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Identifizierung von TNFalpha-induzierten Überlebensgenen mit der Cre-Genfalle
(2006)
- Das pro-inflammatorische Zytokin Tumornekrose-Faktor alpha (TNFalpha) kann, abhängig vom zellulären Kontext, sowohl Wachstum als auch Apoptose in Säugerzellen induzieren. Diese gegensätzlichen Effekte sind zurückzuführen auf die Fähigkeit von TNFalpha verschiedene Signalwege in der Zelle zu aktivieren. Nach einer vorübergehenden Aktivierung eines antiapoptotischen Genexpressionsprogrammes über einen membranständigen TNF-Rezeptor-Multiproteinkomplex und den Transkriptionsfaktor NF-KB, kommt es zur Modifikation des Signaltransduktionskomplexes. Dieser ist nun in der Lage andere Adapterproteine und Caspasen zu rekrutieren, was letztendlich zur Einleitung der Apoptose führt. Ziel dieser Arbeit war es neue Überlebensgene zu identifizieren, die nach TNFalpha-Behandlung transient aktiviert werden, da diese Gene in Tumorzellen möglicherweise dazu beitragen, apoptotischen Prozessen entgegenzuwirken. Langfristig könnten ihre Genprodukte als diagnostische Marker oder als Angriffspunkte für neue Therapieansätze dienen. Um TNFalpha-induzierte Überlebensgene zu identifizieren wurde als Modellsystem die menschliche Cervixkarzinomzellinie HeLa eingesetzt, welche resistent gegenüber TNFalpha ist. Allerdings wird bei Blockade der Translation, zusätzlich zu der Zytokinbehandlung, Apoptose ausgelöst. Dies zeigt, dass bei der alleinigen Zugabe von TNFalpha die Transkription von Überlebensgenen induziert wird, deren Aktivität apoptotische Signalwege blockiert. Zur Identifizierung dieser transient aktivierten Gene wurde eine Strategie benutzt, welche auf einer Kombination von Genfallen-Mutagenese und Cre/loxP-spezifischer Rekombination beruht. Zunächst wurde eine HeLa-Reporterzellinie mit einem stabil integrierten, Creabhängigen, molekularen Schalter generiert. Dieser besteht aus einer Kassette mit einem konstitutiv aktiven Promotor, der die Expression eines "gefloxten", selektionierbaren Markergens antreibt. 3’ hierzu befindet sich ein zweites Markergen, das in dieser Konfiguration transkriptionell inaktiv ist. Die Reporterzellinie wurde mit einer retroviralen Genfalle transduziert, die ein Cre-Rekombinasegen trägt, aber keine cis-regulatorischen DNA-Elemente besitzt, so dass die Cre-Expression vollständig von den zellulären Sequenzen in der Nachbarschaft der Integrationsstelle des Genfallen-Provirus abhängig wird. Eine transkriptionelle Aktivierung der Cre-Genfalle, auch wenn diese nur transient ist, führt zu einer Deletion des 5'-gelegenen Markergens in dem Selektionssystem und damit zur Expression des 3'-Markers. Diese irreversible Rekombination, die ein Indikator für eine transkriptionelle Aktivierung der Genfalle ist, wurde zur Selektion einer Zellpopulation mit Genfallen-Integrationen in TNFa-induzierten Genen genutzt. Aus einer aus 2 x 106 unabhängigen Insertionen bestehenden Genfallen-Integrationsbank wurde in einem zweistufigen Selektionsverfahren 50 HeLa-Zellinien mit Genfalleninsertionen in TNFalpha induzierbaren Genen isoliert. Die Sequenzierung Genfallen-flankierender genomischer Sequenzen und anschließender Datenbankanalyse ergab folgende Verteilung der Genfallen-Integrationen: 45 % lagen in annotierten Genen, 19 % in Genen mit unbekannter Funktion, 19 % in hypothetischen Genen, 5 % in ESTs (expressed sequence tags), 6 % in repetitiven Elementen und 6 % in nicht-annotierten Regionen. Neben bekannten TNFalpha-regulierten Genen wurde eine Reihe von neuen Genen identifiziert, welche bisher noch nicht mit der TNFalpha-Signaltransduktionskaskade assoziiert worden waren. Die Validierung der so gefundenen Gene in Northern-Blots machte deutlich, dass der Expressionsanstieg nach TNFalpha-Stimulation insgesamt nicht sehr stark ausgeprägt war, zeigte aber eine klare Induktion zweier Gene (rhobtb3, atf-1) nach Zytokin-Stimulation. Interessanterweise erfolgten die Genfalleninsertionen in 50 % aller Fälle in umgekehrter Orientierung zum annotierten Gen, was darauf hindeutet, dass mit Hilfe der gewählten Strategie nicht-kodierende RNAs identifiziert werden können. Obwohl der Nachweis dieser Transkripte und ihre biologische Relevanz noch aussteht, können sie in zwei Kategorien eingeteilt werden. Integrationen oberhalb von Genen oder in 5'-UTRs, repräsentieren entweder regulatorische RNAs, die mit Promotorelementen interagieren oder Transkripte, welche unter der Kontrolle von bidirektionalen Promotoren stehen. Die zweite Kategorie, Insertionen auf dem nicht-kodierenden Strang, innerhalb von Introns, legen das Vorkommen natürlicher antisense-Transkripte nahe. Interessanterweise liegen 50 % aller antisense-Integrationen 3' zu potentiellen Transkriptionsstartstellen, die mit verschiedenen Algorithmen vorhergesagt wurden. Dies kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass entsprechende genomische Regionen tatsächlich transkribiert werden. Aufgrund neuer Erkenntnisse über die Funktionen von nicht-kodierenden RNA-Molekülen, gerade auch in Zusammenhang zur Tumorprogression, könnte deren mögliche regulatorische Rolle innerhalb der TNFalpha-Signaltransduktionskaskade von großem Interesse sein. Die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Experimente führten nicht nur zur Identifizierung neuer, potentieller TNFalpha-Zielgene, sondern zeigten auch, dass Genfallen ein nützliches Werkzeug bei der Suche nach nicht-kodierenden RNAs in lebenden Zellen sein können und ihr Einsatz möglicherweise die Methode der Wahl für die Identifizierung derartiger Transkripte darstellt.
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Einfluss des Cannabinoidsystems auf die exzitotoxische neuronale Schädigung : Untersuchungen am Modellsystem NMDA-geschädigter organotypischer hippokampaler Schnittkulturen (OHSC) der Ratte
(2007)
- Neben den Phytocannabinoiden und synthetischen Cannabinoiden exisitieren bei Säugetieren und Menschen endogene Cannabinoide (EC). Diese lipophilen Signalstoffe sind vorwiegend im ZNS und Immunsystem aktiv. Heute werden den EC vermehrt neuroprotektive Eigenschaften zugewiesen. Mit den Cannabinoid (CB)1- und -2-Rezeptoren wurden bisher zwei dem endogenen Cannabinoidsystem (ECS) zugehörige Rezeptoren kloniert. Pharmakologische Untersuchungen an CB1- und -2-Rezeptor defizienten Mäusen weisen jedoch auf noch weitere bisher nicht klonierte Rezeptoren hin. Zu den bekanntesten im ZNS selbst synthetisierten und gezielt freigesetzten Liganden für die CB Rezeptoren zählen Arachidonylethanolamin (AEA), 2-Arachidonylglycerin (2-AG) und Palmitylethanolamin (PEA). Deren Mengen steigen z.B. nach einer traumatischen Schädigung deutlich an. Die postulierte Neuroprotektion der EC erfolgt wahrscheinlich über eine Reduktion der glutamatergen Neurotransmission. Darüber hinaus kommt es auch in Mikrogliazellen und Astrozyten zur Cannabinoid induzierten Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden, wodurch Produktion und Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen wie TNF-alpha vermindert werden. Im vorliegenden Projekt sollten die den Phytocannabinoiden (THC) und den EC zugewiesenen neuroprotektiven Eigenschaften am Modellsystem der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) nach einer exzitotoxischen Läsion vergleichend untersucht werden. Dazu wurden OHSC von 8 Tage alten Ratten hergestellt und durch Applikation von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) exzitotoxisch geschädigt. Exzitotoxische Läsionen zeichnen sich durch einen massiven Neuronenverlust sowie durch die Aktivierung von Mikrogliazellen und Astrozyten aus. Die Anzahl der zerstörten Körnerzellen im Gyrus dentatus (GD) des Hippokampus wurde als Maß für die Bestimmung des neuronalen Schadens angesehen. Weiterhin wurde die Anzahl der aktivierten Mikrogliazellen im Bereich der Körnerzellschicht quantitativ bestimmt. Dann sollte geprüft werden, ob die eingesetzten Cannabinoide die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen reduzieren und ob sich eine Reduktion der Mikrogliazellen positiv auf das Überleben der Neurone auswirkt. Ungeschädigte und NMDA geschädigte OHSC wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von THC, AEA, 2-AG oder PEA behandelt. Durch Zugabe von Propidiumiodid (PI) wurden die degenerierten Neurone markiert (PI+-Neurone). Mit Hilfe von FITC-konjugiertem Griffonia simplicifolia Isolektin B4 (IB4+) wurden die Mikrogliazellen dargestellt und die OHSC abschließend mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop analysiert. Es folgten weitere Versuche, bei denen verschiedene synthetische Agonisten/Antagonisten von CB-Rezeptoren verwendet wurden, um die möglicherweise an neuroprotektiven Prozessen beteiligten CB-Rezeptoren zu identifizieren. Um die mögliche Beteiligung des CB1- und -2-Rezeptors zu beleuchten, kamen die Antagonisten AM251 und AM630 zum Einsatz. Die Beteiligung von bisher nur pharmakologisch identifizierten CB-Rezeptoren, wie dem WIN- oder dem abnormalen (abn) Cannabidiol-Rezeptor, wurde mit Hilfe des Agonisten WIN und des Antagonisten Capsazepin für den WIN-Rezeptor, oder, im Falle des abn Cannabidiol Rezeptors, mit Hilfe der Agonisten abn Cannabidiol und 2-AG sowie der Antagonisten O-1918 und Cannabidiol untersucht. In ungeschädigten OHSC waren in der KZS des GD nahezu keine PI+-Neurone und nur sehr wenige IB4+-, ramifizierte Mikrogliazellen nachweisbar. Nach NMDA-Schädigung stieg die Zahl der PI+-Neurone und der IB4+-, amöboiden Mikrogliazellen massiv an. Die aktivierten Mikrogliazellen akkumulierten vorwiegend an Stellen höchster neuronaler Schädigung. Im Vergleich zu ausschließlich mit NMDA-behandelten OHSC verursachte das Phytocannabinoid THC eine konzentrationsabhängige numerische Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen. Die Anzahl der PI+-Neurone wurde hingegen nicht beeinflusst. Alle verwendeten Endocannabinoide (AEA, 2-AG, PEA) reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen. Darüber hinaus war die Zahl der PI+-Neurone nach Gabe von 2-AG und PEA im Sinne eines neuroprotektiven Effektes deutlich vermindert, wohingegen AEA keine neuroprotektiven Eigenschaften besaß. Die synthetischen CB-Rezeptor-Agonisten WIN und abn Cannabidiol reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen und PI+-Neurone ebenfalls deutlich. Der Einsatz der oben beschriebenen Antagonisten ergab, dass die THC-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen durch den CB2-Rezeptor Antagonisten AM630 aufgehoben wurde, was auf eine Beteiligung des CB2-Rezeptors hindeutet. Die 2-AG-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen wurde durch die abn-Cannabidiol-Rezeptor-Antagonisten O-1918 und Cannabidiol gehemmt. Der 2-AG vermittelte neuroprotektive Effekt wurde ebenfalls durch O-1918 und Cannabidiol aufgehoben. Beide Antagonisten hoben auch die abn-Cannabidiol-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen und die abn-Cannabidiol-induzierte Neuroprotektion auf. Die am Modellsystem der OHSC durchgeführten Versuche zeigen deutlich, dass die verwendeten Cannabinoide nach einer exzitotoxischen Schädigung einen unterschiedlichen Einfluss auf die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen und die Zahl degenerierender Neurone ausüben. Sie belegen ferner, dass eine Reduktion der Anzahl aktivierter Mikrogliazellen sich nicht per se neuroprotektiv auszuwirken scheint. Daher ist festzustellen, dass ein Zusammenspiel verschiedenartiger CB-Rezeptortypen auf der einen und unterschiedlicher Zelltypen auf der anderen Seite beim Mechanismus der Neuroprotektion stattfindet. In unseren Untersuchungen erwiesen sich THC und AEA als nicht neuroprotektiv, obwohl für beide Substanzen in der Literatur solche Effekte unter In-vivo-Bedingungen beschrieben wurden. Die Diskrepanz zwischen 2-AG und PEA auf der einen Seite und AEA und THC auf der anderen Seite in unserem Modellsystem ließe sich eventuell dadurch erklären, dass in der OHSC keine immunkompetenten Blutzellen vorhanden sind, die möglicherweise ein wichtiges Element im Zusammenspiel verschiedener Zelltypen bei der Neuroprotektion unter In- vivo-Bedingungen darstellen. Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir OHSC mit isolierten Milzmakrophagen inkubiert, um so aus der Blutbahn einwandernde immunkompetente Zellen zu simulieren. Die Ergebnisse dieser Experimente belegen, dass Milzmakrophagen tatsächlich zum Ort höchster neuronaler Schädigung in der OHSC migrieren und bei Anwesenheit dieser Milzkakrophagen sowohl AEA als auch THC neuroprotektiv sind. Schließlich wurde mit primären Kulturen von Mikroglialzellen und Astrozyten untersucht, ob Cannabinoide die Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen beeinflussen. Diesbezüglich wurde die Konzentrationen des Zytokins TNF-alpha im Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass die eingesetzten Cannabinoide die Freisetzung von TNF-alpha äußerst differenziert regulieren. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit interessante und neue Befunde zur neuroprotektiven Wirkung von Cannabinoiden erhoben wurden. Diese Daten werden sicherlich eine breite Ausgangsbasis für zukünftige Untersuchungen bieten, in denen die weitere Analyse des komplexen Zusammenspiels zwischen verschiedenen CB-Rezeptoren und unterschiedlichen Zelltypen des ZNS bei der Cannabinoid-vermittelten Neuroprotektion erfolgen wird.
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Klonierung und Charakterisierung eines ecotropen porzinen endogenen Retrovirus der Klasse C (PERV-C)
(2006)
- Durch die vertikale Vererbung von endogenen Retroviren, deren Fähigkeit humane Zellen in vitro zu infizieren und ihrer Rekombinationsfähigkeit besteht ein Risikopotential bei der Verwendung porziner Gewebe bzw. Organe im Rahmen der XTx, weshalb ein Screening auf PERV im Genom von Spendertieren und eine immunologische Kontrolle von Xenotransplantatempfängern von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnten vier native, teilweise unvollständige, provirale Sequenzen aus einer Genbibliothek einer Zelllinie von Minischweinen isoliert werden. Der Molekularklon PERV-C(1312) zeigt die vollständigen Leserahmen für das gag-, pol- und env-Gen, die 5LTR Sequenz beinhaltet einen Repeat mit 39 bp. Das Virus ist in der Lage produktiv porzine ST-IOWA Zellen in vitro zu infizieren und nach Transfektion in humane Nierenzellen in das Genom zu integrieren. Eine Rekombination mit PERV-B(33)/ATG Partikeln konnte nicht gezeigt werden. Nach Transfektion von Deletionsmutanten von PERV-B(33)/ATG in MAX-T Zellen, denen das gag- und pol-Gen fehlte und lediglich der offene Leserahmen für das env-Gen intakt war, konnte keine Rekombination bzw. Inkorporation von Env-B Proteinen in PERV-C Partikeln nachgewiesen werden. Für eine immunologische Detektion des Env-C Proteins wurde ein polyklonales Antiserums in Kaninchen generiert und ein monoklonaler Antikörper hergestellt. Die Epitope für beide Antikörper sind im SU des env-C Gens lokalisiert. Das Env-C Protein kann durch das polyklonale Antiserum durch Western Blot Analyse in Zelllysaten und in immunhistochemischen Analysen in verschiedenen Zelllinien detektiert werden. In PERV-C Partikeln wird das Env-Protein sowohl durch das polyklonale Antiserum als auch durch den monoklonalen Antikörper spezifisch detektiert. Durch den immunologischen Nachweis von PERV-C Proteinen ist es möglich im Hinblick auf eine XTx den Nachweis dieser Proteine in möglichen Rezipienten durchzuführen. Durch die zusätzlich isolierten Flankensequenzen des replikationskompetenten Molekularklons PERV-C(1312) wäre eine Screening Methode, durch die Verwendung einer spezifischen Flankensonde, möglich, um genomische Integrationsorte und somit die Präsenz dieses Provirus in den Zellen des Spendertieres vorab zu überprüfen, um möglichst Spendertiere für eine XTx zu verwenden, die frei von PERV-C(1312) sind. Somit leistet diese Arbeit einen Beitrag zur besseren Evaluierung des Risikopotentials zukünftiger Xenotransplantationen.
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Charakterisierung und Regulation der murinen sekretorischen Phospholipasen A2 in der neonatalen Maushaut und im Prozeß der Hautkarzinogese sowie Aufklärung ihrer Bedeutung für die epidermale Prostaglandinbiosynthese
(2006)
- Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind eine Familie von Enzymen, die die Fähigkeit besitzen, die Hydrolyse der mittleren (sn-2) Esterbindung aus Phospholipiden zu katalysieren. Die Produkte dieser Hydrolyse, freie Fettsäuren und Lysophospholipide, sind nicht nur Bausteine für die Synthese von Lipiden, sondern sie haben wichtige Funktionen als Lipid „second-messenger“ in zellulären Signaltransduktionsprozessen. In der Klasse der sekretorischen PLA2 wurden in Säugern bisher 10 Isoenzyme identifiziert, wobei die sPLA2-IIC beim Menschen nur als Pseudogen vorkommt. In der murinen Epidermis scheinen eines oder mehrere dieser Enzyme eine Rolle bei der Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere zu spielen. Darüber hinaus kontrollieren sie die Freisetzung von Arachidonsäure für die Produktion von Eicosanoiden, die sowohl für die Proliferation der Keratinozyten als auch für inflammatorische Prozesse und die Entstehung von Tumoren in der Haut von entscheidender Bedeutung sind. Da bislang weder das detaillierte Expressionsmuster der einzelnen sPLA2-Enzyme noch deren spezifische Funktionen in muriner Epidermis bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit eine umfassende Analyse an Schnitten von neonataler Maushaut und an murinen Papillomschnitten durchgeführt. Zusätzlich zum Nachweis der sPLA2-Expression in vivo wurden primäre murine Keratinozyten in vitro verwendet, um die Auswirkungen der Differenzierung der Keratinozyten auf die Expression der verschiedenen sPLA2-Enzyme zu untersuchen. Die Tumorzellinie HEL30 wurde zur Durchführung funktioneller Studien und für Kolokalisationsstudien verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut in vivo sowie in isolierten primären murinen Keratinozyten alle bisher bekannten sPLA2 Enzyme exprimiert sind. Für die sPLA2-IB, -IIE, -IIF, -V und -XII konnte sowohl in den Keratinozyten der neonatalen Maushaut als auch in den primären Keratinozyten eine Expression vor allem in den differenzierten Zellen nachgewiesen werden. Dass diese Enzyme somit wahrscheinlich mit Differenzierungsprozessen gekoppelt sind, zeigte sich am Beispiel der sPLA2-V, die im murinen Papillom, welches vorwiegend aus proliferierenden Keratinozyten steht, nicht exprimiert war. Hingegen waren sPLA2 -IIA, -IID, und -X fast ausschließlich in Keratinozyten der Basalzellschicht der Epidermis und in den proliferierenden primären Keratinozyten exprimiert. Dies läßt vermuten, dass diese Enzyme eventuell eine Rolle bei der (Hyper-)Proliferation von Keratinozyten spielen. Darüber hinaus sind diese Enzyme auch in der Lage, Arachidonsäure freizusetzen, und sind somit eventuell an der Eicosanois-Homöostase beteiligt. Um eine eventuelle Beteiligung der basal exprimierten sPLA2 Enzyme an der Eicosanoidbiosynthese nachzuweisen, wurden Immunfluoreszenzstudien an neonataler Maushaut und an murinen Hautpapillomen des 2-Stufen-Tumorpromotionsmodells durchgeführt. Wie zuvor beschrieben waren alle drei Enzyme in der Basalzellschicht der neonatalen Maushaut exprimiert. Im Gegensatz dazu war die sPLA2-IIA im murinen Papillom nur am äußersten, nicht mehr hochproliferativen, Papillomrand zu detektieren. Die sPLA2-X dagegen zeigte eine starke Expression in den hochproliferativen basalen Keratinozyten dieses Gewebes. Für die sPLA2-IID konnte im Papillom ein Expressionsmuster festgestellt werden, das bis in die suprabasalen Schichten reicht. Betrachtet man die Expression der phospho-cPLA2, so konnte dieses Enzym in der neonatalen Maushaut vor allem in der Basalzellschicht, aber auch suprabasal im Stratum spinosum detektiert werden. Im Papillom zeigt dieses Enzym dagegen eine sehr starke Expression im gesamten Gewebe. Wie erwartet konnte COX-2 in der neonatalen Maushaut nicht detektiert werden, während das Expressionsmuster dieses Enzymes im Papillom mit dem der sPLA2-IID und phospho-cPLA2 korreliert Um Hinweise über die Expression und Funktion von sPLA2 –IID, -X und cP LA2 im Karzinom zu bekommen, wurde als Modellsystem die murine Karzinomzelllinie HEL30 verwendet. Diese Zellen produzieren bereits konstitutiv eine hohe Menge an PGE2. Eine TPA Stimulation dieser Zellen induziert eine zusätzlich stark erhöhte PGE2 Produktion. Anhand der Ergebnisse aus den Western Blot Analysen konnte gezeigt werden , dass sPLA2-IID und -X in den HEL30-Zellen auf Proteinebene exprimiert sind, jedoch konnte keine Veränderung der Proteinexpression dieser beiden Enzyme nach TPA-Behandlung der HEL30 Zellen detektiert werden. Dies führte zu der Annahme, dass diese Enzyme eventuell, wie die cPLA2, über ihre Enzymaktivität oder eine zelluläre Translokation reguliert werden. Durch den Einsatz des sPLA2-Inhibitors Me-Indoxam konnte jedoch weder die konstitutive noch die TPA-stimulierte PGE2 Produktion gehemmt werden, was vermutlich, wie die anschließenden siRNA Studien zeigen, auch an der Eigenschaft dieses Inhibitors liegen könnte nicht membrangängig zu sein. Weiterhin konnte durch den Einsatz des COX-2-spezifische Inhibitors Celecoxib und des COX-1-präferierende Inhibitor Indomethazin gezeigt werden, dass COX-2 vor allem an der TPA induzierte PGE2-Freisetzung, und COX-1 sowohl an der konstitutiven als auch an der der TPA induzierten PGE2-Freisetzung aus HEL30 Zellen beteiligt sind. Die Ergebnisse der Untersuchungen mit dem cPLA2-Inhibitor Pyrrolidin-1 lassen vermuten, dass in diesen Zellen die cPLA2 vor allem an der TPA induzierten PGEs-Synthese beteiligt ist, aber nicht an der konstitutiven Freisetzung. Während in unbehandelten HEL30 Zellen die sPLA2-IID im Cytosol exprimiert ist und eine schwache Kolokalisation mit COX-2 zeigt, verlagert sich dieses Enzym nach 20 minütiger TPA Stimulation, in Richtung Kernmembran und zeigt nun eine sehr starke Kolokalisation mit COX-2. Nach Inkubation der HEL30 Zellen mit einer siRNA, die die Expression der sPLA2-IID ausschalten sollte, war sowohl die konstitutive als auch die TPA-induzierte PGE2-Biosynthese signifikant reduziert. Gleichzeitig konnte durch den Einsatz der siRNA eine Reduktion des sPLA2-IID-Proteins beobachtet werden. Dies deutet an, dass die sPLA2-IID mit beiden Cyclooxygenasen gekoppelt sein könnte und ihr Substrat je nach Stimulation und Änderung der Lokalisation dem einen oder dem anderen Enzym zur Verfügung stellt. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die sPLA2-IID intrazellulär katalytisch aktiv ist und signifikant zur PGE2-Biosynthese beiträgt. Um genauere Aussagen über die Bedeutung dieser sehr interressanten Ergebnisse machen zu können, sind weitere Untersuchungen nötig, um herrauszufinden, ob die Herunterregulierung der sPLA2-IID - z.B. in Form einer sPLA2-IID-knockout-Maus - Konsequenzen für die Hyperproliferation derKeratinozyten hat, und somit einen Einfluß auf die Progression der Tumorpromotion ausüben könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein spezifisches Expressionsmuster für die Gruppen I, II, V, X und XII sPLA2 in der murinen Haut beschrieben werden, welches mit der Regulation von Wachstum und Differenzierung verbunden ist. Hieraus läßt sich schließen, dass die einzelnen sPLA2 Enzyme unterschiedliche Funktionen in der epidermalen Homöostase sowohl unter normalen als auch pathologischen Bedingungen ausüben.
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Hochdurchsatzmutagenese von sezernierten und menbranständigen Proteinen in Maus embryonalen Stammzellen
(2006)
- In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosaβgeo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.
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Klonierung und Expression von Antikörperfragmenten gegen Prostaglandin E 2
(2002)
- Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
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Piper methysticum (Kava-Kava) : vergleichende Untersuchungen zur Hepatotoxizität von Kava-Extrakten, Kava-Inhaltsstoffen und chemischen Anxiolytika
(2006)
- Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Zielrichtungen verfolgt: 1. Vergleichende Testung von Kavainhaltsstoffen, Kava-Fertigarzneimitteln und chemischen Anxiolytika auf Hepatotoxizität Mit Hilfe der Hepatocarcinom-Zelllinie Hep-G2 wurden alle noch verfügbaren Kava-Fertigarzneimittel einem Cytotoxizitätstest unterzogen, durch die Herkunft der Zelllinie aus der Leber handelt es sich um eine spezifische Cytotoxizität – um Hepatotoxizität. Ebenso wurden isolierte, reine Inhaltsstoffe von Piper methysticum, Strukturverwandte und chemische Anxiolytika diesen Hepatotoxizitätstests unterzogen. Da alle Tests unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden und bei jedem Test auf den microtiter-plates Kontrollen mitgeführt wurden, erlauben die Ergebnisse eine vergleichende Aussage zur Cytotoxizität. Besonders die Kava-Fertigarzneimittel, weniger die reinen Kava-Inhaltsstoffe (Kava-Lactone) fallen durch eine gewisse Cytotoxizität bei Hep-G2 auf. Die mit getesteten, handelsüblichen, chemischen Anxiolytika waren deutlich weniger cytotoxisch im Hep-G2-Assay. 2. Aufklärung der möglichen Ursache für die Fälle von Hepatotoxizität in Zusammenhang mit Kava Parallel zu den Hep-G2-Tests wurde eine Arbeit über die starke Hepatotoxizität des Kava-Alkaloids Pipermethystin publiziert. Nach Extraktion und Synthese von Pipermethystin wurden noch zwei weitere Kava-Alkaloide synthetisiert und Strukturverwandte mit in die Tests aufgenommen. Die starke Hepatotoxizität des Pipermethystins konnte bestätigt werden. Durch weitere Versuche mit Abbauprodukten und Strukturverwandten des Pipermethystins konnte ein Dihydropyridon-Heterocyclus als toxisches Prinzip des Pipermethystins bestimmt werden. 3. Vergleichende Untersuchung der Ergebnisse mit Primärzellen, humanen Hepatocyten Durch Kooperation mit der Universität Mainz war es möglich, die in den Hep-G2-Tests aufgefallenen Substanzen an humanen Hepatocyten zu testen. Teilweise gab es bei diesen Untersuchungen Parallelen, teilweise variierten die Ergebnisse erheblich. Der Grund liegt in den unterschiedlichen enzymatischen Ausstattungen der Hep-G2-Zellen bzw. der humanen Hepatocyten und den daraus resultierenden unterschiedlichen metabolischen Fähigkeiten.
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Effekt von ACE- gegenüber Vasopeptidase-Inhibition auf Advanced Glycation End Products (AGEs) und den Rezeptor von AGEs (RAGE) in experimenteller diabetischer Nephropathie : in vivo/in vitro Mechanismen der AGE, RAGE Inhibition
(2006)
- Der Prävention und Therapie von diabetischer Nephropathie kommt immer mehr Bedeutung zu, da sie der Hauptgrund für terminale Niereninsuffizienz ist. Ein möglicher Therapieansatz ist die Hemmung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems mit Angiotensin Converting Enzyme Inhibitoren oder kombinierten ACE und neutrale Endopaptidase (Vasopeptidase) Inhibitoren. Trotz der therapeutischen Effektivität einer pharmakologischen Hemmung des RAAS ist die Bedeutung von ACE und NEP in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie noch nicht vollständig geklärt. Auf Gewebsebene kann die erhöhte Bildung und Akkumulation von AGEs zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie beitragen (73) und der ACE-Inhibitor Ramipril kann die Anreicherung von fluoreszierenden AGEs in der Niere und im Serum von Typ I diabetischen, hypertensiven Ratten verhindern (73). Da AGEs unterschiedliche Strukturen und Effekte auf Proteine haben, sollte der Einfluss des ACEInhibitors Ramipril und des Vasopeptidase Inhibitors AVE7688 auf die Akkumulation von den drei prototypischen AGEs 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in einem Typ II diabetischen Tiermodell untersucht werden. Für den AGE-Subtyp CML wurde zusätzlich noch die Konzentration im Serum und die CML Clearance in ZDF Ratten bestimmt. Des Weiteren sollte der Effekt von Ramipril und AVE7688 auf die AGE Bildung in vitro analysiert werden. Die Charakterisierung der ZDF Ratten ergab, dass es zu einer 40, 50 und 55%igen Akkumulation der AGE-Subtypen 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten kommt. Diese Akkumulation konnte durch die Behandlung mit AVE7688 komplett verhindert werden, während Ramipril nur die CML Akkumulation in 37 Wochen alten ZDF Ratten leicht reduzierte. Auch wurde die CML Akkumulation im Serum von 37 Wochen alten ZDF Ratten durch AVE7688 verhindert. AVE7688 reduzierte nicht nur die AGE Akkumulation, sondern verbesserte auch die CML Clearance, während Ramipril keinen Effekt hatte. Die Effekte zur AGE Reduktion gingen einher mit einer Verhinderung der Albuminurie durch AVE7688 und einer 30%igen Reduktion durch Ramipril. In vitro Studien zu AGE Bildung zeigten, dass AVE7688 die Bildung von CML und Pentosidin verhindern kann und dass chelatierende Eigenschaften von AVE7688 an diesem Effekt beteiligt sein könnten. Ramipril hatte nur sehr schwach chelatierende Eigenschaften und keinen Einfluss auf die in vitro Bildung von CML oder Pentosidin. Neben der Akkumulation von AGEs trägt auch die Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion des Receptor of Advanced Glycation End Products (RAGE) zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie bei. Dies wurde in doppelt transgenen diabetischen Mäusen gezeigt, die aufgrund der RAGE Überexpression verstärkt diabetische Nephropathie im Vergleich zu diabetischen Mäusen mit normaler RAGE Expression entwickeln (64). Die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion mit den Liganden AGEs und S100B führt zu Entzündungsprozessen und zu einer Hochregulation der RAGE Expression (97). Da es in ZDF Ratten zur Akkumulation von AGEs kommt, wurde untersucht, ob ihr Rezeptor RAGE vermehrt in ZDF Ratten exprimiert wird und ob AVE7688 oder Ramipril die RAGE Expression beeinflussen. Die Substanzen könnten zum einen die RAGE-Liganden Interaktion direkt beeinflussen oder über eine Reduktion der Liganden die RAGE Expression verändern. Um dies zu untersuchen, wurde zunächst biochemisch die Interaktion von RAGE mit den Liganden AGEs und S100B näher analysiert, und die Bindedomaine von RAGE charakterisiert. Anhand dieser Daten wurde der Effekt von AVE7688 und Ramipril auf die biochemische RAGE-Liganden Interaktion und zelluläre RAGE Aktivierung in Makrophagen im Vergleich zu einem RAGE Antagonisten untersucht. In den ZDF Ratten korrelierte die AGE Akkumulation mit einer erhöhten RAGE Expression in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten. AVE7688, nicht jedoch Ramipril, reduzierte die erhöhte RAGE Expression in den ZDF Ratten. Bei der Charakterisierung der RAGE-Liganden Interaktion stellte sich heraus, dass AGEs, die Pentosidin und CML enthalten, ebenso wie S100B an RAGE binden und dass die V-Domaine von RAGE ausreichend für die Bindung der Liganden ist. Kreuzkompetitionen zeigten, dass AGEs und S100B innerhalb der gleichen Bindungsstelle von RAGE binden und dass AGEs, die Pentosidin enthalten, wesentlich affiner an RAGE binden als reine CML AGEs, wobei S100B von den untersuchten Liganden am affinsten an RAGE gebunden hat. Eine Untersuchung des Einflusses der Substanzen auf die RAGE-Liganden Interaktion ergab, dass die aktiven Metabolite von AVE7688 und Ramipril in physiologisch relevanten Konzentrationen keinen Effekt auf die Interaktion von RAGE mit AGEs oder S100B hatten. Da weder AVE7688 noch Ramipril die RAGE-Liganden Interaktion beeinflussten, wurde ein Homologiemodell der RAGE V-Domaine erstellt, um die Struktur eines RAGE Antagonisten besser vorhersagen zu können. Anhand des Modells konnte eine stark positiv geladene Fläche identifiziert werden, was vermuten lies, dass elektrostatische Wechselwirkungen an der RAGE-Liganden Interaktion beteiligt sein könnten. Diese Hypothese wurde durch die Daten unterstützt, dass Heparin aufgrund seiner negativen Ladung an die RAGE V-Domaine bindet und die Bindung von AGEs und S100B an RAGE kompetieren kann. Punktmutationen von ausgewählten positiven Resten innerhalb der RAGE V-Domaine zeigten, dass die Mutation von einer Aminosäure kaum einen Effekt hatte, während die Mutation von drei oder fünf positiv geladenen Resten, die Bindung der Liganden an RAGE reduzierte. Auch zellulär konnte Heparin die RAGE vermittelte Sekretion von TNFα in Makrophagen verhindern. Die erhöhte AGE Clearance und die Inhibition der AGE Bildung, vermutlich durch die chelatierenden Eigenschaften von AVE7688, könnten zur Reduktion der renalen AGE Akkumulation und einer Verbesserung der Nephropathie bei Typ II Diabetes beitragen. Die Daten lassen auch vermuten, dass die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion bei Diabetes durch AVE7688 verhindert werden kann, wobei AVE7688 keinen Effekt auf die Bindung der pathogenen RAGE-Liganden AGEs und S100B an RAGE hatte. Die Inhibition der RAGE Signaltransduktion könnte auf eine Reduktion der Liganden zurückgeführt werden, wobei der Effekt eine differenzielle Regulation der Expression von sRAGE nicht ausgeschlossen werden kann. Dieser neu identifizierte Wirkungsmechanismus der Vasopeptidasehemmung trägt mutmaßlich zur hohen Wirksamkeit dieser Substanzklasse bei diabetischer Nephropathie bei.
