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Determination of the structure of complex I of Yarrowia lipolytica by single particle analysis
(2004)
Komplex I enthält ein Flavinmononukleotid sowie mindestens acht Eisen- Schwefel Zentren als redoxaktive Cofaktoren. Da ein wesentlicher Teil des mitochondrialen Genoms für Untereinheiten von Komplex I codiert, betrifft eine Vielzahl von mitochondrialen Erkrankungen diesen Enzymkomplex.
Komplex I wurde bisher aus Mitochondrien, Chloroplasten und Bakterien isoliert. Die Minimalform von Komplex I wird in Bakterien gefunden, wo er aus 14 (bzw 13 im Falle einer Genfusion) Untereinheiten besteht und eine Masse von etwa 550 kDa aufweist. Generell werden sieben hydrophile und sieben hydrophobe Untereinheiten mit über 50 vorhergesagten Transmembranhelices gefunden. Im Komplex I aus Eukaryoten wurde eine grössere Anzahl zusätzlicher, akzessorischer Untereinheiten nachgewiesen. Hier werden die sieben hydrophoben Untereinheiten vom mitochondrialen Genom codiert, während alle anderen Untereinheiten kerncodiert sind und in das Mitochondrium importiert werden müssen.
Die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica wurde als Modellsystem zur Untersuchung von eukaryotischem Komplex I etabliert. Die bisher am besten untersuchte Hefe Saccharomyces cerevisiae enthält keinen Komplex I. Hier wird die Oxidation von NADH durch eine andere Klasse von sogenannten alternativen NADH Dehydrogenasen durchgeführt. Auch Y. lipolytica enthält ein solches alternatives Enzym, das allerdings mit seiner Substratbindungsstelle zur Aussenseite der inneren Mitochondrienmembran orientiert ist. Durch molekularbiologische Manipulation konnte eine interne Version dieses Enzymes exprimiert werden, wodurch es möglich ist, letale Defekte in Komplex I Deletionsmutanten zu kompensieren. Mittlerweile wurden alle Voraussetzungen geschaffen, um kerncodierte Untereinheiten von Komplex I aus Y. lipolytica gezielt genetisch zu verändern. Die Proteinreinigung wird durch die Verwendung einer auf einem His-tag basierenden Affinitätsreinigung erheblich erleichtert...
Fourier-Transform Infrarot Differenz Spektroskopie ist eine Methode. die es erlaubt, selbst kleinste konformelle Änderungen in der Umgebung der katalytischen Zentren in Enzymen selektiv und mit hoher Zeitauflösung zu messen. Diese Technik wurde an Oxidasen von Paracoccus denitrificans, Thermus thermophilus und Escherichia coli angewandt, um einen Einblick in strukturelle und molekulare Prozesse der Bindung und Dynamik von Liganden am binuklearen Zentrum zu erhalten. Die pH- und Temperatur-Abhängigkeit von CO Schwingungsmoden sowie deren Verhalten nach der Photolyse konnten zeitaufgelöst untersucht und miteinander verglichen werden. Bei Temperaturen >180K war die Bestimmung von thermodynamischen Parametern wie Enthalpie-Barrieren und Arrhenius-Vorfaktoren möglich. Aus dem Verlauf der Rückbindungskinetiken ließen sich ferner Rückschlüsse über die konformelle Heterogenität der Bindung ziehen. Für Temperaturen um 140K konnte das Protein im "quasistationären" Zustand vermessen werden, da Rückreaktionen des Liganden an die Bindungsstelle des Häm a3 unterbunden waren. Trotz der strukturellen Ähnlichkeit und analoger Funktion zeigten diese typischen Oxidasen große Unterschiede sowohl im Reaktionszentrum als auch im kinetischen Verhalten des Liganden. Die kinetischen Parameter für alle untersuchten Oxidasen weichen deutlich voneinander ab und spiegeln unter anderem die Stärke der Bindung am CUB wider. Die Temperaturabhängigkeit der Populationen der CO-Konformere und die äquivalente Rückbindungs-Kinetik der unterschiedlichen Konformere in den Oxidasen aus dem thermophilen System weisen auf ein strukturelles Merkmal in der Nähe des binuklearen Zentrums hin, das den Populations-Austausch in anderen Oxidasen unterbindet. Aufgrund der pH-Abhängigkeit der entsprechenden Oxidasen kann man schließen, daß diese Eigenschaft durch eine oder mehrere protonierbare Gruppen bewirkt wird, die die unterschiedlichen Konformere in bestimmten Positionen fixiert hält. Die Rückbindungsraten des Liganden zeigen für die T. thermophilus Oxidasen eine Rückbindung erster Ordnung. was auf eine homogene Verteilung der zwei Konformer-Populationen im Enzym deutet. Hingegen zeigte die Oxidase aus P. denitrificans für die Rückbindung eine Verteilung der Reaktionsraten. Ursache dafür ist ein sehr heterogenes Ensemble an Proteinen, das minimale strukturelle Unterschiede im Konformationsraum des Reaktionszentrums aufweist. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Beobachtung von Absorptionsbanden der Hämpropionate an Cytochrome c Oxidase von Paracoccus denitrificans nach CO Rückbindung. Sowohl über 13C-isotopenmarkierte Hämpropionate als auch über ortsgerichtete Mutagenese in deren unmittelbarer Umgebung konnten definierte Banden-Zuordnungen im IR-Differenzspektrum erhalten werden. Experimente am Enzym mit Mutationen an der Stelle Asp 399 zeigten, daß die strukturellen Eigenschaften des Häm a3-CuB Zentrums im wesentlichen von dieser Veränderung nicht beeinflußt werden. Jedoch war die pH-Abhängigkeit der CO Konformere hier unterbunden, was auf deren Einfluß auf eine Protonierbarkeit im Wildtyp-Enzym hinweist. Rückschlüsse anhand der Mutante Asp399Asn zeigten (über den Verlust der pH-Abhängigkeit) ganz klar, daß alle unterschiedlichen CO-Konformere funktionell intakt sind. FT-IR Messungen an einem weiteren Enzym, der isolierten Cytochrom bd Oxidase aus E. coli, zeigten bei einer Untersuchung der CO Rückbindungs-Eigenschaften bei 84K die ausschließliche Rückbindung an das Häm d. der möglichen Sauerstoff-Bindungsstelle. Die Bindungsstelle an Häm b, die zu ca. 5% ebenfalls CO bindet, kann bei diesen Temperaturen nicht wiederbesetzt werden. Im typischen Spektralbereich von 1680 bis 1760 cm hoch minus 1 konnten eindeutig die Absorptionsbanden von Asparagin- oder Glutaminsäure-Seitenketten identifiziert werden. Über einen direkten Vergleich der Spektren, die über Redox-Reaktion und CO Rückbindung erhalten wurden, konnten diese Signale als klar in der direkten Umgebung des binuklearen Zentrums lokalisiert zugeordnet werden. Eine Rolle als vorübergehender Protonen-Akzeptor/Donor auf dem Weg zur Sauerstoff-Bindungsstelle ist naheliegend.
Struktur, Funktion und Dynamik von Na(+)-, H(+)-Antiportern : eine infrarotspektroskopische Studie
(2008)
Die Funktion von Membranproteinen ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Um diese verstehen zu können, ist das Verständnis der Beziehungen zwischen der Struktur, der Dynamik und der Wechselwirkung mit der Umgebung der Membranproteine notwendig. Spektroskopische Methoden, wie beispielsweise FTIR- und CD-Spektroskopie sind in der Lage, diese Informationen zu geben. In der vorliegenden Dissertation haben sie bedeutende Beiträge zum Verständnis der durch die Aktivierung induzierten Konformationsänderungen der Na+/H+ Antiporter geleistet. Die hohe Empfindlichkeit einer selbstkonstruierten FTIR-ATR-Perfusionszelle ermöglichte es, über eine Proteinprobe verschiedene Wirkstoffmoleküle perfundieren zu lassen und die dadurch verursachten strukturellen Änderungen spektroskopisch zu charakterisieren. Die Konformationsänderungen, die den Aktivierungsprozess begleiten, wurden bei zwei verschiedenen Na+/H+ Antiportern, NhaA und MjNhaP1, untersucht. Sie werden bei unterschiedlichen pH-Bereichen aktiviert bzw. deaktiviert. Der Na+/H+ Antiporter NhaA aus E. coli hat seine maximale Transportaktivität bei pH 8,5 und ist bei pH < 6,5 vollständig inaktiv. Trotz bekannter 3D-Struktur dieses Proteins für die inaktive Konformation bei pH 4 bleiben die Konformationsänderungen, die mit der Aktivierung des Proteins einhergehen, immer noch ungeklärt. Die Analyse der FTIR- und CD-Spektren von NhaA ergab in beiden Zuständen Anteile an beta-Faltblatt, an Schleifen und ungeordneten Strukturen, wobei die alpha-helikale Struktur dominiert. Die FTIR Spektren des inaktiven und aktiven Zustands zeigen zwei Komponenten, die auf die Präsenz zweier alpha-Helices mit unterschiedlichen Eigenschaften abhängig vom Aktivitätszustand hindeuteten. Die temperaturinduzierten strukturellen Änderungen und die Reorganisation des Proteins während des Entfaltungsprozesses bestätigten, dass die Aktivierung des Proteins eine Änderung in den Eigenschaften der alpha-Helices zur Folge hat. Aktivierung führt zu einer thermischen Destabilisierung dieser Struktur. Auch für die beta-Faltblattstruktur, welche den Hauptkontakt zwischen den Monomeren bildet, wurde ein unterschiedliches thermisches Verhalten zwischen dem inaktiven und aktiven Zustand beobachtet. Daraus konnte gefolgert werden, dass Aktivität nur dann möglich ist, wenn NhaA als Dimer vorliegt. Die Ergebnisse des (1)H/(2)H Austauschs zeigen, dass die Lösungsmittelzugänglichkeit des Proteins sich mit der Aktivierung ändert. Die Aktivierung des Proteins induziert eine offene, für die Lösung zugänglichere Konformation, in welcher die Aminosäureseitenketten in der hydrophilen Region des Proteins schneller Wasserstoff durch Deuterium austauschen, und in welcher zusätzliche Aminosäureseitenketten, die sich im inaktiven Zustand in der hydrophoben Region des Proteins befinden, mit der Aktivierung der Lösung exponiert werden. Die Aufnahme reaktionsinduzierter Differenzspektren ergab eindeutige spektroskopische Signaturen für die Zustände „inaktiv“ und „aktiv“. Die Differenzspektren der pH-Titration zeigten, dass der pH-Wert einen dramatischen Effekt sowohl auf die Sekundärstruktur als auch auf den Protonierungszustand der Aminosäureseitenketten hat. Die pH- und Na+-induzierte Aktivierung des Proteins führt zur Umwandlung der transmembranen alpha-helikalen Struktur bezüglich Länge, Ordnungsgrad und/oder Anordnung und zur einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Glutaminsäure oder Asparaginsäure. Die pD induzierten Sekundärstrukturänderungen lieferten zusätzlich Informationen über die Umgebungsänderung der Aminosäureseitenkette des Tyrosins mit der Aktivierung. Der Vergleich der durch die Bindung des Natriums und des Inhibitors induzierten Differenzspektren zeigte, dass die Bindungsstellen des Natriums und des Inhibitors unterschiedlich sind. Die FTIR- und CD-Ergebnisse für den Na+/H+ Antiporter MjNhaP1 aus M. jannaschii, der im Gegensatz zu NhaA bei pH 6 aktiv und bei pH Werten > 8 inaktiv ist, zeigten, dass ähnlich wie NhaA das Protein im aktiven Zustand bei pH 6 hauptsächlich aus alpha-Helices aufgebaut ist. Es bestand die Möglichkeit, zwei verschiedene Probenpräparationen (Protein in Detergenz bzw. in 2D-Kristallen) zu untersuchen und miteinander zu vergleichen. Die Erhöhung des pH-Werts bei der in Detergenz solubilisierten Probe führte zu einer Abnahme der alpha-helikalen und einer Zunahme der ungeordneten Strukturen. Das äußerte sich auch in den Untersuchungen zur thermischen Stabilität und im (1)H/(2)H Austauschexperiment. Die thermische Stabilität der alpha-Helices nahm mit der Inaktivierung dramatisch ab. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass bei der Aktivierung von MjNhaP1 die beta-Faltblattstruktur nicht involviert ist, aber diese von fundamentaler Bedeutung für die Gesamtstabilität des Proteins und wahrscheinlich für den Hauptkontakt zwischen den Monomeren verantwortlich ist. Im Gegensatz zu NhaA ist die Monomer Monomer Wechselwirkung nicht für die Aktivität von MjNhaP1 notwendig. Aufgrund des höheren Anteils von ungeordneter Struktur im inaktiven Zustand der in Detergenz solubilisierten Probe beobachtet man in diesem Zustand einen höheren (1)H/(2)H Austausch. Der Vergleich mit den Ergebnissen des (1)H/(2)H Austausches von 2D-Kristallen ermöglichte die Lokalisation der ungeordneten Struktur an der Außenseite des Proteinmoleküls im inaktiven Zustand. Die pH-induzierten Differenzspektren zeigten, dass die Aktivierung zu einer Helikalisierung des Proteins und einer Protonierungsänderung der Aminosäureseitenketten von Asparaginsäure und/oder Glutaminsäure unabhängig von der Probenpräparation führt. Der Vergleich von NhaA und MjNhaP1 zeigt, dass die Aktivierung in beiden Fällen mit einer Konformationsänderung und Änderung der Protonierung oder der Umgebung von einer oder mehreren Seitenketten von Asparaginsäure oder Glutaminsäure verbunden ist. Dabei sind die Strukturänderungen der beiden Proteine während der Aktivierung ähnlich, bei Inaktivierung jedoch deutlich unterscheidbar. Die pH-induzierten Strukturänderungen wurden bei NhaA und MjNhaP1 durch die Mutanten G338S und R347A, die keine pH-Abhängigkeit der Aktivität zeigen, bestätigt.
Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
Im ersten Teil dieser Arbeit sind Protein-Protein Docking-Studien dokumentiert. Bis heute konnten die meisten Protein-Komplex-Strukturen nicht experimentell aufgeklärt werden, so auch die beiden oben genannten Elektrontransfer-Komplexe. Nach einem erfolgreichen Test wurden verschiedene Cytochrom c Oxidase:Cytochrom c Paare mit der gleichen Methode gedockt: COX aus Paracoccus denitrificans mit Pferdeherz Cytochrom c und COX mit dem löslichen Fragment des membrangebundenen Cytochrom C552 (beide aus P. denitrificans). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die diffusive Annäherung des Cytochrom c an die Cytochrom c Qxidase mit der Brownschen Dynamik Methode simuliert. Die Diffusionsbewegung eines Brownschen Teilchens in wässriger Lösung wird durch die Langevin-Gleichung bestimmt. Der auf dieser Gleichung fußende Ermak-McCammon-Algorithmus ist Grundlage der Simulationsmethode. Die so ermittelten Raten für COX und Pferdeherz, sowie für COX und Cytochrom C552, wurden dann mit experimentell gewonnenen Raten verglichen. Da die Elektrostatik für den Annäherungsprozeß dieser Proteine eine so gewichtige Rolle spielt, wirken sich Mutationen, die mit einer Ladungsänderung einhergehen, merklich aus. Dies ist vor allem dann der Fall, wenn sich die Mutation in der Nähe der Bindungsstelle befindet. Aus dem gleichen Grund ist die Assoziationsrate auch stark von der Ionenstärke der umgebenden Lösung abhängig. Steigt die Ionenkonzentration wird die elektrostatische Komplementarität der Bindingsstellen der beiden Makromoleküle stärker abgeschirmt, und die Rate sinkt. Diese beiden relativen Trends konnten durch die Simulationen gut reproduziert und bestätigt werden. Allerdings liegen die absoluten Resultate merklich über den experimentell gemessenen Raten. Es ist sehr gut möglich, daß post-diffusive Effekte, die nicht in einer Brownschen Dynamik Simulation von starren Körpern berücksichtigt werden können, die Raten erniedrigen. Um den Einfluß der Membranumgebung auf die Wechselwirkung des Elektrontransportsystems zu untersuchen. wurde eine DPPC Doppelschicht um die Oxidase modelliert und energieminimiert. Mit Poisson-Boltzmann Rechnungen wurde das elektrostatische Potential dieses Nanosystems untersucht und mit dem der einzelnen Oxidase verglichen. Durch einen modifizierten Set-up konnten dann auch für dieses Membransystem Brownsche Dynamik Simulationen durchgeführt werden. Der Vergleich mit den vorhergehenden Simulationen ohne Membran erbrachte bemerkenswerte Ergebnisse. Während die Assoziationsraten für Pferdeherz Cytochrom c durch den Membraneinfluß erniedrigt wurden, stiegen sie im Fall des physiologischen Transferpartners c552. Pferdeherz Cytochrom c weist eine positive Nettoladung und einen ausgeprägten bipolaren Charakter auf. Eine große Zahl positiv geladener Seitenketten befindet sich auf der gleichen Hemisphäre wie die Bindungsstelle. Obwohl die DPPC Lipidmoleküle neutral sind, zeigten die Elektrostatikrechnungen, daß die Membranoberfläche abstoßend auf positive Ladungen wirkt. Da sich nun die Bindungsstelle der Oxidase für Cytochrom c nur etwa 10 Å oberhalb der Membran befindet, verringert sich die Wahrscheinlichkeit der Assoziation.
Results were presented from Brownian dynamics simulations for cyt c molecules approximated as spherical particles with diameter 2R ' 3.3 nm interacting with a charged planar membrane surface. Using the well-known Ermak-McCammon algorithm of ref. [36, 37] for solving the Langevin equations (see Chapter 2), a new computer program in C++ was developed. An overview of the way it is implemented is given in Chapter 3. The program in its current state is able to compute the trajectories (translation and rotation) of hundreds of spherical particles in systems with typical dimensions of 103 − 1003 nm3 . As explained in the introductory Chapter 1 the motivation for studying the dynamics of cyt c molecules in such systems came from the progress in the research of photosynthetic bacteria, e.g. While the internal processes of energy transduction (light harvesting, channelling to RC, charge separation) are quite well understood, the dynamics of soluble cyt c as an electron transporter in this context is not yet clear. In many textbooks one can find illustrations where a single cyt c is responsible for the electron transport between two integral membrane proteins (the reaction centre RC and the bc1 complex). But as pointed out in publications like refs. [49], [59], [60], [61] or [62] biological cells are crowded with different molecules. Consequently, one can assume that the electron transport between two integral membrane proteins is not simply taken on by one single cyt c molecule. Instead it is likely that many of these particles are located in a cyt c pool above the membrane and that they perform the electron transport in turns. Thus, it is desirable to have a simulation package that is able to compute the trajectories of many proteins. Note that the detailed processes of electron transfer and binding to membrane proteins are not modelled here. The details of these processes are quite complicated so that we refrained from including them in the coarse-grained simulations. Here, the actual binding is simply defined by a particle distance zb from the membrane which marks the beginning of the attractive potential. ...
In this study, the structural and functional properties of the Na+/Betaine symporter BetP were investigated upon K+-induced activation. BetP regulates transport activity dependent on the amount of associated anionic lipids and the cytoplasmic K+-concentration. For this purpose, FTIR spectroscopy was implemented as a non-perturbing biophysical method which shed light on how the membrane lipids contribute to the molecular mechanisms of activation and regulatory response of BetP.
The enzyme quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic e-proteobacterium Wolinella succinogenes is part of the anaerobic respiratory system of this organism. It couples the reduction of fumarate to succinate to the oxidation of menaquinol to menaquinone. W. succinogenes uses fumarate as terminal electron acceptor and can use various substrates (e.g., formate or molecular hydrogen) as electron donors. The concerted catalytic substrate turnover of either a hydrogenase or a formate dehydrogenase in conjunction with QFR contributes to the generation of an electrochemical potential gradient across the bacterial plasma membrane, which is used for the phosphorylation of ADP with inorganic phosphate, Pi, to ATP. In addition to an FAD (in subunit A) and three iron-sulfur clusters (in subunit B), QFR binds a low- and a high-potential heme b group in its transmembrane subunit C, as was ultimately shown in the crystal structure at 2.2 Å resolution (Lancaster et al., 1999, Nature 402, 377– 385). Both hemes are part of the electron transport chain between the two catalytic sites of this redox enzyme. The midpoint potentials of the hemes are well established but their assignment to the distal and proximal positions in the structure had not yet been determined. Furthermore, QFR from W. succinogenes has been proposed to exhibit a novel coupling mechanism of transmembrane electron and proton transfer, which has been described in the so-called “E-pathway” hypothesis (Lancaster, 2002, Biochim. Biophys. Acta 1565, 215–231). The aim of this project was to characterize the relationship between structure and function of QFR and to investigate the details of the proposed coupling mechanism (“Epathway”) with the help of computer-based electrostatic calculations on the QFR wild-type (WT) coordinates, and electrochemically induced FTIR and VIS difference spectroscopy on the QFR WT and available variant enzymes (in particular enzyme variant E180Q, in which the glutamic acid at position C180 has been replaced by a glutamine). 1.) It was demonstrated in this study that the diheme-containing QFR exhibits stable and reproducible electrochemically induced FTIR difference bands in the midinfrared range from 1800 cm-1 to 1000 cm-1 that reflect transitions from the reduced to the oxidized state of the enzyme. The spectral features that were observed in the FTIR difference spectra are fully reversible when changing from a reductive to an oxidative reference potential at the working electrode and vice versa. This indicates that the underlying redox reactions of the enzyme at the gold grid working electrode are also fully reversible under the applied experimental conditions. The same reversible spectral redox behavior in the visible range could also be ascertained for the Soret- and a-band of the two heme b groups of QFR. This behavior allowed to reliably determine the heme b midpoint potentials of QFR at various pH values. Analysis of the FTIR difference spectra in the amide I range yields evidence for structural reorganizations of the polypeptide backbone upon the electrochemically induced redox reaction. 2.) The redox titrations of the high- and low-potential heme b of QFR as simulated by multiconformation continuum electrostatics (MCCE) calculations showed a very high level of agreement with respect to the experimentally observed midpoint potentials of the heme b groups at pH 7. As determined with the help of the theoretical calculations, prominent features governing the differences in redox potential between the two hemes are the higher loss of reaction field energy for the proximal heme and the stronger destabilization of the oxidized form of the proximal heme due to several buried and ionized Arg and Lys residues. The explicit incorporation of crystallographically identified water molecules in the calculations had a noticeable effect on the absolute values of the determined midpoint potentials, although the relative difference of the two obtained midpoints did not change significantly. The results of the electrostatic calculations clearly showed that the lowpotential heme corresponds to the distal position bD in the structure, and that the high-potential heme is identical to the proximal heme bP. This assignment could previously not be achieved unequivocally with experimental methods. 3.) In addition, the currently discussed mechanism of coupled electron and proton transfer in the QFR of W. succinogenes (i.e., the “E-pathway” hypothesis) is further supported by the results of this study. The simulations of intermediate states of electron transfer via the heme b groups show that the protonation state of the key amino acid residue Glu C180 depends on the redox states of the heme groups as suggested in the “E-pathway” hypothesis. This result yields a possible mechanism for the coupling of transient transmembrane proton transfer via Glu C180 to the electron transfer via the heme b groups, since Glu C180 could be part of a “proton wire” and its redox-dependent protonation state could serve as the regulatory element of the “E-pathway”. Furthermore, the results of simulated heme reduction indicate that the side chain of Glu C180 also changes its conformation with respect to the redox state of the hemes. Both major results concerning the role of Glu C180, the change of protonation as well as the reorientation of the side chain upon reduction of the heme groups, are consistent with the results from electrochemically induced FTIR difference spectroscopy: Of particular interest was the spectral range above 1710 cm-1, where C=O stretching vibrations of protonated COOH carboxyl groups absorb, because those groups can act as proton donors, respectively acceptors, and can be involved in intra-protein proton transfer reactions. It was possible to observe signals of such protonated carboxyl groups originating from QFR enzyme, which either change their protonation state and/or experience an environmental change in the course of the induced redox reaction. This finding was supported by the fact that the relevant FTIR difference signals are sensitive to an isotopic hydrogen/deuterium (1H/2H) exchange via the buffer solution, since they were shifted towards lower wavenumbers in D2O. Furthermore, it could be shown with the help of site-directed mutagenesis that the acidic residue Glu C180, which is located in the membranespanning, diheme-containing subunit C of QFR, is contributing to the redox dependent signal of protonated carboxyl groups. The observed residual signal in the FTIR double-difference spectrum of QFR wild-type and enzyme variant E180Q (Glu C180 has been replaced with a Gln residue) could be interpreted as a protonation/deprotonation event that is superimposed by an environmental effect on the specific C=O vibration. This result strongly supports the proposed “E-pathway” of coupled transmembrane electron and proton transfer in the QFR enzyme, which states that residue Glu C180 is an essential constituent of a transient redox-controlled transmembrane proton transfer pathway. 4.) As a second possible constituent of the suggested “E-pathway”, the ring C propionate of the distal heme was found to be unusually fully protonated in all simulated redox states, indicating a possible role as a transient proton donor/acceptor in the “E-pathway”. Similarly to Glu C180, experimental evidence from FTIR difference spectroscopy on a modified QFR with 13C-labeled heme propionates was obtained, which indicates an involvement of at least one of the two propionates of heme bD in proton transfer. The observed signals can tentatively be interpreted as a redox-coupled (de)protonation of the ring C propionate of bD, which is possibly xiii superimposed by a conformational or environmental change of the specific propionate. 5.) Also the observation of a strong redox Bohr effect for both heme b groups in QFR is in line with the proposed “E-pathway” hypothesis, as this effect yields a possible and well-established mechanism for the coupling of proton transfer and redox changes of the heme groups. The comparison of the observed effect in QFR WT and E180Q together with the results from FTIR spectroscopy and MCCE calculation indicate that the ring C propionate of the distal heme is dominating the pHdependence of the midpoint potential of bD, and that the corresponding group for bP is Glu C180. The origin of the redox Bohr effect for bP in the enzyme variant E180Q (which is dramatically changed with respect to the WT) could not be identified unequivocally, but the observation of this redox Bohr effect in the variant implies the presence of other protolytic groups, which interact with heme bP and which may be necessary for a functional “E-pathway”.
Validierung einer neuen Messmethode zur direkten Bestimmung der Heparin-Konzentration im Blut
(2012)
In dieser Arbeit wurde ein neues Verfahren zur Heparin-Bestimmung (LiSA-H, light scattering assay of heparin) evaluiert. Dieses wurde an der Universität Frankfurt a. M. am Institut für Biophysik entwickelt und ermittelt erstmals die direkte Heparin-Konzentration im Blutplasma. Durch die Analyse der Lichtstreuung einer Plasmaprobe wird die Bildung von Nanopartikeln aus Heparin und Protamin verfolgt. Die Lichtstreuintensität ist dabei proportional zu der in der Probe enthaltenen Heparin-Plasmakonzentration (Heparin-PK). Das Antikoagulans Heparin wird bei Herz-OPs mit Einsatz der Herz-Lungen-Maschine (HLM) verwendet und soll perioperativ eine lutgerinnselbildung in der HLM, sowie Thromboembolien im Patienten verhindern. Am OP-Ende wird die Wirkung durch Protamin antagonisiert, um eine suffiziente Gerinnung wieder herzustellen. Das derzeitige Gerinnungsmanagement basiert auf einem indirekten Messverfahren, der ACT (activated clotting time), welches starken Störeinflüssen, wie z.B. der Hypothermie, Hämodilution und bestimmten Medikamenten unterliegt. Durch die mögliche Falschdosierung der beiden Medikamente, steigt die Gefahr einer Blutung und Thrombose. LiSA-H soll in Zukunft eine zuverlässigere und kostengünstige „point of care― Analyse der Gerinnung und hierdurch eine gezielte Dosierung von Heparin und Protamin ermöglichen, die die Komplikationsrate verringert. In der vorliegenden Studie handelt es sich um eine offene, nicht kontrollierte, prospektive Multicenter-Studie, die mit 50 Patienten am Universitätsklinikum Frankfurt a.M. und 30 Patienten am Kinderherzzentrum Gießen durchgeführt wurde. Es wurde gezeigt, dass die durchschnittliche perioperative Heparin-PK bei Erwachsenen und Kindern bei ca. 5,4 I.E./ml liegt. Es wurde nachgewiesen, dass die Heparin-Clearance bei Kindern (~113 Min.) um das zweifache im Vergleich zu Erwachsenen (~254 Min.), erhöht ist. Besonders hervorzuheben ist die hohe Fehlerquote der ACT-Messung, die bei Erwachsenen in bis zu 1,8 % und bei Kindern in bis zu 20 % der Messungen keinen aussagekräftigen Wert lieferte. Das bedeutet, dass bei Kindern während einer OP bis zu zwei und bei Erwachsenen bis zu drei Stunden keine Information über den aktuellen Gerinnungszustand vorlag. Um eine Validierung der Messergebnisse vorzunehmen, wurden Rückstellproben mit dem Standardlaborverfahren PiCT (Prothrombinase induced clotting time) gemessen. Die Daten aus dem PiCT korrelieren mit den Ergebnissen aus der LiSA-H-Messung wesentlich besser (r² = 0,80), als mit der herkömmlichen ACT-Messmethode (r² = 0,57). Die ermittelten Heparin-PK und die ACT-Werte während einer OP wurden in Chronogrammen dargestellt. Es wurde gezeigt, dass in 30 % der OPs bei Erwachsenen und in 60 % bei Kindern die Messdaten aus der ACT und LiSA-H nur unzureichend synchron bei Nachdosierung mit Heparin anstiegen oder entsprechend der Heparin-Clearance im OP-Verlauf abfielen. Dies zeigte sich besonders kritisch während langandauernder, komplikationsreicher OPs, die einen erhöhten Blutverlust oder sogar Rethorakotomien nach sich zogen, in denen der ACT-Wert eine suffiziente Gerinnung nahe legte, die LiSA-HMessung aber eine noch hohe Heparin-PK nachwies. Erfahrungen aus den klinischen Studien zeigten, dass die Kombination aus der Messung der Heparin-PK und einer Gerinnungsanalyse bei einem ATIII-Mangel von Vorteil ist. Erst die Kombination aus einerseits mehrfach niedrig gemessener ACT-Werte, trotz ggf. Nachdosierungen von Heparin und andererseits ausreichend gemessener Heparin-PK im LiSA-H, kann einen ATIII-Mangelzustand aufdecken. Dadurch können Nach- bzw. Überdosierungen vermieden und damit die Wahrscheinlichkeit für postoperative Komplikationen verringert werden. Der wichtigste Einflussfaktor auf die LiSA-H-Messung ist die Hämodilution, die durch Einbeziehung des Patienten-Blutvolumens (z.B. mit der Nadler-Formel) durch mathematische Korrektur berücksichtigt werden kann. Patientenindividuelle Reaktionen auf gleiche Heparin- und Protamin-Dosierungen sowie eine patientenspezifische Heparin-Clearance zeigten in diesen Studien auf, dass das derzeitige Antikoagulationsmanagement mit den Dosierungsempfehlungen (Körpergewichtsbezogene Dosierung, 1:1 Dosierung von Protamin zur initialen Heparin-Dosis oder der summierten Heparin-Dosis, „pauschale― Nachdosierungen von 5.000 oder 10.000 I.E. Heparin bei ACT < 480) für eine optimale Dosierung der Medikamente unzureichend ist. In Outcome-Studien soll mit der LiSA-H-Messung Dosierungsempfehlungen von Heparin und Protamin ausgearbeitet werden. Außerhalb der Herz-Thorax-Chirurgie eröffnen sich weitere Möglichkeiten, wie z.B. in Dialysezentren und in der Neurochirurgie, für die bereits Studien geplant sind.
In dieser Arbeit wurde eine Messmethode entwickelt, die es ermöglicht, mittels Infrarotspektroskopie quantitative Aussagen über bestimmte Inhaltsstoffe in Körperflüssigkeiten zu machen. Hierfür wurden sowohl selektierte Blutplasma- und Vollblutproben gemessen als auch selektierte Urinproben. Die richtige Selektion des Probensatzes ist von großer Wichtigkeit, um für jede Komponente eine große, unabhängige Varianz der Absorptionswerte zu erhalten. Hierfür wurden sowohl physiologische als auch pathologische Proben in den Datensatz integriert. Um Referenzwerte für diese ausgewählten Proben zu erhalten, wurden konventionelle klinische Methoden verwendet. Grundsätzlich ist die Genauigkeit dieser Methode durch die Genauigkeit der jeweiligen Referenzmethode, also den konventionellen klinischen Methoden, beschränkt. Mit der neu entwickelten Methode besteht nun die Möglichkeit, die wichtigsten Parameter im Blut und Urin schnell, einfach und reagenzienfrei quantitativ zu bestimmen. Zusätzlich zu den in dieser Arbeit angegebenen Inhaltsstoffen ist es möglich, für weitere Komponenten oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts quantitative Angaben zu machen. Hierbei könnten z.B. für Albumin oder Glukose im Urin pathologische Proben identifiziert werden und somit Rückschlüsse auf bestimmte Krankheitsbilder ermöglicht werden. ...