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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung einer spektroskopischen Methode für die medizinische Diagnostik und zielt auf die Einführung neuer analytischer Methoden in die klinische Praxis, die eine höhere Qualität bei der Behandlung von Patienten sowie eine Kostensenkung versprechen. Es wird eine reagenzienfreie infrarotspektroskopische Messmethode vorgestellt, mit der die Konzentrationen bestimmter Inhaltsstoffe von Körper- und anderen Flüssigkeiten quantitativ bestimmt werden können. Dabei kommt das kommerzielle FTIR- (Fourier-Transform Infrarot-) Spektrometer ALPHA der Firma Bruker zum Einsatz, für das eine spezielle ATR- (Abgeschwächte Totalreflexion) Messzelle konstruiert wurde. Diese eignet sich sowohl für Durchflussmessungen bei Volumenströmen von bis zu 1 l/min als auch für diskrete Proben mit einem minimalen Volumen von 10 µl. Die Kombination aus Spektrometer und Messzelle stellt somit ein kompaktes Messgerät dar, das zur Steuerung und Auswertung lediglich einen Computer benötigt und dessen Stabilität ebenfalls Langzeitmessungen erlaubt. Es stellt damit eine Basis für ein neuartiges Medizingerät dar, das auch außerhalb der Laborumgebung und insbesondere in der klinischen Routine von ungeschultem Personal eingesetzt werden kann.
Die quantitative Auswertung der Spektren erfolgt mittels multivariater Kalibrierung und PLS (Partial Least Squares) Regression. Dabei werden für die unterschiedlichen Inhaltsstoffe entsprechende Kalibriermodelle verwendet, die aus einer Reihe sorgfältig ausgewählter Proben erstellt wurden. Die Auswahl bezieht sich dabei vor allem auf einen breiten Konzentrationsbereich und auf möglichst unabhängig voneinander schwankende Konzentrationswerte der Inhaltsstoffe. Es wurden daher sowohl Proben im physiologischen als auch im pathologischen Bereich verwendet. Da die Konzentrationswerte der Kalibrierproben bekannt sein müssen, wurden die Proben mittels konventioneller klinischer Methoden analysiert. Die Genauigkeit dieser Referenzanalytik begrenzt dabei die maximale Genauigkeit der vorgestellten Methode.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Kalibriermodelle für die Inhaltsstoffe Glucose, Harnstoff, Creatinin und Lactat in der Waschlösung bei der Hämodialyse (Dialysat) sowie für die Inhaltsstoffe Glucose, Harnstoff, Cholesterol, Triacylglyceride, Albumin und Gesamtprotein in Vollblut und ebenso für Hämoglobin und Immunglobulin G in hämolysiertem Vollblut erstellt. Im Fall von Dialysat wurden hierfür sowohl künstlich erstellte sowie auch bei realen Dialysebehandlungen von Patienten entnommene Proben verwendet. Für Vollblut wurden bestehende Spektren an das neue Messgerät angepasst und durch Spektren neuer Blutproben erweitert. Die hiermit erreichte Genauigkeit und Präzision genügt in den meisten Fällen bereits klinischen Ansprüchen.
Für Dialysat wird gezeigt, dass mit dem vorgestellten Aufbau bereits kontinuierliche inline-Messungen direkt am Patienten möglich sind und gute Ergebnisse liefern. Dabei wurde sowohl auf eine einfache Anwendbarkeit während der Dialysebehandlung als auch auf eine einfache Bedienung mittels der vorgestellten Software geachtet. Das Gerät lässt sich somit problemlos in den klinischen Alltag integrieren und bietet aufgrund der Reagenzienfreiheit eine kostengünstige Methode zur kontinuierlichen und regelmäßigen Überwachung der Behandlungsverläufe.
Im Fall von Vollblut wird gezeigt, dass Messungen mit einer Probenmenge von 10 µl beispielsweise aus der Fingerbeere prinzipiell möglich sind und ebenfalls reproduzierbare Ergebnisse liefern. Damit steht eine präzise, einfache, kompakte und betriebskostengünstige Methode zur Verfügung, um in kurzer Zeit wichtige Blutparameter quantitativ bestimmen zu können.
Das kompakte und reagenzienfreie Messsystem erlaubt eine Vielzahl von Anwendungen, die insbesondere von den schnellen Analyseergebnissen und den geringen Verbrauchskosten profitieren. Beispielsweise beim Blutspendedienst, beim Hausarzt oder in Seniorenheimen kann die schnelle und einfache Ermittlung der hier untersuchten Blutparameter zur ersten Beurteilung des Patienten dienen und damit die Diagnose erleichtern. Der hohe Probendurchsatz und die vernachlässigbaren Betriebskosten führen in diesem Fall zu einer schnellen Amortisierung der Anschaffungskosten. Auch in Apotheken kann mit einem derartigen System ein erweiterter Service für Kunden angeboten werden.
Aufgrund des geringen Probenvolumens kommt das Messsystem ebenfalls für Anwendungen im Versuchstierbereich in Frage, beispielsweise für die Untersuchung von Mäuseblut in der German Mouse Clinic am Helmholtz Zentrum München. Die der Maus zu entnehmende Blutmenge und damit die Belastung des Tieres kann hierdurch erheblich reduziert werden.
Die Kompaktheit dieses universellen Systems erlaubt es weiterhin, eine Vielzahl anderer Flüssigkeiten zu untersuchen, die bereits erfolgreich infrarotspektroskopisch analysiert wurden. Dazu gehört unter anderem Urin, Bier und Wein.
In der Arbeit wird abschließend ebenfalls gezeigt, dass der Einsatz abstimmbarer Quantenkaskadenlaser zusammen mit der ATR-Technik prinzipiell die Möglichkeit eröffnet, die aufwändigen und teuren FTIR-Spektrometer zu ersetzen. Langfristig ist sowohl mit einer Verkleinerung des Aufbaus als auch mit einem Sinken des derzeit noch sehr hohen Anschaffungspreises zu rechnen. Der bereits verfügbare Abstimmbereich genügt zur Bestimmung der Glucosekonzentration. Eine Erweiterung, beispielsweise durch die Verwendung mehrerer Quantenkaskadenlaser mit unterschiedlichem Abstimmbereich, ermöglicht die Untersuchung weiterer Parameter.
Heparin wird als gerinnungshemmendes Medikament in vielen Bereichen eingesetzt: in niedriger Dosierung wird es vor allem zur Thromboseprophylaxe verwendet, in höheren Konzentrationen kommt es zum Beispiel in der Hämodialyse oder bei herzchirurgischen Eingriffen unter Verwendung der Herz-Lungen-Maschine zum Einsatz, um ein Gerinnen des Patientenblutes zu verhindern. Obwohl Heparin schon seit vielen Jahrzehnten eingesetzt wird, fehlt bis heute eine Methode, mit der sich die Heparin-Konzentration einfach, schnell und kostengünstig während des OP-Verlaufs bestimmen lässt. Vielmehr wird der Zustand des Patientenblutes über Gerinnungsverfahren eingeschätzt, die nur indirekt abhängig von Heparin sind und die von vielen Parametern beeinflusst werden. Eine Überwachung des Heparinspiegels ist mit diesen Methoden nicht möglich. Ein weiteres Problem ergibt sich, wenn am Ende des Eingriffs die normale Blutgerinnung wiederhergestellt werden soll. Zu diesem Zweck wird Protamin verabreicht, welches das im Patientenblut zirkulierende Heparin binden und damit dessen gerinnungshemmende Wirkung neutralisieren soll. Die Verabreichung des Protamins geschieht jedoch nicht, wie es idealerweise wäre, entsprechend der aktuellen Heparin-Konzentration, da derzeit kein Heparin-Messverfahren existiert. Dies kann eine fehlerhafte Heparin-Neutralisierung zur Folge haben, welche mit weitreichenden Nebenwirkungen, vor allem einer erhöhten Blutungsgefahr, verbunden ist.
Aufgrund dieser Problematik wurde eine streulichtphotometrische Methode (LiSA-H) entwickelt, mit dem die Bestimmung der Heparin-Konzentration einer Patientenprobe während chirurgischen Eingriffen möglich ist. Diese basiert auf der Messung der Intensität des an Heparin-Protamin-Nanopartikeln gestreuten Lichts. Diese Nanopartikel bilden sich, sobald Protamin einer Lösung mit Heparin, z.B. heparinisiertes Blutplasma, zugegeben wird.
Mit Hilfe von analytischer Ultrazentrifugation sowie Rasterkraftmikroskop-Aufnahmen konnten die Größe und die Größenverteilung der Heparin-Protamin-Partikel charakterisiert werden. Beide Methoden zeigten gut übereinstimmende Ergebnisse und lieferten Partikeldurchmesser von etwa 70 – 200 nm.
Um den Prozess der Messung zu optimieren, wurde nach Filtrationsmethoden gesucht, um den zeit- und arbeitsaufwendigen Zentrifugationsschritt zu vermeiden. Dazu wurden Filtermembranen aus verschiedenen Materialien und mit unterschiedlichen Porengrößen getestet, die eine Plasmagewinnung durch Filtration von Vollblut ermöglichen sollten. Leider war dies mit den getesteten Filtersystemen nicht möglich. Dies bleibt jedoch ein aktuelles Thema und wird weiterhin untersucht werden.
Zusätzlich zu der streulichtbasierten Messmethode konnte gezeigt werden, dass über fluoreszenzspektroskopische Methoden die Bestimmung kleiner Heparin-Konzentrationen möglich ist. Dafür wurde Protaminsulfat mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und die Erniedrigung der Emissionsintensität des fluoreszierenden Protamins nach Zugabe von Heparin beobachtet. Aus dem Grad dieser Intensitätsabnahme lässt sich auf die Heparin-Konzentration schließen. Diese Methode wäre hervorragend dafür geeignet, das streulichtbasierte Verfahren zu ergänzen, das im niedrigen Konzentrationsbereich zunehmend unempfindlich wird. Hierfür müssen jedoch noch einige Messungen durchgeführt werden, um zu zeigen, ob eine Messung auch von Plasma- oder sogar Vollblutproben möglich ist.
Es wurde ein klinischer Prototyp entwickelt, der die Bestimmung der Heparin-Konzentration in einer Blutplasmaprobe während chirurgischer Eingriffe ermöglicht. Dabei wird eine LED mit einem Emissionsmaximum bei 627 nm verwendet und die Streulichtintensität zur Bestimmung der Anzahl und der Größe der Heparin-Protamin-Partikel genutzt. Die Steuerung der Messung sowie die Auswertung der Messdaten werden mit einem Netbook und eigens dafür neu entwickelter Software realisiert. Mit diesem Prototyp lässt sich reproduzierbar aus der Änderung der Streulichtintensität einer Blutplasmaprobe nach Protaminzugabe innerhalb weniger Minuten deren Heparin-Konzentration bestimmen. Es wurde eine Kalibrierfunktion erstellt, mit der es möglich ist, aus der Streulichtintensität die Heparin-Konzentration zu berechnen.
Eine erste Studie im Universitätsklinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt a.M., bei der bei 50 herzchirurgischen Eingriffen unter Verwendung der Herz-Lungen-Maschine parallel zur üblichen Gerinnungsmessung eine Heparin-Bestimmung mit dem neuen Heparin-Assay erfolgte, zeigte, dass es mit diesem Verfahren möglich ist, im OP-Verlauf die Heparin-Konzentration im Patientenblut zu ermitteln. Daraus konnten schließlich weitere Informationen wie die individuelle Geschwindigkeit des Heparin-Abbaus erhalten werden.
Eine zweite Studie in der Kinderkardiologie des Universitätsklinikums Gießen, deren Ergebnisse statistisch noch nicht vollständig ausgewertet sind, wurde ebenfalls mit Erfolg abgeschlossen. Die vorläufigen Ergebnisse zeigten hier, dass sich die Heparin-Abbaukinetik bei Erwachsenen und Kindern deutlich unterscheidet. Zudem zeigte sich, dass die gemessene Gerinnungszeit bei Kindern wesentlich schlechter (nur 30 % der Fälle) mit der gemessenen Heparin-Konzentration korreliert als bei Erwachsenen (etwa 70 % der Fälle).
Validierung einer neuen Messmethode zur direkten Bestimmung der Heparin-Konzentration im Blut
(2012)
In dieser Arbeit wurde ein neues Verfahren zur Heparin-Bestimmung (LiSA-H, light scattering assay of heparin) evaluiert. Dieses wurde an der Universität Frankfurt a. M. am Institut für Biophysik entwickelt und ermittelt erstmals die direkte Heparin-Konzentration im Blutplasma. Durch die Analyse der Lichtstreuung einer Plasmaprobe wird die Bildung von Nanopartikeln aus Heparin und Protamin verfolgt. Die Lichtstreuintensität ist dabei proportional zu der in der Probe enthaltenen Heparin-Plasmakonzentration (Heparin-PK). Das Antikoagulans Heparin wird bei Herz-OPs mit Einsatz der Herz-Lungen-Maschine (HLM) verwendet und soll perioperativ eine lutgerinnselbildung in der HLM, sowie Thromboembolien im Patienten verhindern. Am OP-Ende wird die Wirkung durch Protamin antagonisiert, um eine suffiziente Gerinnung wieder herzustellen. Das derzeitige Gerinnungsmanagement basiert auf einem indirekten Messverfahren, der ACT (activated clotting time), welches starken Störeinflüssen, wie z.B. der Hypothermie, Hämodilution und bestimmten Medikamenten unterliegt. Durch die mögliche Falschdosierung der beiden Medikamente, steigt die Gefahr einer Blutung und Thrombose. LiSA-H soll in Zukunft eine zuverlässigere und kostengünstige „point of care― Analyse der Gerinnung und hierdurch eine gezielte Dosierung von Heparin und Protamin ermöglichen, die die Komplikationsrate verringert. In der vorliegenden Studie handelt es sich um eine offene, nicht kontrollierte, prospektive Multicenter-Studie, die mit 50 Patienten am Universitätsklinikum Frankfurt a.M. und 30 Patienten am Kinderherzzentrum Gießen durchgeführt wurde. Es wurde gezeigt, dass die durchschnittliche perioperative Heparin-PK bei Erwachsenen und Kindern bei ca. 5,4 I.E./ml liegt. Es wurde nachgewiesen, dass die Heparin-Clearance bei Kindern (~113 Min.) um das zweifache im Vergleich zu Erwachsenen (~254 Min.), erhöht ist. Besonders hervorzuheben ist die hohe Fehlerquote der ACT-Messung, die bei Erwachsenen in bis zu 1,8 % und bei Kindern in bis zu 20 % der Messungen keinen aussagekräftigen Wert lieferte. Das bedeutet, dass bei Kindern während einer OP bis zu zwei und bei Erwachsenen bis zu drei Stunden keine Information über den aktuellen Gerinnungszustand vorlag. Um eine Validierung der Messergebnisse vorzunehmen, wurden Rückstellproben mit dem Standardlaborverfahren PiCT (Prothrombinase induced clotting time) gemessen. Die Daten aus dem PiCT korrelieren mit den Ergebnissen aus der LiSA-H-Messung wesentlich besser (r² = 0,80), als mit der herkömmlichen ACT-Messmethode (r² = 0,57). Die ermittelten Heparin-PK und die ACT-Werte während einer OP wurden in Chronogrammen dargestellt. Es wurde gezeigt, dass in 30 % der OPs bei Erwachsenen und in 60 % bei Kindern die Messdaten aus der ACT und LiSA-H nur unzureichend synchron bei Nachdosierung mit Heparin anstiegen oder entsprechend der Heparin-Clearance im OP-Verlauf abfielen. Dies zeigte sich besonders kritisch während langandauernder, komplikationsreicher OPs, die einen erhöhten Blutverlust oder sogar Rethorakotomien nach sich zogen, in denen der ACT-Wert eine suffiziente Gerinnung nahe legte, die LiSA-HMessung aber eine noch hohe Heparin-PK nachwies. Erfahrungen aus den klinischen Studien zeigten, dass die Kombination aus der Messung der Heparin-PK und einer Gerinnungsanalyse bei einem ATIII-Mangel von Vorteil ist. Erst die Kombination aus einerseits mehrfach niedrig gemessener ACT-Werte, trotz ggf. Nachdosierungen von Heparin und andererseits ausreichend gemessener Heparin-PK im LiSA-H, kann einen ATIII-Mangelzustand aufdecken. Dadurch können Nach- bzw. Überdosierungen vermieden und damit die Wahrscheinlichkeit für postoperative Komplikationen verringert werden. Der wichtigste Einflussfaktor auf die LiSA-H-Messung ist die Hämodilution, die durch Einbeziehung des Patienten-Blutvolumens (z.B. mit der Nadler-Formel) durch mathematische Korrektur berücksichtigt werden kann. Patientenindividuelle Reaktionen auf gleiche Heparin- und Protamin-Dosierungen sowie eine patientenspezifische Heparin-Clearance zeigten in diesen Studien auf, dass das derzeitige Antikoagulationsmanagement mit den Dosierungsempfehlungen (Körpergewichtsbezogene Dosierung, 1:1 Dosierung von Protamin zur initialen Heparin-Dosis oder der summierten Heparin-Dosis, „pauschale― Nachdosierungen von 5.000 oder 10.000 I.E. Heparin bei ACT < 480) für eine optimale Dosierung der Medikamente unzureichend ist. In Outcome-Studien soll mit der LiSA-H-Messung Dosierungsempfehlungen von Heparin und Protamin ausgearbeitet werden. Außerhalb der Herz-Thorax-Chirurgie eröffnen sich weitere Möglichkeiten, wie z.B. in Dialysezentren und in der Neurochirurgie, für die bereits Studien geplant sind.