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Diese Dissertation befasst sich mit Validierungsstrategien von Tests zur Erfassung studentischer Kompetenzen. Kompetenzen von Studierenden werden zu verschiedenen Zwecken erhoben. Dies beginnt beim Eintritt in das Studium durch Zulassungstests und wird im Studium fortgesetzt z.B. durch Tests zur Zertifizierung von Kompetenz (Benotung von Leistung) oder zur Zuteilung auf bestimmte Kurse (Einteilung in Sprachniveaus). Neben diesen internen Tests zur Erfassung studentischer Kompetenzen werden auch externe Tests genutzt um etwa die Lehre zu verbessern (Evaluation von Veranstaltungen). Die mit dem Einsatz von Tests verbundenen Konsequenzen können sowohl für Studierende als auch Lehrpersonen und Entscheidungsträger*innen schwerwiegend sein. Daher sollten Tests wissenschaftlichen Gütekriterien genügen.
Das wichtigste Kriterium für die Beurteilung von wissenschaftlichen Tests ist Validität. In dieser Dissertation wird ein argumentationsbasiertes Validierungsansatz verfolgt. In diesem wird nicht die Validität eines Tests untersucht, sondern die Plausibilität der Interpretation beurteilt, die mit den Testwerten verbunden ist. Bislang fehlt jedoch für viele der wissenschaftlichen Tests für den deutschen Hochschulbereich ein auf die Testwertinterpretation abgestimmtes Validitätskonzept.
In dieser Arbeit wird ein Validierungsschema vorgestellt, in das übliche Testnutzen der Erfassung studentischer Kompetenzen an deutschen Hochschulen eingeordnet werden können. Die Einordnung von Testnutzen in das Schema erlaubt die Ableitung von passenden Validitätsevidenzen. Im Fokus stehen das Verhältnis von Test zu 1) Konstrukt, 2) Lehre und 3) beruflichen Anforderungen.
Das Validierungsschema wird angewandt, um Testwertinterpretationen eines empirischen Forschungsprojektes zur Erfassung von Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement bei Studierenden zu validieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Validierung der Interpretation, dass die Testwerte von drei nachhaltigkeitsbezogenen Tests Indikatoren für hochschulisch vermittelte Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement sind. Die Analysen zur Gewinnung von Validitätsevidenzen konzentrieren sich auf die Grundannahme, dass Lernfortschritte in den nachhaltigkeitsbezogenen Tests vorwiegend hochschulisch vermittelt werden. Dafür wurde ein Messwiederholungsdesign mit zwei Gruppen von Studierenden realisiert. Studierende in der Schwerpunktgruppe besuchten ein Semester lang eine reguläre Lehrveranstaltungen mit Bezug zu Nachhaltigkeitsthemen und Nachhaltigkeitsmanagement, Studierende der Kontrollgruppe besuchten keine solchen Lehrveranstaltung. Die Einteilung in Schwerpunkgruppe und Kontrollgruppe erfolgte über Analyse von Modulhandbüchern und verwendeten Lehrmaterialien. Die Ergebnisse zeigen, dass Studierende aus der Schwerpunktgruppe in zwei der drei Tests höhere Lernfortschritte zeigen als Studierende der Kontrollgruppe. Selbstberichte der Studierenden zu hochschulischen und außerhochschulischen Lerngelegenheiten lassen darauf schließen, dass Studierende der Schwerpunkgruppe auch außerhochschulisch ein höheres Interesse an Nachhaltigkeitsthemen zeigen, dies schlägt sich jedoch nicht in höherem Vorwissen in den verwendeten Tests nieder. Insgesamt wird daher für die zwei Tests mit höheren Lernfortschritten in der Schwerpunktgruppe die Interpretation als plausibel bewertet, dass die Testwerte hochschulisch vermittelte Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement abbilden.
Using walls to navigate the room: egocentric representations of borders for spatial navigation
(2021)
Spatial navigation forms one of the core components of an animal’s behavioural repertoire. Good navigational skills boost survival by allowing one to avoid predators, to search successfully for food in an unpredictable world, and to be able to find a mating partner. As a consequence, the brain has dedicated many of its resources to the processing of spatial information. Decades of seminal work has revealed how the brain is able to form detailed representations of one’s current position, and use an internal cognitive map of the environment to traverse the local space. However, what is much less understood is how neural computations of position depend on distance information of salient external locations such as landmarks, and how these distal places are encoded in the brain.
The work in this thesis explores the role of one brain region in particular, the retrosplenial cortex (RSC), as a key area to implement distance computations in relation to distal landmarks. Previous research has shown that damage to the RSC results in losses of spatial memory and navigation ability, but its exact role in spatial cognition remains unclear. Initial electrophysiological recordings of single cells in the RSC during free exploration behaviour of the animal resulted in the discovery of a new population of neurons that robustly encode distance information towards nearby walls throughout the environment. Activity of these border cells was characterized by high firing rates near all boundaries of the arena that were available to the animal, and sensory manipulation experiments revealed that this activity persisted in the absence of direct visual or somatosensory detection of the wall.
It quickly became apparent that border cell activity was not only modulated by the distance to walls, but was contingent on the direction the animal was facing relative to the boundary. Approximately 40% of neurons displayed significant selectivity to the direction of walls, mostly in the hemifield contra-lateral to the recorded hemisphere, such that a neuron in left RSC is active whenever a wall occupies proximal space on the right side of the animal. Using a cue-rotation paradigm, experiments initially showed that this egocentric direction information was invariant to the physical rotation of the arena. Yet this rotation elicited a corresponding shift in the preferred direction of local head-direction cells, as well as a rotation in the firing fields of spatially-tuned cells in RSC. As a consequence, position and direction encoding in RSC must be bound together, rotating in unison during the environmental manipulations, as information about allocentric boundary locations is integrated with head-direction signals to form egocentric border representations.
It is known that the RSC forms many anatomical connections with other parts of the brain that encode spatial information, like the hippocampus and para-hippocampal areas. The next step was to establish the circuit mechanisms in place for RSC neurons to generate their activity in respect to the distance and direction of walls. A series of inactivation experiments revealed how RSC activity is inter-dependent with one of its communication partners, the medial entorhinal cortex (MEC). Together they form a wider functional network that encodes precise spatial information of borders, with information flowing from the MEC to RSC but not vice versa. While the conjunction between distance and heading direction relative to the outer walls was the main driver of neural activity in RSC, border cells displayed further behavioural correlates related to movement trajectories. Spiking activity in either hemisphere tended to precede turning behaviour on a short time-scale in a way that border cells in the right RSC anticipated right-way turns ~300 ms into the future.
The interpretation of these results is that the RSC’s primary role in spatial cognition is not necessarily on the early sensory processing stage as suggested by previous studies. Instead, it is involved in computations related to the generation of motion plans, using spatial information that is processed in other brain areas to plan and execute future actions. One potential function of the RSC’s role in this process could be to act correctly in relation to the nearby perimeter, such that border cells in one hemisphere are involved in the encoding of walls in the contralateral hemifield, after which the animal makes an ipsilateral turn to avoid collision. Together this supports the idea that the MEC→RSC pathway links the encoding of space and position in the hippocampal system with the brain’s motor action systems, allowing animals to use walls as prominent landmarks to navigate the room.
The aim of this work was to establish a new way of predicting novel dual active compounds by combining classical fingerprint representation with state-of-the-art machine learning algorithms. Advantages and disadvantages of the applied 2D- and 3D-fingerprints were investigated. Further, the impact of various machine learning algorithms was analyzed. The new method developed in this work was used to predict compounds, which inhibit two different targets (LTA4H and sEH) involved in the same disease pattern (inflammation). The development of multitarget drugs has become more important in recent years. Many widespread diseases like metabolic syndrome, or cancer are of a multifactorial nature, which makes them hard to be treated effectively with a single drug. The new in silico method presented in this work can help to accelerate the design and development of multitarget drugs, saving time and efforts.
The nowadays readily available access to a large number of 3D-structures of biological targets and published activity data of millions of synthesized compounds enabled this study and was used as a starting point for this work. Four different data sets were compiled (crystalized ligands from the PDB, active and inactive compounds from ChEMBL23, newly designed compounds using a combinatorial library). Those data sets were collected and processed using an automated KNIME workflow. This automation has the advantage of allowing easy change and update of compound sources and adapted processing ways.
In a next step, the compounds from the compiled data sets were represented using a variety of well-established 2D- and 3D-fingerprints (PLIF, AtomPair, Morgan, FeatMorgan, MACCS). All those fingerprints share the same underlying bit string scheme but vary in the way they describe the molecular structure. Especially the difference between 2D- and 3D-fingerprints was investigated. 2D-fingerprints are solely based on ligand information. 3D-fingerprints, on the other hand, are based on X-ray structure information of protein-ligand complexes. One major difference between 2D- and 3D-fingerprints usage is the need for a 3D-conformation (pose) of the compound in the targets of interest when using 3D-fingerprints. This additional step is time-consuming and brings further uncertainties to the method.
Based on the calculated fingerprints state-of-the-art machine learning algorithms (SVC, RF, XGB and ADA) were used to predict novel dual active compounds. The models were evaluated by 10-fold cross validation and accuracy as the primary measure of model performance was maximized. Second, individual parameters of the four machine learning algorithms were optimized in a grid search to achieve maximal accuracy using the optimized partitioning scheme. Overall accuracies, regardless of fingerprint and machine learning algorithm, are slightly better for LTA4H than for sEH.
The goal to predict dual active compounds was realized by comparing the set of predicted to be active compounds for LTA4H and sEH. For the 3D-fingerprint PLIF the machine learning algorithm Random Forest was chosen, from which compounds for synthesis and testing were selected. Of 115 predicted to be active compounds, six compounds were cherry picked. Two compounds showed very good/moderate dual inhibitory activity. Of the 2D-fingerprints, the AtomPair fingerprint in combination with the machine learning algorithm Random Forest was chosen from which compounds were selected for synthesis and testing. 116 compounds were predicted to be dual active against LTA4H and sEH. One of those compounds showed good dual inhibitory activity.
In this work it was possible to show advantages and disadvantages of using 2D- and 3D-fingerprints in combination with machine learning algorithms. Both strategies (2D: ligand-based, 3D: structure-based) lead to the prediction of novel dual active compounds with moderate to very good inhibitory activity. The method developed in this work is able to predict dual active compounds with very good inhibitory activity and novel (previously unknown) scaffolds inhibiting the targets LTA4H and sEH. This contribution to in silico drug design is promising and can be used for the prediction of novel dual active compounds. Those compounds can further be optimized regarding binding affinity, solubility and further pharmacological and physicochemical properties.
Durch die weltweite Verbreitung von bakteriellen Resistenzgenen wie der Carbapenemase New-Delhi-Metallo-β-Laktamase (NDM), die nahezu alle Beta-Laktamantibiotika spalten kann, und die langwierige Entwicklung neuer Antibiotika, hat die Erforschung von Resistenzdeterminanten eine hohe Priorität. In der vorliegenden Arbeit wurde die neu entdeckte Variante NDM 16b unter epidemiologischen Gesichtspunkten, mit einem in vivo Infektionsmodell sowie die Interaktion von NDM-Varianten mit dem menschlichen Komplementsystem untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit erfolgte eine epidemiologische Datenerhebung für 60 blaNDM tragende Patientenisolate des Zeitraums 2007 - 2017 auf Basis klinikinterner Datenbanken zu multiresistenten Erregern und zudem eine quantitative Empfindlichkeitstestung für 13 (Reserve-)Antibiotika. Es fiel eine kontinuierliche Zunahme an NDM-Isolaten und insbesondere von NDM-Varianten mit der Punktmutation M154L auf, da diese Mutation eine erhöhte Hydrolaseaktivität vermittelt. Deutlich erkennbar war eine Korrelation der M154L-Varianten und E. coli. Im Resistenzprofil der blaNDM-positiven Isolate zeigten sich hohe Resistenzraten (> 94%) gegen alle Beta-Laktam-Antibiotika und Fluorchinolone. Fosfomycin und Colistin waren in über 75% der Fälle noch wirksam.
Im zweiten Teil wurden Infektionsversuche mit dem Modellorganismus Galleria mellonella (Larve der großen Wachsmotte) durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die NDM-Produktion der injizierten Erreger keinen Einfluss auf die Pathogenität hatte. Zudem konnte in Therapieversuchen mit Imipenem im lebenden Organismus gezeigt werden, dass über die bakterielle NDM-Produktion die Resistenz gegen Imipenem vermittelt wird.
Im dritten Teil der Arbeit wurden die NDM-Varianten NDM 1Δ28, NDM 4Δ28 und NDM 16bΔ28 hinsichtlich ihres inhibitorischen Potentials auf Komplement untersucht. Mit den erzielten Ergebnissen der funktionellen Tests konnte für den klassischen und den Lektinweg eine signifikante Hemmung durch alle drei NDM Varianten nachgewiesen werden. Ein direkter Vergleich der einzelnen NDM-Varianten ergab, dass NDM 1Δ28 die stärkste und NDM 16bΔ28 die schwächste Inhibition auf den klassischen Komplementweg ausübte. Bindungsanalysen mit einzelnen Komplementkomponenten (C3, C3b, C3c, C4 und C4b) ließen auf eine Interaktion von NDM 1Δ28 mit C4b schließen.
Zusammenfassend leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Fortführung epidemiologischer Untersuchungen von NDM Varianten und erbringt den in vivo Nachweis für Resistenzvermittlung durch NDM. Weiterhin wurde gezeigt, dass NDM neben der Carbapenemasefunktion auch eine immunmodulierende Wirkung erfüllt, indem der klassische und Lektinweg des Komplementsystems gehemmt wird. Damit liegt die Vermutung nahe, dass die globale Ausbreitung von NDM-produzierenden Erregern nicht nur durch die Vermittlung der Antibiotikaresistenz, sondern auch durch eine Immunevasion bedingt ist. Zukünftig könnte somit die Erforschung des Mechanismus der Immunevasion ebenso interessant sein wie die Suche nach wirksamen Inhibitoren der NDM.
Der Verzehr von radioaktiv belasteten Pilzfruchtkörpern stellt ein Gesundheitsrisiko für den Menschen dar und auch fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 sind Pilze aus Waldökosystemen zum Teil noch stark durch das ausgetretene radioaktive 137Cs belastet. Die Einschätzung der Belastung und somit des Gesundheitsrisikos ist aufgrund einer Vielzahl von Einflussfaktoren, wie z. B. der Pilzart, der Tiefe des Myzels, der Bodenkontamination und der Feuchtigkeit des Bodens, schwierig. Ziel dieser Arbeit war es die Variabilität, den Einfluss verschiedener Faktoren sowie die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Pilzfruchtkörpern zu ermitteln. Des Weiteren wurde überprüft, ob die Bodenkontamination für eine Abschätzung der 137Cs-Aktivität von Pilzfruchtkörpern herangezogen werden kann. Für die Untersuchungen wurden über mehrere Jahre Proben von Maronenröhrlingen (Imleria badia) und Steinpilzen (Boletus edulis) aus vier Waldgebieten in Mittel- und Süddeutschland mit unterschiedlichem Aktivitätseintrag nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 analysiert. Die Gebiete waren Eichenzell, Wülfersreuth, Oberschönenfeld und der Nationalpark Bayerischer Wald. Als Ergänzung dienten zugesendete Proben derselben Pilzarten von Mitgliedern aus Pilzvereinen aus ganz Deutschland. Zusätzlich zu den Pilzproben wurden Bodenproben gemessen, um zum einen die aktuelle Bodenkontamination zu bestimmen und zum anderen zu überprüfen, ob der Großteil des 137Cs weiterhin im Bereich des Pilzmyzels zu finden ist.
Für die Untersuchung der örtlichen Variabilität der 137Cs-Aktivität wurden Maronenröhrlinge (Imleria badia) aus dem Waldgebiet Eichenzell in den Jahren 2017 bis 2019 analysiert. Innerhalb eines Sammeltages variierten die Messwerte verschiedener Proben innerhalb des Waldgebietes teilweise um den Faktor sechs. Dabei ist die Variabilität innerhalb eines Teilgebietes größer als zwischen beiden Teilgebieten des Waldgebietes Eichenzell. Für ein repräsentatives Ergebnis eines Gebietes ist es aufgrund der Variabilität erforderlich, eine ausreichende Menge an Fruchtkörpern zu analysieren.
Um die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Maronenröhrlingen (Imleria badia) zu ermitteln, wurden Proben aus drei Waldgebieten über fünf bis neun Jahre analysiert. Die Wahl der drei Waldgebiete erfolgte anhand des 137Cs-Aktivitätseintrags nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986. Die Bodenkontaminationswerte variieren von 3.000 Bq/m² in Eichenzell über 12.500 Bq/m² in Wülfersreuth bis 35.000 Bq/m² in Oberschönenfeld. Die effektiven Halbwerts-zeiten liegen in einem engen Bereich von 5,2 bis 5,8 Jahre mit einem Mittelwert von 5,4 ± 0,3 Jahren. Damit reduziert sich die radioaktive Belastung der Pilzfruchtkörper in etwa fünfmal schneller als durch die rein physikalische Halbwertszeit des 137Cs von 30,08 Jahren. Durch die Hinzunahme von bereits im Jahr 1990 veröffentlichten Daten ergab sich eine längere effektive Halbwertszeit von 7,7 ± 0,6 Jahren.
Für die Untersuchung der zwei Einflussfaktoren Exposition des Sammelgebiets (Hangausrichtung nach Ost oder West) und Höhenlage wurden sowohl Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch Steinpilze (Boletus edulis) hinsichtlich der 137Cs-Aktivität gemessen, um die Auswirkung auf Pilzarten mit unterschiedlichem Akkumulationsvermögen zu analysieren. Als Untersuchungsgebiet diente der Nationalpark Bayerischer Wald, da dieser ein großes Gebiet umfasst und verschiedene Ausprägungen der beiden Faktoren abbildet. Zudem wurde das Gebiet in Folge der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl stark kontaminiert und der Park ist ein beliebtes Pilzsammelgebiet. Anhand der 137Cs-Aktivität von Bodenproben konnte das Gebiet in zwei Regionen (Cluster) eingeteilt werden: eine Region mit hohem und eine mit niedrigem Aktivitätseintrag. Im Vergleich wiesen Maronenröhrlinge (Imleria badia) durchschnittlich eine um den Faktor fünf höhere 137Cs-Aktivität als Steinpilze (Boletus edulis) auf. Der Faktor Höhenlage zeigte im Gegensatz zur Exposition einen Einfluss auf die Kontamination der Pilzfruchtkörper. In Bezug auf die Höhenlage war der Einfluss nur im Falle eines hohen Aktivitätseintrags signifikant, wobei die Pilzproben aus der niedrigsten Höhenlage am höchsten belastet waren.
Zur Ermittlung der vertikalen Verteilung des 137Cs im Boden wurden in den Waldgebieten Eichenzell und Nationalpark Bayerischer Wald Proben bis zu einer Tiefe von 24 cm entnommen und anschließend in 2 cm Schichten analysiert. Alle Verteilungen konnten mit einem Gauß-Fit oder einem multiplen Gauß-Fit mit 2 bis 3 Maxima abgebildet werden. Das erste Maximum lag in allen Fällen in den organischen Horizonten oder im Übergangsbereich zum Ah-Horizont. Folglich befindet sich der Großteil des 137Cs fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl immer noch im Bereich des Pilzmyzels und kann somit von den Pilzen aufgenommen und in den Fruchtkörpern angereichert werden.
Der Vergleich der 137Cs-Aktivität der Pilz- und Bodenproben aus dem Nationalpark Bayerischer Wald ergab sowohl für Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch für Steinpilze (Boletus edulis) eine positive Korrelation. Nach Unterteilung der Proben anhand der Höhenlage zeigte sich eine noch stärkere Korrelation. Dies zeigt, dass neben der Bodenkontamination auch die Höhenlage einen Einfluss auf die 137Cs-Aktivität der Fruchtkörper hat.
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1. Das Wachstum und die Fähigkeit zur Butyratproduktion von E. callanderi KIST612 wurde in geschlossenen Batch-Kulturen mit den Substraten Glukose, Methanol, Formiat, H2 + CO2 und CO untersucht. E. callanderi KIST612 zeigte sich nur bei Wachstum auf 20 mM Glukose oder 20 mM Methanol in der Lage, Butyrat in größeren Mengen (3,7 – 4,3 mM) zu produzieren. Das Hauptprodukt bei allen untersuchten Wachstumssubstraten war jedoch Acetat.
2. In bioinformatischen Analysen des Genoms von E. callanderi KIST612 konnte nur eine A1AO-ATP-Synthase gefunden werden, welche eine V-typ c-Untereinheit bestehend aus 4 TMH‘s mit nur einer Na+-Bindestelle aufweist. Diese konnte aus gewaschenen Membranen von E. callanderi durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE) sowie einer Größenausschluss-Chromatographie (Superose 6) bis zur apparenten Homogenität gereinigt werden. Nach Produktion einzelner Untereinheiten (A, B, C, D, E, F und H) in E. coli und Generierung von Antikörpern, konnten alle Untereinheiten (A, B, C, D, E, F, H, a sowie c) in der gereinigten Enzympräparation immunologisch oder mittels „Peptide-Mass-Fingerprinting“ nachgewiesen werden. Es konnte somit erstmals eine A1AO-ATP-Synthase aus einem mesophilen Organismus ohne Verlust von Untereinheiten gereinigt werden.
3. Der Gesamtkomplex wies unter nativen Bedingungen eine molekulare Masse von ca. 670 kDa auf. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich anhand der hantelförmigen Strukturen, dass die A1AO-ATP-Synthase als intakter Gesamtkomplex gereinigt werden konnte.
4. Die gereinigte A1AO-ATP-Synthase wurde zunächst anhand ihrer ATP-Hydrolyse-Aktivität biochemisch charakterisiert. Die ATP-Hydrolyse-Aktivität hatte ein pH-Optimum von 7 – 7,5 und ein Temperaturoptimum bei 37 °C. Durch Messung der ATPase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Mengen an Na+ konnte die vorhergesagte Na+-Abhängigkeit des Enzyms nachgewiesen werden. Zudem zeigten Hemmstoffexperimente mit DCCD, dass dieser Inhibitor mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert. Dies bestätigte nochmals, dass das Enzym funktionell gekoppelt gereinigt werden konnte.
5. Zur weiteren Untersuchung der Ionenspezifität wurde der an die ATP-Hydrolyse gekoppelte Ionentransport durch Rekonstitution des Enzyms in Liposomen und anschließender Messung des Na+- oder H+-Transports gemessen. In den Proteoliposomen konnte mit Hilfe von 22Na+ gezeigt werden, dass das Enzym Natriumionen translozieren kann. Während in Anwesenheit des Natriumionophors ETH 2120 kein 22Na+-Transport beobachtet werden konnte, führte die Anwesenheit des Protonophors TCS zu einer geringfügigen Stimulation der 22Na+-Translokation. Insgesamt konnte ein primärer Na+-Transport nachgewiesen werden, welcher von der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi katalysiert wird.
6. Durch Rekonstitution der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi in Liposomen konnte erstmals biochemisch nachgewiesen werden, dass ein solches Enzym trotz seiner V-Typ c-Untereinheit in der Lage ist, ATP zu synthetisieren. Durch die Zugabe von Ionophoren (ETH 2120 und TCS) konnte der elektrochemische Ionengradient aufgehoben werden, wodurch keine ATP-Synthese beobachtet werden konnte. Der erstmalige Nachweis der ATP-Synthese wurde bei einem ΔµNa+ von 270 mV erbracht.
7. Die ATP-Synthese zeigte sich ebenfalls abhängig von der Na+-Konzentration. Der KM-Wert lag bei 1,1 ± 0,4 mM und war vergleichbar mit dem für die ATP-Hydrolyse ermittelten Wert. Ebenso konnte für die ATP-Synthese-Richtung gezeigt werden, dass DCCD mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert.
8. Um den biochemischen Nachweis zu erbringen, dass die A1AO-ATP-Synthase auch unter physiologisch relevanten Potentialen zur ATP-Synthese befähigt ist, wurde der energetische Schwellenwert der ATP-Synthese bestimmt. Dieser betrug 87 mV als Triebkraft für ΔpNa, 94 mV als Triebkraft für Δψ und 90 mV als Triebkraft für ΔµNa+. Erstaunlicherweise konnte die ATP-Synthese der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 sowohl durch Δψ als auch ΔpNa angetrieben werden. Unterschiedliche Kombinationen von Δψ und ΔpNa führten zu dem gleichen energetischen Schwellenwert; Δψ und ΔpNa waren im Enzym aus E. callanderi KIST612 äquivalente Triebkräfte.
9. Der energetische Schwellenwert der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 wurde mit dem der F1FO-ATP-Synthasen aus A. woodii, E. coli und P. modestum verglichen. Dazu wurden die Enzyme im ATP-Synthase-defizienten E. coli-Stamm DK8 produziert und anschließend durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Einbau der Enzyme in Liposomen waren alle Enzyme in der Lage, ATP als Reaktion auf ΔµNa+ (A. woodii und P. modestum) oder ΔµH+ (E. coli) zu synthetisieren. Im Vergleich zum Enzym aus E. callanderi zeigten sich zwei auffällige Unterschiede. Erstens war keine der F1FO-ATP-Synthasen in der Lage, ΔpNa/ΔpH als alleinige Triebkraft zu nutzen. Während die ATP-Synthese in den Enzymen aus E. coli und P. modestum nur durch ΔµH+ bzw. ΔµNa+ angetrieben werden konnte, konnte das Enzym aus A. woodii zusätzlich auch durch Δψ als einzige Triebkraft angetrieben werden.
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Ziel dieser Arbeit war es, einen genaueren Einblick in die Rolle von PaCLPXP für den Energiemetabolismus von P. anserina zu erhalten und mögliche Komponenten zu identifizieren, welche wichtig für die Langlebigkeit der PaClpP-Deletionsmutante sind. Folgende neue Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden:
1. Die Substrat-Analyse durch eine Cycloheximid-Behandlung und anschließender Proteom-Analyse legte erfolgreich eine Reihe potentieller bisher nicht bekannter Substrate von PaCLPP offen. Interessanterweise waren unter den identifizierten Proteinen viele ribosomale Untereinheiten und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege des Energiemetabolismus zu finden. Am auffälligsten unter diesen Substraten war die extreme Anreicherung eines Retikulon-ähnlichen Proteins, das einen neuen Aspekt der möglichen molekularbiologischen Rolle von PaCLPP in P. anserina andeutet.
2. Durch die Zugabe von Butyrat zum Medium, konnte erfolgreich die Autophagie sowohl im P. anserina Wildtyp als auch in der PaClpP-Deletionsmutante reduziert werden. Diese Verminderung der Autophagie sorgt bei ΔPaClpP für eine Verkürzung der Lebensspanne. Dieser Effekt ist spezifisch für die PaClpP-Deletionsmutante, während die Auswirkung von Butyrat auf den Wildtyp nur marginal ist. Dieses Ergebnis untermauert frühere Analysen dieser Deletionsmutante, welche besagen, dass die Langlebigkeit von ΔPaClpP Autophagie abhängig ist (Knuppertz und Osiewacz, 2017).
3. Die Metabolom-Analyse von ΔPaClpP im Vergleich zum Wildtyp zeigt, dass das Fehlen der PaCLPP zu Veränderungen in der Menge der Metaboliten der Glykolyse und des Citratzyklus kommt. Außerdem sind die Mengen der meisten Aminosäuren und der Nukleotide betroffen. Diese Analyse beweist, dass das Fehlen dieser mitochondrialen Protease weitreichende Folgen für die ganze Zelle hat. Durch die signifikante Verringerung von ATP und die Anreicherung von AMP in jungen ΔPaClpP-Stämmen und durch den Umstand der gesteigerten Autophagie in dieser Mutante, fiel das Augenmerk auf die AMPK. Dieses veränderte AMP/ATP-Verhältnis ist ein Indiz für eine gesteigerte AMPK-Aktivität und könnte auch den Umstand der gesteigerten Autophagie in ΔPaClpP erklären.
4. Das Gen codierend für die katalytische α-Untereinheit der AMPK (PaSnf1) konnte erfolgreich in P. anserina deletiert werden. Das Fehlen von PaSNF1 führt zu einer reduzierten Wuchsrate, eine beeinträchtige weibliche Fertilität und eine verzögerte Sporenreifung. Es konnte gezeigt werden, dass die Autophagie infolge einer PaSnf1-Deletion nicht gänzlich unterdrückt wird, PaSNF1 allerdings für die Stress-induzierte Autophagie notwendig ist. Überraschenderweise führt die Abwesenheit von PaSNF1 zu einer verlängerten Lebensspanne im Vergleich zum Wildtyp. Die meisten Effekte infolge einer PaSnf1-Deletion konnten durch die Einbringung eines FLAG::PaSNF1-Konstrukts komplementiert werden.
5. Eine gleichzeitige PaSnf1 und PaClpP-Deletion führt zu eine unerwarteten, extremen Lebenspannenverlängerung, die die Verlängerung der Lebensspanne bei der PaClpP-Deletionsmutante noch übertrifft. Interessanterweise geht dieser Phänotyp nicht mit einer erhöhten Autophagie einher. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass das Fehlen von PaSNF1 sowohl in ΔPaSnf1 als auch in ΔPaSnf1/ΔPaClpP zu einer veränderten Mitochondrien-Morphologie im Alter führt. Die Abwesenheit von PaSNF1 verursacht, dass die Stämme auch im Alter (20d) noch überwiegend filamentöse Mitochondrien aufweisen. Zudem zeigen die drei analysierten Deletionsstämme (ΔPaSnf1, ΔPaClpP und ΔPaSnf1/ΔPaClpP) massive Einschränkungen wenn sie auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind.
6. Auffallend war, dass bei ΔPaSnf1, ΔPaClpP und bei ΔPaSnf1/ΔPaClpP die Stämme mit dem Paarungstyp „mat-“ langlebiger sind als die Stämme mit dem Paarungstyp „mat+“. Dieser Effekt ist bei der ΔPaSnf1/ΔPaClpP-Doppelmutante am stärksten ausgeprägt. Weitere Untersuchungen dazu ergaben, dass die Paarungstypen immer dann eine Rolle spielen, wenn die Stämme mitochondrialem Stress ausgesetzt, oder aber auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind. Verantwortlich für diese Unterschiede sind zwei rmp1-Allele, die mit den unterschiedlichen Paarungstyp-Loci gekoppelt sind und mit dem jeweiligen Paarungstyp-Locus vererbt werden (rmp1-1 mit „mat-“; rmp1-2 mit „mat+“).
Untersuchungen zum HIV-assoziierten Immun-Rekonstitutions-Inflammationssyndrom bei Tuberkulose
(2021)
HIV- und Tuberkulose (TB)-koinfizierte Patienten können nach Beginn einer antiretroviralen Therapie (ART) als Komplikation ein Immunrekonstitutionssyndrom (IRIS) entwickeln. Dabei kommt es zu einem Neuauftreten oder einer Verschlechterung von klinischen Symptomen oder radiologischen Befunden im Zusammenhang mit der TB. Präsentieren kann sich ein IRIS entweder als eine plötzliche Verschlechterung der Infektion nach ART-Beginn („paradoxical/paradoxes IRIS“) oder durch ein Demaskieren einer vorher klinisch inapparenten und unbehandelten Infektion („unmasking/demaskierendes IRIS“). Aufgrund nicht einheitlich definierter Diagnosekritierien kann die Diagnosestellung im klinischen Alltag eine Herausforderung darstellen.
Ziel dieser Dissertation war es deshalb, klinische Charakteristika, Risikofaktoren und ggf. protektive Faktoren für die Entwicklung eines IRIS bei TB zu identifizieren. Diese Ergebnisse sollten zu besseren Verständnis und Vorhersagen von IRIS im Zusammenhang mit TB beitragen.
Dazu wurden retrospektiv Daten von 52 Patienten, die im Zeitraum 01.01.2010 - 30.06.2016 mit einer HIV-Infektion und zur Behandlung einer aktiven Tuberkulose stationär in der Infektiologie des Uniklinikums Frankfurts aufgenommen wurden, pseudonymisiert erfasst. Es wurden u. a. Arztbriefe, Laborbefunde, Fieberkurven und Visitenberichte aus dem Patientenmanagementprogramm „ORBIS“, der Datenbank „epidem“ und des Laborinformationsprogramms „Nexus swisslab“ des Uniklinikums Frankfurt genutzt. Zu den Parametern gehörten neben patientenspezifischen Daten wie Alter und Geschlecht unter anderem auch Routinelaborparameter, Serologien, Art der TB, genaue ART und TB-Therapien und Laborparameter, die zur Beurteilung einer Entwicklung der Immunrekonstitution und der virologischen Suppression hinweisend sind. Dazu zählen insbesondere HI-Viruslastwerte, CD4- und CD8-Zellzahlen für einen Zeitraum von 48 Wochen ab ART-Beginn.
Zur Untersuchung der unterschiedlichen IRIS-Arten wurden die Patienten in zwei Gruppen aufgeteilt: bereits mit einer ART vorbehandelte Patienten, bei denen somit die Entwicklung eines demaskierendem IRIS möglich war, und ART-naive Patienten, die theoretisch ein paradoxes IRIS entwickeln konnten. Durch Beurteilung des Krankheitsverlaufes und unter spezieller Berücksichtigung der HI-Viruslast im Verlaufe der ART wurde nach der IRIS-Definition von French et al. (2004) festgelegt, ob ein IRIS vorlag. Bei unklaren Fällen erfolgte eine gemeinsame Besprechung und definitive Einteilung im kliniksinternen Kolloquium. Schließlich wurde die statistische Auswertung mithilfe des Statistikprogramms „bias“ durchgeführt und dabei jeweils die „IRIS“ mit der „Nicht-IRIS“-Gruppe verglichen. Angewandt wurden der Exakte Fisher-Test für kategorische und der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test für numerische Variablen.
Die paradoxe IRIS-Inzidenz betrug 29,7 %, die demaskierende IRIS-Inzidenz 46,7 %. Am häufigsten präsentierte sich das IRIS in der Frankfurter Kohorte mit Fieber, am zweithäufigsten als Lymphadenopathie oder mit respiratorischen Beschwerden. Für sowohl Patienten mit paradoxem als auch demaskierendem IRIS zeigte sich ein signifikant längerer Krankenhausaufenthalt als für Patienten, die kein IRIS entwickelten. Sonst wurden für das demaskierende IRIS keine weiteren statistisch signifikanten Parameter gefunden, u. a. aufgrund Limitationen wie der sehr kleinen Studienpopulation (15 Patienten).
Patienten mit paradoxem IRIS hatten zudem eine signifikant höhere Rehospitalisierungsrate (63,3 % vs. 15,4 %; p= 0,006), was die klinische Relevanz aufzeigt. Außerdem korrelierten extrathorakale TB-Manifestationen (p= 0,025), niedrige CD4+-Lymphozyten-Zellzahl (p= 0,006) und hohe Viruslast (p= 0,017) vor ART-Beginn mit einer paradoxen TB-IRIS-Entwicklung. Diese Patienten sollten folglich nach ART-Beginn besonders engmaschig klinisch kontrolliert werden, da bei ihnen ein IRIS wahrscheinlicher ist. Ebenfalls statistisch signifikant zeigte sich erhöhte Laktatdehydrogenase (LDH) und erniedrigtes Albumin im Serum. In Kombination mit den davorgenannten Parametern könnten die Werte dabei behilflich sein, das individuelle paradoxe IRIS-Risiko bei Tuberkulose einzuschätzen. ART-Bestandteile oder Zeit zwischen dem Beginn der TB-Therapie und ART hatten in der Studie keinen Einfluss.
Im EU-Projekt „Regulatory Control Networks of Synthetic Lethality“ (SYNLET) wurden durch Vergleich der Genexpressionsprofile auf Transkriptionsebene von parentalen sensitiven Neuroblastom-Zelllinien und ihren Vincristin-resistenten Sublinien bioinformatisch 40 Kandidatengene ermittelt, die für Vincristin-Resistenz und damit Zellüberleben essentiell sein könnten. Diese Kandidatengene wurden im Rahmen dieser Dissertation einzeln in Neuroblastomzellen der Vincristin-resistenten Sublinie UKF-NB-2rVCR20 herunterreguliert durch Transfektion (Elektroporation) von small interfering RNAs (siRNAs; knock down). Anschließend wurden die Zellen ohne und mit verschiedenen Vincristin-Konzentrationen auf Zellviabilitätsveränderungen getestet. Beim Kandidatengen mit den niedrigsten Zellviabilitäten (SMARCC1) wurde ein Western Blot gemacht, um die Herunterregulierung zu bestätigen. Zu Beginn wurde das effektivste Programm zur Elektroporation der UKF-NB-2rVCR20-Zellen durch eine Transfektionsoptimierung ermittelt. Alle Kandidatengene wurden 2x transfiziert, bei unklaren oder besonders interessanten Ergebnissen auch 3x. Als positive Kontrolle wurde der ABC-Transporter MDR1 herunterreguliert, da hier die Auswirkungen auf die Resistenz gegen Vincristin bekannt sind. Bei 10 von 40 Kandidatengenen waren die Zellviabilitäten ohne Vincristin und/oder bei mindestens einer Vincristin-Konzentration extrem verändert (FOXJ1, MAP2K1, NFYB, RICS, SMARCA1, SMARCB1, SMARCC1, STK35, TOCA1 und TPM2). Das entspricht einem Prozentsatz von 25 % Kandidatengenen, bei denen die bioinformatisch vorhergesagte Wirkung in vitro bestätigt werden konnte. Allerdings sind bei diesen 10 effektiven Kandidatengenen auch 2 Gene dabei, nach deren Herunterregulierung es zu einer erhöhten Zellviabilität kam (FOXJ1 und RICS). Bei der Frage, welche Gene das Absterben der Tumorzellen beschleunigen und als ein mögliches Therapieziel in Frage kommen könnten, bleiben also 8 Kandidatengene (20 % aller Kandidatengene). Das interessanteste Kandidatengen ist SMARCC1, da die Herunterregulierung alleine (ohne Zugabe von Vincristin) zu einer massiven Abnahme der Zellviabilität führte. Damit stellt SMARCC1 ein interessantes Ziel zur Therapie in Tumorzellen dar.