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Die Niere stellt im Organismus einen der Hauptangriffspunkte für Toxine dar. Dies liegt zum einen in der Tatsache begründet, dass zahlreiche Substanzen renal eliminiert werden. Eine weitere Funktion der Niere ist die Regulation des Flüssigkeitsund Elektrolythaushaltes durch Rückresorption von Wasser, Ionen, Aminosäuren und Glucose. Dies führt zu einer Aufkonzentrierung des Primärharns und folglich werden für die zu eliminierenden Toxine im Harn normalerweise höhere Konzentrationen erreicht, als beispielsweise im Blutplasma. Ein Portfolio von verschiedenen metabolisierenden Enzymen, die hauptsächlich in der Niere auftreten, sorgt weiterhin dafür, dass einige der gefilterten Substanzen erst in der Niere eine Bioaktivierung zum Toxin erfahren. Es ist somit von grosser Bedeutung, geeignete Testsysteme zu entwickeln, mit denen die Nephrotoxizität von Arzneistoffen, Chemikalien und anderen Substanzen untersucht werden kann. Die globale Analyse der Genexpression mit Hilfe von Mikroarrays bietet die Möglichkeit, die Veränderungen in der Expression von mehreren Tausend Genen gleichzeitig in der Niere oder in renalen Zellkulturen nach der Einwirkung eines potenziellen Nephrotoxins zu untersuchen. Eines der Ziele dieser Arbeit bestand darin, diese vielversprechende Methode für den Einsatz bei der Untersuchung von Nephrotoxizität zu evaluieren. In diesem Zusammenhang sollte geklärt werden, inwiefern sich aus der Literatur bekannte Tatsachen über den Toxizitätsmechanismus bestimmter Nephrotoxine bestätigen lassen und ob Hinweise auf bisher unbekannte Aspekte bezüglich der Vermittlung der Nephrotoxizität der Nephrotoxine gewonnen werden können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war es, ein Zellkulturmodell zu etablieren und zu charakterisieren, das es ermöglicht, Genexpressionsanalysen zur Untersuchung der Nephrotoxizität in vitro durchzuführen und das ausserdem mit in vivo vergleichbare Daten liefert. In verschiedenen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass eine Kultur primärer Zellen etabliert werden konnte, die die funktionellen Eigenschaften von proximalen Tubuluszellen zeigt und keine Verunreinigung mit anderen Zelltypen des Nierencortex aufweist. Weiterhin wurden die optimalen Bedingungen für die Durchführung von Expressionsanalysen mit dieser Zellkultur definiert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden das Expressionsprofil von Ochratoxin A mit Hilfe von cDNA-Mikroarrays, sowie die Profile von Quecksilber-II-chlorid, Paraquat und Puromycin mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarrays in vivo und in vitro untersucht und bewertet. Ein Vergleich der beiden verfügbaren Plattformen (cDNA-Mikroarrays und Oligonukleotid-Mikroarrays) mit der Echt-Zeit-PCR als unabhängiger Methode lieferte aufschlussreiche Erkenntnisse über ihre Vor- und Nachteile. Die Analyse der Genexpressionsveränderungen nach der Einwirkung von OTA, HgCl2, Paraquat und Puromycin zeigte, dass sich mit Hilfe des Genexpressionsprofils zahlreiche Erkenntnisse über den Toxizitätsmechanismus der Substanzen gewinnen lassen, die sowohl durch die histopathologischen Befunde als auch mit Hilfe der einschlägigen Literatur bestätigt werden konnten. Zum Teil konnten sogar bisher unbekannte Aspekte der nephrotoxischen Wirkungen der untersuchten Modell- Toxine aufgedeckt werden, wie zum Beispiel die verstärkte Induktion von Golgi- Transport-assoziierten Genen im Nierencortex der Ratte nach Behandlung mit Paraquat. Die Analyse des Genexpressionsprofils kann somit vielversprechende Hinweise für das umfassende Verständnis des Toxizitätsmechanismus von Nephrotoxinen liefern. Der Vergleich der Expressionsmuster von HgCl2, Paraquat und Puromycin machte weiterhin deutlich, dass es einerseits transkriptionelle Änderungen gibt, die für das jeweilige Toxin spezifisch waren, andererseits aber auch Expressionsmuster aufgezeigt werden konnten, die allen untersuchten Nephrotoxinen gemeinsam waren. Durch die Identifizierung solcher gemeinsamen Genexpressionsprofile aus einer Datenbank mit zahlreichen bekannten Nephrotoxinen, könnte es in Zukunft sogar möglich sein, die potenzielle Nephrotoxizität unbekannter Arzneistoffe oder Chemikalien mit Hilfe von Mikroarrays vorherzusagen oder beispielsweise aus mehreren Kandidaten für einen neuen Arzneistoff, denjenigen mit dem geringsten nephrotoxischen Potenzial bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung herauszufiltern.
Mit einer Prävalenz von rund 5% bildet das Hereditäre Nonpolypöse Kolorektalkarzinom (HNPCC), auch Lynch Syndrom genannt, die häufigste genetische Disposition unter allen Kolorektalkarzinomen in Deutschland. Das Lynch Syndrom wird autosomal-dominant vererbt und tritt im Schnitt bereits ab dem 44. Lebensalter auf, während die Mehrheit der Kolorektalkarzinome erst mit 63 Jahren diagnostiziert wird. Ein wichtiges Merkmal sind sogenannte HNPCC-assoziierte Malignome, welche sich außerhalb des Dickdarms befinden. Die Diagnose gestaltet sich allerdings relativ schwierig, da bei Lynch Syndrom-Patienten kein eindeutiger klinisch auffälliger Phänotyp vorliegt und die Diagnosestellung nur in Zusammenhang mit einer Familienanamnese des Patienten möglich ist.
Mittlerweile ist bekannt, dass für das charakteristische Auftreten von hochgradigen Mikrosatelliteninstabilitäten im Tumorgewebe ein defektes DNA-Mismatch-Reparatursystem verantwortlich ist. Diese Defekte treten vor allem in den Genen MLH1, MSH2, MSH6 oder PMS2 auf und können über die Keimbahn vererbt werden.
Das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 wurde im Jahr 2009 publiziert, nachdem es bei einer Familie aus Französisch-Guyana gehäuft identifiziert wurde. Mehrere Familienmitglieder waren an unterschiedlichen Krebsarten erkrankt, und die Tatsache, dass neben Dickdarmtumoren auch synchrones und metachrones extrakolonisches Tumorwachstum auftrat, ließen den Schluss einer positiven Familienanamnese für das Lynch Syndrom zu. Auffällig war jedoch, dass das Spektrum dieser extrakolonischen Tumoren nicht im Einklang mit den typischen HNPCC-assoziierten Malignomen stand. Daher lag die Vermutung nahe, dass das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 für diesen Phänotyp verantwortlich ist.
Das dem zugrundeliegende Fusionsgen MLH1•ITGA9 ist das Resultat einer interstitiellen Deletion auf Chromosom 3p21.3. Es kodiert für den N-Terminus des Mismatch-Reparaturgens MLH1 sowie den C-Terminus des rund 400 kb downstream gelegenen Integrin α9. Aufgrund der fehlenden nukleären Lokalisationssequenz und weiterer wichtiger im C-Terminus gelegenen Domänen des MLH1-Proteins ist davon auszugehen, dass es außer Stande ist, Basenfehlpaarungen zu reparieren; ebenso sollte das Fusionsprotein theoretisch keine Funktionen des Wildtyp Integrin α9 mehr ausüben können.
Diese Annahmen konnten durch diverse Versuche wie Zelladhäsions- und Zellmigrationsassays bestätigt werden; das Fusionsprotein hatte dabei keinerlei Einfluß auf das Adhäsions- oder Migrationsverhalten unterschiedlicher Zelllinien.
Bezüglich der Lokalisation von MLH1•ITGA9 wurde über Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der fehlenden nuklären Lokalisationssequenz im MLH1-Proteinteil der Nachweis erbracht, dass sowohl das Fusionsprotein als auch seine Variante MLH1∆ (bestehend aus dem MLH1-Teil) lediglich im Zytoplasma, und nicht wie der Wildtyp auch im Zellkern, zu finden ist.
Desweiteren zeigten Co-Immunopräzipitationsexperimente eine Interaktion zwischen dem Fusionsprotein und MLH1∆ mit dem Tumorsuppressor BRCA1. Die Folgen dieser Interaktion wurden auf translationeller und Proteinebene mit dem Ergebnis untersucht, dass Zellen, welche das Fusionsprotein oder seine trunkierte Variante MLH1∆ exprimieren, nach Etoposidstimulierung teilweise in gravierendem Ausmaß einen negativen Einfluss auf die p53-abhängige DNA-Reparaturmaschinerie aufweisen. Dies zeigte sich besonders deutlich auf transkriptioneller Ebene in einer bis zu 96%igen Herunterregulierung wichtiger Zellzyklus- sowie proapoptotischer Gene. Die durchflusszytometrische Analyse dieser Zellen zeigte außerdem eine höhere Apoptoseresistenz nach Etoposidstimulierung im Vergleich zu Wildtyp-MLH1 exprimierenden Zellen.
Hintergrund: In den letzten Jahren ist der Diabetes mellitus zunehmend in den Fokus des weltweiten Interesses gerückt. Zahlreiche Arbeiten konnten eindrucksvoll aufzeigen, dass der Diabetes mellitus mit einer erhöhten Morbidität, einer verringerten Lebensqualität und Lebenserwartung sowie mit enormen Kosten für den einzelnen sowie die Gesellschaft verbunden ist. Um dieser „Lawine“ entgegenzutreten, sind in den letzten Jahren zahlreiche Anstrengungen unternommen worden. Eine war die Einführung zahlreicher neuer Wirkstoffe und Wirkstoffklassen, wie beispielsweise der kurzwirksamen Insulinanaloga. Aus pathophysiologischer Sicht bieten die Insulinanaloga gegenüber dem entsprechenden kurzwirksamen Humaninsulin zahlreiche Vorteile. Seit Einführung des ersten kurzwirksamen Insulinanalogas steht aber auch die Frage im Raum, ob und in wie weit die erheblichen Mehrkosten, die eine Therapie mit Insulinanaloga im Vergleich zu kurz wirksamem Humaninsulin verursachen, durch einen Zusatznutzen gerechtfertigt sind. Ein Cochrane-Review aus dem Jahr 2006 sowie eine Bewertung des Instituts für Qualität und Wirtschaftlichkeit im Gesundheitswesen aus dem Jahr 2005 bescheinigten den kurzwirksamen Insulinanaloga nur einen geringen bzw. keinen Zusatznutzen im Vergleich zu Humaninsulin. Werden neben dem IQWiG-Bericht weitere Quellen herangezogen, die Aussagen zum Nutzen von Medikamenten machen, wie beispielsweise Leitlinien, finden sich zum Teil widersprüchliche Aussagen, obwohl alle zuvor genannten Publikationen für sich in Anspruch nehmen, die Grundlagen der Evidence based Medicine zu berücksichtigen. Sowohl innerhalb der primären (Klinische Studien) und sekundären (Metaanalysen, HTAs, Leitlinien) klinischen Evidenz, als auch im Vergleich zu Studien zur Pharmakokinetik und –dynamik herrscht eine Diskrepanz, die weiterer Analysen im deutschen Versorgungskontext bedarf. Methodik und Daten: Es wurde ein systematischer Review zu Metaanalysen über den Vergleich von kurzwirksamen Insulinanaloga vs. kurzwirksamem Humaninsulin wie auch zu Leitlinien hinsichtlich Empfehlungen zur Anwendung von kurzwirksamen Humaninsulin bzw. Insulinanaloga in der Evidenz und Versorgungsrealität von kurzwirksamen Insulinanaloga in der Behandlung des T2DM 3 Behandlung von Typ-2-Diabetikern durchgeführt. Die identifizierten Publikationen wurden nach internationalen Kriterien und mit Methoden der EbM bewertet. In einem zweiten Schritt, wurde die Versorgungsrealität, abgebildet über Routinedaten der Gesetzlichen Krankenversicherung Gmünder ErsatzKassse, untersucht. Hierfür wurden sowohl die Stammdaten, Arzneimitteldaten, Stationäre- und ambulante Daten sowie Daten aus den Disease Management Programmen verwendet. Die Identifikation von Typ-2-Diabetikern die erstmals ein kurzwirkendes Insulin nutzten, erfolgte über ein mehrstufiges Prinzip, welches eine Erweiterung der „internen Diagnosevalidierung“ nach Ferber und Kollegen darstellt. In einem abschließenden dritten Schritt werden die Ergebnisse aus dem deutschen Versorgungskontext mit den Angabenaus der publizierten klinischen Evidenz abgeglichen. Ergebnisse: Neben dem Abschlussbericht des IQWiG konnten über die systematische Evidenzrecherche zwei weitere systematische Reviews inklusiver Metaanalyse sowie 16 Leitlinien identifiziert und in die Untersuchungen eingeschlossen werden. Im Vergleich der verschiedenen Datensätze zeigt sich eine große Diskrepanz zwischen Studienpatienten auf der einen und Patienten im deutschen Versorgungskontext auf der anderen Seite. Insgesamt konnte die vorliegende Arbeit die nicht ausreichende Evidenzbasis für einen Zusatznutzen der Analoga erneut bestätigen und weiteren Forschungsbedarf aufzeigen. Fazit: Die kurzwirksamen Insulinanaloga sind nur ein Beispiel für Arzneistoffe (-klassen), bei denen Fragen zur Kosten-Nutzen-Relation aufgrund hoher Tagestherapiekosten und eines geleichzeitig beschränkten Budgets der GKV relevant sind. Die Zukunft unseres Gesundheitssystems wird mit davon abhängen, wie das Verfahren der Kosten-Nutzen-Bewertung konkret in Deutschland umgesetzt wird bzw. wie der Marktzugang geregelt werden soll. Eine Grundbedingung ist hierbei, dass die Versorgungs- wie auch die Outcomeforschung in Deutschland ausgebaut, der Umgangmit fehlenden Daten umfassend diskutiert wird und die verfügbaren Daten stärker miteinander verknüpft werden.
Die Protoonkogene Ras und Raf spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung eines extrazellulären Signals in den Zellkern. Die direkte Interaktion zwischen GTP-gebundenem, aktiviertem Ras und der Proteinkinase Raf führt zur Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade, die eine entscheidende, regulatorische Rolle bei onkogenen, mitogenen und entwicklungsabhängigen Signalwegen besitzt. Die Beeinflussung der Kaskade stellt daher einen interessanten Ansatz für die Arzneistoffentwicklung dar. Trotz der bekannten Proteinstrukturen von Ras und Raf sind bisher nur wenige Stoffe gefunden worden, die die Interaktion direkt beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher ein Testsystem auf der Basis des Hefe-Zwei-Hybrid-System etabliert, mit dessen Hilfe Effektoren der Ras/Raf-Wechselwirkung schnell und einfach identifiziert werden können. Das erste Ziel der Arbeit war die Etablierung einer Testmethode in 96-well-Microtiterplatten, die einen schnellen Durchsatz verschiedener Proben erlaubt. Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit 469 Reinsubstanzen und Pflanzenextrakte in verschiedenen Konzentrationen getestet. Durch die Verwendung geeigneter Kontroll-Hefestämme konnte außerdem eine Aussage über die Spezifität der Substanzinteraktion getroffen werden. Bei einigen Ras/Raf-aktivierenden Substanzen konnten über die Testung systematischer Substanzreihen Struktur-Wirkungsbeziehungen aufgestellt werden. Cycloalkylidencarbonsäuren wurden als erste potente Ras/Raf-Aktivatoren identifiziert, deren wahrscheinlicher Interaktionsbereich durch die Expression verkürzter Raf-Mutanten auf den Bereich von AS 131-194 von Raf eingeschränkt werden konnte. Sie stabilisieren nicht nur die Bindung von mutiertem, sondern auch von Wildtyp-Ras an Raf. In einem zweiten, unabhängigen Säugerzell-Testsystem, das auf der Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade und dem anschließendem Nachweis des phosphorylierten MEK-Proteins beruht, lieferten die aktiven Verbindungen erste Hinweise auf eine Aktivierung der Signalkaskade. Mögliche Optimierungen der beiden verwendeten Testsystem, sowie Alternativen, weitergehende Experimente und Einsatzgebiete von Ras/Raf-Effektoren werden abschließend diskutiert.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Epicutanoeus immunotherapy as a novel prophylactic and therapeutic strategy for birch pollen allergy
(2014)
The development of a convenient, effective and safe allergen-specific immunotherapy (SIT) for birch pollen allergy, one of the most prevalent allergic diseases in Northern Europe, North America and Northern Japan, is of crucial importance. Epicutaneous immunotherapy (EPIT) has gained attention as a safe and non-invasive alternative for subcutaneous immunotherapy, a conventional SIT. However, clinical studies showed a limited effcacy of EPIT, indicating the necessity of improvement of the treatment regime. In this study, we hypothesized that a combination of a hypoallergen with an appropriate adjuvant could be a strategy to improve EPIT. To verify this hypothesis, we aimed at investigating the efficacy of epicutaneous treatment with rBet v 1, the major birch pollen allergen, plus Toll-like receptor (TLR) agonists for prophylaxis and therapy of birch pollen allergy using a murine model of birch pollen-induced allergic asthma. Furthermore, the efficacy of rBet v 1B2, a hypoallergenic variant of Bet v 1, as a therapeutic allergen in EPI was pre-clinically investigated. TLRs recognize conserved microbial molecules (like PAMPs), and are known to promote the counter-regulation of TH2 responses by the induction of TH1-type and/or regulatory cytokines by immune cells. The hypoallergen Bet v 1B2 is a folding-variant of the wild-type allergen rBet v 1 with reduced allergenicity, but retained T-cell immunogenicity. The low allergenicity, could allow the application of hypoallergens in higher doses, and therefore provide a safer and more effective treatment to regulate T-cell immune responses. First, the expression and purification of recombinant Bet v 1 and Bet v 1B2 was optimized. Compared to natural proteins, recombinant proteins offer the possibility to use well-defined molecules with a consistent pharmaceutical quality. Using optimal Escherichia coli expression strains in combination with immobilized metal chelate affinity chromatography (IMAC) and size exclusion chromatography (SEC), we successfully prepared a large amount of rBet v 1 and rBet v 1B2 with a high purity. The allergenic potency of rBet v 1 and the hypoallergenic characteristics of rBet v 1B2 were confirmed by measurement of IgE reactivity and mediator release capacity using ELISA and basophil activation tests, respectively. In a second part, a murine model of birch pollen-induced allergic asthma was established. It was shown that intraperetoneal sensitization with an optimal dose of rBet v 1 and intranasal challenge with birch pollen extract induced elevated IgE levels, airway eosinophilia and pulmonary inflammation in BALB/c mice. The clinical features are comparable to those in patients with allergic asthma, indicating that sensitized and challenged mice could be used for a pre-clinical study to assess the efficacy of the treatment for birch pollen allergy. Next, we investigated the adjuvant effects of Polyadenylic:polyuridylic acid (Poly(A:U)), a TLR3 agonist, and R848 (resiquimod), a TLR7 agonist, in prophylactic EPI with rBet v 1 to intervene with birch pollen allergy. Here, we hypothesized that TLR3 and TLR7 could be possible target receptors to induce adjuvant effects in EPI, since these receptors are expressed in Langerhans cells and dermal dendritic cells, persistent antigen presenting cells in the cutaneous tissues. BALB/c mice received EPI with rBet v 1 alone, or plus Poly(A:U), or R848 on their depilated back using patches. Mice treated epicutaneously were then sensitized with rBet v 1 plus ALUM and intranasally challenged with birch pollen extract. We found that prophylactic EPI with rBet v 1 plus R848 inhibited the production of Bet v 1-specific IgE antibodies in sensitization, suppressed pulmonary inflammation and airway hyperreactivity upon challenge. In contrast to R848, no adjuvant effect of Poly(A:U) on suppression of asthmatic features was observed. Our results indicated that R848, but not Poly(A:U), could be a potential adjuvant for prophylactic EPI of birch pollen induced allergic asthma. Finally, the therapeutic potency of EPI with rBet v 1, or rBet v 1B2 alone, or plus R848 was assessed. After sensitization and challenge, mice received therapeutic EPI with rBet v 1 alone, or plus R848, and re-challenge with birch pollen extract. We found that therapeutic treatment with Bet v 1B2 reduced established Bet v 1-specific IgE antibodies, pulmonary inflammation and airway hyperreactivity upon re-challenge. Therapeutic treatment with the recombinant wild-type allergen does not influence these key characteristics of allergic asthma. In contrast to the findings in the prophylactic treatment with rBet v 1 plus R848,no therapeutic benefit was found upon combination with R848. This could be due to the high number of treatment days. Reduction of this number may lead to a beneficial effect. However, these findings indicate that Bet v 1B2 could be a potential therapeutic agent for the treatment of established birch pollen induced allergic asthma. In conclusion, this study demonstrates for the first time that prophylactic EPI with the recombinant form of Bet v 1 in combination with R848 could prevent and suppress asthmatic features in an established birch pollen allergy. Not only therapeutic, but also prophylactic applications of EPI could be of importance to prevent allergic sensitization, considering the high prevalence of allergic diseases. R848 could be a potential adjuvant for enhancing the prophylactic potential of EPI for the treatment of birch pollen allergy. Furthermore, the beneficial use of the hypoallergen Bet v 1B2 in therapeutic EPI was demonstrated by intervention of established asthmatic features. In the future, a combination of hypoallergens alone or together with adjuvants in EPIT could lead to a more convenient and effective therapeutic treatment of established birch pollen induced allergic asthma.
Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
Der erste Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Etablierung und Validierung eines in vitro Testsystems zur Auffindung von Substanzen, die selektiv die Interaktion der mitogenen Signalmoleküle Ras und Raf inhibieren können. Die Deregulation der Ras-Signalkaskade spielt in einer Vielzahl maligner Transformationen eine bedeutende Rolle. Daher besteht in der pharmazeutischen Forschung großes Interesse an der Auffindung von Inhibitoren, die in der Lage sind, solche proliferativen Signale zu unterbinden und möglicherweise Ras- vermittelte Malignität einzudämmen. Das im Rahmen dieser Promotionsarbeit entwickelte Testsystem zur Detektion von Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion basiert auf der intracistronischen ß-Galaktosidase Komplementation. Hierbei werden zwei sich nicht komplementierende Deletionsmutanten der ß-Galaktosidase, deren Affinität zueinander sehr niedrig ist, mit interagierenden Proteinpaaren fusioniert, wodurch es zur Ausbildung eines aktiven Enzymkomplexes kommen kann, dessen Aktivität sich über die Umwandlung eines fluorogenen Substrats nachweisen lässt. Bei Expression der interagierenden Fusionsproteine im E.coli Stamm ER2507 zeigte sich in intakten Zellen eine spezifische Komplementation der Interaktionspartner. Eine in vitro Komplementation der Fusionsproteine konnte trotz nativer Aufreinigung nicht beobachtet werden, da die Proteine im zellfreien System unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur sehr schwach miteinander interagierten. Das zelluläre Testsystem ließe sich in dieser Form für die Wirkstoffsuche nach Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion einsetzen. Die Evaluierung und Validierung muss aber für jedes interagierende Proteinpaar gesondert erfolgen. Der zweite Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Entwicklung und Charakterisierung zellulärer Systeme zur Validierung von PKB/Akt als Zielstruktur für die Entwicklung neuartiger anti-tumoraler Strategien. PKB/Akt wird in der Literatur als zentraler Mediator von zellulären Überlebenssignalen beschrieben. Zudem weisen verschiedene Tumore eine konstitutive Aktivierung und/oder eine Überexpression von PKB/Akt auf, was möglicherweise mit dem Auftreten von Chemoresistenz korreliert. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte durch die Etablierung eines geeigneten zellulären Modells die Bedeutung von PKB/Akt bei der Verhinderung des Auftretens von Anoikis herausgestellt werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, einen kausalen Zusammenhang zwischen konstitutiver Aktivierung von PKB/Akt und der Vermittlung von Chemoresistenz in vitro als auch in vivo darzulegen. Bei der molekularen Untersuchung der PKB/Akt- vermittelten Desensitivierung von Lungenkarzinomzellen gegenüber Zytostatika zeigte sich, dass PKB/Akt Chemoresistenz durch breit gefächerte Eingriffe in die apoptotischen Hauptsignalwege über eine Vielzahl von Mechanismen wie beispielsweise die verstärkte Phosphorylierung der Initiator-Caspase 9, die erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL oder die verlangsamte Induktion von p53 vermittelt. Die selektive Inhibition der Kinaseaktivität von PKB/Akt stellt somit einen interessanten Ansatz für neuartige therapeutische Strategien dar, die darauf abzielen, Tumorzellen, die Chemoresistenz aufgrund einer hohen intrinsischen Aktivität von PKB/Akt aufweisen, durch Applikation eines PKB/Akt-Inhibitors gegenüber Standard-Chemotherapeutika zu resensitivieren und auf diese Weise eine Vielzahl von chemoresistenten Tumoren einer Therapie zugänglich zu machen.
Für viele pädiatrische Patienten mit Leukämie ist die Durchführung einer Hoch-Dosis- Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation oft die einzige Möglichkeit die Heilungsrate zu verbessern. Die Eliminierung der residualen leukämischen Blasten basiert einerseits auf der Konditionierung mit hoch-aggressiver Chemotherapie. Andererseits ist sie auf immunologische Reaktionen zwischen immunkompetenten Zellen, die entweder in dem Transplantat enthalten sind, oder aus diesem neu entstehen und den verbliebenen leukämischen Blasten zurückzuführen. Diese immunologische Interaktion wird auch als Graftversus- Leukämie-Reaktion (GVL) bezeichnet und hauptsächlich von T-und NK-Zellen vermittelt. Trotz zunächst erfolgreicher allogener Transplantation erleidet ein beträchtlicher Anteil der Patienten ein Rezidiv. Während ein offenes Rezidiv oft nicht mehr behandelbar ist, können Patienten mit drohendem Rezidiv oder minimaler Resterkrankung (MRD) durch Infusion immunkompetenter Zellen des Spenders, sogenannte Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI), teilweise erfolgreich behandelt werden. Die Behandlung mit DLI ist limitiert durch die Graft-versus-host-disease (GVHD), eine mit zum Teil schweren Komplikationen verbundene Reaktion, die potentiell tödlich verlaufen kann. Die gentechnische Veränderung der alloreaktiven Zellen mit einem Suizidgen ermöglicht eine kontrollierte, spezifische Eliminierung dieser Zellen im Falle einer GVHD Entwicklung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene retrovirale Selektions/Suizid- Fusionsvektoren für die Transduktion von Spender T-Zellen im Kontext einer DLI entwickelt. Beide Selektions/Suizid-Fusionselemente wurden in einem für die Transduktion in T-Zellen optimierten retroviralen Vektor generiert. Die Selektionsmarker waren so gewählt, dass eine Anreicherung der Transgen-positiven Zellen über eine immunomagnetische Selektion möglich war. Ein Vektor kodierte für ein Fusionsmolekül aus dem zytoplasmatisch trunkierten humanen CD34-Oberflächenmarker (tCD34) und der Zellzyklus-abhängigen GCV-hypersensitiven HSVtk39 (Herpes-simplex Virus I Thymidin Kinase) Mutante. Durch GCV-Applikation konnte in den transduzierten, tCD34/HSV-tk39 exprimierenden Zellen spezifisch die Apoptose induziert werden. Der zweite Vektor wurde so konstruiert, dass ein Fusionsprotein aus dem humanen DLNGFR-Oberflächenmarker und der Zellzyklus-unabhängigen death-effector-domain (DED) des humanen FADD (Fas-associated-protein with death domain) Moleküls entstand. Über zwei zwischengeschaltete FKBP (FK506-binding protein) Domänen wurden die beiden Elemente miteinander fusioniert. In DLNGFR/Fv'Fv/DED-exprimierenden Zellen konnte die Apoptose durch die Applikation eines spezifisch an die beiden FKBP-Domänen bindenden synthetischen Substrats (AP20187), das die Dimerisierung des DED-Moleküls induzierte, ausgelöst werden. Durchflusszytometrische Analysen von transduzierten und selektierten humanen primären TZellen zeigten, dass beide Fusions-Transgene korrekt in den Zielzellen exprimiert wurden. Die spezifische Induktion der Apoptose durch Aktivierung des jeweiligen Suizidmoleküls wurde in Funktionalitätstestungen nachgewiesen. Beide Fusionsmoleküle vermittelten eine effiziente Eliminierung der transduzierten Zellen (90 %-98 %). In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die beiden Suizidmechanismen einer unterschiedlichen Kinetik unterlagen. Während die DED-induzierte Apoptose sehr schnell auf die Applikation des Suizidaktivators folgte, vermittelte der HSV-tk39 Mechanismus eine deutlich langsamere aber etwas effizientere Eliminierung der Zellen. Erste Untersuchungen einer Kombination beider Fusionsmoleküle deuten auf einen additiven/synergistischen Effekt hin, der zu einer schnellen und effizienten Eliminierung der Zellen führt (>=99 %). Zur Zeit stellt die Strategie der Suizidgen-transduzierten T-Zellen die am vielversprechendste Methode zur Kontrolle einer GVHD-Reaktion dar. Die hier entwickelten Vektoren ermöglichen eine effiziente, kontrollierte Eliminierung der Zellen und bieten Potential zur Weiterentwicklung einer optimierten Strategie.
Das positions-spezifisch integrierende TRE5-A Retrotransposon besitzt zwei Promotorregionen (A- und C-Modul). Für das C-Modul konnte ein spezifisch bindendes Protein (CbfA) gefunden werden, das vermutlich über die Expression des Minusstrang-Transkripts regulativ in den Transpositionsmechanismus eingreift. Gleichzeitig stellt CbfA in D. discoideum einen kritischen Faktor dar, der sowohl auf das Wachstum als auch auf die Differenzierung Einfluss nimmt.
Es konnte gezeigt werden:
• Der AT-Haken in CbfA ist für die DNA-Bindung essentiell. Die Inaktivierung hat zur Folge, dass keine Differenzierung stattfindet. Es scheint, dass primär der AT-Haken für die DNA-Bindung sorgt und von den Zinkfingern unterstützt wird.
• Die JmjC-Domäne in CbfA ist essentiell. Transformanden mit CbfA ohne aktive JmjC-Domäne zeigen Defekte sowohl in Wachstum als auch Differenzierung.
• CbfA ist ein nukleares Protein. Es konnte zwar keine Kernlokalisationssequenz identifiziert werden, jedoch weisen die Versuche auf zumindest eine Kernlokalisierungssequenz im C-Terminus des cbfA hin.
• Ein C-terminal verkürztes CbfA ist funktionslos: wahrscheinlich aufgrund fehlender Kernlokalisation und somit fehlender DNA-Bindung.
• Ein N-terminal verkürztes CbfA ist teilweise funktionsfähig: die Komplementation in JH.D2-Zellen führt zu einer partiellen Revertierung hin zum Phänotyp der AX2-Zellen.
• Struktur-Homologien der JmjC-Domäne in CbfA zu Mitgliedern aus der Familie der Fe(II)/2OG-Oxygenasen, DNA-bindende Motive und die Lokalisation im Zellkern weisen auf eine Funktion des CbfAs als Chromatin-Remodeller im Zellkern hin.
• In der Transit von Wachstums- zu Entwicklungsphase kann der CbfA-Mangel durch artifizielle Proteinase A-Expression ausgeglichen werden, aber nicht durch Komplementation mit YakA, Adenylat-Zyklase oder cAMP Rezeptor 1.
• CbfA fungiert wahrscheinlich als Regulator der acaA-Transkription auf Ebene der chromosomalen Strukturen.
• cbfB, ein weiteres Gen mit einer JmjC-Domäne wurde in D. discoideum identifiziert, die Gensequenz vervollständigt und vom Dictyostelium Genom-Projekt verifiziert.
Neben den Phytocannabinoiden und synthetischen Cannabinoiden exisitieren bei Säugetieren und Menschen endogene Cannabinoide (EC). Diese lipophilen Signalstoffe sind vorwiegend im ZNS und Immunsystem aktiv. Heute werden den EC vermehrt neuroprotektive Eigenschaften zugewiesen. Mit den Cannabinoid (CB)1- und -2-Rezeptoren wurden bisher zwei dem endogenen Cannabinoidsystem (ECS) zugehörige Rezeptoren kloniert. Pharmakologische Untersuchungen an CB1- und -2-Rezeptor defizienten Mäusen weisen jedoch auf noch weitere bisher nicht klonierte Rezeptoren hin. Zu den bekanntesten im ZNS selbst synthetisierten und gezielt freigesetzten Liganden für die CB Rezeptoren zählen Arachidonylethanolamin (AEA), 2-Arachidonylglycerin (2-AG) und Palmitylethanolamin (PEA). Deren Mengen steigen z.B. nach einer traumatischen Schädigung deutlich an. Die postulierte Neuroprotektion der EC erfolgt wahrscheinlich über eine Reduktion der glutamatergen Neurotransmission. Darüber hinaus kommt es auch in Mikrogliazellen und Astrozyten zur Cannabinoid induzierten Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden, wodurch Produktion und Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen wie TNF-alpha vermindert werden. Im vorliegenden Projekt sollten die den Phytocannabinoiden (THC) und den EC zugewiesenen neuroprotektiven Eigenschaften am Modellsystem der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) nach einer exzitotoxischen Läsion vergleichend untersucht werden. Dazu wurden OHSC von 8 Tage alten Ratten hergestellt und durch Applikation von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) exzitotoxisch geschädigt. Exzitotoxische Läsionen zeichnen sich durch einen massiven Neuronenverlust sowie durch die Aktivierung von Mikrogliazellen und Astrozyten aus. Die Anzahl der zerstörten Körnerzellen im Gyrus dentatus (GD) des Hippokampus wurde als Maß für die Bestimmung des neuronalen Schadens angesehen. Weiterhin wurde die Anzahl der aktivierten Mikrogliazellen im Bereich der Körnerzellschicht quantitativ bestimmt. Dann sollte geprüft werden, ob die eingesetzten Cannabinoide die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen reduzieren und ob sich eine Reduktion der Mikrogliazellen positiv auf das Überleben der Neurone auswirkt. Ungeschädigte und NMDA geschädigte OHSC wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von THC, AEA, 2-AG oder PEA behandelt. Durch Zugabe von Propidiumiodid (PI) wurden die degenerierten Neurone markiert (PI+-Neurone). Mit Hilfe von FITC-konjugiertem Griffonia simplicifolia Isolektin B4 (IB4+) wurden die Mikrogliazellen dargestellt und die OHSC abschließend mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop analysiert. Es folgten weitere Versuche, bei denen verschiedene synthetische Agonisten/Antagonisten von CB-Rezeptoren verwendet wurden, um die möglicherweise an neuroprotektiven Prozessen beteiligten CB-Rezeptoren zu identifizieren. Um die mögliche Beteiligung des CB1- und -2-Rezeptors zu beleuchten, kamen die Antagonisten AM251 und AM630 zum Einsatz. Die Beteiligung von bisher nur pharmakologisch identifizierten CB-Rezeptoren, wie dem WIN- oder dem abnormalen (abn) Cannabidiol-Rezeptor, wurde mit Hilfe des Agonisten WIN und des Antagonisten Capsazepin für den WIN-Rezeptor, oder, im Falle des abn Cannabidiol Rezeptors, mit Hilfe der Agonisten abn Cannabidiol und 2-AG sowie der Antagonisten O-1918 und Cannabidiol untersucht. In ungeschädigten OHSC waren in der KZS des GD nahezu keine PI+-Neurone und nur sehr wenige IB4+-, ramifizierte Mikrogliazellen nachweisbar. Nach NMDA-Schädigung stieg die Zahl der PI+-Neurone und der IB4+-, amöboiden Mikrogliazellen massiv an. Die aktivierten Mikrogliazellen akkumulierten vorwiegend an Stellen höchster neuronaler Schädigung. Im Vergleich zu ausschließlich mit NMDA-behandelten OHSC verursachte das Phytocannabinoid THC eine konzentrationsabhängige numerische Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen. Die Anzahl der PI+-Neurone wurde hingegen nicht beeinflusst. Alle verwendeten Endocannabinoide (AEA, 2-AG, PEA) reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen. Darüber hinaus war die Zahl der PI+-Neurone nach Gabe von 2-AG und PEA im Sinne eines neuroprotektiven Effektes deutlich vermindert, wohingegen AEA keine neuroprotektiven Eigenschaften besaß. Die synthetischen CB-Rezeptor-Agonisten WIN und abn Cannabidiol reduzierten die Anzahl der IB4+-Mikrogliazellen und PI+-Neurone ebenfalls deutlich. Der Einsatz der oben beschriebenen Antagonisten ergab, dass die THC-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen durch den CB2-Rezeptor Antagonisten AM630 aufgehoben wurde, was auf eine Beteiligung des CB2-Rezeptors hindeutet. Die 2-AG-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen wurde durch die abn-Cannabidiol-Rezeptor-Antagonisten O-1918 und Cannabidiol gehemmt. Der 2-AG vermittelte neuroprotektive Effekt wurde ebenfalls durch O-1918 und Cannabidiol aufgehoben. Beide Antagonisten hoben auch die abn-Cannabidiol-induzierte Reduktion der IB4+-Mikrogliazellen und die abn-Cannabidiol-induzierte Neuroprotektion auf. Die am Modellsystem der OHSC durchgeführten Versuche zeigen deutlich, dass die verwendeten Cannabinoide nach einer exzitotoxischen Schädigung einen unterschiedlichen Einfluss auf die Anzahl aktivierter Mikrogliazellen und die Zahl degenerierender Neurone ausüben. Sie belegen ferner, dass eine Reduktion der Anzahl aktivierter Mikrogliazellen sich nicht per se neuroprotektiv auszuwirken scheint. Daher ist festzustellen, dass ein Zusammenspiel verschiedenartiger CB-Rezeptortypen auf der einen und unterschiedlicher Zelltypen auf der anderen Seite beim Mechanismus der Neuroprotektion stattfindet. In unseren Untersuchungen erwiesen sich THC und AEA als nicht neuroprotektiv, obwohl für beide Substanzen in der Literatur solche Effekte unter In-vivo-Bedingungen beschrieben wurden. Die Diskrepanz zwischen 2-AG und PEA auf der einen Seite und AEA und THC auf der anderen Seite in unserem Modellsystem ließe sich eventuell dadurch erklären, dass in der OHSC keine immunkompetenten Blutzellen vorhanden sind, die möglicherweise ein wichtiges Element im Zusammenspiel verschiedener Zelltypen bei der Neuroprotektion unter In- vivo-Bedingungen darstellen. Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir OHSC mit isolierten Milzmakrophagen inkubiert, um so aus der Blutbahn einwandernde immunkompetente Zellen zu simulieren. Die Ergebnisse dieser Experimente belegen, dass Milzmakrophagen tatsächlich zum Ort höchster neuronaler Schädigung in der OHSC migrieren und bei Anwesenheit dieser Milzkakrophagen sowohl AEA als auch THC neuroprotektiv sind. Schließlich wurde mit primären Kulturen von Mikroglialzellen und Astrozyten untersucht, ob Cannabinoide die Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Freisetzung von proinflammatorischen Substanzen beeinflussen. Diesbezüglich wurde die Konzentrationen des Zytokins TNF-alpha im Kulturüberstand mittels ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass die eingesetzten Cannabinoide die Freisetzung von TNF-alpha äußerst differenziert regulieren. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit interessante und neue Befunde zur neuroprotektiven Wirkung von Cannabinoiden erhoben wurden. Diese Daten werden sicherlich eine breite Ausgangsbasis für zukünftige Untersuchungen bieten, in denen die weitere Analyse des komplexen Zusammenspiels zwischen verschiedenen CB-Rezeptoren und unterschiedlichen Zelltypen des ZNS bei der Cannabinoid-vermittelten Neuroprotektion erfolgen wird.
Der Prävention und Therapie von diabetischer Nephropathie kommt immer mehr Bedeutung zu, da sie der Hauptgrund für terminale Niereninsuffizienz ist. Ein möglicher Therapieansatz ist die Hemmung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems mit Angiotensin Converting Enzyme Inhibitoren oder kombinierten ACE und neutrale Endopaptidase (Vasopeptidase) Inhibitoren. Trotz der therapeutischen Effektivität einer pharmakologischen Hemmung des RAAS ist die Bedeutung von ACE und NEP in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie noch nicht vollständig geklärt. Auf Gewebsebene kann die erhöhte Bildung und Akkumulation von AGEs zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie beitragen (73) und der ACE-Inhibitor Ramipril kann die Anreicherung von fluoreszierenden AGEs in der Niere und im Serum von Typ I diabetischen, hypertensiven Ratten verhindern (73). Da AGEs unterschiedliche Strukturen und Effekte auf Proteine haben, sollte der Einfluss des ACEInhibitors Ramipril und des Vasopeptidase Inhibitors AVE7688 auf die Akkumulation von den drei prototypischen AGEs 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in einem Typ II diabetischen Tiermodell untersucht werden. Für den AGE-Subtyp CML wurde zusätzlich noch die Konzentration im Serum und die CML Clearance in ZDF Ratten bestimmt. Des Weiteren sollte der Effekt von Ramipril und AVE7688 auf die AGE Bildung in vitro analysiert werden. Die Charakterisierung der ZDF Ratten ergab, dass es zu einer 40, 50 und 55%igen Akkumulation der AGE-Subtypen 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten kommt. Diese Akkumulation konnte durch die Behandlung mit AVE7688 komplett verhindert werden, während Ramipril nur die CML Akkumulation in 37 Wochen alten ZDF Ratten leicht reduzierte. Auch wurde die CML Akkumulation im Serum von 37 Wochen alten ZDF Ratten durch AVE7688 verhindert. AVE7688 reduzierte nicht nur die AGE Akkumulation, sondern verbesserte auch die CML Clearance, während Ramipril keinen Effekt hatte. Die Effekte zur AGE Reduktion gingen einher mit einer Verhinderung der Albuminurie durch AVE7688 und einer 30%igen Reduktion durch Ramipril. In vitro Studien zu AGE Bildung zeigten, dass AVE7688 die Bildung von CML und Pentosidin verhindern kann und dass chelatierende Eigenschaften von AVE7688 an diesem Effekt beteiligt sein könnten. Ramipril hatte nur sehr schwach chelatierende Eigenschaften und keinen Einfluss auf die in vitro Bildung von CML oder Pentosidin. Neben der Akkumulation von AGEs trägt auch die Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion des Receptor of Advanced Glycation End Products (RAGE) zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie bei. Dies wurde in doppelt transgenen diabetischen Mäusen gezeigt, die aufgrund der RAGE Überexpression verstärkt diabetische Nephropathie im Vergleich zu diabetischen Mäusen mit normaler RAGE Expression entwickeln (64). Die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion mit den Liganden AGEs und S100B führt zu Entzündungsprozessen und zu einer Hochregulation der RAGE Expression (97). Da es in ZDF Ratten zur Akkumulation von AGEs kommt, wurde untersucht, ob ihr Rezeptor RAGE vermehrt in ZDF Ratten exprimiert wird und ob AVE7688 oder Ramipril die RAGE Expression beeinflussen. Die Substanzen könnten zum einen die RAGE-Liganden Interaktion direkt beeinflussen oder über eine Reduktion der Liganden die RAGE Expression verändern. Um dies zu untersuchen, wurde zunächst biochemisch die Interaktion von RAGE mit den Liganden AGEs und S100B näher analysiert, und die Bindedomaine von RAGE charakterisiert. Anhand dieser Daten wurde der Effekt von AVE7688 und Ramipril auf die biochemische RAGE-Liganden Interaktion und zelluläre RAGE Aktivierung in Makrophagen im Vergleich zu einem RAGE Antagonisten untersucht. In den ZDF Ratten korrelierte die AGE Akkumulation mit einer erhöhten RAGE Expression in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten. AVE7688, nicht jedoch Ramipril, reduzierte die erhöhte RAGE Expression in den ZDF Ratten. Bei der Charakterisierung der RAGE-Liganden Interaktion stellte sich heraus, dass AGEs, die Pentosidin und CML enthalten, ebenso wie S100B an RAGE binden und dass die V-Domaine von RAGE ausreichend für die Bindung der Liganden ist. Kreuzkompetitionen zeigten, dass AGEs und S100B innerhalb der gleichen Bindungsstelle von RAGE binden und dass AGEs, die Pentosidin enthalten, wesentlich affiner an RAGE binden als reine CML AGEs, wobei S100B von den untersuchten Liganden am affinsten an RAGE gebunden hat. Eine Untersuchung des Einflusses der Substanzen auf die RAGE-Liganden Interaktion ergab, dass die aktiven Metabolite von AVE7688 und Ramipril in physiologisch relevanten Konzentrationen keinen Effekt auf die Interaktion von RAGE mit AGEs oder S100B hatten. Da weder AVE7688 noch Ramipril die RAGE-Liganden Interaktion beeinflussten, wurde ein Homologiemodell der RAGE V-Domaine erstellt, um die Struktur eines RAGE Antagonisten besser vorhersagen zu können. Anhand des Modells konnte eine stark positiv geladene Fläche identifiziert werden, was vermuten lies, dass elektrostatische Wechselwirkungen an der RAGE-Liganden Interaktion beteiligt sein könnten. Diese Hypothese wurde durch die Daten unterstützt, dass Heparin aufgrund seiner negativen Ladung an die RAGE V-Domaine bindet und die Bindung von AGEs und S100B an RAGE kompetieren kann. Punktmutationen von ausgewählten positiven Resten innerhalb der RAGE V-Domaine zeigten, dass die Mutation von einer Aminosäure kaum einen Effekt hatte, während die Mutation von drei oder fünf positiv geladenen Resten, die Bindung der Liganden an RAGE reduzierte. Auch zellulär konnte Heparin die RAGE vermittelte Sekretion von TNFα in Makrophagen verhindern. Die erhöhte AGE Clearance und die Inhibition der AGE Bildung, vermutlich durch die chelatierenden Eigenschaften von AVE7688, könnten zur Reduktion der renalen AGE Akkumulation und einer Verbesserung der Nephropathie bei Typ II Diabetes beitragen. Die Daten lassen auch vermuten, dass die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion bei Diabetes durch AVE7688 verhindert werden kann, wobei AVE7688 keinen Effekt auf die Bindung der pathogenen RAGE-Liganden AGEs und S100B an RAGE hatte. Die Inhibition der RAGE Signaltransduktion könnte auf eine Reduktion der Liganden zurückgeführt werden, wobei der Effekt eine differenzielle Regulation der Expression von sRAGE nicht ausgeschlossen werden kann. Dieser neu identifizierte Wirkungsmechanismus der Vasopeptidasehemmung trägt mutmaßlich zur hohen Wirksamkeit dieser Substanzklasse bei diabetischer Nephropathie bei.
Colorectal cancer is one of the most cause of cancer and death in Western societies. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs), which regulate transcription through modification of chromatin structure, received considerable interest on the ground of they ability to stop the growth and induce cell death in colon cancer tumours, representing a promising transcriptional cancer therapy. This kind of cancer initiates with an activating mutation in the Wnt cascade, allowing the nuclear import of ß-catenin binding to LEF/TCF. This induces the overexpression of growthpromoting oncogenes affecting the cell cycle arrest, lineage-specific cell differentiation and apoptosis processes. In addition, ß-catenin also participates in cell-cell adhesion via interactions with E-cadherin, which can be repressed by families of transcription factors Snail and ZEB. This, and gain of vimentin has been closely correlated with local invasion and metastasis since they avoid the induction of apoptosis through the loss of cell anchorage, a phenomenon called anoikis. In this process the inactivation of the kinases Src an FAK provoking disruption of focal adhesion complexes through is involved. LAQ824 is a HDAC inhibitor derivative of hydroxamic acid, which present antitumor effect in colon and other cancer cells. The aim of this study is to analyse the effect of LAQ824 in cell proliferation, apoptosis, motility and tumour invasion in a colon carcinoma model based on the adenoma-carcinoma sequence descrying trough which pathways LAQ824 is able to cause these effects. Here I demonstrate for the first time that a HDAC inhibitor, LAQ824, induces detachmentinduced cell death of colon cancer cell lines HCT116 and HT-29, a phenomenon called anoikis, in a caspase-dependent and p53-independent manner. In this process the component of the Wnt signalling pathway ß-catenin is involved. Furthermore LAQ824 upregulates the adhesion molecule E-cadherin expression in these cell lines independently of its repressor Snail, but probably mediated by the repressor ZEB. In addition LAQ824-induced anoikis is caused by disruption of focal adhesion complexes through inhibition of the activity of the kinases FAK and Src inhibiting cell motility indicating a strong antimetastatic potential for LAQ824.
Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase, die das MLL-Protein an zwei konservierten Erkennungssequenzen (CS1 und CS2) hydrolysiert. Die daraus entstehenden Spaltprodukte, p320N und p180C bilden ein stabiles Heterodimer und fügen sich mit zahlreichen Proteinen zu einem Multiproteinkomplex zusammen, der die epigenetischen Prozesse während der Embryogenese, Zellzyklus und Stammzell-Wachstum steuert. Der MLL-Komplex weist eine spezifische Histon-Methyltransferase-Aktivität für Lysin-4 des Histon 3 Proteins auf (H3K4me3). Diese spezifische Aktivität hält ein Muster der aktiven Gene während der Entwicklung und Zelldifferenzierung aufrecht. Das AF4-MLL Fusionsprotein, welches durch die chromosomale Translokation t(4;11) gebildet wird, ist ebenfalls ein Substrat von Taspase1. Die Hydrolyse dieses Fusionsproteins führt ebenfalls zu Spaltprodukten, die zunächst miteinander ein Heterodimer bilden, um anschliessend einen onkogenen Multiproteinkomplex auszubilden. Dieser Komplex scheint hämatopoietische Stammzellen zu "reprogrammieren" und den Ausbruch einer lymphoblastischen Leukämie auszulösen.
Die Aktivität der Taspase1 selbst wird durch Eigen-Proteolyse reguliert. Es wird zunächst als Proenzym (p50) hergestellt, das anschliessend durch Autoproteolyse in die enzymatisch aktive Form konvertiert wird. Taspase1 ist ein enzymatisch strikt kontrolliertes Enzym mit geringer Substratanzahl. Neben MLL gibt es nur wenige, bekannte Substrate; allerdings scheint Taspase1 in den Zellen solider Tumoren überexprimiert zu sein. Daraus kann postuliert werden, dass Taspase1/MLL-Aktivität für diese Tumorarten von bedeutung ist. Taspase1 ist die einzige bislang bekannte Protease in Säugerzellen, die dazu befähigt ist, das Leukämie-spezifische AF4-MLL proteolytisch zu spalten und damit seine onkogenen Eigenschaften zu aktivieren. Eine spezifische Inhibierung der Taspase1 könnte deshalb eine mögliche Methode zur Therapie von t(4;11)-Leukämie darstellen. Aus diesem Grund war Taspase1 als ein potentielles Wirkstoffziel interessant und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer untersucht.
Um die Funktionsweise von Taspase1 zu untersuchen, wurde die 2005 veröffentlichte Kristallstruktur der Taspase1 als Grundlage für alle weiteren Arbeiten verwendet. Da die Struktur allerdings nur unvollständig aufgelöst war, wurden die unaufgelösten Bereiche mittels bioinformatischer Tools in Kooperation mit Tim Geppert (Arbeitskreis von Prof. Dr. Gisbert Schneider) modelliert. Die Modellierung führte zu einem detaillierteren Modell des Taspase1-Proenzyms, also dem Zustand vor der autokatalytischen Aktivierung.
Taspase1 weist interessanterweise nur Homologien zu L-Asparaginasen-2 (Familie der Hydrolasen), darunter Glycosylasparaginase, auf. Glycosylasparaginase durchläuft ebenfalls einen Autokatalyse-Prozess, allerdings nach einem N-O-Acyl-shift-Mechanismus. Daher wurde Taspase1 zunächst anhand geeigneter Experimente daraufhin überprüft, ob hier ebenso ein solcher Mechanismus für die Autokatalyse in Betracht kommt. Allerdings widerlegten die durchgeführten Experimente diese Vermutung.
Um die molekulare Funktionsweise der Taspase1 zu eruieren, wurde nun das modellierte Taspase1-Proenzym verwendet. Dies erlaubte die Identifizierung von kritischen Aminosäuren. Durch Mutationsanalysen konnte so die Funktion von Taspase1 aufgeklärt werden. So wurde ein intrinsischer Serin-Protease-Mechanismus für den Prozess der Autokatalyse entdeckt. Dabei spielt Serin-291 - unmittelbar in der Nähe des katalytischen Zentrums - eine wesentliche Rolle.
Anhand weiterer Mutationsanalysen konnte dann schrittweise der Aktivierungsmechanismus von Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei scheint die Homodimerisierung zweier Taspase1- Proenzyme der wesentliche Schlüssel für die vollständige Aktivierung der Taspase1 zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Aminosäuren Tryptophan-173, Arginin-262, und Glutaminsäure-295 als kritische Aminosäuren identifiziert.
Weiterhin konnte anhand der funktionellen Analyse aller Mutanten zuletzt eine trans-dominant-negative Taspase1-Variante (C163E-S291A; tdn-TASP1) hergestellt werden. Das proenzymatische Monomer dieser Mutante ist dabei befähigt, mit einem Wildtyp-Taspase1-Monomer zu heterodimerisieren und seine Aktivität vollständig zu inhibieren. Die Funktion dieser trans-dominant-negativen Mutante validierte den in dieser Arbeit postulierten Aktivierungsmechanismus der Taspase1, der nun zukünftig für ein rationales Wirkstoff-Design verwendet werden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle retinaler Perizyten nach einer Infektion mit dem Humanen Zytomegalievirus und deren mögliche Beteiligung an einer HCMV-Retinitis untersucht. Zunächst wurde die Isolation, Kultivierung und Vermehrung von humanen retinalen Perizyten (HRP) etabliert. Eine erfolgreiche Isolation der HRP ist abhängig vom Alter des Spenders, welches unter 50 Jahren liegen sollte, als auch vom Zeitpunkt der Entnahme des Auges. Dabei sollten die Retinae spätestens nach 48 h post mortem aus den Augen präpariert werden. Nach Aufschluss mit einem Dispase/Kollagenase-Gemisch und Separation über ein Zellnetz wurden die isolierten Perizyten auf mit Fibronektin oder ECM (extrazelluläre Matrix) beschichtete Kulturflaschen ausgebracht. Aufgrund der Optimierung des Mediums war es zum ersten Mal möglich, humane retinale Perizyten über 12-15 Passagen zu kultivieren. Somit standen genügend Zellen zur Analyse der Infizierbarkeit mit HCMV und für die Reportergenanalyse zu Verfügung.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Zellen mit HCMV infizierbar sind, jedoch keine lytische Infektion stattfindet und nur wenige Zellen einen zytopathischen Effekt zeigen. Mithilfe von Titerbestimmungen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen infizierter Perizyten konnte die Virusreplikation und die Bildung reifer bzw. funktioneller Viruspartikel nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Expression der viralen IE- und late-Proteine in HCMV-infizierten Perizyten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitativer RealTime-PCR nachgewiesen. Während einer HCMV-Infektion werden unterschiedliche inflammatorische Prozesse induziert. Dazu gehört z. B. die Aktivierung zellulärer Transkriptionsfaktoren, welche durch ihre Bindung an Promotorregionen die Transkription verschiedener Gene die für Zytokine und Adhäsionsmoleküle kodieren, und andere Transkriptionsfaktoren beeinflussen (Pahl, 1999). Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird als Hauptregulator für die HCMV-Replikation beschrieben, in retinalen Perizyten wird NF-κB jedoch nicht aktiviert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung und Genexpressionsstudien konnte ein weiterer proinflammatorischer Prozess, die Überexpression von ICAM-1, in infizierten Perizyten nachgewiesen werden. ICAM-1 bewirkt die Infiltration und Anhaftung von Leukozyten an infizierten Zellen. Durch Adhäsionsstudien wurde eine 4,6-fach gesteigerte Anhaftung an HCMV-infizierten Perizyten nachgewiesen, welche durch blockierende Antikörper wieder aufgehoben werden konnte. Durch Expressionanalysen von Chemokin- und Interleukingenen mittels qRT-PCR und ELISA-Analysen konnten erhöhte Sekretionen von CCL2, CCL5, CXCL10 und IL-8 in HCMV-infizierten HRP nachgewiesen werden. Die Resultate einer Infektion mit Vollvirus wurden durch die Transfektion mit Expressionsplasmiden für die viralen Proteine IE1/2 bestätigt. Eine gesteigerte Expression der Zytokine wurde vor allem durch die Überexpression von IE2 und synergistisch durch IE1/2 nachgewiesen. Eine durch IE1 induzierte Expression wurde nur für CCL2 detektiert. Die viralen IE-Proteine sind potentielle Transaktivatoren viraler und zellulärer Promotoren. Ziel war es, den Einfluss auf die Promotoren der Zytokingene (von -3000bp bis 100 bp) durch Koexpression der viralen IE1/IE2-Proteine mittels Luciferase-Reportergenassays in HRP zu untersuchen. Nur der CCL2-Promotor (-1355/+55) zeigte eine erhöhte basale Promotor-aktivität. Um den Einfluss der IE-Proteine auf die Promotoren zu untersuchen, wurden Kotransfektionen mit den Expressionsplasmiden für IE1/2 und den Reportergen-konstrukten der Zytokingene durchgeführt. Dabei zeigten die Analysen mit den Minimalpromotoren (TATA-Box/NF-κB Bindungsstellen) keine erhöhten Luciferaseaktivitäten. NF-κB wurde durch eine HCMV-Infektion nicht aktiviert, somit ist die Transaktivierung der Promotoren von CCL2, CCL5, CXCL10, IL-8 und ICAM-1 in infizierten Perizyten vermutlich NF-κB unabhängig. Die Transaktivierung dieser Promotoren könnte durch AP-1 vermittelt sein, da die höchsten Luciferaseaktivitäten durch die Kotransfektion mit strangabwärts gelegenen Promotorbereichen erhalten wurden, in diesen Bereichen befinden sich potentielle Bindungsstellen für AP-1, SP-1 und anderer Transkriptionsfaktoren. Mittels Western Blot-Analyse wurde eine Induktion der Expression von AP-1 durch HCMV nachgewiesen, somit wird die HCMV-Replikation in HRP vermutlich über AP-1 vermittelt.
In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane Perizyten isoliert und erstmals mit HCMV infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen als Modellsystem zur Untersuchung einer HCMV-Retinitis von großer Bedeutung sind. Aufgrund ihres hohen Anteils in der Retina, ihrer schützenden Funktion für die Blut-Retina Schranke sowie ihrer Beteiligung an der HCMV-Retinitis spielen diese bisher nur wenig untersuchten Zellen, offensichtlich eine große Rolle im immunpriviligiertem Auge. Für die Etablierung neuer Therapieansätze für eine HCMV-Retinitis könnten detailliertere Untersuchungen retinaler Perizyten Aufschluss über den Replikationsmechanismus von HCMV und die damit verbundenen inflammatorischen Prozesse während einer HCMV-Retinits bieten.
Das “Protein Associated with Myc” spielt in den verschiedenen physiologischen Vorgängen eine Rolle. Dazu zählen Prozesse der Synaptogenese und Schmerzverarbeitung ebenso wie eine Regulation des Pteridin- und cAMP-Stoffwechsels. Auf welche Weise PAM die unterschiedlichen Effekte vermittelt, ist bislang nur in Ansätzen verstanden. Um die Wirkmechanismen von PAM aufzuklären, wurden in dieser Arbeit seine biochemischen Funktionen untersucht. Die These, dass PAM als E3 Ubiquitinligase aktiv ist, konnte in vitro mittels biochemischer Versuche zweifelsfrei bestätigt werden. Sowohl das nativ aufgereinigte, humane PAM, als auch der heterolog expremierte C-Terminale Bereich (C-PAM), der die katalytisch aktive RING Finger Domäne enthält, wiesen die Fähigkeit zur Ubiquitinkettenbildung und Autoubiquitinierung auf. Bei der Identifikation eines möglichen Zielproteins rückte das Protein TSC2 und der damit verbundene TSC2 / mTOR Signalweg in den Fokus. Für das gewählte Modell-System HeLa Zellen ließ sich eine Interaktion von PAM und TSC2 durch Ko-Immunopräzipitationen und Immunzytochemie nachweisen. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass das vollständige, native PAM, nicht aber die isolierte RING Finger Domäne, TSC2 polyubiquitinieren und zum proteasomalen Abbau markieren kann. TSC2 ist ein negativer Regulator der mTOR Kinaseaktivität, in dem es den stimulatorischen Einfluss von Rheb auf mTOR inhibiert. PAM wird in HeLa Zellen durch das Phospholipid Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aktiviert. Nach S1P Behandlung der Zellen war eine Phosphorylierung der Proteinkinase mTOR nachweisbar. Diese ging mit einer Aktivierung der Kinaseaktivität einher, wie die rapamycinsensitive Phosphorylierung der mTOR Zielproteine p70S6K und 4E-BP1 zeigte. Durch Gabe von Rezeptor-Agonisten/-Antagonisten konnte eine Beteiligung des S1P1 und S1P2 Rezeptors ausgeschlossen werden. Der zunächst vermutete Mechanismus eines S1P induzierten, PAM-abhängigen Abbaus von TSC2 konnte trotz vielfältiger Herangehensweisen nicht nachgewiesen werden. Eine Phosphorylierung als Indikation einer Inaktivierung war ebenfalls nicht detektierbar. Auch die GAP Aktivität von TSC2 auf Rheb, wird in in vitro Versuchen durch die Interaktion mit PAM nicht vermindert. Durch eine Verminderung der TSC2 Expression mittels spezifischer siRNA zeigte sich, dass TSC2 nicht in die S1P-abhängige mTOR Aktivierung involviert ist. Auch regulatorische Proteinkinasen wie AKT, ERK oder PI3K, die durch S1P aktiviert werden können, sind an dem Signalweg nicht beteiligt, wie die Hemmung dieser Enzyme mit spezifischen Inhibitoren zeigte. Dagegen konnte eine Beteiligung von PAM und Rheb zum einen mittels Proteintransfektion bestätigt werden, zum anderen ließen sich die S1P Effekte durch Hemmstoffe verhindern, die für eine Aktivierung von PAM, respektive Rheb, nötig sind. Durch Nukleotidbindungsstudien war ein Einfluss von PAM auf den GTP-Beladungszustand von Rheb nachweisbar. Sowohl in einem GTPS Bindungsversuch als auch in einem GDP Dissoziationsexperiment erhöhte PAM konzentrationsabhängig die GTP Bindung bzw. den GDP/GTP Austausch an Rheb. In dieser Arbeit wird damit erstmalig eine duale Funktion eines Proteins als Ubiquitinligase und GEF beschrieben. So konnte die postulierte Aktivität von PAM als Ubiquitinligase bestätigt und TSC2 als Zielprotein identifiziert werden. Gleichzeitig wurde ein TSC2 unabhängiger Weg der mTOR Aktivierung aufgeklärt, an dem PAM und Rheb beteiligt sind. Als möglicher Mechanismus kommt eine Aktivität von PAM als Guanin-Nukleotid Austausch Faktor (GEF) auf Rheb in Frage. Durch Beschreibung von PAM als negativem Regulator von TSC2 und Aktivator von Rheb trägt diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zur TSC2 / mTOR Forschung bei. Umgekehrt ermöglicht sie eine neue Sichtweise auf partiell PAM-abhängige Vorgänge wie Synaptogenese und Nozizeption, indem sie TSC2 / mTOR in diese Prozesse integriert.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Proteoglykans Biglycan und seiner Funktion als Signalmolekül in inflammatorischen und autoimmunen Prozessen. Die biologische Bedeutung der in vitro gewonnenen Ergebnisse in primären Makrophagen und dendritischen Zellen wurde durch in vivo Modelle der Pathogenvermittelten-und nicht-Pathogen-vermittelten Inflammation und der Autoimmun-Erkrankung Lupus Nephritis bestätigt. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine durch Interaktion mit Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4. Mit nucleotide-binding oligomerization like Rezeptorprotein3 (NLRP3)-,apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD (ASC)- , Caspase-1- und TLR2/4- defizienten Mäusen und verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren war es möglich in primären murinen peritonealen und Knochenmark-Makrophagen nachzuweisen, dass Biglycan die Caspase-1 NLRP3/ASC-abhängig aktivierte und damit die Prozessierung der Proform und Sekretion von reifem IL-1β induzierte. Durch Bindung an TLR2/TLR4 aktivierte Biglycan die NFκB, Erk und p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalwege und stimulierte die Expression von Interleukin-1 beta (IL-1β). Biglycan aktivierte zudem den P2X7 Rezeptor (P2X7R) in Makrophagen und ist somit in der Lage auch ohne zusätzliche Ko-Stimulation, beispielsweise durch ATP, das NLRP3 Inflammasom zu stimulieren und die Prozessierung von aktivem IL-1β anzuregen. In einem Pathogenvermittelten (Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Sepsis) wie auch –nicht-athogenvermittelten (unilaterale Uretherobstruktion, UUO) Mausmodell der Inflammation wurde die biologische Relevanz dieser Prozesses gezeigt. Die Defizienz von Biglycan ging in diesen Modellen mit verminderter Aktivierung des NLRP3/Caspase-1 Inflammasomes, geringeren Spiegeln von reifem IL-1β und geringerer Organschädigung einher. Nachdem aufgezeigt werden konnte, dass die Biglycan-Konzentrationen in Nierenbiopsien und im Plasma von Patienten mit Lupus Nephritis stark erhöht waren, wurde seine Relevanz in Immunitätsreaktionen einschließlich autoinflammatorischen Prozessen genauer untersucht. Die Effekte von Biglycan in verschiedenen Stadien der Erkrankung wurden mit der MRL-Faslpr (kurz MRL/lpr) Maus, einem etablierten Modell der Lupus Nephritis (LN) und einem dafür generierten Modell der Defizienz (Bgn-/- MRL/lpr) und Überexpression von Biglycan (hBGN MRL/lpr) analysiert. In den verschiedenen Stadien der LN nahm die Konzentration von zirkulierendem und renalem Biglycan in MRL/lpr Mäusen zu und korrelierte gleichermaßen mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Die Defizienz von Biglycan verminderte hingegen stark die renale Infiltration von Entzündungszellen, insbesondere B1-Zellen, außerdem die Zytokin-, Chemokin- und Immunglobulin-Konzentrationen und minderte die Progredienz der Niereninsuffizienz verglichen mit Lupus Mäusen gleichen Alters. In der Initialphase der Lupus Nephritis induzierte Biglycan in Mäusen, transient transgen für humanes Biglycan (hBGN MRL/lpr), vermehrte renale Zellinfiltration und Albuminurie als Zeichen nephrotischer Dysfunktion. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Produktion des stark proinflammatorischen Zytokines IL-1β in jungen Lupus Nephritis Mäusen NLRP3/Caspase-1-abhängig ist und durch Biglycan verstärkt wurde. Die Mechanismen, durch die endogenes Biglycan die Leukozyteninfiltration in Lupus Mäusen induzierte und somit inflammatorische und autoimmune Vorgänge potenzierte, wurden insbesondere an B-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Biglycan die renale Migration von einem besonderen B-Zell Subtyp, B1-Zellen, verantwortlich für die T-Zellenunabhängige Autoimmunglobulinproduktion beim LN, unterhielt. Dabei vermittelte Biglycan die Rekrutierung von B1-Zellen in die Niere durch Regulation der Expression und Synthese der B-Zell C-X-C Chemokin Ligand 13 (CXCL13) in der Niere und in residenten peritonealen Makrophagen. In vitro konnte zudem der Mechanismus aufgeklärt werden, über den Biglycan CXCL13 reguliert. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Expression und Sekretion von CXCL13 über TLR2 und TLR4. Die Daten zeigen auf, dass Biglycan als endogenes Gefahrensignal starke proinflammatorische Reaktionen hervorruft. Über Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, TLR2 und TLR4, aktiviert Biglycan des weiteren Zellen des adaptiven Immunsystems und inuziert die Rekrutierung weiterer Lymphozyten. Demnach kann postuliert werden, dass Biglycan als Brückenmolekül das anegborene und adaptive Immunsystem verbindet, und somit ein potenzielles neues „drug target“ in autoinflammatorischen, wie auch autoimmunen Vorgängen darstellt.