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Der Transport von antigenen Peptiden in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ist ein zentraler Vorgang bei der Antigenprozessierung und ihrer MHC-Klasse-I-vermittelten Präsentation auf der Zelloberfläche. Intrazelluläre Translokation über die ER-Membran erfolgt mit Hilfe von TAP, eines ATP-abhängigen ABC-Transporters. Einer ATP-unabhängigen Substratbindung folgt der eigentliche Transportschritt, dessen Energetisierung einer ATP-Spaltung bedarf. In der vorliegenden Dissertation wurde die ATPase-Aktivität des TAP-Komplexes aufgeklärt und detailliert charakterisiert. Es wurde eine schnelle und schonende Isolierungs- und Rekonstitutionsmethode entwickelt, die es erlaubt, den partiell aufgereinigten TAP-Komplex in Liposomen einzubauen und Funktionsstudien in vitro durchzuführen. Zum ersten Mal war es damit möglich, die Peptid-stimulierte TAP-spezifische ATP-Hydrolyse direkt zu beobachten und deren kinetische Parameter zu bestimmen. Eine direkte Korrelation zwischen Bindungsaffinität des Peptides zu TAP (Bindungskonstante KD) und der halbmaximalen Stimulation der ATPase-Aktivität von TAP (Km,pep) wurde festgestellt. Die Versuche mit den verzweigten Peptiden zeigten, dass Peptide, die nicht transportiert werden können, keine Stimulation der ATPase-Aktivität hervorrufen. Somit wurde die allosterische Interaktion zwischen Peptidbindung, ATP-Hydrolyse und Peptidtransport nachgewiesen. Nach der Entfernung des peptidexportierenden Sec61-Komplexes aus den Proteoliposomen konnte die vorläufige Stöchiometrie des Transportschrittes bestimmt werden. Eine weitere Anwendung fand die Rekonstitutionsmethode bei der Aufklärung des molekularen Wirkungsmechanismus des TAP-Inhibitors US6, indem der TAP-Komplex zusammen mit der aktiven ER-luminalen Domäne von US6 in die Proteoliposomen rekonstituiert wurde. Die Bindung von US6(delta147-183) an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung an die zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse wird durch die Inhibition der ATP-Bindung unterbunden, wohingegen die Peptid- und ADP-Bindung von TAP nicht beeinflusst sind.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
Die NO-sensitive Guanylat-Cyclase (GC), der wichtigste physiologische Rezeptor für Stickstoffmonoxid (NO), ist an der Produktion des sekundären Botenstoffes cGMP beteiligt. Die GC ist ein obligates Heterodimer bestehend aus je einer alpha- und einer beta-Untereinheit, wobei die alphabeta-Isoform am häufigsten vorkommt. Die Bindung von NO an die prosthetische Häm-Gruppe der beta-Untereinheit führt zur Aktivierung des Enzyms. Das dabei gebildete cGMP bindet an Effektorproteine wie Proteinkinase G, Phosphodiesterasen und Ionenkanäle und vermittelt dadurch seine zellulären Effekte. Der Mechanismus der NO-induzierten Aktivierung der GC ist weitgehend bekannt; hingegen ist bisher nur wenig über alternative Regulationsmodi der GC wie zum Beispiel Phosphorylierung, Protein-Protein-Interaktion oder Translokation bekannt. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es daher, die Phosphorylierung der GC durch Tyrosinkinasen der Src-Familie sowie den GC-Interaktionspartner AGAP1 zu untersuchen. Die Tyrosinphosphorylierung der GC konnte in Gegenwart von Protein-Tyrosinphosphatase-Inhibitoren wie Pervanadat erstmals in endogenen Zellen wie Thrombozyten und vaskulären glatten Muskelzellen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit dem Inhibitor SU6656 zeigten, dass Kinasen der Src-Familie an der Pervanadat-induzierten Phosphorylierung beteiligt sind. In Überexpressionssystemen wurde die GC durch Src und Fyn phosphoryliert, wobei Src hier deutlich effektiver war. Zudem kann Src die beta-Untereinheit der GC in vitro direkt phosphorylieren. Die Verwendung von Kinase-knockout-Zellen zeigte, dass neben Src auch andere Kinasen die GC-Phosphorylierung vermitteln können. Src interagiert mit dem Holoenzym der GC, wenn der Tyrosinrest 192 der beta-Untereinheit phosphoryliert ist. Hierbei bindet Src über seine SH2-Domäne an die GC. Mit der GC assoziiertes Src kann mindestens einen weiteren Tyrosinrest der beta-Untereinheit phosphorylieren. Ferner weisen einige Resultate auf eine zweite Bindungsstelle hin, die unabhängig von Tyrosin-192 und der SH2-Domäne ist. Experimente zur Lokalisation deuten auf eine möglicherweise durch Src vermittelte Translokation der Guanylat-Cyclase zur Plasmamembran hin. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit AGAP1, einem etablierten Interaktionspartner der GC. AGAP1 ist am endosomalen Vesikeltransport beteiligt, indem es die Aktivität von Arf-GTPasen Phospholipid-abhängig stimulieren kann. In dieser Arbeit zeigte sich, dass AGAP1 über seinen N-Terminus sowie einen oder mehrere Segmente des C-Terminus dimerisiert. Außerdem kann AGAP1 über seine Pleckstrin-Homologie-Domäne an Phosphatidylinositol- Monophosphate und Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphat binden. Zusammenfassend betrachtet zeigt diese Arbeit neue potentielle Regulationsmechanismen der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase durch Tyrosinphosphorylierung und durch die Interaktion mit der Tyrosinkinase Src und dem Multidomänen-Protein AGAP1 auf. Hierbei wird deutlich, dass der NO/cGMP-Signalweg, die Tyrosinphosphorylierungs-Kaskaden und der Vesikeltransport regulatorisch ineinander greifen.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
Das “Protein Associated with Myc” spielt in den verschiedenen physiologischen Vorgängen eine Rolle. Dazu zählen Prozesse der Synaptogenese und Schmerzverarbeitung ebenso wie eine Regulation des Pteridin- und cAMP-Stoffwechsels. Auf welche Weise PAM die unterschiedlichen Effekte vermittelt, ist bislang nur in Ansätzen verstanden. Um die Wirkmechanismen von PAM aufzuklären, wurden in dieser Arbeit seine biochemischen Funktionen untersucht. Die These, dass PAM als E3 Ubiquitinligase aktiv ist, konnte in vitro mittels biochemischer Versuche zweifelsfrei bestätigt werden. Sowohl das nativ aufgereinigte, humane PAM, als auch der heterolog expremierte C-Terminale Bereich (C-PAM), der die katalytisch aktive RING Finger Domäne enthält, wiesen die Fähigkeit zur Ubiquitinkettenbildung und Autoubiquitinierung auf. Bei der Identifikation eines möglichen Zielproteins rückte das Protein TSC2 und der damit verbundene TSC2 / mTOR Signalweg in den Fokus. Für das gewählte Modell-System HeLa Zellen ließ sich eine Interaktion von PAM und TSC2 durch Ko-Immunopräzipitationen und Immunzytochemie nachweisen. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass das vollständige, native PAM, nicht aber die isolierte RING Finger Domäne, TSC2 polyubiquitinieren und zum proteasomalen Abbau markieren kann. TSC2 ist ein negativer Regulator der mTOR Kinaseaktivität, in dem es den stimulatorischen Einfluss von Rheb auf mTOR inhibiert. PAM wird in HeLa Zellen durch das Phospholipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aktiviert. Nach S1P Behandlung der Zellen war eine Phosphorylierung der Proteinkinase mTOR nachweisbar. Diese ging mit einer Aktivierung der Kinaseaktivität einher, wie die rapamycinsensitive Phosphorylierung der mTOR Zielproteine p70S6K und 4E-BP1 zeigte. Durch Gabe von Rezeptor-Agonisten/-Antagonisten konnte eine Beteiligung des S1P1 und S1P2 Rezeptors ausgeschlossen werden. Der zunächst vermutete Mechanismus eines S1P induzierten, PAM-abhängigen Abbaus von TSC2 konnte trotz vielfältiger Herangehensweisen nicht nachgewiesen werden. Eine Phosphorylierung als Indikation einer Inaktivierung war ebenfalls nicht detektierbar. Auch die GAP Aktivität von TSC2 auf Rheb, wird in in vitro Versuchen durch die Interaktion mit PAM nicht vermindert. Durch eine Verminderung der TSC2 Expression mittels spezifischer siRNA zeigte sich, dass TSC2 nicht in die S1P-abhängige mTOR Aktivierung involviert ist. Auch regulatorische Proteinkinasen wie AKT, ERK oder PI3K, die durch S1P aktiviert werden können, sind an dem Signalweg nicht beteiligt, wie die Hemmung dieser Enzyme mit spezifischen Inhibitoren zeigte. Dagegen konnte eine Beteiligung von PAM und Rheb zum einen mittels Proteintransfektion bestätigt werden, zum anderen ließen sich die S1P Effekte durch Hemmstoffe verhindern, die für eine Aktivierung von PAM, respektive Rheb, nötig sind. Durch Nukleotidbindungsstudien war ein Einfluss von PAM auf den GTP-Beladungszustand von Rheb nachweisbar. Sowohl in einem GTPS Bindungsversuch als auch in einem GDP Dissoziationsexperiment erhöhte PAM konzentrationsabhängig die GTP Bindung bzw. den GDP/GTP Austausch an Rheb. In dieser Arbeit wird damit erstmalig eine duale Funktion eines Proteins als Ubiquitinligase und GEF beschrieben. So konnte die postulierte Aktivität von PAM als Ubiquitinligase bestätigt und TSC2 als Zielprotein identifiziert werden. Gleichzeitig wurde ein TSC2 unabhängiger Weg der mTOR Aktivierung aufgeklärt, an dem PAM und Rheb beteiligt sind. Als möglicher Mechanismus kommt eine Aktivität von PAM als Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) auf Rheb in Frage. Durch Beschreibung von PAM als negativem Regulator von TSC2 und Aktivator von Rheb trägt diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur TSC2 / mTOR Forschung bei. Umgekehrt ermöglicht sie eine neue Sichtweise auf partiell PAM-abhängige Vorgänge wie Synaptogenese und Nozizeption, indem sie TSC2 / mTOR in diese Prozesse integriert.
Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen sind hochspezialisierte Zellen des Immunsystems, die durch Sekretion der Serin-Protease Granzym B (GrB) und des membranolytischen Proteins Perforin Virusinfizierte, körperfremde oder auch Tumorzellen durch Induktion von apoptotischem Zelltod eliminieren. Während Perforin für die Aufnahme von Granzym B in Zielzellen verantwortlich ist, wirkt Granzym B im Zytosol als aktive Effektor-Caspase und spaltet Caspase-3 und andere zelluläre Caspasen sowie verschiedene zentrale Caspasen-Substrate. Granzym B aktiviert damit wie Caspase-3 Apoptose-Signalwege am unteren Effektorende und umgeht daher die meisten Kontrollmechanismen, die in Tumorzellen häufig dereguliert sind und zur Resistenz gegenüber klassischer Chemo- und Strahlentherapie führen. Beide Proteasen stellen damit vielversprechende Enzymaktivitäten für die Verwendung als Effektorfunktion in Tumorzell-spezifischen zytotoxischen Fusionsproteinen dar. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante Formen von Granzym B und Caspase-3 hergestellt und daraufhin untersucht, ob beide Enzyme mit dem ErbB2-spezifischen "single chain" Antikörper scFv (FRP5) als Tumorzell-spezifischer Zellbindungsdomäne fusioniert werden können, ohne dadurch die Faltung der Proteasen zu verhindern, um eine gezielte Applikation in Tumorzellen und Eliminierung der Zellen durch Apoptose zu ermöglichen. Die Herstellung von Granzym B als rekombinantes Protein im präparativen Maßstab war bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte humanes aktives Granzym B in der Hefe Pichia pastoris mit Ausbeuten von 1 bis 4 mg/l Kultur exprimiert werden. Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität wurde ein in vitro Assays etabliert, bei dem rekombinante Procaspase-3 als Substrat für Granzym B eingesetzt wurde. Nach intrazellulärer Applikation mit einem synthetischen Transduktionsreagens induziert das gereinigte Protein Apoptose in HeLa Zellen. Wie für endogenes Granzym B in der Literatur beschrieben, wird rekombinantes Granzym B aus Pichia pastoris sehr schnell in HeLa Zellen aufgenommen, lokalisiert aber in vesikulären Strukturen, in denen die enzymatische Aktivität eingeschlossen ist. Aus verschiedenen Expressionskulturen wurden jedoch zwei unterschiedliche Proteine isoliert, die bei vergleichbarer molarer Masse und enzymatischer Aktivität in Zellen aufgenommen wurden bzw. nicht internalisierten, was darauf hinweist, daß eine posttranslationale Modifikation der Protease für die Bindung von Granzym B an Zielzellen verantwortlich ist. Während für die Freisetzung von Granzym B aus den Membranvesikeln und Induktion von Apoptose Perforin erforderlich ist, konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, daß Kulturen verschiedener etablierter Tumorzellinien nach Behandlung mit Granzym B auch in Abwesenheit von Perforin-Aktivität auffallende morphologische Veränderungen zeigen, die mit dem partiellen Verlust des Kontakts zum Kultursubstrat verbunden sind. Dies deutet darauf hin, daß Granzym B auch extrazellulär auf Zellen einwirkt, indem es Komponenten der extrazellulären Matrix spaltet, und so indirekt Apoptose durch Anoikis induziert. Dieser Effekt ist jedoch für eine mögliche therapeutische Verwendung von Granzym B nicht von Bedeutung, da relativ hohe Proteinkonzentrationen erforderlich sind. Um Granzym B selektiv gegen Tumorzellen zu richten, wurden verschiedene Fusionen mit dem "single chain" Antikörper scFv(FRP5) sowie einer bakteriellen Translokationsdomäne von Exotoxin A oder Diphtherietoxin konstruiert und in E. coli oder Pichia pastoris exprimiert. Während verschiedene in E. coli hergestellte Fusionsproteine nicht enzymatisch aktiv waren, konnte im Überstand einer Pichia Expressionskultur volle-Länge GrB-scFv(FRP5) sowie Granzym B Aktivität nachgewiesen werden. Die Expressionsrate war allerdings so gering, daß eine präparative Isolierung nicht möglich war. Es konnte damit aber gezeigt werden, daß die Fusion heterologer Proteindomänen an den C-Terminus von Granzym B unter Erhalt der enzymatischen Aktivität prinzipiell möglich ist, während zusätzliche Peptidsequenzen am N-Terminus der Protease zumindest partiell zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen. Aktive Caspase-3 besteht aus zwei Peptiden p12 und p17, die im aktiven Enzym ein Tetramer (p12 p17)2 bilden. Um Caspase-3 selektiv in Tumorzellen zu applizieren, wurden ebenfalls Möglichkeiten untersucht, eine der beiden Untereinheiten mit dem scFv(FRP5) als Tumorzell-spezifische Zellbindungsdomäne zu fusionieren. Während aus den beiden separat in E. coli exprimierten p12 und p17 Untereinheiten durch gemeinsame Rückfaltung enzymatisch aktive Caspase-3 rekonstituiert werden konnte, führte die Fusion heterologer Proteindomänen an den N- und C-Terminus der p12 Untereinheit sowie an den C-Terminus der p17 Untereinheit zum Verlust der enzymatischen Aktivität, wahrscheinlich aufgrund der Verhinderung der korrekten Faltung des Protease-Tetramers. Dagegen konnte an den N-Terminus der p17 Untereinheit eine bakterielle Translokationsdomäne unter Erhalt der enzymatischen Aktivität fusioniert werden; ein entsprechendes Konstrukt, das zusätzlich den "single chain" Antikörper scFv(FRP5) enthielt, wurde aber in E. coli vollständig degradiert. Nachdem die Idee, Granzym B oder aktive Caspase-3 zur selektiven Induktion von Apoptose in Tumorzellen für therapeutische Zwecke einzusetzen, bereits seit längerem diskutiert wird, es jedoch bisher praktisch nicht möglich war, entsprechende rekombinante Fusionsproteine in funktionaler Form herzustellen, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit wichtige grundlegende Informationen, wie die weitere Entwicklung solcher Moleküle erfolgreich durchgeführt werden könnte.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
MHC Klasse I Moleküle liegen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) als Dimer bestehend aus einer schweren Kette mit Transmembrandomäne und einem 12 kDa-Protein, dem ß2-Mikroglobulin vor. Nach der Beladung des MHC-Klasse I-Moleküls mit einem antigenen Peptid, welche vorwiegend im Cytosol durch proteasomalen Abbau generiert und durch den Transportkomplex TAP ins ER transloziert werden, findet der Transport des MHC-Peptid-Komplexes zur Zelloberfläche statt. Dort wird das Antigen cytotoxischen T-Zellen präsentiert. An der Assemblierung und Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen sind verschiedene Chaperone beteiligt. Eine wichtige Rolle beim Peptidbeladungsprozess von MHC-Klasse I-Molekülen spielt Tapasin. Dabei handelt es sich um ein 48 kDa, MHC-codiertes Typ I Transmembran-Glycoprotein aus der Immunglobulinsuperfamilie. Es verbrückt den TAP-Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen, hält unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle im ER zurück und führt eine Qualitätskontrolle des gebundenen Peptids durch. Bei dieser Peptideditierung werden Peptide wieder selektiv aus der MHC-Bindungstasche entfernt, wenn sie mit einer niedrigen Affinität gebunden sind. Dadurch wird sichergestellt, dass keine leeren oder suboptimal beladenen MHC-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System etabliert, mit dem der Einfluss von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen in vitro untersucht werden kann. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalem, löslichem Tapasin aus E. coli-Zellen aufgestellt. Weiterhin wurden ß2m und die schwere Kette von HLA-B*2705 heterolog in E. coli-Zellen exprimiert, isoliert und zusammen mit einem Reporterpeptid zum funktionalen HLA-B*2705 renaturiert. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und HLA-B*2705-Molekülen konnte mittels der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie eine direkte Interaktion zwischen Tapasin und unbeladenem HLA-B*2705 gezeigt werden. Detailliertere Untersuchungen zur Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung wurden mittels einer Gelfiltration gekoppelt mit der Fluoreszenzdetektion des Reporterpeptids durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle in Anwesenheit von Tapasin stabilisiert werden und in einer Konformation gehalten werden, die eine Assoziation mit Peptid fördert. Weiterhin wurde gezeigt, dass durch Tapasin die Assoziationsrate für die Peptidbindung erhöht ist. Somit kann in Anwesenheit von Tapasin eine größere Anzahl an Peptiden auf eine stabile und hochaffine Bindung an MHC-Klasse I-Moleküle überprüft werden. In Experimenten mit bereits beladenen MHC-Klasse I-Molekülen konnte gezeigt werden, dass der neugebildetete Komplex auch nach erfolgter Peptidassoziation durch Tapasin stabilisiert wird. Dies ist vermutlich auf eine Erniedrigung der Dissoziationsrate für das Peptid zurückzuführen. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen.
Funktionalisierung mikro- und nanostrukturierter Oberflächen zur spezifischen Proteinimmobilisierung
(2014)
Die vollständige Sequenzierung des humanen Genoms zu Beginn dieses Jahrtausends leitete einen Boom der Genomik ein, in deren Anfangszeiten man sich jedoch vor einer großen Herausforderung sah. Aufgrund der selbst bei einfachen Organismen großen Anzahl kodierender Gene und auch vor dem Hintergrund ständig wachsender Datenbanken mit immer neuen vollständig sequenzierten Arten, stellten sich genetische Analysen mit klassischen Methoden als zu zeit- und kostenaufwändig heraus. Die Entwicklung sog. DNA-Chips – feste Substrate, die mehre zehn- bis hunderttausend verschiedene Oligonukleotide tragen und die parallele Durchführung einer großen Anzahl von genetischen Analysen in sehr kurzer Zeit bei vergleichsweise geringen Kosten erlaubten – lösten dieses Problem. Analog hierzu werden Protein-Chips ähnlich gute Erfolgsaussichten in der Proteomik beschieden. Der Aufbau eines Protein-Chips ist dem eines DNA-Chips sehr ähnlich, allerdings sind die Anforderungen, die für eine funktionale Immobilisierung von Proteinen an eine Substratoberfläche gestellt werden, ungleich höher. Es muss gewährleistet sein, dass durch die Verankerung auf dem Substrat die native Struktur der Proteine nicht zerstört wird, dass die immobilisierten Proteine in einer Orientierung vorliegen, in der wichtige Merkmale, wie Bindungsmotive, aktive Zentren usw. weiterhin zugänglich sind und dass unspezifische Proteinadsorptionen auf ein Minimum reduziert werden. Ziel dieser Arbeit war es, ein Konzept für eine Protein-Chip-Plattform zu entwickeln, welches diese Voraussetzungen erfüllt.
Einleitend wird die Erarbeitung eines Assays zur Analyse einer Antikörper-Antigenwechselwirkung mittels Oberflächenplasmonresonanz-(SPR)-spektroskopie dargestellt. Da diese Technik ebenfalls eine native Immobilisierung von Proteinen auf einem festen Substrat erfordert, stellt sie eine Vorform der Protein-Chip-gestützten Analyse dar. Dem entsprechend werden an SPR-Oberflächen ähnliche Anforderungen gestellt wie an Protein-Chips. In der Etablierungsphase des SPR-Assays wurden zunächst grundlegende Parameter wie die Immobilisierungs- und Regenerationsbedingungen optimiert. Anschließend wurde überprüft, ob Antigen und Antikörper unter den gewählten Versuchsbedingungen noch miteinander interagieren konnten und die Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen nicht beeinträchtig wurde. Hauptziel des SPR-Assays war die Überprüfung der Bindeaktivität verschiedener Chargen des Antikörpers im Vergleich zu einer Referenz-Charge unter Berücksichtigung eines möglichen Einflusses der Lagerzeit. Als Ergebnis konnte zwar eine geringe Abnahme der Bindungsaktivität beobachtet werden, welche eindeutig mit der Lagerzeit korrelierte, ein signifikanter Unterschied zwischen den zu vergleichenden Chargen war jedoch nicht erkennbar.
Der weitaus größere Teil der in dieser Dissertation beschriebenen Ergebnisse betrifft die Konzeption neuer Protein-Chip-Architekturen. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe um Armin Gölzhäuser von der Universität Bielefeld wurde eine Protein-Chip-Plattform erarbeitet, für deren Herstellung Nitrobiphenyl-(NBPT)-Monolagen auf Gold mit Hilfe chemischer Lithographie im Mikro bzw. Nanomaßstab strukturiert wurden. Die Strukturen wurden anschließend mit multivalenten NTA-Verbindungen funktionalisiert, sodass Proteine mit His-Tag spezifisch darauf verankert werden konnten. Die wichtigsten Vorteile dieses Systems sind eine hohe Bindungsstabilität der immobilisierten Proteine, eine aufgrund der weiten Verbreitung des His-NTA-Systems leichte Verfügbarkeit His-getaggter Proteine sowie die Erhaltung ihres nativen Zustandes bei gleichzeitig uniformer Orientierung auf der Substratoberfläche. Nachdem zunächst die grundsätzliche Machbarkeit der Strukturierung und Funktionalisierung gezeigt wurde, folgte eine eingehende Charakterisierung der einzelnen Fertigungsschritte per Rasterkraftmikroskopie (AFM) und SPR-Spektroskopie, um diese anschließend weiter zu optimieren. So konnte die Proteinresistenz in den Bereichen zwischen den Mikro- bzw. Nanostrukturen, in denen keine Proteine binden sollten, deutlich verbessert werden. Zusätzlich wurde die Effizienz der Oberflächenfunktionalisierung gesteigert, sodass eine höhere Immobilisierungsdichte möglich war. Die Funktionalität des verbesserten Protein-Chips wurde mittels AFM und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) überprüft. Es konnte eine hochspezifische und stabile, aber gleichzeitig reversible Bindung His-getaggter Proteine auf dem Protein-Chip gezeigt werden. Die bis dahin nass-chemisch durchgeführten Fertigungsschritte wurden in der Folge ins Hochvakuum übertragen, um die Herstellung dieser Protein-Chips mittels Gasphasenabscheidung zu ermöglichen. Als Ergebnis dieser Arbeiten konnten proteinresistente EG3-Monolagen allein durch Gasphasendeposition generiert werden. Bis auf die Funktionalisierung mit trisNTAs konnten im Rahmen dieser Arbeit sämtliche Fertigungsschritte in die Gasphase übertragen werden. Protein-Chips, die auf diese Art hergestellt worden waren, hatten in Hinsicht auf Bindungsspezifität und -stabilität ebenso gute Eigenschaften wie Protein-Chips aus der klassischen nass-chemischen Fertigung. Zusätzlich wurde parallel zu diesen Arbeiten ein neuer Ansatz zur Strukturierung und trisNTA-Funktionalisierung von EG3-SAMs erarbeitet.
Ein zweiter Protein-Chip-Prototyp sollte durch orthogonale Funktionalisierung von nano-strukturierten Glasoberflächen mit Polyenthylenglykol (PEG) und multivalenten Chelatoren hergestellt werden. CLSM-Untersuchten ergaben zunächst, dass dieser Ansatz der orthogonalen Funktionalisierung nicht gelang, da auf den Goldstrukturen nur wenig Protein zu binden schien, während in den vermeintlich proteinresistenten PEG-Bereichen eine vergleichsweise große Menge His-getaggter Proteine adsorbierte. Nach einer Reihe von Versuchen stand fest, dass sich die Verfahren zur Funktionalisierung mit PEG und bisNTA-Thiolen gegenseitig störten. Die PEGylierung verhinderte die anschließende Ausbildung einer dicht-gepackten bisNTA-SAM, was zwar durch vorheriges Aufbringen einer Schutz-SAM aus Undecylthiolen gemildert, aber nicht vollständig verhindert werden konnte. Die anschließende Funktionalisierung der Nanostrukturen mit bisNTA-Thiolen führte wiederum zur Dotierung der PEG-Schicht mit bisNTA-Thiolen, sodass diese Schicht ihre Proteinresistenz verlor. Da dieser ungewollte Prozess seine Ursache in der zweistufigen PEGylierungsreaktion hatte und dieser auch durch verschiedenste Block-Verfahren nicht vollständig verhindert werden konnte, wurde ein alternatives, einstufiges PEGylierungsverfahren getestet. Dieses hatte eine deutliche Verbesserung der Oberflächeneigenschaften zur Folge. Einerseits zeigten die Glasbereiche nun eine sehr gute Proteinresistenz, zum Anderen hatte das neue PEGylierungsverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Ausbildung von bisNTA-SAMs. Mittels CLSM konnte auf Mikrostrukturen eine hochspezifische Proteinbindung beobachtet werden, während die PEGylierten Glasbereiche frei von Proteinen blieben. Interessanterweise konnte auf entsprechend funktionalisierten Nanostrukturen jedoch keine Proteinbindung nachgewiesen werden. Hierfür sind mehrere Ursachen denkbar, zu deren Klärung es weiterer Untersuchungen bedarf.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.