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Calreticulin is a Ca2+ -binding chaperone that resides in the lumen of the endoplasmic reticulum and is involved in the regulation of intracellular Ca2+ homeostasis and in the folding of newly synthesized glycoproteins. In this study, we have used site-specific mutagenesis to map amino acid residues that are critical in calreticulin function. We have focused on two cysteine residues (Cys(88) and Cys(120)), which form a disulfide bridge in the N-terminal domain of calreticulin, on a tryptophan residue located in the carbohydrate binding site (Trp(302)), and on certain residues located at the tip of the "hairpin-like" P-domain of the protein (Glu(238), Glu(239), Asp(241), Glu(243), and Trp(244)). Calreticulin mutants were expressed in crt(-/-) fibroblasts, and bradykinin-dependent Ca2+ release was measured as a marker of calreticulin function. Bradykinin-dependent Ca2+ release from the endoplasmic reticulum was rescued by wild-type calreticulin and by the Glu(238), Glu(239), Asp(241), and Glu(243) mutants. The Cys(88) and Cys(120) mutants rescued the calreticulin-deficient phenotype only partially ( approximately 40%), and the Trp(244) and Trp(302) mutants did not rescue it at all. We identified four amino acid residues (Glu(239), Asp(241), Glu(243), and Trp(244)) at the hairpin tip of the P-domain that are critical in the formation of a complex between ERp57 and calreticulin. Although the Glu(239), Asp(241), and Glu(243) mutants did not bind ERp57 efficiently, they fully restored bradykinin-dependent Ca2+ release in crt(-/-) cells. This indicates that binding of ERp57 to calreticulin may not be critical for the chaperone function of calreticulin with respect to the bradykinin receptor.
LIN-2/7 (L27) domains are protein interaction modules that preferentially hetero-oligomerize, a property critical for their function in directing specific assembly of supramolecular signaling complexes at synapses and other polarized cell-cell junctions. We have solved the solution structure of the heterodimer composed of the L27 domains from LIN-2 and LIN-7. Comparison of this structure with other L27 domain structures has allowed us to formulate a general model for why most L27 domains form an obligate heterodimer complex. L27 domains can be divided in two types (A and B), with each heterodimer comprising an A/B pair. We have identified two keystone positions that play a central role in discrimination. The residues at these positions are energetically acceptable in the context of an A/B heterodimer, but would lead to packing defects or electrostatic repulsion in the context of A/A and B/B homodimers. As predicted by the model, mutations of keystone residues stabilize normally strongly disfavored homodimers. Thus, L27 domains are specifically optimized to avoid homodimeric interactions.
The transporter associated with antigen processing (TAP)-like (TAPL, ABCB9) belongs to the ATP-binding cassette transporter family, which translocates a vast variety of solutes across membranes. The function of this half-size transporter has not yet been determined. Here, we show that TAPL forms a homodimeric complex, which translocates peptides across the membrane. Peptide transport strictly requires ATP hydrolysis. The transport follows Michaelis-Menten kinetics with low affinity and high capacity. Different nucleotides bind and energize the transport with a slight predilection for purine bases. The peptide specificity is very broad, ranging from 6-mer up to at least 59-mer peptides with a preference for 23-mers. Peptides are recognized via their backbone, including the free N and C termini as well as side chain interactions. Although related to TAP, TAPL is unique as far as its interaction partners, transport properties, and substrate specificities are concerned, thus excluding that TAPL is part of the peptide-loading complex in the classic route of antigen processing via major histocompatibility complex class I molecules.
Benzene solutions of Me3SnCl when exposed to moisture yield the adduct Me3SnCl·Me3SnOH·H2O. This adduct represents an intermediate in Me3SnCl hydrolysis. The structure of Me3SnCl·Me3SnOH·H2O features an array of Me3Sn units connected alternatingly by bridging Cl and OH ligands.
The NO/cGMP pathway inhibits Rap1 activation in human platelets via cGMP-dependent protein kinase I
(2005)
The NO/cGMP signalling pathway strongly inhibits agonist-induced platelet aggregation. However, the molecular mechanisms involved are not completely defined.We have studied NO/cGMP effects on the activity of Rap1, an abundant guanine-nucleotidebinding protein in platelets. Rap1-GTP levels were reduced by NO-donors and activators of NO-sensitive soluble guanylyl cyclase. Four lines of evidence suggest that NO/cGMP effects are mediated by cGMP-dependent protein kinase (cGKI): (i) Rap1 inhibition correlated with cGKI activity as measured by the phosphorylation state ofVASP, an established substrate of cGKI, (ii) 8-pCPT-cGMP, a membrane permeable cGMP-analog and activator of cGKI, completely blocked Rap1 activation, (iii) Rp- 8pCPT-cGMPS, a cGKI inhibitor, reversed NO effects and (iv) expression of cGKI in cGKI-deficient megakaryocytes inhibited Rap1 activation. NO/cGMP/cGKI effects were independent of the type of stimulus used for Rap1 activation.Thrombin-,ADPand collagen-induced formation of Rap1-GTP in platelets as well as turbulence-induced Rap1 activation in megakaryocytes were inhibited. Furthermore, cGKI inhibited ADP-induced Rap1 activation induced by the G a i -coupled P2Y12 receptor alone, i.e. independently of effects on Ca2+-signalling. From these studies we conclude that NO/cGMP inhibit Rap1 activation in human platelets and that this effect is mediated by cGKI. Since Rap1 controls the function of integrin a IIbß 3 , we propose that Rap1 inhibition might play a central role in the anti-aggregatory actions of NO/cGMP.
Antibody library technology represents a powerful tool for the discovery and design of antibodies with high affinity and specificity for their targets. To extend the technique to the expression and selection of antibody libraries in an eukaryotic environment, we provide here a proof of concept that retroviruses can be engineered for the display and selection of variable single-chain fragment (scFv) libraries. A retroviral library displaying the repertoire obtained after a single round of selection of a human synthetic scFv phage display library on laminin was generated. For selection, antigen-bound virus was efficiently recovered by an overlay with cells permissive for infection. This approach allowed more than 10(3)-fold enrichment of antigen binders in a single selection cycle. After three selection cycles, several scFvs were recovered showing similar laminin-binding activities but improved expression levels in mammalian cells as compared with a laminin-specific scFv selected by the conventional phage display approach. Thus, translational problems that occur when phage-selected antibodies have to be transferred onto mammalian expression systems to exert their therapeutic potential can be avoided by the use of retroviral display libraries.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Strukturen der Excisionase (Xis) aus dem Bakteriophagen HK022 sowie des Proteinkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der CuA-Domäne aus T. thermophilus mittels NMR in wässriger Lösung bestimmt. Im Falle der Excisionase wurde mit Hilfe isotopenmarkierter Proteinproben die vollständige Zuordnung der 1H-, 15N- und 13C-Resonanzen durchgeführt. Hierauf basierend wurden anhand verschiedener zwei- und dreidimensionaler NOESY Spektren insgesamt 902 Abstandsbeschränkungen identifiziert, mit deren Hilfe die räumliche Struktur des Proteins bestimmt werden konnte. Die Strukturrechnungen ergaben letztendlich ein Strukturensemble von 20 Konformeren, die aus 2 alpha-Helices und 5 beta-Faltblattsträngen aufgebaut sind. Die beta-Faltblattstränge bilden 2 antiparalelle beta-Faltblätter, während die beiden alpha-Helices eine L-Formation darstellen. Die letzten 12 Aminosäurereste am C-Terminus zeigten keine NOEs und besaßen folglich auch keine geordnete Struktur. Dennoch ist dieser C-terminale Teil der Sequenz möglicherweise von physiologischem Interesse, da für den Rest 66 eine Asn/IsoAsp- Isomerisierung beobachtet wurde, welche eine Rolle bei der Autoregulation dieses Proteins in vivo spielen könnte. Ein weiteres markantes Strukturelement der Excisionase ist das Triprolinsegment Pro32-Pro33-Pro34, das die beiden beta-Faltblätter miteinander verbindet. Diese drei Prolinreste liegen in einer cis-trans-trans Konformation vor; aufgrund von Ligandenwechselwirkungen verschiedener anderer Proteine, die ein solches Motiv besitzen, liegt die Vermutung nahe, daß diese Region in der spezifischen Protein-Protein-Interaktion, die während der exzisiven Rekombination stattfindet, eine Schlüsselrolle spielen könnte. Zur Untersuchung der Wechselwirkung von Cytochrom c552 mit der CuA-Domäne wurden beide löslichen Fragmente mit dem 15N-Isotop angereichert. Daraufhin konnten für jedes Protein heteronukleare NMR-Experimente durchgeführt werden, die eine vollständige Zuordnung der Amidresonanzen sowohl im reduzierten als auch im paramagnetischen oxidierten Zustand ermöglichte. Basierend auf diesen Resonanzzuordnungen konnten Veränderungen der chemischen Verschiebungswerte aufgrund von Oberflächenkontakten mit dem jeweiligen Redoxpartner mittels 2D [15N, 1H]-TROSY Experimenten in beiden Redoxzuständen ermittelt werden. Die betroffenen Aminosäurereste, welche an der Moleküloberfläche die Kontaktzone definieren, wurden für eine Docking-Rechnung herausgezogen, um letztendlich die räumliche Struktur des Elektronentransferkomplexes zwischen Cytochrom c552 und der ba3-Oxidase zu bestimmen. Interessanterweise traten beim Cytochrom c552 zusätzlich zu den Verschiebungseffekten auf der Moleküloberfläche im reduzierten Zustand auch noch sehr dominante Sekundäreffekte im hinteren Teil der Hämspalte an der Stelle auf, wo das Propionat A über Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Protein verbunden ist. Analog zu dem System aus P. denitrificans befindet sich auch im Cytochrom c552 aus T. thermophilus in dieser Position ein aromatischer Ring, der vermutlich von elektronischen Veränderungen im Hämring beeinflußt wird und diese Effekte durch seinen somit veränderten Ringstrom an die unmittelbare Umgebung weitergibt. Diese experimentellen Daten unterstützen die Elektronendelokalisierungstheorie von Wikström und Mitarbeitern (Johansson et al., 2002a und b), wonach im reduzierten Häm ein Teil der Elektronenladung bis in die Peripherie des Hämrings delokalisiert ist, einschließlich der nichtkonjugierten Propionatreste. Aus vorangegangenen Studien ergab sich bereits, daß der Elektronentransferkomplex in T. thermophilus auf hydrophoben Wechselwirkungen beruht, im Gegensatz zum P. denitrificans System, in dem die Interaktion elektrostatischer Natur ist (Maneg et al., 2003). Tatsächlich weist die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des Elektronentranferkomplexes einen hohen Anteil (ca. 40%) an unpolaren Kontaktoberflächen auf. Das Cytochrom c552 bindet dabei an die CuA-Domäne nahe dem CuA-Zentrum, so daß der Abstand zwischen den Metallzentren von Donor und Akzeptor 15,6 Å beträgt. Der Hämring des Cytochrom c552 berührt die CuA-Domäne im Bereich von Phe86 und Phe88, wie bereits von Soulimane et al. (2000) aufgrund der Sequenzhomologie mit dem P. denitrificans System postuliert worden war. Wie jedoch aus dem berechneten Elektronentransferweg hervorgeht, ist die aromatische Seitenkette des Phe88 nicht unbedingt in die Elektronenübertragung einbezogen. Der ca. 19-20 Å lange Weg des Elektrons führt wahrscheinlich vom Häm über das Proteinrückgrat der CuAReste Ala87 und Phe88 zum CuA-Zentralliganden His114 und schließlich zum binuklearen Kupferzentrum. Dies erklärt auch, wieso eine F88L Mutation der CuA-Domäne (Maneg et al., 2003) nur zu einer 50%igen Abnahme der Aktivität geführt hat. Hiermit ist nun für das T. thermophilus System der gesamte Weg der Elektronenübertragung vom Cytochrom c552 über die CuA-Domäne zur Untereinheit I der ba3-Oxidase in den Grundzügen aufgeklärt, da der Elektronentransfer vom CuA- zum CuB-Zentrum bereits zuvor beschrieben worden war (Soulimane et al., 2000).
In einer Vielzahl von Tumoren begründet sich die maligne Transformation der Zellen in einer Überexpression der ErbB2-Rezeptortyrosinkinase. Aufgrund der erhöhten ErbB2-Rezeptordichte auf der Zelloberfläche wird durch die Aktivierung des Rezeptors eine starke Proliferation der Zellen ausgelöst, welche invasiv in gesundes Gewebe eindringen. Dieses starke Wachstum wird über die Aktivierung ErbB2-vermittelter Angiogenese sichergestellt und lässt sich durch die Verwendung von Chemotherapeutika nicht aufhalten. Auf diese Weise können sich diese malignen Zellen durch Metastasierung im ganzen Körper verteilen, was sich in einer 5 Jahres-Überlebensrate der Patienten von 5 % widerspiegelt. Die Inhibition der ErbB2-Rezeptor-Tyrosinkinase stellt somit durch ihre Rolle in der Tumorprogression, ein relevantes Ziel der modernen Tumormedizin dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die ErbB2-Tyrosinkinasedomäne in einem Hefe Zwei-Hybrid System verwendet, um spezifische Interaktionspartner zu isolieren, die mit der Funktion der Kinase interferieren. Bei den potentiellen Inhibitoren handelt es sich um Peptid-Aptamere. Dies sind randomisierte Peptide aus 12 bis 42 Aminosäuren, die in einer konstringierten Konformation in ein Gerüstprotein eingebaut sind. Als Gerüstprotein wurde das intrazelluläre Protein Thioredoxin verwendet, dessen aktives Zentrum als Schleife aus der Proteinstruktur ragt. In dieses aktive Zentrum wurden die randomisierten Peptide inseriert und für die Interaktion mit der Tyrosinkinase präsentiert. Durch die Klonierung einer optimierten PeptidAptamer Bibliothek gelang es einen Pool von 2 x 108 unterschiedlichen Peptiden zu konstruieren. Aus dieser Bibliothek konnten durch das Hefe Zwei-Hybrid System Peptid-Aptamere isoliert werden, die spezifisch mit dem ErbB2-Rezeptor interagierten. Diese in der Hefe gezeigte Interaktion wurde in vitro in GST-Pulldown und in vitro Co-IP Experimenten bestätigt. Damit die Funktion der Aptamere in Krebszellen analysiert werden konnte, wurden die Peptid-Aptamere über die lentivirale Transduktion und Proteintransduktion effizient in Zielzellen eingebracht. Mit Hilfe der Aptamer-Transduktion konnte die Rezeptor-Aptamer Interaktion durch Co-IP und Co-Lokalisationsuntersuchungen auch in ErbB2-exprimierende Zellen, wie SKBr3 und NIH#3.7, bestätigt werden. Zur Funktionsanalyse wurden die Aptamere ferner in MCF7 Zellen eingebracht und dort durch HRG die Aktivierung von ErbB2/ErbB3-Heterodimeren induziert. Diese Heterodimere übertragen über den PKB/AKT-Signalweg ein anti-apoptotischen Signal in die Zelle, welches zur Chemoresistenz-Entwicklung dieser Zellen beiträgt. Die ErbB2-induzierte Aktivierung des PKB/AKT-Signalweges konnte durch die Aptamer-Applikation verhindert werden. Im Folgenden wurden die Aptamere in MCF7 her2 Zellen transduziert. Bei MCF7 her2 Zellen handelt es sich um MCF7 Zellen, die stabil mit ErbB2 transfiziert wurden. Die daraus resultierende Überexpression des ErbB2 Rezeptors führt über die Induktion des AKT-Signalweges zur Resistenz der Zellen gegenüber Chemotherapeutika-Behandlung, wie Taxol. Durch Applikation der Aptamer wurden MCF7 her2 Zellen für die Taxol-Behandlung resensitiviert. Auf diese Weise wurden in der vorliegenden Arbeit Peptid-Aptamere isoliert, die mit der ErbB2-induzierter Chemoresistenz interferierten und damit in Kombination mit einer Taxol-Behandlung eine alternative Therapiemöglichkeit bieten.