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In der Umweltpolitik werden die Themenfelder Klimawandel und Biodiversität besonders betont. Klimaveränderung und Erhalt/Veränderungen der biologischen Vielfalt werden zumeist unabhängig voneinander betrachtet und nicht miteinander verknüpft. Debatten zum Klimawandel und zum Schutz der Biodiversität werden von Vertretern der Politik, Wirtschaft, Wissenschaft und Gesellschaft kontrovers geführt. Die im aktuellen Diskurs um den Schutz von Naturwäldern erwähnten Zusammenhänge von Biodiversität und Klimawandel werden analysiert, da diese Schutzstellung auch auf Biodiversität abzielt. Erwartungsgemäß wird Biodiversität sehr häufig thematisiert, besonders bezogen auf die Rotbuche. Bezogen auf die Klimaveränderung wird das Speicherpotential der Böden betont. Hinweise für weitere Aktivitäten im LOEWE Biodiversität und Klima Forschungszentrum BiKF wurden identifiziert.
Jahresbericht 2008 / HeBIS
(2009)
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Kollagen des marinen Schwammes Chondrosia reniformis Nardo: Optimierte großtechnische Herstellung, Analytik und neue pharmazeutisch-technologische Anwendungsmöglichkeiten Großtechnische Isolierung und Untersuchung von Chondrosia-Kollagen Schwämme spielen eine wichtige Rolle im Ökosystem des Meeres und ihr Vorkommen ist begrenzt. Zur schonenden und nachhaltigen Nutzung als Rohstoffquelle müssen im Hinblick auf eine industrielle Nutzung alternative Wege zur Gewinnung von marinem Schwammkollagen entwickelt werden. Ein Beispiel hierfür sind die sogenannten „Marikulturen“ direkt im Meer, aus denen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Schwämme stammten. Im Gegensatz zu den früher eingesetzten Methoden zur Isolierung des Chondrosia-Kollagens, die Laborcharakter trugen, konnte in der vorliegenden Dissertationsarbeit ein stark vereinfachtes, für die großtechnische Produktion geeignetes Verfahren mit einer hohen Ausbeute (ca. 35%) beschrieben werden. Das Schwammausgangsmaterial wurde über ca. 4 Tage mit Hilfe von Natriumsulfit reduktiv behandelt und die Kollagenfasern (nach einem Filtrationsschritt) in saurem Medium gewonnen. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen des isolierten Materials zeigten die kollagentypische Fibrillenquerstreifung, die Unlöslichkeit der Faserbündel in saurem Milieu sowie deren Abbau in die einzelnen Fibrillen in neutraler Pufferlösung. Die von tierischen Kollagenen abgeleitete Bestimmung des Proteingehaltes ergab einen im Vergleich zum kalkulierten Kollagenanteil höheren Gesamtproteingehalt. Dies ist ein Hinweis auf mögliche nichtkollagene Proteinanteile, die an Kollagen assoziiert vorliegen können. Untersuchungen zur Aminosäurenzusammensetzung des isolierten Materials ergaben im Vergleich zu den von Swatschek et al. (2002a) publizierten Ergebnissen einen deutlich höheren Glycin- und einen mehr als doppelt so hohen Hydroxyprolingehalt. Dies kann dahingehend gedeutet werden, dass die neue Isolierungsmethode die bekannten Verunreinigungen des Kollagens mit Glykoproteinen reduziert und zu einem deutlich reineren Kollagenmaterial führt. Mit Hilfe einer neu entwickelten Methode konnten erstmalig Partikel aus Chondrosia-Kollagen hergestellt werden, deren Größe im Nanometerbereich lag. Hierbei handelte es sich um eine kontrollierte alkalische Hydrolyse des isolierten, gefriergetrockneten Kollagens in 1,5 M NaOH. Es konnte eine Partikelausbeute in Höhe von ca. 10% erzielt werden. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen zeigten gleichförmige, sphärische Partikel. Die Partikelgrößenuntersuchungen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (nach Resuspension der gefriergetrockneten Schwammkollagennanopartikel (SKNP)) ergaben eine Größe von 168 ± 9,1 nm. Somit sind diese Partikel im Gegensatz zu den bisher aus Chondrosia-Kollagen gewonnenen Mikropartikeln auch für intravenöse Anwendungen geeignet und haben eine größere Trägerkapazität. Die hergestellten Nanopartikel wurden adsorptiv mit dem Wirkstoff 17?-Estradiol-Hemihydrat beladen. In Abhängigkeit von der eingesetzten Stoffkonzentration (1,25 bis 5,0 mg/ml) konnten Beladungsraten von bis zu 13,1% erzielt werden. Die Stabilitätsprüfung von wässrigen Partikelsuspensionen ergab nach 180 Tagen Einlagerung eine auf 7 bis 8% reduzierte Beladungsrate. Nach Inkorporation der beladenen Partikel in eine Hydrogelgrundlage wurde die transdermale Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs im Rahmen der Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen untersucht. SKNP-Gele mit einer Estradiolkonzentration in Höhe von 0,06% wurden mit gleichkonzentrierten partikelfreien Gelen verglichen. In den Speichelproben der Patientinnen konnten nach täglicher einmaliger Applikation des Nanopartikelgels nach 28 Tagen signifikant höhere Estradiolkonzentrationen gemessen werden. Die ermittelten Flächen unter den Konzentrations-Zeit-Kurven (AUC) über 24 h nach der einmaligen topischen Applikation von 0,75 mg Estradiol waren um das 2,3 bis 3,4-fache höher als die entsprechenden AUC-Werte des Vergleichsgels. 24 h nach Auftragen des Gels lagen die Estradiolspiegel des Vergleichsgels in etwa wieder auf Höhe der Basalwerte, wohingegen die Estradiolwerte nach Applikation des SKNP-Gels zum gleichen Messzeitpunkt mindestens doppelt so hoch waren. Somit konnten bei Anwendung der SKNP-Zubereitung eine deutlich erhöhte transdermale Estradiolabsorption und eine verlängerte Arzneistoffwirkung beobachtet werden. Das nanopartikuläre Trägersystem aus Chondrosia-Kollagen stellt damit eine vielversprechende Möglichkeit zur Erhöhung der transdermalen Bioverfügbarkeit von lipophilen, schlecht resorbierbaren Wirkstoffen dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Formulierung für einen magensaftresistenten Überzug mit Chondrosia-Kollagen als Filmbildner entwickelt. Die Sprühsuspension bestand aus 15% gefriergetrocknetem Kollagen, dem Weichmacher Triethylcitrat (1,5%), dem Trennmittel Talkum (7,5%) und Wasser. Der Coating-Prozess wurde in einem Dragierkessel mit Placebotabletten durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wurden Tabletten-Stichproben entnommen, um die erforderliche Kollagenschichtdicke für eine Magensaftresistenz zu bestimmen. Tabletten mit einer Kollagenauftragsmenge von 12,9 mg/cm2 entsprachen der Prüfung auf Magensaftresistenz gemäß Europäischem Arzneibuch. Die Widerstandsdauer in 0,1 M Salzsäure betrug mehr als 2 h und der Zerfall in Phosphatpufferlösung pH 6,8 höchstens 10 min. Rasterelektronenmikrosko-pische Aufnahmen bei unterschiedlichen Vergrößerungen zeigten eine gleichmäßige und glatte beschichtete Oberfläche. Das Auftragsverfahren im Dragierkessel erwies sich als reproduzierbar. Die mechanischen Eigenschaften der überzogenen Tabletten waren zufriedenstellend und die Magensaftresistenz wurde durch eine 6-monatige Lagerung nicht beeinträchtigt. Als Naturprodukt eignet sich Schwammkollagen als Überzugsmaterial für Nichtarzneimittel. Der schnelle Zerfall des Kollagenüberzugs in neutraler Pufferlösung stellt einen Vorteil gegenüber den häufig verwendeten Schellacküberzügen dar, die sich im Darmtrakt zu langsam auflösen und daher nicht selten mit synthetischen Polymeren kombiniert werden.