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Die Diatomee C. meneghiniana reagiert sowohl auf Veränderung der Lichtintensität während des Wachstums, als auch auf Veränderungen der Eisenkonzentration im Medium. Die Erhöhung der Lichtintensität respektive die Erniedrigung der Eisenkonzentration im Medium wurden als Stresssituationen für C. meneghiniana definiert. Unter Stressbedingungen findet zunächst eine generelle Erhöhung der Zellzahl statt, wobei das Volumen der einzelnen Zellen unter Eisenmangelbedingungen stark reduziert wird. Aus diesem Grund findet man schließlich unabhängig von der Lichtintensität in den Eisenmangelkulturen niedrigere Werte für die Biovolumina als in den Kulturen mit Eisensättigung.
Es konnten je nach Kulturbedingung kleine Unterschiede in der äußeren Morphologie der Silikatschalen festgestellt werden, die sich jedoch im Rahmen der normalen Variationsbreite bewegen und daher nicht signifikant sind. In allen Kulturen konnten auf Grund der schonenden Präparationsmethode die für C. meneghiniana als typisch beschriebenen Schwebfäden aus Chitin beobachtet werden.
Die Größe der Phäoplasten ist in den Eisenmangelkulturen und in de Starklichtkulturen deutlich geringer, weshalb auch die Anzahl der Thylakoidbänder sinkt. Die für Diatomeen typische Dreifachbänderung der Thylakoide bleibt jedoch immer erhalten. Zudem zeigen die Phäoplasten der LL 12 – und HL 12 – Zellen Ansammlungen eines Stoffs, der zwar nicht näher identifiziert wurde, wobei es sich aber höchstwahrscheinlich weder um Lipid-Globuli noch um das als Speicherstoff bei Diatomeen vorkommende -1,3-Glucan Chrysolaminarin handelt.
Die Färbung der Kulturen zeigt bereits eine Veränderung in der Pigmentierung der Zellen in Abhängigkeit von der Kulturbedingung. Der Chlorophyllgehalt pro Zellen wird vor allem unter Eisenmangel reduziert, während es in Zellen der HL – Kulturen zu einer Verdoppellung des Gehalts an XC – Pigmenten kommt. Die Kombination beider Effekte führt dazu, dass die HL 12 und der LL 1 – Kultur gleichermaßen hellbraun gefärbt sind, die Färbung der HL 1 – Kultur jedoch beinahe gelb ist. Die hellere Färbung der Eisenmangelkulturen ist wahrscheinlich als Chlorose anzusehen und eine klassische Folge von Eisenmangel bei Diatomeen. Die zugehörigen DEORs der ganzen Zellen sind in den HL – Kulturen anfangs sehr hoch und sinken später.
Die Ursache ist vermutlich in der hohen Lichtintensität und der durch Erhöhung der Zellzahl im Verlauf der Anzucht entstehenden gegenseitigen Beschattung der Zellen zu sehen. Hierfür spricht auch die parallel stattfindende Abnahme der XC – Pigmente – Konzentration.
Die Ermittlung der PS I : PS II – Stöchiometrien zeigt, dass sich offenbar auch die innere Architektur der Thylakoidmembran verändert. So liegt das relative, berechnete Verhältnis von PS II zu PS I nur in der LL 12 – und der HL 1 – Kultur bei 2 : 1. Dieses Verhältnis wird üblicherweise für küstennahe unter den den Anzuchtbedingungen vergleichbaren Lichtverhältnissen lebende Spezies angenommen. Die HL 12 - und die LL 1 – Zellen hingegen weisen ein Verhältnis von 1 : 1 auf. Da es nicht möglich ist, die Veränderung in beiden Kulturen entweder mit Eisenmangel oder Starklichtstress zu erklären, muss hier von unterschiedlichen Ursachen ausgegangen werden.
Die Reoxidationskinetiken weisen darauf hin, dass die Übertragung der Energie von QA an QB je nach Kultur unterschiedlich schnellen Kinetiken folgt. Dies ist wiederum durch die Bindungsart des QB, bzw. seine Verfügbarkeit als Akzeptor bedingt.
In den O-J-I-P-Messungen zeigt sich zunächst, dass die F0 – Werte der Eisenmangelkulturen niedriger liegen. Als Ursache hierfür wird eine Verkleinerung der Antenne des PS II, die sich durch den unter Eisenmangel deutlich erniedrigten Chlorophyllgehalt pro Zelle erklären lässt, und die dadurch bedingte Verringerung der Fluoreszenz angenommen. Deutlich ist zudem, dass die Energie in den HL – Kulturen deutlich schlechter von QA an QB weitergegeben wird, weshalb auch die daraus resultierenden Fv/FM – Werte deutlich niedriger sind. Als Erklärung hierfür kommt der unter HL stark erhöhte XC – Pool in Frage, der bekanntermaßen am nichtphotochemischen Quenching beteiligt ist, das wiederum vor allem unter Lichtstress auftritt.
Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm –Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm – Absorption bei, Fraktion II und IV mit der Auswertung der Slotblotsignale für die Photosysteme korreliert.
Die endgültige Aufreinigung der FCPs wurde letztlich mit diskontinuierlichen Saccharosegradienten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass alle FCP – Fraktionen nach der Anionenaustauscherchromatografie einen mehr oder weniger großen Anteil an Verunreinigungen durch Photosysteme enthalten, die auf diese Weise abgetrennt werden konnten.
Die Kulturbedingungen haben zwar keinen Einfluss auf den Oligomerisierungsgrad von FCPa, bzw. FCPb, allerdings konnten Unterschiede in der Stabilität der Komplexe festgestellt werden. FCPa scheint unter LL weniger stabil zu sein, während der FCPb unter Eisenmangelbedingungen einen Teil seiner Stabilität einbüßt. Weiterhin kann in der Gelfiltration des FCPa kann nur eine Schulter beobachtet werden und im FCPb sieht man teilweise sogar zwei Schultern. Da sich die Schulter mit der längeren Retentionszeit auf Höhe der Monomerschulter des FCPa befindet, und die Retentionszeit der anderen Schulter beinahe der des FCPa-Trimers entspricht, könnte dies die Hypothese unterstützen, dass der FCPb ebenfalls aus Trimeren aufgebaut ist. Kleine Verschiebungen in der Retentionszeit wären durch das unterschiedliche Molekulargewicht der Monomere erklärbar.
Die SDS – PAGE zeigt zunächst keine Veränderungen in der Zusammensetzung der FCPs unterschiedlicher Kulturbedingungen. Einzig die beiden HL –FCPb – Proben weisen eine hochmolekulare Bande bei ca. 62 kDa auf, die nicht näher identifiziert werden konnte. Auf Grund der Größe kann jedoch ausgeschlossen werden, dass es sich um Kopurifikation des unter Eisenstress bei Diatomeen häufig als Ersatz für Ferredoxin vorkommenden Flavodoxins oder einen Eisentransporter handelt. Die Inkubation mit spezifischen Antikörpern gegen einzelne fcp – Proteine zeigt, dass die 18 kDa – Bande des FCPa fcp2 enthält und die 19 kDa – Bande fcp6. Die 19 kDa – Bande des FCPb reagiert jedoch nicht mit dem fcp6 – Antikörper. Da aus C. cryptica nur noch zwei weitere fcp – Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 19 kDa bekannt sind und fcp7 auf Aminosäureniveau eine sehr hohe Ähnlichkeit mit dem fcp6 aufweist, kann man vermuten, dass es das entsprechende Protein im FCPb der fcp5 ist.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
Integrin a2ß1 ist ein Adhäsionsrezeptor, der verschiedene Kollagentypen bindet. Als solcher spielt es eine bedeutende Rolle für Zellfunktionen wie Migration und die Regulation des Zytoskeletts, Zellteilung, Apoptose und Differenzierung. Integrin a2ß1 übernimmt deshalb eine tragende Funktion in Prozessen wie Wundheilung, Angiogenese und der Progression und Metastasierung von Krebs. Rhodocetin ist ein Antagonist des Integrins a2ß1. Es ist ein C-Typ-Lektin-artiges Protein das im Schlangengift der Malaiischen Grubenotter (Calloselasma rhodostoma) entdeckt wurde. Rhodocetin besteht aus vier Untereinheiten a, ß, ? und d, die zwei Dimere formen (aß und ?d), welche wiederum eine kreuzförmige heterotetramere Quartiärstruktur bilden, die bislang nur für Rhodocetin beschrieben wurde. Rhodocetin bindet an die Integrin-a2A-Domäne der a-Untereinheit des Integrins a2ß1. Rhodocetin unterbindet damit die Bindung von Kollagen und die Aktivierung des Integrins. Der genaue Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne ist noch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Hybridomtechnik monoklonale Antikörper gegen Rhodocetin generiert. Es wurden sechs Fusionen von Lymphozyten mit Myelomazellen durchgeführt, für die sowohl Mäuse als auch Ratten mit Rhodocetin immunisiert wurden. Die erzeugten Hybridomaklone wurden zunächst im ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, Rhodocetin zu binden. Positiv getestete Klone wurden selektiert und die monoklonalen Antikörper aus den Zellüberständen aufgereinigt. Es konnten 14 monoklonale Antikörper etabliert werden. Die Antikörper wurden zunächst in ihren Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurden verschiedene ELISAs, Immunblot und Immunpräzipitation genutzt. In der Duchflusszytometrie wurde getestet, ob die Antikörper an Integrin a2ß1 gebundenes Rhodocetin detektieren. Die Antikörper lassen sich hinsichtlich ihr Bindungseigenschaften und der Lage ihrer Bindungsepitope auf den verschiedenen Rhodocetin-Heterodimeren in unterschiedliche Klassen unterteilen. Es wurde nachgewiesen, dass Rhodocetin Konformationsänderungen unterliegt, die durch die Bindung einiger der generierten Antikörper induziert werden. Um den Einfluss divalenter Kationen auf die Konformation von Rhodocetin sowie den Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne zu untersuchen, wurde die analytische Gelfiltrationschromatographie genutzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung divalenter Kationen die Konformation von Rhodocetin beeinflusst. Um die Interaktionsstudien von Rhodocetin mit der a2A-Domäne auszuwerten wurde ein Sandwich-ELISA etabliert. Dieser ermöglichte es, im Anschluss an die Gelfiltration, die beiden Rhodocetin-Heterodimere unabhängig voneinander im Eluat nachzuweisen und zu quantifizieren. Es wurde nachgewiesen, dass das Rhodocetin-Heterotetramer während der Interaktion mit der Integrin-a2A-Domäne dissoziiert und nur das ?d-Dimer einen stabilen Komplex mit der a2A-Domäne bildet, während das aß-Dimer freigesetzt und unabhängig von diesem Komplex eluiert wird. Die pharmakologischen Eigenschaften von Rhodocetin wurden in einem Tumor-Xenograft-Modell untersucht, für das immundefizienten Mäusen HT1080 Fibrosarkomzellen implantiert wurden. Rhodocetin wurde den Mäusen intravenös appliziert und die Auswirkungen auf die Tumoren sowie der Verbleib von Rhodocetin im Körper analysiert. Die Entwicklung der Serumkonzentration von Rhodocetin wurde mit dem etablierten Sandwich-ELISA untersucht, welches hierzu mit einer Standardreihe kalibriert wurde. Die Elimination von Rhodocetin folgt einer Kinetik erster Ordnung. Die Exkretion von Rhodocetin erfolgt über die Niere. Es zeigte sich, dass etwa zwei Drittel des applizierten Rhodocetins unmittelbar nach Injektion von Integrin a2ß1-exprimierenden Zellen des Blutes gebunden werden. Die immunhistologische Auswertung von Tumoren und Kontrollgeweben ergab, dass Rhodocetin an Endothelzellen innerhalb der Nierenglomeruli sowie der Leber bindet. Rhodocetin konnte auch auf Endothelzellen der Tumorvaskulatur nachgewiesen werden. Innerhalb der Tumoren wurde Rhodocetin auch außerhalb von Blutgefäßen gefunden, wo es an HT1080 Tumorzellen bindet. Die Behandlung mit Rhodocetin beeinträchtigte die Integrität der Blutgefäße innerhalb der Tumoren und führte zu Hämorrhagien. Um die Auswirkungen von Rhodocetin auf die Tumoren genauer zu untersuchen und zu quantifizieren, wurde dynamische Magnetresonanztomographie genutzt. Es zeigte sich, dass Rhodocetin die Durchlässigkeit der Blutgefäße in Tumoren signifikant erhöht.
Eine verzögerte und mitunter unvollständige Immunrekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) birgt ein erhöhtes Risiko für Infektionen und das Auftreten eines Rezidivs. Adoptive Immuntherapien können dazu beitragen, die Immunrekonstitution zu beschleunigen. Die Indikation hierzu ist jedoch streng geregelt, da eine zusätzliche Immuntherapie mit Risiken, wie z.B. dem Auftreten einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD), verbunden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf das Auftreten von Komplikationen und das Überleben nach SZT. Dazu wurde ein multivariates Normwertmodell entwickelt, das die Beurteilung der Rekonstitution verschiedener Leukozytensubpopulationen ermöglicht. Der Einfluss der Regeneration spezifischer Immunzellen wie Cytomegalievirus-spezifischer T-Zellen (CMV-CTLs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs) auf den Verlauf nach SZT wurde insbesondere hinsichtlich CMV-bedingter Komplikationen, GvHD und Rezidiv untersucht.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. In-silico Analysen von putativen Apoptose-Faktoren im Genom von P. anserina
Es konnten mehrere Gene, die in einer Apoptose-Maschinerie involviert sein könnten, im Genom von P. anserina identifiziert werden. Diese Homologen wurden in zwei Ka-tegorien unterteilt: (i) die nicht-mitochondrialen Proteine PaMCA1, PaMCA2 und PaPARP und (ii) die Homologen des Apoptose-induzierenden Faktors AIF.
2. Einfluss der Metacaspase-Aktivität auf programmierte Zelltodprozesse
Mithilfe von Aktivitätsmessungen konnte eine Arginin-spezifische Aktivität der Meta-caspasen nachgewiesen werden. Diese Metacaspase-Aktivität nimmt in seneszenten Kulturen und nach H2O2-Behandlung signifikant zu. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines programmierten, ROS-induzierten Zelltods im letzten Entwicklungs-stadium des Alternsmodell P. anserina.
3. Die Rolle von AIF-Homologen in der Entwicklung von P. anserina
GFP-Fusionsproteine identifizierten eine mitochondriale Lokalisation der AIF-Homologen PaAIF2, PaAMID2 und PaPRG3. Desweiteren konnte eine altersabhängige PaAIF2-Translokation von den Mitochondrien zum Zellkern gezeigt werden, ähnlich der Apoptose-induzierenden Translokation von humanem AIF. Die Deletion von PaAif2 und PaAmid2 führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber oxidativem Stress und zu einer Verlängerung der Lebensspanne. Diese Befunde weisen auf einen ROS-induzierten, AIF-vermittelten Zelltod hin, der an der Lebensspannen-Kontrolle von P. anserina beteiligt ist.
4. Die Funktion des Proteins PaCYPD bei Seneszenz und programmiertem Zelltod
Membranpotential-Messungen konnten einen Rückgang des mitochondrialen Memb-ranpotentials von 21 % bei den PaCYPD-Überexpressionsstämmen nachweisen. Durch die Behandlung mit dem spezifischen PaCYPD-Inhibitor CSA konnte das Membranpo-tential wieder normalisiert werden. Zusammen mit dem detektierten Verlust von
7 Zusammenfassung
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Cytochrom c in den Mitochondrien der Überexpressionsstämme wird durch diese Studi-en die Vermutung einer PaCYPD-abhängigen Öffnung der mPTP untermauert. Die Pa-PaCypD-Deletion führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber mitochondrial-abhängigem, oxidativem Stress und gegenüber verschiedenen Apoptose-Induktoren. Die Überexpression von PaCypD hingegen führte zu einem beschleunigten Alterungspro-zess (Präseneszenz), einem verschlechterten Resistenzverhalten gegenüber Stress- und Apoptose-Induktoren und zu einer massiven Verkürzung der Lebensspanne. Die Le-bensspanne konnte aber durch die Behandlung mit CSA wieder auf Wildtyp-Niveau verbessert werden. Dies weist auf einen PaCYPD-vermittelte Zelltod hin. Interessan-terweise konnte durch das Wachstum auf CSA-haltigem Medium auch die Lebensspanne des Wildtyps verlängert werden. Um die hier nachgewiesene, lebensver-längernde Wirkung von CSA zu verifizieren, könnte diese Studie leicht auf andere Modellorganismen übertragen werden.
Prokaryotische Organismen werden in ihrer natürlichen Umgebung mit schwankenden Umwelteinflüssen konfrontiert oder müssen gegebenenfalls extremen Bedingungen standhalten. Um sich an derartige Veränderungen anpassen zu können und damit ein weiteres Überleben zu sichern, ist es wichtig neue genetische Informationen zu akquirieren. Die molekulare Basis dieser Anpassung sind Genmutationen, Genverlust, intramolekulare Rekombination und/oder horizontaler Gentransfer. Der vorliegende Selektionsdruck der Umwelt begünstigt schlussendlich die Spezialisierung und damit die Erschließung neuer Standorte aufgrund des Erwerbs neuer metabolischer Eigenschaften, Resistenzgene oder Pathogenitätsfaktoren. Vergleichende Analysen bakterieller Genome, welche auf Analysen der GC-Gehalte, der Codon- und Aminosäurenutzung und der Genlokalisation beruhen, zeigten, dass bei diesem evolutiven Prozess bzw. der Weiterentwicklung der bakteriellen Genome der horizontale Gentransfer als treibende Kraft eine entscheidende Rolle spielt. So indizieren Genomstudien, dass 0-22% der gesamten bakteriellen und 5-15% der archaeellen Gene horizontal erworben wurden, wobei der DNA-Transfer nicht ausschließlich zwischen Vertretern einer Domäne, sondern ebenfalls zwischen Organismen unterschiedlicher Domänen stattgefunden hat. So sind z.B. 24 bzw. 16% der Gene von Genomen hyperthermophiler Organismen wie Thermotoga maritima oder Aquifex aeolicus archaeellen Ursprungs. Ebenso finden sich Gene für Chaperone und DNA-Reparaturenzyme im Genom des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus wieder, welche wahrscheinlich ebenfalls durch horizontalen Gentransfer aus hyperthermophilen und archaeellen Genomen erworben wurden um eine Anpassung an extreme Standorte zu ermöglichen. Durch vergleichende Genomstudien wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch horizontalen Gentransfer erworbenen Gene oftmals zu einer Neuorganisation von Transkriptionseinheiten und zu einer veränderten Genomorganisation führten. Dennoch finden sich immer wieder Beispiele von horizontal erworbenen Operonen in den verschiedenen Organismen. Gut charakterisierte Vertreter horizontal übertragener Operone sind dabei z.B. das archaeelle H+-ATPase-Operon, das Operon der Na+-translozierenden NADH:Ubichitonoxidoreduktase oder das Nitratreduktase-Operon.
Man unterscheidet bei dem horizontalen Gentransfer zwischen drei Mechanismen der DNAAufnahme: Konjugation, Transduktion und Transformation. Die DNA-Übertragung durch Konjugation ist durch einen spezifischen Zell-Zell-Kontakt definiert, der durch einen von der Donorzelle ausgehenden, sogenannten F-Pilus hergestellt wird. Die Donorzelle überträgt schließlich Plasmid-kodierte genetische Informationen und oftmals Eigenschaften für die eigenständige Konjugation auf eine Rezipientenzelle. Die Transduktion hingegen beschreibt die DNA-Übertragung von Bakteriophagen auf eine Wirtszelle, wobei hier eine hohe Wirtsspezifität Voraussetzung ist. Die Übertragung der DNA von einer Bakterienzelle in eine andere erfolgt dabei ohne Kontakt der Zellen. Die natürliche Transformation ist definiert als Transfer von freier DNA und ermöglicht damit im Gegensatz zu den beiden ersten spezifischen Mechanismen der DNA-Übertragung ein größeres Spektrum der Verbreitung genetischer Informationen. Freie DNA, welche entweder durch Zelllyse oder Typ-IVSekretion ausgeschieden wird und aufgrund von Adsorption an mineralische Oberflächen über längere Zeiträume stabil in der Umgebung vorliegen kann, kann unter der Voraussetzung der Existenz eines speziellen Aufnahmesystems von Bakterien aufgenommen werden. Mittlerweile sind über 44 Bakterien aus unterschiedlichen taxonomischen Gruppen beschrieben, die eine natürliche Kompetenz ausbilden können. Die bekanntesten Beispiele für natürlich transformierbare Gram-negative Bakterien sind Heliobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas stutzeri, Haemophilus influenzae, T. thermophilus und Acinetobacter baylyi. Auch unter den Gram-positiven Bakterien finden sich einige Vertreter, die natürlich kompetent sind, wie Deinococcus radiodurans, Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae. Ungeachtet der relevanten Rolle der Transformation im horizontalen Gentransfer, ist über die Struktur und Funktion der komplexen DNA-Aufnahmesysteme wenig bekannt.
Die noradrenergen Neurone der sympathischen Ganglien und die cholinergen Neurone der parasympathischen Ziliarganglien gehen aus den NLZ hervor. BMP-Signale induzieren die Differenzierung beider Neuronentypen, die mit der Expression von Ascl1 und Phox2a/b beginnt. Im Fall der sympathischen Ganglien werden dann Hand2 und GATA2/3 exprimiert, was wiederum zur Expression der noradrenergen Marker TH und DBH führt, die auch in differenzierten Neuronen weiterhin vorhanden sind. Im Gegensatz dazu werden während der Entwicklung der parasympathischen Ziliarneurone sowohl Hand2 als auch TH/DBH nur transient exprimiert, die differenzierten Neurone besitzen zum Großteil einen cholinergen Phänotyp (Goridis und Rohrer, 2002; Müller und Rohrer, 2002).
Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der Hox-Gene bei der Differenzierung des PNS. 14 der analysierten Hox-Gene werden in den sympathischen Ganglien exprimiert, wobei wir uns bei der näheren Analyse auf das HoxB-Cluster beschränkt haben. HoxB5, HoxB6, HoxB7, HoxB8 und HoxB9 werden zwischen E4 und E7 in den sympathischen und sensorischen Ganglien exprimiert, wobei nur HoxB8 und HoxB9 eine deutliche Expression in den sympathischen Ganglien zeigen. Die HoxB-Gene könnten dem Expressionsmuster nach also eine Rolle bei der frühen Entwicklung und auch bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Phänotyps der sympathischen Ganglien spielen.
Die differenzielle Expression der HoxB-Gene in den sympathischen Neuronen und den Ziliarneuronen und ihre mögliche Beteiligung bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Charakters waren Ausgangspunkt für die ektopische Expression eines Vertreters des HoxB-Clusters, HoxB8, in den Ziliarganglien. In der Normalentwicklung wird die Expression von Hand2, TH und DBH nach E4 in den Ziliarneuronen stark reduziert (Abb. 22A). Wird HoxB8 in den Vorläuferzellen der Ziliarneurone in vivo überexprimiert, wird die Hand2-, TH- und DBH-Expression weit über E4 hinaus, bis mindestens E8 auf einem signifikant höheren Niveau gehalten (Abb. 22B). HoxB8 kann diesen Effekt allerdings nur ausüben, wenn es in den noch undifferenzierten Vorläuferzellen exprimiert wird. Die HoxB8-Überexpression in Primärkulturen von Ziliarneuronen an E5 oder E8 führt nur noch zu einem Anstieg der Hand2-Expression, hat aber keinen Einfluss mehr auf die noradrenerge Genexpression (Abb. 22B).
HoxB8 zeigt zusätzlich im Vergleich mit den anderen analysierten Hox-Genen einen spezifischen Effekt auf die Hand2-, TH- und DBH-Expression, denn sowohl das paraloge Hox-Gen HoxC8 als auch das anterior-exprimierte HoxB-Gen HoxB1 erreichen nur an E5 eine signifikante Expression der drei Gene. Weder HoxC8 noch HoxB1 können die Expression von Hand2 und TH/DBH über E5 hinaus aufrechterhalten (Abb. 22C), während HoxB8 deren Expression auch noch an E8 auf einem hohen Niveau halten kann.
Die HoxB8-vermittelte Aufrechterhaltung der TH- und DBH-Expression in den Ziliarneuronen konnte allerdings nicht in einen direkten Zusammenhang mit der erhöhten Hand2-Expression gebracht werden, da die Überexpression von Hand2 nicht zu einer Aufrechterhaltung von TH und DBH an E5 und E6 führt (Abb. 22C).
Die Effekte von HoxB8 auf die Entwicklung der Ziliarneurone, die durch HoxB8 z.T. noradrenerge, sympathische Eigenschaften annehmen, unterstützen die Vorstellung, dass HoxB8 bei der Differenzierung und Ausbildung des noradrenergen Phänotyps in sympathischen Ganglien eine Rolle spielt. Es konnte also erstmals einem Vertreter der Hox-Gen-Familie eine mögliche Funktion bei der Differenzierung autonomer Neurone zugeordnet werden.
Das Prostatakarzinom (PCa) ist in Deutschland die häufigste bösartige Malignität beim Mann; jährlich erkranken etwa 58.000 Männer am PCa. Mit 11.000 Todesfällen pro Jahr liegt PCa in der Mortalitätsstatistik an dritter Stelle, hinter dem Bronchialkarzinom und dem Dickdarmkarzinom. Solange PCa auf die Vorsteherdrüse begrenzt ist, besteht die Möglichkeit einer Heilung über die Prostatektomie oder Bestrahlung. Bei etwa 15% der Neuerkrankungen tritt ein metastasierender PCa auf. Bei etwa 20% der Patienten mit organbegrenztem Tumor zeigen lokale Therapieformen keine Wirkung, so dass ebenfalls einer invasiven Ausbreitung Vorschub geleistet wird. Weitere Therapieformen bilden die Androgensuppression und die Chemotherapie. Bei der Androgensuppression kommt es sehr häufig zu einem hormonrefraktären Stadium, das über einen PSA-Anstieg definiert wird. Ist das hormonrefraktäre Stadium erreicht, stehen nur begrenzte Therapieoptionen zur Verfügung. In der jüngeren Vergangenheit wurden neue molekulare Substanzen entwickelt, die gezielt in den Metabolismus der Karzinomzellen eingreifen, die targeted therapy molecules. PCa ist eine sehr heterogene Karzinomentität. Das Verständnis des Zusammenspiels von parallelen und interagierenden mitogenen Signaltransduktionswegen beim PCa, die sein Wachstum, seine Differenzierung und seine Zellmotiliät regulieren, ist von enormer Bedeutung, um neue bzw. schon bestehende Inhibitoren gegen PCa erfolgreich zu entwickeln oder als Mono- bzw. Kombinationstherapie anzuwenden. Zu den beim PCa häufig überexprimierten Signalproteinen gehören der mammalian target of rapamycin (mTOR), die Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) und die Histondeacetylasen (HDACs). Ziel dieser Arbeit war es, die Effektivität von Inhibitoren auf diese Signalproteine als Einzel- und Kombinationstherapie im Hinblick auf das Zellwachstum und die Adhäsionseigenschaft der PCa-Zellen zu untersuchen. Zur Anwendung kamen RAD001, ein mTOR-Inhibitor, AEE788, ein Multikinaseinhibitor gegen den VEGF- und EGF-Rezeptor, die Valproinsäure (VPA), ein HDAC-Inhibitor und das Interferon-alpha-2a (IFNalpha2a), ein körpereigenes Zytokin. Die Untersuchungen basierten auf zellbiologischen und biochemischen Analysen in-vitro unter Verwendung der PCa-Zelllinien DU145, PC-3 und LNCaP und in-vivo mittels eines xenogenen Nacktmausmodells. Im Rahmen funktioneller Untersuchungen wurden unter den entsprechenden Therapien das Zellwachstum mit dem MTT-Test ermittelt, das Expressionsmuster der zellzyklusregulierenden Proteine durch die Western-Blot-Hybridisierung und die Progression des Zellzyklus mittels der Durchflusszytometrie untersucht. Im weiteren Verlauf wurden die Adhäsionsprozesse an Matrix und an Endothel analysiert und die Modulation der Integrinsubtypen mit Hilfe der fluorimetrischen und molekularbiologischen Methoden sowie deren Genaktivität evaluiert. Die Synthese der gebundenen und freien Form von PSA wurde mit dem ELISA-Verfahren gemessen. Zur detaillierten Aufklärung der Wirkmechanismen der Medikamente diente die nähere Untersuchung intrazellulärer Signalwege anhand molekularbiologischer Studien. AEE788, RAD001, VPA, nicht jedoch IFNalpha2a erzielten eine deutliche Reduktion im Zellwachstum und der Adhäsion der PCa-Zellen. Dabei war jede Substanz durch ein eigenes Wirkprofil charakterisiert und zeigte eine zelltypabhängige molekulare Aktivität. Während AEE788 und RAD001 eine direkte Wirkung auslösten, war der Effekt von VPA zeitversetzt. Im Gegensatz zu VPA und RAD001 beeinflusste AEE788 vor allem androgenresistente Zellen. Eine kombinierte Behandlung erwies sich nicht in allen Fällen als gleich effektiv. Letztendlich zeigten vor allem AEE788/RAD001, VPA/RAD001 und VPA/IFNalpha2a deutliche antitumorale Effekte. Dabei demonstrierten die Untersuchungen eine Verringerung des Zellwachstums, einhergehend mit einer deutlichen Modulation der relevanten regulatorischen Zellzyklusproteine, einer Zunahme der Tumorsuppressoren und einer deutlichen Verlangsamung der Zellzyklusprogression. AEE788/RAD001 und VPA/IFNalpha2a erzielten dabei eine effektive Reduktion von Wachstum und Adhäsion. In Analysen der Adhäsionsprozesse konnte die Modulation der Integrinsubtypen und der integrinassoziierenden Kinasen aufgrund der Substanzen demonstriert werden und zeigte bei androgenresistenen und androgensensitiven Zellen einen unterschiedlichen Wirkungseinfluss. Nur die Kombination von VPA/IFNalpha2a verringerte signifikant die PSA-Synthese und zeigte bei der Evaluation der intrazellulären Signalwege einen deutlichen Verstärkereffekt in der Regulation der Proteinexpression und der Aktivität von EGFR, ERK1/2 und P70S6K. In der darauffolgenden in-vivo-Untersuchung konnte der Verstärkereffekt von VPA/IFNalpha2a in einer effektiven Reduktion des Tumorvolumens demonstriert werden. Da insbesondere PCa einen sehr heterogenen Phänotyp aufweist, bietet vor allem die kombinierte targeted Therapie neue Hoffnung und vielversprechende Therapiemöglichkeiten. Die eigenen Daten demonstrieren, dass nur bestimmte Medikamenten-Kombinationen eine effektive Verstärkung der antikarzinogenen Effekte erzielen und eine wirksame Therapie des PCa ermöglichen. Bei der klinischen Anwendung ist zu beachten, dass abhängig von Geno- und Phänotyp individuelle Therapiekonzepte zu berücksichtigen sind.
Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit wurde die Rolle der putativen mitochondrialen Kinase PINK1 untersucht. Die Mutationen in diesem Gen sind für die PARK6 Form von Morbus Parkinson ursächlich. Dies ist eine neurodegenerative Erkrankung, welche die Lebensqualität der Betroffenen weitgehend beeinträchtigt. Sie wird mit Dopamin-Ersatzmitteln und DBS (Deep Brain Stimulation) behandelt, beide nicht frei von Nebenwirkungen. Levodopa können bekannterweise zu schweren Fällen von Dyskinesie führen. Die Aufklärung der physiologischen Rolle von PINK1 würde den Wissenschaftlern auf dem Weg zur Früherkennung und anderen Therapiemöglichkeiten verhelfen. Die PARK6 Form der Parkinson Erkrankung wird derzeit anhand von verschiedenen Modellorganismen (M. musculus, D. melanogaster, D. rerio, C. elegans), sowie von verschiedenen Zellmodellen (HeLa, PC12, Fibroblasten aus PARK6 Patienten) untersucht. Als neuronale Zelllinie eignen sich die SH-SY5Y Zellen besonders gut für die Forschung an der durch den Verlust von dopaminergen Neuronen gekennzeichneten Parkinson-Erkrankung und sind diesbezüglich als ein relevantes Zellmodell breit akzeptiert (Xie et al.2010). In der vorliegenden Diplomarbeit wurden mit einem adenoviralen Konstrukt generierte PINK1 knockdown SH-SY5Y Zellen (M. Klinkenberg) als ein potentielles Zellmodell für die PARK6 Form von M. Parkinson analysiert. Als Kontrolle für die PINK1- abhängigen Effekte wurden NT (non target) Zellen herangezogen. Ausschlaggebend für die Wahl dieses Zellmodells war die Beobachtung, dass die PINK1 KD SH-SY5Y Zellen bei einer Reduktion des Serumgehaltes im Medium wesentlich langsamer wachsen als die NT Zellen (M. Jendrach). Die Serumdeprivation schien also der notwendige Stressfaktor zu sein, welcher zur Auslösung eines PINK1-abhängigen Phänotyps führen könnte. Daraus ergab sich die Frage, welche anderen PINK1-abhängigen Veränderungen unter Serumentzug zur Ausprägung kommen. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde zunächst die relative Genexpression der PINK1 KD SH-SY5Y Zellen in Bezug auf die NT Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass der PINK1 KD bei reduziertem Serumgehalt zur Herunterregulation weiterer Parkinsonrelevanter Gene führt, deren Produkte an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind. Die Effekte traten nur bei stabil transfizierten Zellen auf und waren durch einen transienten PINK1 KD nicht reproduzierbar. Viele dieser Gene sind für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Homöostase bedeutsam und deshalb wurde die mitochondriale Funktion und Erscheinung in den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen genauer erforscht. Im Gegensatz zu früheren Befunden (Mai et al. 2010) wurde eine Herunterregulation des für die mitochondriale Teilung zuständigen Fis1-Proteins ermittelt, darüber hinaus aber keine Änderung der mitochondrialen Morphologie auch nach induziertem Zellstress beobachtet (Dagda et al. 2009, Lutz et al. 2009). Ein Defizit in der mitochondrialen Atmung wurde festgestellt, nachdem die Zellen bei 1g/L Glucose kultiviert und für 24h auf ein Galaktose-haltiges Medium transferiert wurden. Außerdem wurde ähnlich zu Amo et. 2010 al eine leicht verminderte Energieladung der betreffenden Zellen gefunden. Keine Beeinträchtigung der mtDNA-Integrität oder der Überlebensrate bei H2O2-induziertem oxidativen Stress wurde beobachtet. Weiterhin wurde untersucht, inwiefern die in den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen beobachteten Veränderungen in der Genexpression auf weitere Zellmodelle (PINK1 KD HeLa, kortikale Neurone aus PINK1 KO und PINK1 KO / A53T alpha Synuclein überexprimierenden Mäusen) übertragbar sind. Dabei wurden einige Gemeinsamkeiten zwischen den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen und den PINK1 KO /A53T α Synuclein überexprimierenden kortikalen Neuronen ermittelt. Angesichts des Verlustes von dopaminergen Neuronen in M. Parkinson wäre es bedeutsam nachzuvollziehen, ob und wie die verminderte Expression Parkinson-relevanter Gene in diesen PINK1 KD Zellmodellen kompensiert wird, so dass die Zellen trotz der genetischen Einschränkung bei idealisierten in vitro Bedingungen gut überleben können. Hier ist es vorstellbar, dass zusätzlicher Zellstress die Gemeinsamkeiten zwischen den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen und den PINK1 KO / A53T SNCA überexprimierenden Neuronen erweitern könnte. Diesbezüglich wäre es auch relevant zu erforschen, unter welchen Umständen die potentiellen Kompensationsmechanismen versagen, so dass das Zellüberleben nicht mehr gewährleistet wird. Im Licht des altersbedingten Ausbruchs der Symptome bei M. Parkinson würden diese neuen Erkenntnisse dazu beitragen, die möglichen auslösenden Faktoren zu erfassen und so ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen dieser schwerwiegenden Erkrankung zu erhalten.