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Xenorhabdus and Photorhabdus bacteria are gaining more and more attention as a subject of research because of their unique yet similar life cycle with nematodes and insects. This work focused on the secondary metabolites that are produced by Xenorhabdus and Photorhabdus. With the help of modern HPLC-MS methodologies and increasingly available bacterial genome sequences, the structures of unknown secondary metabolites could be elucidated and thus their biosynthesis pathways could be proposed, too.
The first paper reported 17 depsipeptides termed xentrivalpeptides produced by the bacterium Xenorhabdus sp. 85816. Xentrivalpeptide A could be isolated from the bacterial culture as the main component. The structure of xentrivalpeptide A was elucidated by NMR and the Marfey´s method. The remaining xentrivalpeptides were exclusively identified by feeding experiments and MS fragmentation patterns.
The second paper described the discovery and isolation of xenoamicin A from Xenorhabdus mauleonii DSM17908. Additionally, other xenoamicin derivatives from Xenorhabdus doucetiae DSM17909 were analyzed by means of feeding experiments and MS fragmentation patterns. The xenoamicin biosynthesis gene cluster was identified in Xenorhabdus doucetiae DSM17909.
The manuscript for publication focused on the biosynthesis of anthraquinones in Photorhabdus luminescens. The Type II polyketide synthase for the biosynthesis of anthraquinone derivatives was discovered in P. luminescens in a previous publication by the Bode group,1 in which a partial reaction mechanism for the biosynthesis has been proposed. The manuscript reported in this thesis however elucidated the biosynthetic mechanisms in a greater detail as compared to the previous publication. Particularly, the biosynthetic mechanism was deciphered through heterologous expression of anthraquinone biosynthesis (ant) genes in E. coli. Additionally, deactivation of the genes antG encoding a putative CoA ligase and antI encoding a putative hydrolase, was performed in P. luminescens. Selected ant genes were over-expressed in E. coli as well as the corresponding proteins purified for in vitro assays. Model compounds were chemically synthesized as possible substrates of AntI and were used for in vitro assays. Here, it was revealed that the CoA ligase AntG played an essential role in the activation of the ACP AntF. Furthermore, a chain shortening mechanism by the hydrolase AntI was identified and was further confirmed by in vitro assays using model compounds. Additionally, this chain shortening mechanism was supported by homology based structural modeling of AntI.
RNA modifications are widespread in the RNA world. Nevertheless, their functions remain enigmatic. Recent analysis in tRNAs, mRNAs and rRNAs have revealed that apart from enriching their topological potential, these chemical modifications provide an added significant regulatory level to gene expression...
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der frühen embryonalen Entwicklung. ESCs können mit Hilfe neuer Technologien zur Modifikation von Genen (z.B. mit dem CRISPR/Cas9 System) genetisch manipuliert werden. Daraus resultierende „knockout“ ES Zelllinien können helfen, die physiologische Rolle von Proteinen während der Differenzierung zu verstehen.
Transkriptionsfaktoren, die schnell und spezifisch Signalwege regulieren, spielen während der Embryonalentwicklung und während der Differenzierung von ESCs in vielen verschiedenen Zelltypen eine essentielle Rolle. Der Transkriptionsregulator „Far Upstream Binding Protein 1“ (FUBP1) ist ein Protein, welches eine ganz bestimmte einzelsträngige DNA Sequenz, das „Far Upstream Sequenz Element“, erkennt, bindet, und dadurch Gene wie z.B c-myc oder p21 reguliert. Mit der Entwicklung zweier Fubp1 Genfallen Mausstämme (Fubp1 GT) sollte die Frage nach der physiologischen Funktion von FUBP1 beantwortet werden. Die homozygoten FUBP1-defizienten GT Embryonen sterben im Mutterleib ungefähr am Tag E15.5 der Embryonalentwicklung. Sie sind kleiner als Wildtypembryonen und zeigen ein anämisches Aussehen. Daher wurden diese Mausmodelle hinsichtlich der Hämatopoese untersucht, die zu diesem Zeitpunkt vor allem in der Leber stattfindet. Es konnte eine signifikante Reduktion der hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) festgestellt werden und zusätzlich war die langfristige Repopulation der FUBP1-/--Stammzellen im Knochenmark in Transplantationsexperimenten reduziert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von FUBP1 in einem weiteren Stammzellsystem analysiert und gleichzeitig seine Bedeutung in anderen Zelltypen der frühen Embryonalentwicklung untersucht.
Die Quantifizierung der FUBP1 Expression in den ESCs und während der Differenzierung zu sogenannten `embryoid bodies` (EBs) zeigten eine starke Expression auf mRNA- und auf Proteinebene. Nach der erfolgreichen Optimierung der Differenzierung von murinen ESCs wurden Fubp1 „knockout“ (KO) ESC Klone mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technologie etabliert. Die molekularbiologische Analyse der ESCs zeigte eine signifikante Erhöhung der Oct4 mRNA-Expression, während Nanog und die Differenzierungsmarker Brachyury, Nestin und Sox17 unverändert und in vergleichbarer Menge zu den Kontrollen vorhanden waren. Während der Differenzierung der Fubp1 KO Klone zu EBs zeigte sich eine signifikante Reduktion mesodermaler Marker wie Flk-1, SnaiI, Snai2, Bmp4 und FgfR2. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Analysen bestätigte sich die verzögerte Bildung mesodermaler Zellen (Brachyury- und Flk-1-exprimierender Zellen) in den Fubp1 KO Klonen der EBs an den Tagen 3, 4 und 5 nach Beginn der Differenzierung.
Die Anwendung einer Ko-Kultivierung auf OP9 Zellen zur Differenzierung der ESCs in hämatopoetische Linien sollte zeigen, ob der Fubp1 KO ESCs ein Defekt in der frühen Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen zu beobachten ist. Erneut konnte am Tag 5 der ESC-Differenzierung in der OP9 Ko-Kultur eine signifikante Reduktion der mesodermalen (Flk-1+) Zellen festgestellt werden. Die weitere Differenzierung zu hämatopoetischen CD45+ Zellen zeigte jedoch keinen Unterschied im prozentualen Anteil CD45+ Zellen am Tag 12 der Differenzierung. Auch die gezielte Differenzierung zu erythroiden Zellen durch Zugabe des Zytokins EPO zum Medium zeigte keinen signifikanten Unterschied im Differenzierungsgrad der erythroiden Zellen zwischen Kontroll- und Fubp1 KO Klonen.
In weiteren Experimenten habe ich in dieser Arbeit die Expression von FUBP1 in WT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 der Embryonalentwicklung untersucht. Hierbei zeigte sich in beiden Entwicklungsstadien eine immunhistochemische Anfärbung von FUBP1 in den meisten Zellen des Embryos. Die Annahme, dass die Abwesenheit von FUBP1 in der Embryonalentwicklung zu verstärkten apoptotischen Vorgängen führen könnte und gleichzeitig die massive Expansion von Zellen gestört sein könnte wurde mit Hilfe immunhistochemischer Färbung von „cleaved Caspase 3“ (Apoptosemarker) und „Ki-67“ (Proliferationsmarker) in den homozygoten Fubp1 GT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 nicht bestätigt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die Regulation von Apoptose und Proliferation durch FUBP1 während der Embryonalentwicklung nicht die Hauptrolle von FUBP1 darstellt. Es zeigte sich jedoch, dass FUBP1 als Transkriptionsregulator wichtig für die mesodermale Differenzierung von ESCs ist. Zu beobachten war, dass es in den FUBP1-defizienten ESCs zu einer Verzögerung der mesodermalen Differenzierung kommt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass FUBP1 essenziell für die Selbsterneuerung von HSCs ist. Dies macht deutlich, dass FUBP1 neben der Proliferation und Apoptose ein breiteres Spektrum an Signalwegen reguliert, die für Stammzellen und deren Differenzierung von Bedeutung sind.
Die vorliegende Studie vermittelt einen epidemiologischen Überblick über das mit Haut- und Nagelläsionen assoziierte Pilzspektrum im Westen Panamas. Hierzu wurden Proben von vermutlich durch Pilzinfektionen verursachten Haut- sowie Nagelläsionen gesammelt und zum Anlegen von Kulturen verwendet. Die isolierten Pilze wurden basierend auf dem D-H-S System (Rieth), anhand morphologischer Merkmale, rDNA Sequenzdaten sowie phylogenetischen Analysen klassifiziert und mit Hilfe von Literaturdaten sowie physiologischen Eigenschaften als saprotrophe, opportunistische oder pathogene Organismen beurteilt. In Panama wurden 52 Proben von 51 Personen gesammelt, wobei das Material von 42 Haut- und Nagelläsionen der Füße, vier Läsionen der Fingernägel, zwei Chromomykosen, einer Tinea nigra und drei sonstigen Hautläsionen stammt. Bei 75 Prozent (n = 39) der Proben konnten Pilze kultiviert und insgesamt 201 Pilzstämme isoliert und subkultiviert werden. Hiervon wurden 50 Isolate (24,9 %) als Dermatophyten, 24 Stämme (11,9 %) als Hefen und 127 Isolate (63,2 %) als Schimmelpilze klassifiziert. Bei 19 Probanden (48,7 %) konnten Dermatophyten isoliert werden, wobei aus dem Probenmaterial von 12 Personen (63,2 %) ebenfalls andere Pilzarten nachgewiesen wurden. Von zwei Läsionen (5,1 %) wurden nur Hefen isoliert, wobei einmal eine Schwarze Hefe kultiviert wurde. In dem Material acht weiterer Proben (20,5 %) wurden Schimmelpilze und Hefestämme nachgewiesen und bei zehn Probanden (25,6 %) konnten aus dem Probenmaterial nur Schimmelpilze kultiviert werden. 172 Isolate wurden taxonomisch klassifiziert und 44 Arten aus 25 Gattungen, 17 Familien, 15 Ordnungen, sechs Klassen sowie den Abteilungen Ascomycota oder Basidiomycota zugeordnet. Die Ascomyceten stellen mit 164 Stämmen 40 verschiedener Arten aus 23 Gattungen, 15 Familien, 11 Ordnungen und vier Klassen die am häufigsten isolierte und vielfältigste Gruppe dar, während die Basidiomycota nur mit acht Isolaten vier verschiedener Arten zwei unterschiedlicher Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen nachgewiesen wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Panama die anthropophilen Dermatophyten Trichophyton rubrum und T. interdigitale dokumentiert, wobei T. rubrum die am häufigsten isolierte Art darstellt. Kultivierte Hefen waren Candida albicans, C. duobushaemulonii, C. tropicalis, Hortaea werneckii, Sporobolomyces sp., Trichosporon asahii, T. japonicum und T. montevideense. Die Schimmelpilze stellen die größte und ökologisch diverseste Organismengruppe der kultivierten Pilze dar. So wurden von den untersuchten Läsionen sowohl humanpathogene Erreger, als auch opportunistische Arten und rein saprotrophe Pilze sowie mehrere Vertreter wahrscheinlich bisher nicht wissenschaftlich beschriebener Arten bzw. Gattungen nachgewiesen. Aus dem Probenmaterial wurden die Pilze Acremonium collariferum, Aspergillus awamori, A. clavatus, A. flavus, A. giganteus, A. heteromorphus, A. niger, A. ochraceus, A. sclerotiorum, A. versicolor, Chaetomium globosum, Chrysosporium tuberculatum, Cladosporium sphaerospermum, C. tenuissimum, Curvularia geniculata, C. lunata, Fonsecaea pedrosoi, Fusarium oxysporum, F. solani, Lophotrichus bartlettii, Microascus cinereus, Neoscytalidium dimidiatum, Penicillium commune, Scolecobasidium sp., Scopulariopsis carbonaria, S. croci, Verticillium cf. epiphytum und Wardomycopsis litoralis isoliert. Zudem wurden vier Isolate von zwei vermutlich neuen Arten der Gattung Acremonium (Bionectriaceae, Hypocreales), zwei Stämme mit einer genetischen Affinität zu der Gattung Cryptendoxyla (Cephalothecaceae, Sordariales) und jeweils ein mit den Gattungen Fusicladium (Venturiaceae, Venturiales), Knufia (Trichomeriaceae, Chaetothyriales) bzw. Rhexothecium (Eremomycetaceae, Dothideomycetidae) assoziierter Stamm kultiviert. Im Rahmen dieser Studie wurden A. giganteus, C. tenuissimum, L. bartlettii, S. carbonaria, S. croci, V. epiphytum und W. litoralis erstmalig von Mykosen des Menschen dokumentiert und die in der Literatur als Verursacher sowie Besiedler von Haut- und Nagelläsionen beschriebenen Organismen A. clavatus, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, C. tropicalis, C. globosum, C. sphaerospermum, C. lunata, F. oxysporum, M. cinereus, P. commune, T. asahii, T. japonicum und T. montevideense wurden das erste Mal in klinischem Probenmaterial aus Panama nachgewiesen. Die Arten A. awamori, A. heteromorphus, C. globosum, C. tenuissimum, L. bartlettii, M. cinereus, P. commune, S. croci, T. asahii, T. japonicum, T. montevideense, V. epiphytum, W. litoralis und die Gattung Scolecobasidium wurden zudem erstmalig für Panama dokumentiert. Die Isolation von W. litoralis ist ebenfalls der erste Nachweis dieses Pilzes außerhalb von Spanien und auf dem amerikanischen Kontinent. Die große Anzahl im Rahmen dieser Arbeit beschriebener, bisher für die Wissenschaft unbekannter bzw. nicht in Panama dokumentierter Pilzarten lässt auf eine große mykologische Biodiversität in Panama schließen und zeigt den Bedarf weiterer Forschung.
In the adult mammalian brain stem cells within defined neurogenic niches retain the capacity for lifelong de novo generation of neurons. The subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles and the subgranular layer (SGL) of the hippocampal dentate gyrus (DG) have been identified as the two major sites of adult neurogenesis. Moreover, the third ventricle in the hypothalamus is emerging as a new neurogenic niche in the adult brain. Extracellular purine and pyrimidine nucleotides are involved in the control of both embryonic and adult neuro-genesis. These nucleotides act via ionotropic P2X or metabotropic P2Y receptors and studies of the adult SVZ and the DG provide strong evidence that ATP promotes progenitor cell proliferation in this stem cell rich regions. Previous studies have shown that the extracellular nucleotide-hydrolyzing enzyme NTPDase2 is highly expressed by adult neural stem and progenitor cells of the SVZ and the rostral migratory stream (RMS), the hippocampal SGL, and the third ventricle. NTPDase2 preferentially hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates (NTPs) and, to a lower extent, diphosphates, thus modulating their effect on nearby nucleotide receptors. Deletion of the enzyme increases extracellular NTP concentrations, and might indicate roles of purinergic signaling in adult neurogenesis. As shown by enzyme histochemistry, genetic deletion of NTPDase2 essentially eliminates ATPase activity in neurogenic niches but does not affect protein expression levels and activity of other ectonucleotidases. Lack of NTPDase2 leads to expansion of the hippocampal stem cell pool as well as of the inter-mediate progenitor type-2 cells. Cell expansion is lost at around type-3 stage, paralleled by increased labeling for caspase-3, indicating increased apoptosis, and decreased levels in CREB phosphorylation in doublecortin-expressing cells, diminishing survival in this cell population. In line with increased cell death, P2Y12 receptor-expressing microglia is enriched at the hilus orientated side of the granule cell layer. These data strongly suggest that NTPDase2 functions as central homeostatic regulator of nucleotide-mediated neural progenitor cell proliferation and expansion in the adult brain by balancing extracellular nucleotide concentrations and activation of purinergic receptors.
In order to further characterize the role of purinergic signaling in adult neurogenesis, the ADP-sensitive P2Y13 receptor was identified as a potential candidate whose activation might inhibit neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus and the newly identified neurogenic niche at the third ventricle. Deletion of P2ry13 increased progenitor cell proliferation and long-term progenitor survival as well as new neuron formation in the hippocampal neurogenic niche. This was further paralleled by increased thickening of the granule cell layer, CREB phosphorylation, and expression of the neuronal activity marker c-Fos. Increased progenitor cell proliferation and progenitor survival persist in aged P2ry13 knockout animals. However, in the ventral dentate gyrus proliferation and expansion levels of progenitor cells did not differ significantly from the wild type. This study strongly supports the notion that extracellular nucleotides significantly contribute to the control of adult neurogenesis in the dentate gyrus in situ. Data in this work suggest that activation of the P2Y13 receptor dampens progenitor cell proliferation, new neuron formation, and neuronal activity. In contrast to several in vitro studies and studies in the SVZ in situ, a contribution of the ATP/ADP-sensitive P2Y1 receptor could not be confirmed in the dentate gyrus in vivo.
To unravel implications of purinergic signaling and P2Y13 receptor action in the control of adult hypothalamic neurogenesis a pilot study was performed. Mice null for P2ry13 revealed increased progenitor cell proliferation at the third ventricle as well as long-term progeny survival and new neuron formation in the hypothalamus. In contrast to results obtained in the dentate gyrus expression of the neuronal activity marker c-Fos was significantly decreased in hypothalamic nuclei, indicating increased inhibition of appetite-regulating neuronal circuits by surplus neurons in knockout animals. These data provide first evidence that extracellular nucleotide signaling contributes to the control of adult hypothalamic neurogenesis in situ. Activation of the P2Y13 receptor inhibits progenitor cell proliferation, long-term survival and neuron formation and therefore controls inhibition of appetite-regulating circuits in the adult rodent hypothalamus.
Juvenile neuronal ceroid-lipofuscinosis (JNCL) is a rare lysosomal storage disease in children with lethal outcome and no therapy. The origin of JNCL has been traced to autosomal recessive mutations in the CLN3 gene, and ~85% of the JNCL patients harbor a 1.02 kb deletion that removes the exons 7 and 8 and the surrounding intronic DNA (CLN3Δex7/8). So far, structure, function and localization of the CLN3 protein remain elusive. However, there is strong evidence that CLN3 modulates a process or condition that is essential in many cellular pathways. Lipid metabolism and antero-/retrograde transport, two mechanisms CLN3 was previously implicated in, fulfill these requirements. Notably, also a bioactive group of glycosphingolipids referred to as gangliosides is tightly interrelated with these functions. Furthermore, a-series gangliosides have been shown to be involved in the development and sustenance of the brain, where they are essential for neurite outgrowth and cell survival. Defects in ganglioside metabolism were shown to play a crucial role in many lysosomal storage disorders. However, the contribution of gangliosides to NCL pathology is largely unknown.
The present study analyzed central enzymes and metabolites of the a-series ganglioside pathway in a JNCL cell model. The core finding was, thereby, the reduced amount of the neuroprotective ganglioside GM1 in homozygous CbCln3Δex7/8 cells. This was caused by the enhanced action of the GM1-degrading multimeric enzyme complex and in particular, by the upregulation of protein levels and increased enzyme activity of β-galactosidase (Glb1).
Improved binding of Glb1 to substrate-carrying membranes was provided by an increase in LBPA levels. In combination with other smaller alterations in the ganglioside pattern, a shift towards less complex gangliosides became present. The resulting loss of neuroprotection may be the reason for the multifocal pathology in homozygous CbCln3Δex7/8 cells.
The second part of the present study investigated the cellular mechanisms behind the altered ganglioside profile with regard to the potential role of CLN3. Here, the anterograde transport of GM1 to the plasma membrane presented a positive correlation with the amount of full-length CLN3. In case of the truncated protein this correlation was missing, resulting in reduced PM staining with CTxB-FITC. However, transfection of full-length CLN3 in these cells restored the CTxB-FITC intensity. Based on the neuroprotective role of GM1, the corresponding increase in GM1 levels may be the cause for the restoration effects observed in previous studies using full-length CLN3. Hence, administration of GM1 was expected to improve cell viability of homozygous CbCln3Δex7/8 cells and beyond that to rescue potentially some disease phenotypes. However, no effect could be observed. The reason for this may be reduced caveolar uptake and the mislocalization of ganglioside GM1 to the trans-Golgi network (TGN) and redirection towards degradative compartments.
Both are in line with the idea of an impaired endocytic flux in CLN3 deficiency. The observed localization of CLN3 in the TGN suggests a potential role for CLN3 in the lipid sorting machinery, subsequently altering membrane composition and its regulatory functions. The resulting imbalance may affect many of the cellular processes impaired in JNCL.
Rhythms, i.e. periodic sequences of events or states, are a ubiquitous feature of physiological systems such as the heart, the lungs or the brain. For the brain in particular, the diversity of rhythms is remarkable, ranging from low frequency rhythms in the slow/delta band (0.5-4 Hz) during sleep to gamma band oscillations (30-120 Hz) rhythms during alert behavior, all expressed in various brain areas and at various spatial scales. To understand whether these rhythms subserve a function for the organism it is important to also understand the underlying mechanisms that generate them. While the generation of some rhythms appear to be well-understood, e.g. sleep spindles, others such as the cortical beta rhythm (13-30 Hz) have remained elusive.
Understanding the generation of a brain rhythm involves multiple spatial scales, from identifying intracellular mechanisms such as the contribution of individual transmembrane currents to studying how specific neuronal populations or areas affect the full physiological rhythm present in the intact, highly interconnected brain. The aim of this work has been to delineate the mechanistic contributions of individual brain areas to the in vivo generation of two particular rhythms present in efferent areas: (1) The first part of this work studies the influence of thalamocortical neurons on cortical slow/delta waves (0.5-4 Hz) of sleep that are sometimes also present in awake animals. (2) The second part is about the contribution of primary visual cortex to the beta rhythm (13-30 Hz) in extrastriate cortex of awake behaving animals.
Soil fungal communities are an essential element in the terrestrial ecosystem, however their response to ongoing anthropogenic climate change is currently poorly understood. Fungi are one of the most abundant groups of microbes in soil, they are mainly responsible for the decomposition of organic matter (Baldrian et al., 2012; Buée et al., 2009). By binding carbon in soil, fungi thus maintain an important role in the global carbon cycle (Bardgett et al., 2008). Future climates are likely to influence the communities of belowground microbial organisms (Castro et al., 2010; Deacon et al., 2006). However, how these communities are affected in their diversity, composition, and function after environmental perturbation is insufficiently known.
Molecular techniques using high-throughput sequencing are presently revolutionizing the analysis of complex communities, such as soil fungi. High-throughput metabarcoding enables the recovery of DNA sequence data directly from environmental samples, and DNA sequences from entire communities present in these samples can be simultaneously recovered through massively parallel sequencing reactions (Bik et al., 2012; Taberlet et al., 2012b). This results in more accurate estimation of diversity and community composition and thus provides unprecedented insight into cryptic communities (Lindahl and Kuske, 2014). Yet, challenges associated with these novel techniques include the bioinformatic processing, and the ecological analyses of the large amount of sequence data generated. Most biologists without explicit training in bioinformatics spend a fair amount of time learning how to filter raw sequence data, and customize bioinformatics pipelines specific to their project. To improve the quality of data treatment, and decrease the time needed for the analyses, it is desirable to have bioinformatics pipelines that are easy to use, well explained to researchers not trained in bioinformatics, and adaptable to individual research needs...
Bartonella Adhäsin A (BadA), das zur Gruppe der TAAs gehört, ist ein essentieller Pathogenitätsfaktor von B. henselae und übernimmt während des Infektionsverlaufs wichtige Funktion wie Autoagglutination, Adhärenz an ECM-Proteine und Endothelzellen. BadA weist die für die für die Proteinklasse der TAAs charakteristische modulare Architektur bestehend aus N-terminaler Kopf-Domäne, Stiel-Domäne, Hals-Domäne und C-terminaler Membrananker-Domäne auf. Der modulare Aufbau des Proteins deutet daraufhin, dass bestimmte Domänen mit bestimmten biologischen Funktionen des Proteins verknüpft sind. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurden Deletionsmutanten des BadA generiert.
Die Generierung weiterer BadA-Deletionsmutanten wird durch das langsame Wachstum des Erregers und die geringe Auswahl an molekularbiologischen Werkzeugen zur genetischen Manipulation von B. henselae erschwert. Daher sollte in ersten Teil dieser Arbeit ein Expressionsmodell für Deletionsmutanten des BadA etabliert und charakterisiert werden. Dies sollte am Beispiel des trunkierten BadA, BadA HN23, durchgeführt werden. Hierzu sollten drei Hybrid-Varianten des BadA HN23 erstellt werden: (i) Austausch der BadA-Signalsequenz gegen die E. coli OmpA-Signalsequenz, (ii) Austausch der BadA-Membrananker-Domäne gegen die YadA-Membrananker-Domäne sowie (iii) Austausch von sowohl der BadA-Signalsequenz als auch der BadA-Membrananker-Domäne gegen die bereits genannten Elemente. Danach sollten die konstruierten BadA HN23 Hybride und das BadA HN23 in induzierbare Expressionsvektoren kloniert und spezielle E. coli-Expressionsstämme mit diesen Plasmiden transformiert werden. Bei erfolgreicher Expression sollten die optimalen Bedingungen für die Expression (Temperatur, Induktorkonzentration) ermittelt werden und an-schließend die biologische Funktion der heterolog exprimierten BadA HN23 Hybride überprüft werden.
Der erste Abschnitt der hier vorliegenden Arbeit zeigte folgende Ergebnisse:
1) Die beschrieben BadA HN23 Hybrid Konstrukte wurden durch Austausch von: (i) BadA-Signalsequenz gegen E. coli OmpA-Signalsequenz im BadA HN23,
(ii) BadA-Membrananker-Domäne gegen YadA-Membrananker-Domäne im BadA HN23 und
(iii) Austausch von BadA-Signalsequenz und BadA-Membrananker-Domäne gegen E. coli OmpA-Signalsequenz und YadA-Membrananker-Domäne im BadA HN23 generiert.
Die BadA HN23 Hybride und BadA HN23 wurden in Expressionsvektoren kloniert und E. coli Omp2, E. coli Omp8 und E. coli Omp8ΔdegP transformiert.
2) Alle BadA HN23 Hybrid-Konstrukte und BadA HN23 lagen in einer monomeren und trimeren Form vor.
3) Durch IFT und - Durchflusszytometrie-Untersuchungen wurde die Oberflächenexpression der einzelnen Konstrukte quantifiziert. Es zeigte sich, dass es deutliche Unterschiede in der Menge des auf der Zelloberfläche befindlichen jeweiligen BadA HN23 Proteins gab. Dabei wiesen die Konstrukte, die die YadA-Membrananker-Domäne besaßen (BadA HN23 Hybrid 2 und 3), die stärkste Oberflächenexpression auf.
4) Die biologische Funktion des BadA HN23 wurde mittels des E. coli Omp2 BadA HN23 Hybrid 3 charakterisiert. Heterolog exprimiertes BadA HN23 vermittelt Autoagglutination, die Adhärenz des Expressionsstammes an Kollagen G und Endothelzellen.
5) Die Expression des BadA HN23 führt zur signifikant verstärkten in-vivo-Pathogenität im Galleria mellonella-Infektionsmodell.
6) Das E. coli-Expressionsmodell lieferte keine Aussage über eventuelle immunodominate Funktionen des heterolog exprimierten BadA HN23, da auch mit im IFT als anti- B. henselae negativ eingestuften Patientenseren im WB ein BadA HN23 spezifisches Bandensignal detektiert wurde. Dot Blot-Experimente ermöglichten ebenfalls keine Aussage über eventuelle immunodominate Funktion des nativen BadA HN23, da das verwendete anti-B. henselae-positive Patientenserum unspezifische Reaktion gegenüber dem Kontrollstamm zeigte.
Für verschiedene TAAs ist beschrieben worden, dass sie die Serumresistenz der exprimierenden Spezies vermitteln. Daher sollte im zweiten Teil dieser Arbeit der Einfluss von BadA auf eventuelle Serumresistenz zweier B. henselae-Isolate untersucht werden. Dieser Teil lieferte folgende Ergebnisse:
1) B. henselae zeigte Sensitivität gegenüber normalem humanem Serum.
2) Sowohl BadA-positive als auch BadA-negative B. henselae-Isolate können Komplementinhibitoren wie Faktor H binden. Die dabei gebundene Menge ist relativ klein.
Die Expression von Deletionsmutanten des BadA in E. coli ist ein vielversprechendes Modell zur Analyse der Domänen-Funktionsbeziehung des BadA, da die meisten biologischen Funktionen einer homolog exprimierten BadA-Deletionsmutante reproduziert werden konnten und es sich bei E. coli um ein schnell wachsendes Bakterium, das sich leicht genetisch manipulieren lässt, handelt. Allerdings stellt das zytotoxische LPS des E. coli sowie das schnelle Wachstums der Bakterien eine Limitation des Expressionssystems dar, indem es Untersuchungen zum Einfluss der jeweiligen BadA-Deletionsmutante auf die Induktion der proangiogenetischen Wirtszellantwort verhindert oder Untersuchungen zum Einfluss der jeweiligen BadA-Deletionsmutante auf die Adhärenz an Endothelzellen deutlich erschwert. Außerdem kann eine mögliche Interaktion zwischen BadA bzw. BadA-Deletionsmutanten und dem TIVSS und zwischen BadA bzw. BadA-Deletionsmutanten und weiteren Adhäsinen (wie z.B. dem FHA) mit Hilfe dieses Expressionssystems nicht untersucht werden. Dies wäre nur im B. henselae Wildtyp-Stamm möglich.
This thesis describes the adaptation of Acinetobacter species to dry environments with the soil bacterium A. baylyi and the opportunistic hospital pathogen A. baumanii in its focus. The adaptation of A. baylyi and A. baumannii to osmotic stress was investigated. Compatible solutes that were uptaken from the environment or synthesized de novo to cope with the loss of water at high salinity were identified. The corresponding transporters and enzymes involved were characzerized. In addition, the desiccation resistance of A. baumannii was analyzed to elucidate its survival in hospital environments. The usage of compatible solutes during desiccation stress was analyzed and proteins that were produced were identified.
The availability of water is essential for bacterial life and if environmental conditions are awkward, bacteria have to cope with high salinitiy to prevent loss of water. In this thesis it was shown that A. baylyi synthesizes glutamate and mannitol de novo as compatible solutes in response to osmotic stress to balance the osmotic potential. The pathway for mannitol biosynthesis from Fructose-6-Phosphate (F-6-P) via Mannitol-1-Phosphate (Mtl-1-P) was elucidated and the isolation and characterization of a novel type of biofunctional enzyme was described. Interestingly, the unique bifunctional enzyme MtlD, acting as dehydrogenase and phosphatase, mediates both steps of the mannitol biosynthesis pathway. This enzyme catalyzes the reduction of F-6-P to Mtl-1-P with NADPH as reducing equivalent. The dehydrogenase activity of MtlD was salt dependent and the phosphatase activity was dependent on Mg2+ as cofactor. Phylogenetic analyses revealed that MtlD is broadly distributed among other Acinetobacter strains but not in other phylogenetic tribes.
In this thesis it is also described that, besides de novo synthesis of compatible solutes, A. baylyi takes up glycine betaine (GB) or its precursor choline by different transport systems and uses this solutes as osmoprotectants. The uptake of GB occurs via a secondary transporter (ACIAD3460) of the BCCT family. Choline is taken up as precursor and oxidized to GB by two dehydrogenases. The uptake and use of choline as GB precursor involves two transporters, whose genes are encoded in the bet cluster (BetT1, BetT2), two dehydrogenases (BetA, BetB) and a regulatory protein (BetI). Both transporters differ from each other in structure and function: BetT1 is osmo-independent and active independently of osmotic stress. BetT2 contains - in contrast to BetT1 - a long C-terminal domain for osmo-sensing and its activity highly increases in the presence of high osmolarity. The oxidation of choline occurs independently of the osmolarity of the medium but in the absence of salt stress, GB is exported. In contrast, in the presence of high salinity, GB is accumulated in the cytoplasm to balance the osmotic potential in order to prevent loss of water. The regulation of both transporters, the uptake of choline independently of the osmolarity and the export of GB under isoosmotic conditions are regulated by the transcriptional regulator BetI.
A. baumannii ATCC 19606 was also shown to cope with high salinity. Analogously to A. baylyi, A. baumannii ATCC19606 synthesizes glutamate and mannitol de novo in response to osmotic stress. The genes for the synthesis of these compatible solutes are identical to those found in A. baylyi. This suggests that the solute biosynthesis pathways of A. baumannii and A. baylyi are identical. A. baumannii was also able to take up GB and choline in response to osmotic stress and growth at high salinity was restored upon addition of GB and its precursor choline. The bet cluster was also present in the genome A. baumannii and also contains the two different choline transporters BetT1 and BetT2.
Our suggestion that choline or GB or the utilization of phosphatidylcholine as carbon source led to an increase in the survival under desiccation stress was not confirmed. However, 2D analysis of proteins produced during desiccation stress in A. baumannii led to elevated amounts of proteins implicated in biofilm formation, regulation, cell morphology and general stress response, such as Hsp60 or superoxide dismutase, both might play a role in general stress protection.