen, sowie den daraus resultierenden lichtinduzierten strukturellen Änderungen durch die Anwendung einer Vielzahl an (zeitaufgelösten) spektroskopischen Methoden. Diese Ergebnisse tragen zum weiteren Verständnis komplexer Prozesse in biologischem sowie nicht-biologischem Zusammenhang und somit zu einer weiterführenden Entwicklung neuer Systeme bei.
Ziel dieser Arbeit war es zum einen Informationen über den Mechanismus in Dodecinproteinen zu gewinnen, der zu der effizienten Fluoreszenzlöschung von gebundenem Riboflavin und einer deutlichen Verlängerung der Lebendsdauer des Chromophors unter Lichteinwirkung führt. Zum anderen sollte mit Hilfe eines kurzen Modellpeptids, das eine Azobenzoleinheit als Photoschalter in seinem Peptidrückgrat enthielt, erste Schritte der Peptidfaltung untersucht werden.
Die Untersuchungen an Dodecinproteinen konzentrierten sich hauptsächlich auf archaeales Dodecin aus Halobacterium salinarum (HsDod). Eine Besonderheit der Dodecinproteine ist, dass sie im Gegensatz zu anderen Flavinbindeproteinen zwei Flavinmoleküle in jeder ihrer sechs identischen Bindetaschen einbauen können. Kurzzeitspektroskopische Untersuchungen im UV/vis-Spektralbereich zeigen, dass nach Photoanregung eines gebundenen Riboflavinmoleküls nach etwa 10 ps der Ausgangszustand wieder erreicht wird. Weiterhin zeigt das Fehlen der stimulierten Emission in den transienten Daten, dass bereits innerhalb der Zeitauflösung des Experiments, in weniger als 150 fs, der erste angeregte Zustand des Riboflavins entvölkert wird. Dies verhindert unerwünschte Reaktionen des Riboflavins und stellt eine Versorgung der Zelle mit diesem wichtigen Baustein für die Biosynthese von FMN und FAD sicher. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass zwei Spezies mit unterschiedlichen spektralen Signaturen und Lebensdauern an dem Löschungsmechanismus und der Wiedererlangung des Ausgangszustands beteiligt sind. Der Vergleich von HsDod-Proteinen in nicht-deuteriertem und deuteriertem Lösungsmittel sowie die spektrale Signatur der Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 800 fs zerfällt deuten an, dass ein Elektronen- sowie ein Protonentransfer Teil des Mechanismus sind. Mit Hilfe von HsDod-Proteinen, bei denen der Asparaginsäurerest unterhalb der Bindetasche, der für das Binden eines wasserkoordinierten Magnesiumions verantwortlich ist, gegen Serin (D41S) oder Glutaminsäure (D41E) ausgetauscht war, konnte gezeigt werden, dass das wasserkoordinierte Magnesiumion nicht relevant für den Löschungsmechanismus ist. Dennoch konnte eine Beteiligung von Wassermolekülen nicht ausgeschlossen werden. Die Beteiligung eines Elektronentransfers von einem Tryptophanrest in der Bindetasche auf das photoangeregte Flavin konnte durch Messungen an Dodecinproteinen mit Tryptophan-Derivaten mit unterschiedlichen Ionisationsenergien bestätigt werden.
Die Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 5 ps zerfällt, die ebenfalls zu einer Wiederbesetzung des Ausgangszustands führt, konnte nicht eindeutig identifiziert werden. Die spektrale Signatur des zerfallassoziierten Spektrums könnte neben einer neutralen Tryptophanspezies und einem kationischen Riboflavinradikal auch durch schwingungsangeregte Riboflavinmoleküle verursacht werden.
Eine Beteiligung der Ribitylkette am Mechanismus kann aufgrund der Ergebnisse von HsDod-gebundenem Lumiflavin ausgeschlossen werden. Weiterhin konnte anhand der Ergebnisse für HsDod-gebundenes FAD, das in seiner geschlossenen Konformation gebunden wird, wobei der Adeninrest die zweite Position in der Bindetasche besetzt, eine Beteiligung des zweiten Flavins in der Bindetasche am Löschungsmechanismus sowie ein Beitrag zu den Differenzspektren ausgeschlossen werden. Somit dient die Besetzung einer Bindetasche mit zwei Flavinmolekülen vermutlich lediglich der Maximierung der Flavinbeladung. Nicht eindeutig geklärt werden konnte die Frage, ob es sich um einen sequentiellen oder parallelen Mechanismus handelt.
Neben archaealem wurde auch bakterielles Dodecin mittels transienter UV/vis-Spektroskopie untersucht. Für Dodecin aus Halorhodospira halophila (HhDod) konnte ebenfalls eine sehr schnelle Wiedererlangung des Ausgangszustands nach Photoanregung des gebundenen Riboflavins beobachtet werden. Allerdings spiegeln einige Unterschiede in den transienten Daten die Unterschiede in den Bindetaschen von archaealem und bakteriellem Dodecin wider und geben Hinweise darauf, dass die Funktionen in der Zelle für die Dodecine unterschiedlich sind. Diese Hypothese wird durch verschiedene Cofaktoren, Riboflavin und Lumichrom für HsDod und FMN für HhDod, in vivo unterstützt. Die ermittelten Zeitkonstanten sind für das bakterielle Dodecin etwas länger als für das archaeale und die transienten Daten weisen in den spektralen Signaturen der Differenzsignale sowohl Unterschiede als auch Gemeinsamkeiten auf.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden erste Schritte der Peptidfaltung mit Hilfe eines wasserlöslichen bizyklischen Modellpeptids, das den Photoschalter 4(4’-Aminomethylphenylazo)benzoesäure (AMPB) enthält, untersucht. Hierfür wurden Kurzzeitspektroskopische Messungen im mittleren infraroten Spektralbereich für den Schaltvorgang von der cis-Form des Azopeptids in die trans-Form durchgeführt. Diese Methode erlaubt es, transiente Konformationsänderungen des Peptidrückgrats zu verfolgen. In der cis-Form kann das Peptid mehrere unterschiedliche Konformationen einnehmen, während der Konformationsraum für die trans-Form deutlich eingeschränkt ist. Nach der Photoanregung im Bereich der n-pi*-Bande der Azobenzoleinheit finden die grundlegenden konformationellen Änderungen innerhalb der ersten 10-20 ps statt. Dies wurde durch polarisationsabhängige Messungen bestätigt.
Auf dieser Zeitskala finden die größten Änderungen in den transienten Differenzspektren statt, die auf Konformationsänderungen sowie Kühlprozesse zurückzuführen sind. Diese Prozesse konnten mit einer Zeitkonstanten von 5 ps zusammengefasst werden. Auf längeren Zeitskalen finden weitere Reorganisationsprozesse statt, die mit einer Zeitkonstante von 300 ps zusammengefasst werden können. Bei maximaler Verzögerungszeit des Experiments (1,8 ns) ist der Gleichgewichtszustand noch nicht erreicht und es finden weitere Prozesse auf längeren Zeitskalen statt. Im Vergleich zu einem ähnlichen bereits untersuchten DMSOlöslichen bizyklischen AMPB-Peptid konnte keine schnellere Dynamik durch den Einsatz von Wasser als Lösemittel festgestellt werden, wie es vorangegangene transiente Experimente im UV/vis-Spektralbereich an wasser- und DMSO-löslichen bizyklischen Azopeptiden angedeutet hatten. Die Ergebnisse der transienten Messungen zeigen gute Übereinstimmungen mit molekulardynamischen Rechnungen. Das so gewonnene Modell von den Prozessen nach der Isomerisierung des Photoschalters erlaubt Einblicke in erste Schritte bei der Faltung von Peptiden in ihrem natürlichen Lösungsmittel Wasser und die Zeitskalen der entsprechenden Prozesse.
Die Modulation molekularer Systeme mit Licht ist ein in den letzten Jahren immer stärker untersuchtes Forschungsgebiet. Es existiert bereits eine große Anzahl an Publikationen, die mittels statischer Spektroskopie und anderer statischer Methoden Einblicke in die ablaufenden Prozesse gewähren konnten. Untersuchungen im Ultrakurzzeitbereich sind jedoch eher selten, liefern aber detaillierte Informationen zu den ablaufenden Prozessen. Den Wissensstand diesbezüglich zu erweitern, war Ziel dieser Dissertation.
Untersucht wurden neun photoschaltbare, molekulare Dyaden hinsichtlich ihrer Dynamik nach Photoanregung. Die Dyaden setzten sich aus einem Fluorophor (Bordipyrromethen, BODIPY), einem Photoschalter (Dithienylethen, DTE; offen oder geschlossen) und gegebenenfalls einer COOH-Ankergruppe zusammen.
Die Unterschiede in den Molekülstrukturen bestanden in der Verknüpfung der einzelnen Bauteile (kurze oder lange, beziehungsweise gerade oder gewinkelte Brücke) und der Art des Fluorophors und des Photoschalters (jeweils zwei verschiedene Strukturen).
Durch Belichtung mit UV- oder sichtbarem Licht konnten photostationäre Zustände generiert werden, die 40 – 98 % geschlossenes Isomer (je nach Molekül) beziehungsweise 100 % offenes Isomer enthielten.
Unter Verwendung von Licht verschiedener Wellenlängen konnten beide Teile der Dyade (BODIPY beziehungsweise DTE) separat angeregt und hinsichtlich der ablaufenden Photodynamik untersucht werden, wobei der Fokus der Arbeit auf transienten Absorptionsmessungen mit Anregung des BODIPY lag. Bei einem Großteil der untersuchten Moleküle kam es in diesem Fall, je nach Zustand des Photoschalters, zu einem intramolekularen Energietransfer nach der Theorie von Theodor Förster. Durch diese Energietransferprozesse kommt es zu einer drastischen Verkürzung der Lebenszeit des angeregten Zustands des BODIPY. Ausgehend von Lebenszeiten im Bereich von Nanosekunden im Falle der offenen Dyaden (entspricht der Fluoreszenzlebensdauer) reduziert sich die Lebenszeit auf wenige Pikosekunden, beziehungsweise je nach Aufbau des Moleküls sogar noch weiter. Die unterschiedlich schnellen Transferprozesse sind im Sinne der Förster-Theorie durch die unterschiedlichen Entfernungen und relativen Orientierungen der beiden beteiligten Übergangsdipolmomente (von DTE und BODIPY) erklärbar.
Neben Experimenten mit Anregung des BODIPY-Teils der Dyaden wurden weitere Experimente durchgeführt, in denen der geschlossene Photoschalter direkt angeregt wurde. Aus diesen Messungen konnten Erkenntnisse über die Relaxation des DTE erlangt werden. Auf diese Weise war es möglich, bei einigen der Moleküle die Ringöffnungsreaktion zu beobachten und zu charakterisieren. Im Fall von Dyade 4 konnten zusätzlich kohärente Schwingungen des Moleküls nach Photoanregung detektiert werden, die sich anhand einer Frequenzmodulation der Absorptionsbande des BODIPY-Teils über einen Zeitbereich von 2 ps beobachten ließen.
Functional dynamics of ribonucleic acids : development and application of spectroscopic tools
(2016)
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wird der Aufbau eines zeitaufgelösten Fluorimeters, die photophysikalische Grundcharakterisierung der drei 2-(Pyrenylethinyl)-Adenosine (PyAs) und das Wechselwirkungsgeflecht des tetracyclinbindenden Aptamers (TC-Aptamer) mit seinem Liganden Tetracycyclin (TC) und Mg2+ dargestellt.
Das zeitaufgelöste Fluorimeter basiert auf der experimentellen Technik des zeitkorrelierten Einzelphotonenzählens. Es verfügt über zwei Anregungsquellen: gepulste UV-LEDs und einen frequenzverdoppelten titandotierten Saphirlaser. Diese Quellen Decken einen Wellenlängenbereich von (310 - 550) nm ab. Das Spektrometer kann unter günstigen Umständen eine Zeitauflösung von 50 ps erreichen bei einer zeitlichen Messungenauigkeit von weniger als 0,02 %.
Die Leistungsfähigkeit des Aufbaus wird anhand einer umfangreichen Studie an den drei PyAs demonstriert.
Die drei PyAs 2-(1-Pyrenylethinyl)-Adenosine (1PyA), 2-(2-Pyrenylethinyl)-Adenosine (2PyA) und 2-(4-Pyrenylethinyl)-Adenosine (4PyA) sind eine Gruppe fluoreszierender RNA-Nukleosidanaloga, welche die Gesamtheit aller möglichen Konfigurations-isomere der Grundverbindung PyA umfassen. Ihre zeitabhängigen Fluoreszenzzerfallseigenschaften werden ergänzt von stationären Absorptions- und Fluoreszenzspektren, ultraschneller transienter Absorptionsspektroskopie und quantenchemischen Rechnungen. Die Fluoreszenz von 1PyA und 4PyA gehorchen der Regel von Kasha, wohingegen 2PyA einen triexponentiellen Zerfall mit ausgeprägter Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge zeigt. Die transienten Absorptionsspektren aller drei Isomere weisen im gesamten Spektrum dominante, wenig strukturierte Absorptionsbanden des ersten angeregten Zustands auf, welche im nahen UV in unterschiedlichem Maße vom Grundzustandsbleichen und stimulierter Emission überlagert werden. 2PyA zeigt eine deutlich ausgeprägte Signatur für eine interne Umwandlung hin zum S1, wenn es in höhere angeregte Zustände angeregt wird.
Das Fluoreszenzverhalten von 2PyA wird mithilfe eines lokal angeregten (LE) und zweier intramolekularer Ladungstransferzustände, von denen einer der koplanaren Orientierung von Pyren und Adenin (MICT) und der andere einer um 90 ° verdrehten Orientierung (TICT) entspricht. Der LE-Zustand ist hierbei verknüpft mit dem S2 von 2PyA, welcher einer rein pyrenlokalisierten Anregung entspricht. Dieser Zustand existiert so in 1PyA und 4PyA nicht. Der verdrehte TICT-Zustand ist nur in 2PyA bevölkerbar, weil für 2PyA die Barriere zur Bildung von Rotameren am niedrigsten ist und das Molekül nach Anregung daher in diese Geometrie kommen kann und dann durch die stärkere elektrostatische Anziehung stabilisiert wird. 1PyA und 4PyA emittieren hingegen nur aus dem MICT-Zustand.
Die Komplexbildung des TC-Aptamers mit seinem Liganden TC in Lösung wird empfindlich beeinflusst durch die-Konzentration von Magnesiumkationen. Dies wird untersucht durch Bindungs- und Faltungs- und Denaturierungsstudien mit verschiedenen Mg- und Harnstoffkonzentrationen. Als experimentelle Observable dienen hierbei die konformationsabhängige Nukleobasenabsorption und ihr Zirkulardichroismus im fernen UV, die Fluoreszenz des Liganden TC und die freiwerdende Wärme der exothermen Bindungsreaktion des Aptamers mit Mg in An- und Abwesenheit von TC.
Ohne Mg ist eine Interaktion des TC-Aptamers mit TC nicht nachweisbar. Dies liegt daran, dass Mg die notwendige elektrostatische Abschirmung der negativen elektrischen Ladung am RNA-Rückgrat zur Verfügung stellt. Die Abschirmung erlaubt es dem Aptamer kompakte Strukturen mit tertiären Kontakten auszubilden. Wenn die Mg-Konzentration die Faltung des Aptamers vollständig unterstützt (> 1 mM), so befindet sich das Aptamer weitgehend in einer vorgefalteten Konformation, welche der bindungskompetenten stark ähnelt. In diesem Zustand kann das Aptamer seinen Liganden extrem schnell, nämlich annähernd diffusionslimitiert binden. Unter diesen Bedingungen hat TC kaum Einfluss auf die Konformation seines Aptamers.
Bei physiologischen Mg-Konzentrationen (0,2 - 0,8 mM) kann das Aptamer kompakte Konformationen mit tertiären Strukturen einnehmen. Diejenige Konformation, welche der bindenden sehr stark ähnelt, dominiert das konformationelle Gleichgewicht jedoch noch nicht vollständig, es ist lediglich eine Konformation von vielen möglichen. Daher eröffnen physiologische Mg-Konzentrationen dem TC-Aptamer Teile des Konformationsraumes, welche andernfalls nicht zugänglich wären und TC stabilisiert selektiv die native Konformation. Diese konformationelle Verschiebung liefert kann hierbei zur robusten Signalgebung für die Funktion als Riboschalter dienen.
Cellular metabolism can be envisaged by fluorescence lifetime imaging of fluorophores sensitive to specific intracellular factors such as [H+], [Ca2+], [O2], membrane potential, temperature, polarity of the probe environment, and alterations in the conformation and interactions of macromolecules. Lifetime measurements of the probes allow the quantitative determination of the intracellular factors. Fluorescence microscopy taking advantage of time-correlated single photon counting is a novel method that outperforms all other techniques with its single photon sensitivity and picoseconds time resolution. In this work, a time- and space-correlated single photon counting system was established to investigate the behavior of 2-(4-(dimethylamino)styryl)-1-methylpyridinium iodide (DASPMI) in living cells. DASPMI is known to selectively stain mitochondria in living cells. The uptake and fluorescence intensity of DASPMI in mitochondria is a dynamic measure of membrane potential. Hence, an endeavour was made to elucidate the mechanism of DASPMI fluorescence by obtaining spectrally-resolved fluorescence decays in different solvents. A bi-exponential decay model was sufficient to globally describe the wavelength dependent fluorescence in ethanol and chloroform. While in glycerol, a three-exponential decay model was necessary for global analysis. In the polar low-viscous solvent water, a mono-exponential decay model fitted the decay data. The sensitivity of DASPMI fluorescence to solvent viscosity was analysed using various proportions of glycerol/ethanol mixtures. The lifetimes were found to increase with increasing solvent viscosity. The negative amplitudes of the short lifetime component found in chloroform and glycerol at the longer wavelengths validated the formation of new excited state species from the initially excited state. Time-resolved emission spectra in chloroform and glycerol showed a biphasic increase of spectral width and emission maxima. The spectral width had an initial fast increase within 150 ps and a near constant thereafter. A two-state model based on solvation of the initially excited state and further formation of TICT state has been proposed to explain the excited state kinetics and has been substantiated by the de-composition of time-resolved spectra. The knowledge of DASPMI photophysics in a variety of solvents now provides the means of deducing complex physiological parameters of mitochondria from its behavior in living cells. Spatially-resolved fluorescence decays from single mitochondria or only very few organelles of XTH2 cells signified distinctive three-exponential decay kinetics of viscous environment. Based on DASPMI photophysics in a variety of solvents, these lifetimes have been attributed to the fluorescence from locally excited state (LE), intramolecular charge transfer state (ICT) and twisted intramolecular charge transfer (TICT) state. A considerable variation in lifetime among mitochondria of different morphology and within single cell was evident corresponding to the high physiological variations within single cells. Considerable shortening of the short lifetime component (τ1) under high membrane potential condition, such as in the presence of ATP and/or substrate, was similar to quenching and dramatic decrease of lifetime in polar solvents. Under these conditions τ2 and τ3 increased with decreasing contribution. Upon treatment with ionophore nigericin, hyperpolarization of mitochondria resulted in remarkable shortening of τ1 from 159 ps to 38 ps. Inhibiting respiration by cyanide resulted in notable increase of mean lifetime and decrease of mitochondrial fluorescence. Increase of DASPMI fluorescence on conditions elevating mitochondrial membrane potential has been attributed to uptake according Nernst distributions, to de-localisation of π electrons, quenching processes of the methyl pyridinium moiety and restricted torsional dynamics at the mitochondrial inner membrane. Accordingly, determination of anisotropy in DASPMI stained mitochondria in living XTH2 cells, revealed dependence of anisotropy on membrane potential. Such changes in anisotropy attributed to restriction of the torsional dynamics about the flexible single bonds neighboring the olefinic double bond revealed the previously known sub-mitochondrial zones with higher membrane potential along its length. Membrane-potential-dependent changes in anisotropy have further been demonstrated in senescent chick embryo fibroblasts. In conclusion, spectroscopic observations of excited-state kinetics of DASPMI in solvents and its behavior in living cells had revealed for the first time its localisation, mechanism of voltage sensitive fluorescence and its membrane-potential-dependent anisotropy in living cells. The simultaneous dependence of DASPMI photophysics on mitochondrial inner membrane viscosity and transmembrane potential has been highlighted.
Zur Vorhersage der Konformationen organischer Moleküle in wässriger Lösung wurde ein explizites Solvatationsmodell (TPA3) für das Kraftfeldprogramm MOMO entwickelt, getestet und erfolgreich angewendet. Für jede zu optimierende Konformation wird eine der räumlichen Ausdehnung entsprechende Solvathülle generiert. Dadurch werden zu große Solvathüllen mit vielen Wassermolekülen vermieden. Diesem ersten Schritt liegt das Aneinanderreihen von Eiselementarzellen und ungeordneten Wasserzellen zugrunde. Überschneidungen oder unrealistisch nahe Orientierungen von Wassermolekülen zu dem solvatisierten Molekül werden ausgeschlossen. Gleichzeitig wird sichergestellt, dass in der Umgebung von Wasserstoffbrücken-Donoren und -Akzeptoren im solvatisierten Molekül Wassermoleküle zu finden sind.
Die Optimierung vereinfachter Wassermoleküle ohne molekularen Zusammenhalt basiert auf vektoriellen Ausgleichsbewegungen, in die die Bewegungsvektoren der minimierten Wassermolekül-Atome eingehen. Dadurch ist es möglich, ein einziges Potential für Coulomb- und vdw-Wechselwirkungen ohne Vernachlässigung der Rotation zu nutzen, was eine deutliche Rechenzeitoptimierung bedeutet. Die besondere Beachtung der Programmstruktur von MOMO und die sich daraus ergebende Interaktion des Solvatationsmodells mit nahezu allen relevanten Programmteilen des Kraftfeldprogramms ermöglicht trotz ihres kontinuierlichen Austauschs eine Unterscheidung von präzise behandelten nahen und vereinfachten fernen Wassermolekülen während der gesamten Minimierung. Gleichzeitig werden von jedem nahen Wassermolekül die Einzelenergiebeiträge der Wechselwirkungen mit dem solvatisierten Molekül direkt in den Potentialen gesammelt und durch Summation die Stabilisierungsenergie Estab bestimmt.
Somit wird ein Nahbereich mit ungeordneten Wassermolekülen um ein solvatisiertes Molekül herum mit der gesamten in MOMO möglichen Präzision behandelt. Hierbei ist die Berechnung von Wasserstoffbrücken zwischen dem solvatisierten Molekül und umgebenden Wassermolekülen für Estab von entscheidender Bedeutung. Hingegen wird der Fernbereich ausgehend und basierend auf der Eisstruktur rechenzeitoptimiert behandelt. Dynamik und Durchmischung mit dem Nahbereich werden durch den auf der Minimierung der isolierten Atome basierenden TPA3-Algorithmus erreicht.
Mit den erreichten Rechenzeitoptimierungen können systematische Konformationsanalysen an Di- und Tripeptiden in Wasser mit bis zu 2500 Konformationen problemlos durchgeführt werden. Mit den statistischen Auswertungsmethoden des Clusterings, der Medianbildung und der Datenrasterung ergaben sich aussagekräftige Energieflächen über Ramachandran-Diagrammen der berechneten Peptide. Die Visualisierung der Trajektorien und der Minimum-Konformationen der Peptide mit deren Wasserstoffbrücken und der daran beteiligten Wassermoleküle sowie die detaillierte Analyse der Energiebeiträge lieferten eine solide Interpretationsbasis der vorhergesagten Strukturen.
Insgesamt wurden Konformationsanalysen im Vakuum und mit dem neu entwickelten TPA3-Solvatationsmodell an zehn Peptiden durchgeführt. Ungeschützte Peptide wurden in unterschiedlich protonierten Formen berechnet. Vergleichende Konformationsanalysen mit AMBER11 und TIP3P-Solvatationsmodell waren nur für die zwitterionische Form möglich.
Bei dem geschützten Alaninpeptid N-Acetyl-L-L-dialanin-N-methylamid zeigte sich eine Begünstigung der PPII-Struktur. Daneben trat ein Minimum im β-Faltblattbereich auf; eine Stabilisierung des αR-helikalen Bereichs wurde ebenfalls beobachtet. Dies entspricht den in der aktuellen Literatur zu findenden spektroskopisch erhaltenen Ergebnissen.
Aufgrund nicht vorhandener Informationen bezüglich der Energiebeiträge durch das explizite TIP3P-Solvatationsmodell war die Auswertung der AMBER11-Konformationsanalysen auf die Verteilung der Konformationen im Ramachandran-Diagramm begrenzt und somit stark eingeschränkt. Bezüglich N-Acetyl-L-L-dialanin-Nmethylamid ergaben sich auch mit AMBER11 Häufungen im PPII- und β-Faltblatt-Bereich und darüber hinaus im αD-helikalen Bereich.
Für Peptide mit negativ geladenen Seitenketten in der zentralen Position wurden Konformationen, die in Turns zu finden sind, als begünstigt berechnet. Bei Tripeptiden mit Aminosäuren, die Donoren D bzw. Akzeptoren A zur Wasserstoffbrückenbildung in ihren Seitenketten besitzen (Ala−Lys−Ala, Ala−Asp−Ala, Cys−Asn−Ser), wurden in allen Fällen zweifache Wasserstoffbrücken über verbrückende Wassermoleküle hinweg (D/A···H2O···D/A) beobachtet. Diese scheinen insbesondere bei Ala−Asp−Ala durch Beteiligung des Aspartatrestes und einem zweimalig negativen Energiebetrag von mehr als 10 kJ/mol Einfluss auf die Konformation zu nehmen und δ-Turn-Konformationen zu stabilisieren. Die AMBER11-Konformationsanalyse mit TIP3P-Modell ergab hingegen eine deutliche Häufung minimierter Konformationen für φ < 120°. Diese Häufung zeigt sich als deutlicher Streifen im Ramachandran-Diagramm bei φ ≈ 60°. Die α-helikalen Konformationen αD und αL sowie die C7 ax-Struktur sind von AMBER11 hier stark begünstigt. Die Konformationsanalyse mit TPA3-Solvatationsmodell an Ala−Lys−Ala zeigte mehrere Minima; die Konformationen im Bereich δR / PPII / C7 eq werden jedoch besonders stabilisiert. Ein verbrückendes Wassermolekül ist auch hier beteiligt.
Bei den Tripeptiden mit sperrigen Seitenketten, wie Ala−Phe−Ala und Gly−Phe−Gly, wird eine sterische Abschirmung durch den Phenylrest deutlich, die zu einer Abschwächung der Begünstigung von PPII-Konformationen führt. Stattdessen sind α-helikale Konformationen favorisiert. Bei Gly−Phe−Gly scheint diese Abschirmung einen weniger starken Einfluss zu haben: im PPII- und β-Faltblattbereich sind wieder Minima vorhanden. Generell sind die Ergebnisse der MOMO/TPA3-Konformationsanalysen im Einklang mit der aktuellen Literatur und sehr plausibel für Peptide, bei denen (noch) keine eindeutigen Literaturergebnisse vorliegen. Die aktuelle Annahme, dass intramolekulare Wasserstoffbrücken in Peptiden Turn-Konformationen in Wasser stabilisieren könnten, wird mit den in dieser Arbeit mehrfach aufgetretenen zweifachen Wasserstoffbrücken über verbrückende Wassermoleküle erweitert.
Mit AMBER11 konnte dagegen kaum Bezug zu experimentellen Literaturergebnissen hergestellt werden. Dies liegt vor allem daran, dass die für eine aussagekräftige Auswertung unverzichtbaren Energiebeiträge der Peptid-Wechselwirkungen mit einzelnen Wassermolekülen mit AMBER11 nicht zur Verfügung standen. AMBER11 eignet sich daher kaum als Referenz für die mit MOMO und dem neu entwickelten TPA3-Solvatationsmodell erhaltenen Ergebnisse.
The enzyme quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes is a membrane protein complex that couples the catalysis of the oxidation of menaquinol to menaquinone to that of the reduction of fumarate to succinate. This is the terminal step in fumarate respiration, a form of anaerobic respiration in which oxygen is replaced by fumarate as the terminal electron acceptor in many anaerobic microorganisms. In QFR, both the heme groups (low-potential distal and high-potential proximal heme b group in transmembrane subunit C) are part of the electron transport chain between the two catalytic sites of the redox enzyme. Although the reduction of fumarate by menaquinol is exergonic, it is not exergonic enough to support the generation of a transmembrane electrochemical proton potential delta p. Evidence has previously shown that this reaction is catalysed by a novel mechanism, involving the facilitation of transmembrane electron transfer by transmembrane proton transfer via an essential compensatory transmembrane proton transfer pathway ("E-pathway") which is inactive in the oxidized state of the enzyme. The two key constitutents of the the pathway are the amino acid residue Glu C180 of the transmembrane helix V (located in subunit C) and the ring C propionate of the distal heme bD. The aim of the project was to obtain, by employing a combination of time-resolved as well as static spectroscopic approaches, a detailed insight of the transmembrane electron coupled proton transfer mechanism. Minute changes in both the oxidized and reduced states of a redox protein system can be selectively and sensitively monitored by static Fourier Transformed Infrared (FTIR) difference spectroscopy. The technique employed in this context, electrochemically induced FTIR difference spectroscopy, is complemented by computer-based electrostatic calculations. In order to elucidate the catalytic mechanism of the important reactions in QFR, it is necessary to investigate these in a time-resolved manner. Rapid scan FTIR difference spectroscopy is a suitable technique that allows the course of the reaction to be monitored in a time dependent fashion. The techniques employed in this context are time-resolved (tr-FTIR) and transient absorption spectroscopy. In the following, the details of individual sub-projects are discussed in brief. ...
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
Detailed knowledge of reaction mechanisms is key to understanding chemical, biological, and biophysical processes. For many reasons, it is desirable to comprehend how a reaction proceeds and what influences the reaction rate and its products.
In biophysics, reaction mechanisms provide insight into enzyme and protein function, the reason why they are so efficient, and what determines their reaction rates. They also reveal the relationship between the function of a protein and its structure and dynamics.
In chemistry, reaction mechanisms are able to explain side products, solvent effects, and the stereochemistry of a product. They are also the basis for potentially optimizing reactions with respect to yield, enhancing the stereoselectivity, or for modifying reactions in order to obtain other related products.
A key step to investigate reaction mechanisms is the identification and characterization of intermediates, which may be reactive, short-lived, and therefore only weakly populated. Nowadays, the structures of those can in most cases only be hypothesized based on products, side products, and isolable intermediates, because intermediates with a life time of less than a few microseconds are not accessible with the commonly used techniques for structure determination such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.
In this thesis, two-dimensional infrared (2D-IR) spectroscopy is shown to be a powerful complement to the existing techniques for structure determination in solution. 2D-IR spectroscopy uses a femtosecond laser setup to investigate interactions between vibrations - analogous to 2D-NMR, which investigates the interactions between spins. Its ultrafast time resolution makes 2D-IR spectroscopy particularly well suited for the two topics investigated in this thesis: Structure Determination of Reactive Intermediates and Conformational Dynamics of Proteins.
Structure Determination of Reactive Intermediates: The focus of this thesis is using polarization-dependent 2D-IR (P2D-IR) spectroscopy for structure determination of N-crotonyloxazolidinone (referred to as 1), a small organic compound with a chiral oxazolidinone, known as Evans auxiliary, and its reactive complexes with the Lewis acids SnCl4 and Mg(ClO4)2. Chiral oxazolidinones in combination with Lewis acids have frequently been used in stereoselective synthesis for over 30 years. Nevertheless, the detailed mechanisms are in many cases xvi ABSTRACT still mere hypotheses and have not yet been experimentally proven. By accurately measuring the angles between the transition dipole moments in the molecules using an optimized P2D-IR setup and comparing the results to DFT calculations, the conformation of 1 and the conformation and coordination of the main complexes with SnCl4 and Mg(ClO4)2 are unequivocally identified and analyzed in depth. Structural details, such as a slight twist in the solution structure of 1, are detected using P2D-IR spectroscopy; these cannot be inferred from NMR spectroscopy or DFT calculations. In addition to the main Lewis acid complexes, complexes in low concentration are detected and tentatively assigned to different conformations and complexation geometries. The knowledge of those structures is essential for rationalizing the observed stereoselectivities. Additionally, a method is introduced that enables structure determination of molecules in complex mixtures and even in the presence of molecules with similar spectral properties and in high concentration. This work sets the stage for future studies of other substrate-catalyst complexes and reaction intermediates for which the structure determination has not been possible to date.
Conformational Dynamics of Proteins: Exchange 2D-IR spectroscopy allows the investigation of fast dynamics without disturbing the equilibrium of the exchanging species. It is therefore well suited to investigate fast dynamics of proteins and to reveal the speed limit of those. The temperature dependence of the conformational dynamics between the myoglobin substates A1 and A3 in equilibrium is analyzed. The various substates of myoglobin can be detected with FTIR spectroscopy, if carbon monoxide is bound to the heme. From previous studies it is known that the exchange rates at room temperature are in the picosecond time range, well suited to be investigated by 2D-IR spectroscopy. In the temperature range between 0 °C and 40 °C only a weak temperature dependence of the exchange rate in the myoglobin mutant L29I is observed in the present study. The exchange rate approximately doubles from 15 ns-1 at 0 °C to 31 ns-1 at 40 °C. It turned out that the conformational dynamics correlates linearly with the solvent viscosity, which itself is temperature dependent. Comparing our results to measurements at cryogenic temperatures, the linear relation between exchange time constant for this process and the viscosity is shown for the temperature range between -100 °C and 40 °C (corresponding to a viscosity change of 14 orders of magnitude). Thus, it is proven that the dynamics of the conformational switching are mainly determined by solvent dynamics, i.e., the protein dynamics are slaved to the solvent dynamics. This is the first time slaving is observed for such fast processes (in the picosecond time range). The observation implies a long-range structural rearrangement between the myoglobin substates A1 and A3. In addition, the exchange for other mutants and wild type myoglobin is analyzed qualitatively and found to agree with the conclusions drawn from L29I myoglobin.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der Variation des Oxidationspotentials und der Elektronenkonfiguration ( * gegen n *) auf die zur Löschung von angeregten Triplettzuständen durch O2 führenden Prozesse untersucht. Bei ausreichender Triplettenergie werden neben dem Grundzustand des ursprünglich angeregten Sensibilisators in Konkurrenz O2(1 g ) und O2(1 g) Singulettsauerstoff sowie O2(3 g -) Grundzustandssauerstoff gebildet. Frühere Untersuchungen in diesem Arbeitskreis hatten gezeigt, daß es für * Triplettzustände zwei Desaktivierungskanäle gibt, die beide zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führen. Der eine geht von den bei der Löschung zunächst gebildeten 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen ohne Charge Transfer Stabilisierung aus (nCT). Diese befinden sich in einem vollständig eingestellten spinstatistischen Gleichgewicht, aus dem durch innere Konversion in niedrigere Komplexzustände die Desaktivierung erfolgt. Ein gemeinsames Energielückengesetzt f( E) und damit letztlich die Triplettenergie des Sensibilisators bestimmt die Größe der Geschwindigkeitskonstanten der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse in diesem nCT Kanal. Für Sensibilisatoren mit hohem Oxidationspotential und vernachlässigbaren Charge Transfer Wechselwirkungen ist dies der einzige Desaktivierungsprozeß. Mit zunehmender Charge Transfer Wechselwirkung, also mit abnehmendem Oxidationspotential und/oder zunehmender Triplettenergie, wird ein zweiter Desaktivierungskanal geöffnet, der über 1,3(T1 3 ) Komplexe mit Charge Transfer Stabilisierung (pCT) also über Exciplexe führt. Die Exciplexbildung ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im pCT Kanal. Zur Verbreitung der Datenbasis den T1( *) Sensibilisatoren wurde in dieser Arbeit eine Reihe von mit elektronenziehenden bzw. elektronenschiebenden Gruppen substituierten Fluorenen studiert, bei denen im wesentlichen nur das Oxidationspotential variiert, während die Triplettenergien weitgehend konstant bleiben. Die mit den Fluorenen erhaltener Ergebnisse bestätigen das bisher erarbeitet Zweikanal-Desaktivierungsmodell. Insbesondere wird auch das spinstatistische Gewicht von 1:3 für die Bildung von Singulett zu Triplettsauerstoff im Exciplex Kanal gefunden, das nur mit einem relativ langsamen 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) isc Gleichgewicht konsistent ist. Dieses Ergebnis widerspricht der früheren Annahme, wonach ein effizientes isc Gleichgewicht nur zwischen 1,3(T1 3 ) Exciplexen, nicht aber zwischen 1,3(T1 3 ) Encounter Komplexen existieren soll. In der vorliegenden Arbeit wird ein Modell für die 1(T1 3 ) 3(T1 3 ) angeregten Komplexe vorgeschlagen, das in einfacher Weise erklärt, warum das isc zwischen Encounter Komplexen von Sensibilisator und O2 schneller ist, als das zwischen den entsprechenden Exciplexen. Die weitere Analyse der Fluoren Daten zeigt, daß neben dem Oxidationspotential und der Triplettenergie des Sensibilisators auch dessen Struktur die Geschwindigkeitskonstanten beeinflussen kann, allerdings weitaus schwächer als die beiden ersten Einflußgrößen. Mit den Messungen der Geschwindigkeitskonstanten kT 1 , kT 1 und für kT 3 der zu O2(1 g ), O2(1 g) und O2(3 g -) führenden Prozesse für die unterschiedlich substituierten Benzophenonderivate wurde erstmals eine quantitative Untersuchung der Löschung von n * angeregten Triplettzuständen durch O2 durchgeführt. Obwohl für die Benzophenone eine stärkere Variation des Oxidationspotentials bei nahezu konstanter Triplettenergie erreicht werden konnte, wurde im Vergleich zu den * Triplettsensibilisatoren eine wesentlich schwächere Variation von kT 1 , kT 1 und für kT 3 beobachtet. Gleichzeitig liegen die Werte von kT 1 , kT 1 und für kT 3 der Benzophenone mit vernachlässigbarer Charge Transfer Wechselwirkung weit von der für * Triplettsensibilisatoren gefundenen Energielückenbeziehung f( E). Offenbar gilt für n * Triplettsensibilisatoren eine andere Energielückenbeziehung f( E), die viel schwächer von E abhängt. Es konnte gezeigt werden, daß die schwächere Überschußenergieabhängigkeit mit der unterschiedlichen Struktur der 1,3(T1.3 ) Komplexe zusammenhängt. Für 1,3(T1(n *) 3 ) ist eine Vierzentren Struktur, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls parallel und benachbart zu den beiden Atomen der angeregten Carbonyl Gruppe liegen, sehr wahrscheinlich. Bei der Desaktivierung der Carbonyleinheit ändern sich die Bindungslängen der Vierzentrenstruktur stark, was einem Übergang zwischen versetzten Potentialkurven mit schwacher Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren entspricht. Für 1,3(T1( *) 3 ) Komplexe ist eine supra-supra Struktur anzunehmen, bei der die beiden Sauerstoffatome des O2 Moleküls mit gegenüberliegenden Kohlenstoffatomen eines angeregten aromatischen Rings wechselwirken. Bei der Desaktivierung des aromatischen Rings ändern sich die Bindungslängen nur wenig, so daß man von einem Übergang zwischen übereinander liegenden Potentialkurven mit stärkerer Energieabhängigkeit der Franck-Condon Faktoren sprechen kann. Dies ist der eigentliche Grund für die verschiedenen Energielückenbeziehungen f( E) und f( E) bei der Löschung von * und n * Triplettsensibilsatoren durch O2. Die Variation des Oxidationspotentials und damit der Stärke der Charge Transfer Wechselwirkungen in den 1,3(T1 3 ) Komplexen wird durch unterschiedliche Substitution von aromatischen Ringen mit elektronenziehenden oder elektronenschiebenden Gruppen bewirkt. Da die aromatischen Ringe bei den n * Triplettsensibilisatoren im Gegensatz zu den * Triplettsensibilisatoren nicht Bestandteil des elektronisch angeregten Zentrum sind, fallen die Charge Transfer Effekte bei den n * Triplettsensibilisatoren deutlich schwächer aus als bei den * Triplettsensibilisatoren. Damit konnte in der vorliegende Arbeit erstmals eine konsistente Begründung für das unterschiedliche Verhalten von n * und * Triplettsensibilisatoren bei der Löschung durch O2 gegeben werden.