Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (845) (remove)
Has Fulltext
- yes (845)
Is part of the Bibliography
- no (845)
Keywords
- Gentherapie (7)
- NMR-Spektroskopie (6)
- gene therapy (6)
- Elektrophysiologie (5)
- Molekularbiologie (5)
- RNA (5)
- Schmerz (5)
- Apoptosis (4)
- Arzneimitteldesign (4)
- Carotinoide (4)
Institute
- Biowissenschaften (538)
- Biochemie und Chemie (168)
- Biochemie, Chemie und Pharmazie (77)
- Pharmazie (32)
- Institut für Ökologie, Evolution und Diversität (20)
- Georg-Speyer-Haus (6)
- Geowissenschaften (4)
- Medizin (3)
- Physik (3)
- keine Angabe Institut (3)
Clean water is fundamental to human health and ecosystem integrity. However, water quality deteriorates due to novel anthropogenic pollutants present at microgram per liter concentrations in urban water cycles (termed micropollutants). Wastewater treatment plants (WWTP) have been identified as major point sources for aquatic (micro-)pollutants. Chemical and ecotoxicological analyses have shown that conventional biological WWTPs do not fully remove micropollutants and associated toxicities, which is often because of mobile, polar and/or recalcitrant compounds and transformation products (TPs). To minimize possible environmental risks, advanced wastewater treatment (AWWT) technologies could be a promising mitigation measure. Multiple processes are therefore being developed and evaluated such as ozonation and ozonation followed by granulated activated carbon (GAC) or biological filtration. Assessing the performance of these combined AWWTs was the focus the TransRisk project. Within this project, this thesis accomplished four major goals.
Firstly, the preparation of (waste)water samples was optimised for in vitro bioassays. Acidification, filtration and solid phase extraction (SPE) were tested for their impact on environmentally relevant in vitro endocrine activities, mutagenicity, genotoxicity and cytotoxicity. Significantly different outcomes of these assays were detected comparing neutral and acidified samples. Sample filtration had a lesser impact, but in some cases retention of particle-bound compounds could have caused significant toxicity losses. Out of three SPE sorbents the Telos C18/ENV at sample pH 2.5 extracted highest toxicity, some undetected in aqueous samples. These results indicate that sample preparation needs to be optimised for specific sample matrices and bioassays to avoid false-positive or -negative detects in effect-based analyses.
Secondly, the above listed in vitro toxicities were monitored in a protected region for drinking water production in South-West Germany (2012-2015). Out of 30 sampling sites surface water and groundwater were the least polluted. Nonetheless, a few groundwater samples induced high anti-estrogenic activity that prompted further monitoring. The latter included a waterworks in which no toxicity was detected. Hospital wastewater also had elevated in vitro toxicities and hospitals are, thus, relevant intervention points for source control. The biological WWTPs were effective in removing most of the detected toxicity, and the selected bioassays proved to be pertinent tools for water quality assessment and prioritisation of pollution hotspots.
Thirdly, the in vivo bioassay ISO10872 based on Caenorhabditis elegans (C. elegans) was adapted for this thesis. Using this model, a median effect concentration (EC50) for reproductive toxicity of the polycyclic aromatic hydrocarbon β-naphthoflavone (β- NF) of 114 µg/L was computed which is slightly lower than reported in the scientific literature. β-NF induced cyp-35A3::GFP (a biomarker in transgenic animals) in a time and concentration dependent manner (≤ 21.3–24 fold above controls). β-NF spiked wastewater samples supported earlier hypotheses on particle-bound pollutants. Reproductive toxicity (96 h) and cyp-35A3 induction (24 h) of biologically treated and/or ozonated wastewater extracts and growth promoting effects of GAC/biologically filtered ozonated wastewater extracts were observed. This suggested the presence of residual bioactive/toxic chemicals not included in the targeted chemical analysis. It also highlighted the importance of integrating multiple (apical and molecular) endpoints in wastewater assessments.
Fourthly, five in vitro and the adapted C. elegans bioassay were integrated into a wastewater quality evaluation (developed within TransRisk). Out of the five AWWT options, ozonation (at 1 g O3,applied/g DOC, HRT ~ 18 min) combined with nonaerated GAC filtration was rated most effective for toxicity removal. All five AWWTs largely removed estrogenic and (anti-)androgenic activities, but not anti-estrogenic activity and mutagenicity, which even increased during ozonation. This has been observed in related studies and points towards toxic TPs. These results also emphasized the need for implementing an effective post-treatment for ozonation. The results from a parallel in vivo study with Lumbriculus variegatus and Potamopyrgus antipodarum conducted on site at the WWTP (using flow through systems) were in accordance with the C. elegans results. In this context, it is suggested to further implement C. elegans as sensitive, feasible and ecologically relevant model.
In conclusion, this thesis shows how optimised sample preparation, long-term (in vitro) environmental monitoring, sensitive and ecologically relevant (in vivo) bioassays as well as innovative evaluation concepts, are pivotal in improving the removal of micropollutants and their toxicities with AWWTs. Future research should further develop and evaluate measures at sewer systems, conventional biological, tertiary and other advanced treatment technologies, as well as sociopolitical strategies (e.g., source control or natural conservation) and restoration projects. The effect-based tools optimised in this thesis will support assessing their success.
Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
Neuronale Repräsentation intrinsischer cochleärer Signale im Colliculus inferior der Wüstenrennmaus
(2008)
Die vorliegende Arbeit untersucht die neuronale Repräsentation von cochleären Verzerrungsprodukten im auditorischen Mittelhirn der Wüstenrennmaus. Die hohe Sensitivität und die gute Frequenzauflösung des Hörorgans der Säugetiere basiert auf einer aktiven mechanischen Verstärkung der schallinduzierten Basilarmembranschwingung im Innenohr. Die äußeren Haarsinneszellen, die während des Transduktionsprozesses zyklisch ihre Länge ändern und dabei zusätzliche Schwingungsenergie in das System zurückführen, sind der zugrunde liegende Motor des aktiven cochleären Verstärkers. Die stark nichtlinearen Eigenschaften dieses Verstärkers führen allerdings bei gleichzeitiger Verstärkung mehrerer Frequenzkomponenten zur Generierung von Kombinationsschwingungen, welche im Ursprungssignal nicht vorhanden sind. Wird das Ohr beispielsweise durch zwei Töne mit den Frequenzen f1 und f2 stimuliert (f1<f2), so entstehen verschiedene Kombinationsschwingungen, deren prominenteste das quadratische (f2-f1) und das cubische (2 f1-f2) Verzerrungsprodukt sind. Diese Verzerrungen des Ursprungssignals breiten sich von ihrem Entstehungsort im Innenohr, dem Überlappungsbereich der Stimuluswanderwellen, im Flüssigkeitsraum der Cochlea aus und werden über das Mittelohr in den Gehörgang übertragen. Im Gehörgang sind sie mit Hilfe eines sensitiven Mikrophons als otoakustische Emissionen (DPOAE - distortion product otoacoustic emissions) messbar. Zusätzlich bilden sie an ihrem Resonanzort auf der Basilarmembran, vergleichbar mit einem externen Stimuluston gleicher Frequenz, eine eigene Wanderwelle aus und aktivieren den Transduktionsprozess. Die neuronalen Korrelate der cochleären Verzerrungsprodukte sind auf verschiedenen Stationen der Hörbahn messbar und cochleäre Verzerrungsprodukte können als separate Töne wahrgenommen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die neuronalen Korrelate und otoakustischen Emissionen von cochleären Verzerrungsprodukten erstmals simultan bestimmt. Durch den direkten Vergleich der neuronalen Aktivität mit der peripheren Emissionsmessung sollen eventuelle zentralnervöse Veränderungen der Repräsentation der cochleären Verzerrungsprodukte untersucht werden. Dazu wurde die elektrische Aktivität von 91 Neuronen des Colliculus inferior der Wüstenrennmaus während der Stimulation durch zwei hochfrequente Stimulustöne gemessen. Die Frequenzen der Stimulustöne waren so gewählt, dass die Frequenz eines, durch sie evozierten Verzerrungsproduktes, mit der charakteristischen Frequenz des jeweiligen Neurons übereinstimmte. In 95 % aller Messungen konnte eine robuste neuronale Aktivität während Zweitonstimulation gemessen werden, die sich auf die Stimulation durch ein spezifisches cochleäres Verzerrungsprodukt zurückführen lässt. Bei einem Teil der Versuche wurden die Verzerrungsprodukte durch direkte intracochleäre Auslöschung mit einem dritten Tonstimulus eindeutig als Quelle der neuronalen Aktivität bestätigt. Für Verzerrungsproduktfrequenzen oberhalb 1,3 kHz lassen sich die Antworten der Neurone im schwellennahen Bereich gut mit den simultan im Gehörgang bestimmten DPOAE-Pegeln erklären, was einen engen Zusammenhang zwischen intracochleärem Verzerrungsproduktpegel und DPOAE-Pegel nahe legt. Bei höheren Stimuluspegeln konnten die maximalen neuronalen Antworten auf den intracochleären Verzerrungsproduktstimulus signifikant von der Einzeltonantwort abweichen, wobei sowohl eine Erhöhung als auch eine Reduktion der Maximalantwort möglich war. Ein inhibitorischer bzw. verstärkender Einfluss der Stimulustöne auf die neuronale Verzerrungsproduktantwort wird als mögliche Ursache der Unterschiede diskutiert. Für Verzerrungsproduktfrequenzen unterhalb 1,3 kHz wurde ein deutlicher Unterschied zwischen dem intracochleären Verzerrungsproduktpegel und dem im Gehörgang gemessenen Emissionspegel deutlich. Ein Teil der getesteten tieffrequenten Neurone antwortete während Zweitonstimulation bereits für Stimuluspegel, die unterhalb der Reintonschwelle des Neurons lagen. Eine frequenzspezifische Verschlechterung der Mittelohrübertragungsleistung bei tiefen Frequenzen wird als mögliche Ursache für die unterschwelligen Antworten der Neurone diskutiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass cochleäre Verzerrungsprodukte einen substanziellen Anteil an der neuronalen Repräsentation von komplexen Stimuli haben können. Im Besonderen machen die vorgestellten Daten deutlich, dass die neuronalen Repräsentation der Grundfrequenz eines komplexen Klangs wesentlich von cochleären Verzerrungsprodukten beeinflusst sein kann. Dies bedeutet, dass bereits im Innenohr Tonhöheninformation extrahiert werden kann und damit die Relevanz in der Literatur diskutierter neuronaler Mechanismen zur Berechnung von Tonhöhe relativiert wird.
Rhythmic changes in environmental lighting conditions have ever been the most reliable environmental cue for life on earth. Nature has therefore selected a genetically encrypted endogenous clock very early in evolution, as it provided cells and subsequently organisms with the ability to anticipate persevering periods of light and darkness. Rhythm generation within the mammalian circadian system is achieved by clock genes and their protein products. The mammalian endogenous master clock, which synchronizes the body to environmental time, is located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. As an integral part of the time-coding system, the pineal gland serves the need to tune the body to the temporal environment by the rhythmic nocturnal synthesis and immediate release of the hormone melatonin. In contrast to the transcriptional regulation of melatonin synthesis in rodents, a post-translational shaping is indicated in the human pineal gland. Another important mediator of circadian time and seasonality to the body is the pituitary gland. The aim of this work was to elucidate regulation of melatonin synthesis in the human pineal gland. Furthermore, presence and regulation of clock genes in the human pineal and pituitary gland, and in the SCN were analyzed. Therefore, human tissue, taken from regular autopsies, was analyzed simultaneously for different parameters involved in melatonin biosynthesis and circadian rhythm generation. Presented data demonstrate that post-mortem brain tissue can be used to detect the remnant profile of pre-mortem adaptive changes in neuronal activity. In particular, our results give strong experimental support for the idea that transcriptional mechanisms are not dominant for the generation of rhythmic melatonin synthesis in the human pineal gland. Together with data obtained for clock genes and their protein products in the pituitary, data presented here offer 1) a new working hypothesis for post-translational regulation of melatonin biosynthesis in the human pineal gland, and 2) a novel twist in the molecular competence of clock gene proteins, achieved by nucleo-cytoplasmic shuttling in neuronal and neuroendocrine human tissue. Furthermore, in this study, oscillations in abundance of clock gene proteins were demonstrated for the first time in the human SCN.
Seed dispersal is a key ecosystem function for plant regeneration, as it involves the movement of seeds away from the parental plants to particular habitats where they can germinate and transition to seedlings and ultimately adult plants. Seed dispersal is shaped by a diversity of abiotic and biotic factors, particularly by associations between plants and climate and between plants and other species. Due to the ongoing loss of biodiversity and changing global conditions, such interactions are prone to change and pose a severe threat to plant regeneration. One way to address this challenge is to study associations between plant traits and abiotic and biotic factors to understand the potential impacts of global change on plant regeneration. Plant communities have long been analyzed through the lens of vegetative traits, mainly ignoring how other traits interact and respond to the environment. For instance, while associations between vegetative traits (e.g., specific leaf area, leaf nitrogen content) and climate are well studied, there are few case studies of reproductive traits in relation to trait-environment associations in the context of global change.
Thus, the overarching aim of this dissertation is to explore how trait-environment associations, with a special focus on reproductive traits, can improve our understanding of the effect that global change may have on seed dispersal, and ultimately on plant regeneration. To this end, my research focuses on studying associations between plant traits and abiotic and biotic factors along an elevational gradient in both forests and deforested areas of tropical mountains. This dissertation addresses three principal research objectives.
First, I investigate the extent to which reproductive (seed and fruit traits) and vegetative traits (leaf traits) are related to abiotic and biotic factors for communities of fleshy-fruited plants in the Ecuadorian Andes. I used multivariate analyses to test associations between four (a)biotic factors and seven reproductive traits and five vegetative traits measured on 18 and 33 fleshy fruited plant species respectively. My analyses demonstrate that climate and soil conditions are strongly associated with the distribution of both reproductive and vegetative traits in tropical tree communities. The production of “costly” vs. “cheap” seeds, fruits and leaves, i.e., the production of few rewarding fruits and acquisitive leaves versus the production of many less-rewarding fruits and conservative leaves, is primarily limited by temperature, whereas the size of plant organs is more related to variation in precipitation and soil conditions. My findings suggest that associations between reproductive and vegetative traits and the abiotic environment follow similar principles in tropical tree communities.
Second, I assess how climate and microhabitat conditions affect the prevalence of endozoochorous plant species in the seed rain of tropical montane forests in southern Ecuador. I analyzed seed rain data for an entire year from 162 traps located across an elevational gradient spanning of 2000 m. I documented the microhabitat conditions (leaf area index and soil moisture next to each seed trap) at small spatial scale as well as the climatic conditions (mean annual temperature and rainfall in each plot) at large spatial scale. After a one-year of sampling, I counted 331,838 seeds of 323 species/morphospecies. My analyses demonstrate that the prevalence of endozoochorous plant species in the seed rain increases with temperature across elevations and with leaf area index within elevations. These results show that the prevalence of endozoochory is shaped by the interplay of both abiotic and biotic factors at large and small spatial scales.
Third, I examine the potential of seed rain to restore deforested tropical areas along an elevational gradient in southern Ecuador. For this chapter, I collected seed rain using 324 seed traps installed in 18 1-ha plots in forests (nine forest plots) and in pastures (nine deforested plots) along an elevational gradient of 2000 m. After a sampling period of three months, I collected a total of 123,039 seeds of 255 species/morphospecies from both forests and pastures along the elevational gradient. I did not find a consistent decrease in the amount and richness of seed rain between forests and pastures, but I detected a systematic change in the type of dispersed seeds, as heavier seeds and a higher proportion of endozoochorous species were found in forests compared to pastures at all elevations. This finding suggests that deforestation acts as a strong filter selecting seed traits that are vital for plant regeneration.
Understanding the role that trait-environment associations play in how plant communities regenerate today could serve as a basis for predicting changes in regeneration processes of plant communities under changing global conditions in the near future. Here, I show how informative the measurement of reproductive traits and trait environment associations are in facilitating the conservation of forest habitats and the restoration of deforested areas in the context of global change.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors Meis2 als Ko-Faktor in der Entwicklung des anterioren Neuralrohrs untersucht. Hierbei gaben funktionelle Untersuchungen durch Fehl- und Überexpressionsstudien mittels in ovo Mikroelektroporation im Hühnchenembryo, Aufschluss über eine besondere Rolle von Meis2 bei der Spezifizierung und Entwicklung des Tectum opticums. Überdies führten bio-chemische Untersuchungen zur Identifizierung neuer, bislang noch nicht beschriebener Interaktionspartner von Meis2 im sich entwickelnden optischen Tektum und in den Anlagen der Augen. Diese Untersuchungen geben einen weiteren Einblick in die Funktionsweise von Meis2 als Ko-Transkriptionsfaktor. Zusammengefasst lieferten die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit folgende Erkenntnisse: I) Im Mittelhirn ist Meis2-Expression unter den bislang beschriebenen Regulatoren der Mittelhirnentwicklung einzigartig: es ist von Beginn an nicht dynamisch und kennzeichnet ausschließlich die dorsalen Alarplatten des Mittelhirns, den Bereich des zukünftigen optischen Tektums (Kapitel 3.1). Diese Expression unterliegt einer strikten negativen Regulation durch sezernierte Moleküle und Transkriptionsfaktoren der benachbarten Regionen des Neuralrohrs (Kapitel 3.2). II) Meis2 ist für tektale Entwicklung erforderlich: Die Überexpression des dominant negativ wirkenden Konstruktes Meis2EnR störte die Entwicklung tektumspezifischer Strukturen sowohl in der frühen als auch in der späteren Entwicklung (Kapitel 3.3.1 und 3.3.2). Zudem kam es zur Unterdrückung der tektalen Gene ephrinB1 und Dbx1 (Kapitel 3.3.3 und 3.3.4). III) Meis2 ist für tektale Entwicklung ausreichend: Die Fehlexpression von Meis2 führte zur Induktion und Entwicklung ektopischer tektaler Strukturen im Dienzephalon (Kapitel 3.3.5). Dabei führte Meis2 bereits 24 h nach Fehlexpression zur Transdifferenzierung des dienzephalischen in mesenzephalisches Zellschicksal, veränderte jedoch nicht das Schick-sal des metenzephalischen Gewebes (Kapitel 3.3.7). IV) Bei der Induktion tektaler Strukturen ist Meis2 nicht Bestandteil des regulatorischen Netzwerks des Mittel-Hinterhirn Organisators (MHO), eines sekundären Organisators, welcher die Entwicklung der Mittel-Hinterhirn Region steuert (Kapitel 3.3.8). V) Meis2 bildet jedoch im Mittelhirn in vivo Komplexe mit Otx2, einem Schlüsselmolekül zur Spezifizierung des anterioren Neuralrohrs (Kapitel 3.4.1 - 3.4.3). VI) Meis2 kann in vitro durch Bindung an Otx2 einer Grg4/Tle4-vermittelten Unter-drückung der transkriptionellen Aktivität von Otx2 entgegenwirken (Kapitel 3.4.4). Otx2 kann, wie bereits in Arbeiten anderer Labors beschrieben, kontext-abhängig entweder als transkriptioneller Repressor oder Aktivator wirken. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen daher einen möglichen molekularen Mechanismus auf, wie durch zeitlich und räumlich kontrollierte Bindung eines Ko-Aktivators an Otx2 dessen transkrip-tionelle Aktivität wieder hergestellt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben zum ersten Mal einen Transkriptionsfaktor, der unabhängig vom regulatorischen Netzwerk des MHO, die Entwicklung des optischen Tektums induziert. Sie liefern somit ein neuartiges mögliches Modell zur Spezifizierung anteriorer Hirnstrukturen: Die Induktion tektaler Entwicklung erfolgt nach Etablierung der Mittel-Hinterhirn Region durch Meis2, einem tektumspezifischen Ko-Faktor von Otx2. VII) Meis2 bildet, im sich entwickelnden Mittelhirn, auch Komplexe mit den beiden Regulatoren der Tektumentwicklung Pax3 und Pax7 (Kapitel 3.4.5). VIII) Außerdem konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei weitere mögliche Interaktions-partner von Meis2 in den Anlagen der Augen identifiziert werden: Pax6, einem „master control gene“ der Augenentwicklung (Kapitel 3.4.6) und das Enzym Parp-1 (Kapitel 3.4.7), einem weit verbreiteten und vielseitigen Regulator der Genexpression. Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf weitere wichtige Funktionen des Ko-Transkriptions-faktors Meis2 in der Entwicklung des anterioren Zentralnervensystems.
Specific functions of biological systems often require conformational transitions of macromolecules. Thus, being able to describe and predict conformational changes of biological macromolecules is not only important for understanding their impact on biological function, but will also have implications for the modelling of (macro)molecular complex formation and in structure-based drug design approaches. The “conformational selection model” provides the foundation for computational investigations of conformational fluctuations of the unbound protein state. These fluctuations may reveal conformational states adopted by the bound proteins. The aim of this work is to incorporate directional information in a geometry-based approach, in order to sample biologically relevant conformational space extensively. Interestingly, coarse-grained normal mode (CGNM) approaches, e.g., the elastic network model (ENM) and rigid cluster normal mode analysis (RCNMA), have emerged recently and provide directions of intrinsic motions in terms of harmonic modes (also called normal modes). In my previous work and in other studies it has been shown that conformational changes upon ligand binding occur along a few low-energy modes of unbound proteins and can be efficiently calculated by CGNM approaches. In order to explore the validity and the applicability of CGNM approaches, a large-scale comparison of essential dynamics (ED) modes from molecular dynamics (MD) simulations and normal modes from CGNM was performed over a dataset of 335 proteins. Despite high coarse-graining, low frequency normal modes from CGNM correlate very well with ED modes in terms of directions of motions (average maximal overlap is 0.65) and relative amplitudes of motions (average maximal overlap is 0.73). In order to exploit the potential of CGNM approaches, I have developed a three-step approach for efficient exploration of intrinsic motions of proteins. The first two steps are based on recent developments in rigidity and elastic network theory. Initially, static properties of the protein are determined by decomposing the protein into rigid clusters using the graph-theoretical approach FIRST at an all-atom representation of the protein. In a second step, dynamic properties of the molecule are revealed by the rotations-translations of blocks approach (RTB) using an elastic network model representation of the coarse-grained protein. In the final step, the recently introduced idea of constrained geometric simulations of diffusive motions in proteins is extended for efficient sampling of conformational space. Here, the low-energy (frequency) normal modes provided by the RCNMA approach are used to guide the backbone motions. The NMSim approach was validated on hen egg white lysozyme by comparing it to previously mentioned simulation methods in terms of residue fluctuations, conformational space explorations, essential dynamics, sampling of side-chain rotamers, and structural quality. Residue fluctuations in NMSim generated ensemble is found to be in good agreement with MD fluctuations with a correlation coefficient of around 0.79. A comparison of different geometry-based simulation approaches shows that FRODA is restricted in sampling the backbone conformational space. CONCOORD is restricted in sampling the side-chain conformational space. NMSim sufficiently samples both the backbone and the side-chain conformations taking experimental structures and conformations from the state of the art MD simulation as reference. The NMSim approach is also applied to a dataset of proteins where conformational changes have been observed experimentally, either in domain or functionally important loop regions. The NMSim simulations starting from the unbound structures are able to reach conformations similar to ligand bound conformations (RMSD < 2.4 Å) in 4 out of 5 cases of domain moving proteins. In these four cases, good correlation coefficients (R > 0.7) between the RMS fluctuations derived from NMSim generated structures and two experimental structures are observed. Furthermore, intrinsic fluctuations in NMSim simulation correlate with the region of loop conformational changes observed upon ligand binding in 2 out of 3 cases. The NMSim generated pathway of conformational change from the unbound structure to the ligand bound structure of adenylate kinase is validated by a comparison to experimental structures reflecting different states of the pathway as proposed by previous studies. Interestingly, the generated pathway confirms that the LID domain closure precedes the closing of the NMPbind domain, even if no target conformation is provided in NMSim. Hence, the results in this study show that, incorporating directional information in the geometry-based approach NMSim improves the sampling of biologically relevant conformational space and provides a computationally efficient alternative to state of the art MD simulations.
The development of the atrioventricular (AV) canal and the cardiac valves is tightly linked and a critically regulated process. Anomalies in components of the involved pathways can lead to congenital valve malformations, a leading cause of morbidity and mortality in neonates. Myocardial Bmp as well as endocardial Notch and Wnt signaling have been identified as critical factors for the induction of EMT during the formation of the endocardial cushions and cardiac valves. Of these, canonical Wnt signaling positively regulates endocardial proliferation and EMT but negatively regulates endocardial differentiation. Further, elevated Wnt signaling leads to the ectopic expression of myocardial Bmp ligands suggesting a high level of integration of the involved pathways and crosstalk amongst the different cardiac tissues.
Here we have identified a novel role for Id4 as a mediator between Bmp and Wnt signaling. Id4 belongs to the Id family of proteins and is known to be involved in bone and nervous system development. We found that in zebrafish, id4 is expressed in the endocardium of the AV canal at embryonic stages and throughout the atrial chamber in addition to AV canal, in adults. Using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) we established an id4 mutant allele. Our analysis shows that id4 mutant larvae are susceptible to retrograde blood flow, and show aberrant expression of developmental valvular markers. These include expanded expression domains of markers like bmp4, cspg2a and Alcam. In contrast, valve maturation as assessed by the expression of spp1 is considerably reduced in id4 mutants. Using conditional transgenic systems, along with elegant in vivo imaging of transgenic reporter lines, we further found that id4 is a transcriptional target of Bmp signaling, and it is capable of dose dependently restricting Wnt signaling in the endocardium of the Atrioventricular Canal.
Taken together, our data identifies Id4 as a novel player in Atrioventricular Canal and valve development. We show that Id4 function is important in valve development acting downstream of Bmp signaling by restricting endocardial Wnt to allow valve maturation
Gepulste dipolare EPR-Spektroskopie ist eine wertvolle Methode, um Abstände von 1.5 bis 10 nm zwischen zwei Spinmarkern zu messen. Diese Information kann für Strukturbestimmungen hilfreich sein, wo traditionelle Methoden wie Kristallstrukturanalyse und NMR nicht angewendet werden können. Zusätzlich ist es möglich, Änderungen in Konformation und Flexibilität zu verfolgen. Für diese Studien haben sich stabile Nitroxidradikale als Spinmarker etabliert. Diese werden spezifisch durch die site-directed spin labelling Methode (SDSL) kovalent an das zu untersuchende Biomolekül gebunden. In den letzten Jahren wurden weitere Spinmarker für Abstandsbestimmungen mittels EPR-Spektroskopie entwickelt. Besonders interessant sind Triarylmethylradikale (im Folgenden abgekürzt als Trityl) und paramagnetische Metallzentren.
Im Vergleich zu Nitroxidradikalen hat das Tritylradikal einige Vorteile: Eine höhere Stabilität in einer reduzierenden Umgebung wie im Inneren von Zellen, längere Elektronenspin-Relaxationszeiten bei Raumtemperatur und ein schmaleres EPR-Spektrum. Deswegen ist dieses organische Radikal ein alternativer Spinmarker, der besonders gut für die Forschung von Biomolekülen in einer nativen Umgebung unter physiologischen Bedingungen geeignet ist. Auch paramagnetische Metallzentren sind weniger reduktionsempfindlich als Nitroxidradikale. Zusätzlich sind diese Spinmarker interessant in biologischen Fragestellungen. Zum Beispiel besitzen zahlreiche Enzyme paramagnetische Manganzentren als Cofaktoren. Zudem kann Magnesium, ein wesentlicher Cofaktor in Enzymen, Nukleinsäuren und Nukleotid-Bindungsdomänen der G- und Membranproteine, oft durch das paramagnetische Mangan ersetzt werden. Um Abstandsmessungen an Biomolekülen, die nur ein Metallzentrum besitzen, durchzuführen, können zusätzliche Spinmarker in Form eines Nitroxid-, Tritylradikals oder eines anderen paramagnetischen Metallkomplexes mithilfe der SDSL-Methode kovalent gebunden werden.
Nitroxidradikale, Tritylradikale und Metallzentren haben deutlich unterschiedliche EPR-spektroskopische Eigenschaften, welche oft als orthogonale Spinmarker bezeichnet werden. Solche Spinmarker sind nützlich für die Untersuchung von verschiedenen Untereinheiten bei makromolekularen Komplexen. Somit können die intramolekularen Abstände innerhalb einer Untereinheit sowie intermolekularen Abstände zwischen den unterschiedlichen Untereinheiten mit nur einer einzigen Probe bestimmt werden. Zusätzlich können die orthogonalen Marker sehr effektiv genutzt werden, um Metallzentren in Biomolekülen mithilfe der Trilateration-Strategie genau zu lokalisieren.
Die hier vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Nutzung dieser neuen Spinmarker für Abstandsmessungen. Solche Spinmarker sind noch kaum erforscht, obwohl sie für biologische Anwendungen eine große Rolle spielen könnten.
Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war eine Studie über Tritylradikale mithilfe der dipolaren EPR-Spektroskopie. Zu diesem Zweck wurden sowohl double quantum coherence (DQC) und single frequency technique for refocussing dipolar couplings (SIFTER) Experimente als auch Hochfrequenz pulsed electron electron double resonance (PELDOR) Experimente mit einem Trityl-Modellsystem durchgeführt. Dabei wurden die Besonderheiten der unterschiedlichen dipolaren Spektroskopiemethoden mit diesem Spinmarker untersucht, um die Empfindlichkeit und Robustheit für die Abstandsmessungen zu optimieren.
Das zweite Ziel war eine Studie über den Einfluss der Hochspin-Multiplizität des Mangans auf die Abstandsbestimmungen. Für diesen Zweck wurde zuerst ein Modellsystem mit einem orthogonalen Mn2+ Ion und Nitroxidradikal mithilfe der PELDOR-Spektroskopie untersucht. Anschließend wurde ein weiteres Modellsystem mit zwei Mn2+-Ionen untersucht, um PELDOR und relaxation-induced dipolar modulation enhancement (RIDME) Experimente bezüglich ihrer Empfindlichkeit und Robustheit sowie Genauigkeit der Datenanalyse zu optimieren.
Das Trityl-Modellsystem wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Sigurdsson synthetisiert. Die EPR Messungen wurden bei zwei verschiedenen Mikrowellenfrequenzen (34 und 180 GHz) durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Auswahl der optimalen Methode von den EPR-spektroskopischen Eigenschaften des Systems bei den jeweiligen Mikrowellenfrequenzen abhängig ist. Das EPR-Spektrum des Trityls ist bei 34 GHz so schmal, dass das ganze Spektrum von einem üblichen Mikrowellenpuls angeregt werden kann. In diesem Fall sind die DQC und SIFTER Experimente am besten geeignet. Der mit diesen Methoden bestimmte Abstand von 4.9 nm ist in guter Übereinstimmung mit Werten aus der Literatur. Es wurde festgestellt, dass die SIFTER Messung eine höhere Empfindlichkeit als DQC besitzt, da das Signal-zu-Rausch Verhältnis um den Faktor vier größer ist. Außerdem ist die SIFTER-Methode experimentell weniger anspruchsvoll, da ein deutlich kürzerer Phasenzyklus für die Mikrowellenpulse benötigt wird. ...
Characterization of mouse NOA1 : subcellular localizaion, G-Quadruplex binding and proteolysis
(2013)
Mitochondria contain their own protein synthesis machinery with mitoribosomes that are similar to prokaryotic ribosomes. The thirteen proteins encoded in the mitochondrial genome are members of the respiratory chain complexes that generate a proton gradient, which is the electromotoric force for ATP synthesis.
NOA1 (Nitric Oxide Associated Protein-1) is a nuclear encoded GTPase that positively influences mitochondrial respiration and ATP production. Although a role in mitoribosome assembly was assigned to NOA1 the underlying molecular mechanism is poorly understood. This work shows that the multi-domain protein NOA1 serves multiple purposes for the function of mitochondria. NOA1 is a dual localized protein that makes a detour through the nucleus before mitochondrial import. The nuclear shuttling is mediated by a nuclear localization signal and the now identified nuclear export signal. SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) analysis revealed a G-quadruplex binding motif that characterizes NOA1 as ribonucleoprotein (RNP). G-quadruplex binding was coupled to the GTPase activity and increased the GTP hydrolysis rate. The sequence of localization events and the identification of NOA1 being a RNP lead to the discussion of an alternative import pathway for RNPs into mitochondria. The short-lived NOA1 contains ClpX recognition motifs and is specifically degraded by the mitochondrial matrix protease ClpXP. NOA1 is the first reported substrate of ClpXP in higher eukaryotes and augments the contribution of the ClpXP protease for mitochondrial metabolism. To assess the direct action of NOA1 on the mitoribosome co-sedimentation assays were performed. They showed that the interaction of NOA1 and the mitoribosome is dependent on the GTPase function and the nascent peptide chain. In vitro, NOA1 facilitated the membrane insertion of newly translated and isotope labeled mitochondrial translation products into inverted mitochondrial inner membrane vesicles. In conclusion, NOA1 is a G-quadruplex-RNP that acts as mitochondrial membrane insertion factor for mtDNA-encoded proteins.
This thesis provides a comprehensive model of the molecular function of NOA1 and is the basis for future research. The identification of NOA1 as ClpXP substrate is a major contribution to the field of mitochondrial research.
Eine Einschränkung des Hörvermögens durch Schäden der Sinnesrezeptoren im Innenohr gilt beim Menschen sowie bei allen anderen Säugetieren als irreversibel. Die Hörforschung ist an der Frage interessiert, ob durch Plastizität in zentralen Teilen des auditorischen Systems Kompensationsmechanismen die Folgen mildern können. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob und in welchem Umfang nach peripheren Hörschäden durch zentrale Kompensationsmechanismen eine Erholung des Hörvermögens auftritt auf der Basis von plastischen Änderungen der neuronalen Verarbeitung der Eingangssignale aus dem geschädigten Hörorgan. Schäden des Sinnesepithels im Innenohr, z.B. durch überlaute Beschallung oder ototoxische Substanzen, betreffen in der Regel zunächst die äußeren Haarzellen und führen zu einem Verlust der Empfindlichkeit und Frequenzspezifität des Hörvermögens. Eine primäre selektive Schädigung der inneren Haarzellen (IHZ) tritt im Tiermodell, aus unbekannten Gründen nur bei einer Spezies auf, dem Chinchilla (Chinchilla laniger) und zwar nach Gabe des antineoplastischen Medikament Carboplatin. Das gute Tieffrequenzhören der Chinchillas (0.1-20 kHz) ermöglicht außerdem Aussagen zur akustischen Signalverarbeitung in einem für das menschliche Gehör relevanten Frequenzbereich (0.02-16 kHz). Dieses Tiermodell bietet somit die Gelegenheit, die Veränderungen in zentralen Teilen des auditorischen Systems nach einer definierten sensorischen Schädigung zu untersuchen. Hierfür kommt u.a. das auditorische Mittelhirn, der Colliculus Inferior (IC) in Frage. Der IC wird als Hauptintegrationszentrum der Hörbahn angesehen weil er Eingänge von fast allen vor ihm liegenden auditorischen Kernen (z.B. Nucleus cochlearis, Nucleus olivaris und Leminscus lateralis) bekommt. Ein weiterer Grund für die Wahl des IC als Untersuchungsgebiet der vorliegenden Arbeit ist, die Frage zu beantworten, ob die auf der Ebene des auditorischen Kortex bereits nachgewiesene funktionelle Plastizität auch auf der Ebene des IC schon realisiert oder vorbereitet wird. Die vorliegende Arbeit untersucht das Antwortverhalten der Neurone im ICc an wachen Tieren vor und nach einem selektiven Teilverlust der IHZ bei Erhalt der äußeren Haarzellen. Die Arbeitshypothese ist, dass es nach einem abgeschwächten sensorischen Eingang zu Veränderungen der exzitatorischen und inhibitorischen Antwortfelder kommt, die als funktionelle Plastizität bzw. als Kompensation verstanden werden können. Anhand elektrophysiologischer Ableitungen im ICc von wachen, chronisch implantierten Tieren wurden die exzitatorischen und die inhibitorischen Antwortfelder der Neurone durch Einton- und Zweiton- Stimulation getrennt gemessen und bestimmt. Die Resultate zeigen, dass die exzitatorischen und inhibitorischen Antworteigenschaften im IC bei wachen und narkotisierten Tieren unterschiedlich sind. In wachen Tieren weist die Inhibition generell höhere Variation auf als in narkotisierten Tieren und ist unabhängiger von der Art der Exzitation. Eine Carboplatinbehandlung führte bei allen Tieren nach 3-7 Tagen zu einer Abnahme der Amplituden und einer Erhöhung der Schwellen der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale (ABRs). Die histologische Untersuchung des Innenohres (10 Wochen nach Carboplatinbehandlung), zeigte bei allen Tieren Verluste der IHZ (zwischen 20 und 60%) entlang der gesamten Basilarmembran. Es wurden aber keine Verluste von ÄHZ festgestellt. Die Gehirn-Schnitte zeigten, dass die Registrierungen aus dem zentralen Teil des Colliculus Inferior stammen. Die physiologische Untersuchung der Antworteigenschaften der Neurone im IC 4-6 Wochen nach der carboplatinbedingten Schädigung der IHZ zeigte eine Reduktion der Inhibition, die u.a. deutlich an dem Verlauf der Intensitätskennlinien zu beobachten war. Nach dem Teilverlust der IHZ wurden viel weniger nichtmonotone Kennlinien gefunden als vor der Innenohrschädigung. Darüber hinaus beobachteten wir eine Reduzierung der inhibitorischen Regionen und eine signifikante Ausweitung der exzitatorischen Antwortfelder nach dem Teilverlust der IHZ. Die Resultate der vorliegenden Arbeit führen zu der Schlussfolgerung, dass nach einer Teilschädigung der inneren Haarzellen, unter Erhalt der ÄHZ nur ein geringer Sensitivitätsverlust in der zentralen Hörbahn auftritt. Der Verlust von 20-60% der IHZ und der damit einhergehende reduzierte afferente Informationsfluss führt zu physiologischen Veränderungen in der Hörbahn, die im IC von wachen Tieren vor allem durch eine Reduktion der Inhibition hervortritt. Dies deutet daraufhin, dass zentrale Kompensationsmechanismen bei peripheren Hörschäden nicht, wie bisher vermutet, erst in kortikalen sondern zum Teil bereits in subkortikalen Arealen (im Mittelhirn) stattfinden.
Interleukin-11 signaling is a global molecular switch between regeneration and scarring in zebrafish
(2022)
The two diametrically opposing outcomes after tissue damage are regeneration and fibrotic scarring. After injury, adult mammals predominantly induce fibrotic scarring, which most often leads to patient lethality. Fibrotic scarring is the deposition of excessive extracellular matrix that matures and hinders tissue function. The scarring response is mainly orchestrated by myofibroblasts, which arise only upon tissue damage, from various cellular origins, including tissue resident fibroblasts, endothelial cells and circulating blood cells. On the contrary, species like zebrafish, possess the remarkable capacity to regenerate their damaged tissues. After injury, instead of inducing a myofibroblast-mediated fibrogenic gene program, cells in these species undergo regenerative reprogramming at the transcriptional level to activate vital cellular processes needed for regeneration, including proliferation, dedifferentiation, and migration. Several pro-regenerative mechanisms have been identified to date. Most of them, if not all, are also important for tissue homeostasis and hence, are not injury specific. Therefore, the central aim of this study is to identify injury-specific mechanisms that not only induce regeneration, but also limit fibrotic scarring.
To test the notion that fibrotic scarring limits regeneration, I first compared the scarring response in the regenerative zebrafish heart after cryoinjury with what is known in the non-regenerative adult mouse heart. I found that zebrafish display ~10-fold less myofibroblast differentiation compared to adult mouse after cardiac injury. With these findings, I hypothesized that zebrafish employ mechanisms to actively suppress scarring response. Using a novel comparative transcriptomic approach coupled with genetic loss-of-function analyses, I identified that Interleukin-6 (Il-6) cytokine family-mediated Stat3 is one such pro-regenerative pathway in zebrafish.
Il-6 cytokine family consists of Il-6, Interleukin-11 (Il-11), Ciliary neurotrophic factor, Leukemia inhibitory factor, Oncostatin M, and Cardiotrophin-like cytokine factor 1. Il-6 family ligands signal through their specific receptors and a common receptor subunit (Il6st or Gp130). Using gene expression analyses after adult heart and adult caudal fin injuries in zebrafish, I identified that both the Il-11 cytokine encoding paralogous genes (il11a and il11b) are the highest expressed and induced among the Il-6 family cytokines. Hence, I chose Il-11 signaling as a candidate pathway for further analysis. To investigate the role of Il-11 signaling, I generated genetic loss-of-function mutants for both the ligand (il11a and il11b) and the receptor (il11ra) encoding genes. Using various tissue regeneration models across developmental stages in these mutants, I identified that Il-11/Stat3 signaling is indispensable for global tissue regeneration in zebrafish.
To investigate the cellular and molecular mechanisms by which Il-11 signaling promotes regeneration, I performed transcriptomics comparing the non-regenerative il11ra mutant hearts and fins with that of the wild types, respectively. I identified that Il-11 signaling orchestrates both global and tissue-specific aspects of regenerative reprogramming at the transcriptional level. In addition, I also found that impaired regenerative reprogramming in the il11ra mutant hearts and fins resulted in defective cardiomyocyte and osteoblast repopulation of the injured area, respectively.
On the other hand, by deep phenotyping the scarring response in il11ra mutant hearts and fins, I identified that Il-11 signaling limits myofibroblast differentiation. Furthermore, I found that cardiac endothelial cells and fibroblasts are one of the major responders to injury-induced Il-11 signaling. Using lineage tracing, I found that both the endothelial and fibroblast lineages in the non-regenerative il11ra mutants commit to a myofibroblast fate, spearheading the scarring response. In addition, using cell type specific manipulations, I showed that Il-11 signaling in cardiac endothelial cells allows cardiomyocyte repopulation of the injured area. Finally, using human endothelial cells in culture, I uncovered a novel feedback mechanism by which Il-11 signaling limits fibrogenic gene expression by inhibiting its parent activator and a master regulator of tissue fibrosis, TGF-β signaling.
Overall, I identified Interleukin-11/Stat3 signaling as the first global regulator of regeneration in zebrafish. Briefly, I showed that Interleukin-11 signaling promotes regeneration by regulating two crucial cellular aspects in response to injury – (1) it promotes regenerative reprogramming, thereby allowing cell repopulation of the injured area and (2) it limits mammalian-like fibrotic scarring by inhibiting myofibroblast differentiation and TGF-β signaling. Altogether, these zebrafish data, together with the contradicting mammalian data strongly indicate that the secrets of tissue regeneration lie downstream of IL-11 signaling, in the differences between regenerative and non-regenerative species. Furthermore, I establish the non-regenerative il11ra mutant as an invaluable zebrafish model to study mammalian tissue fibrosis.
In dieser Arbeit soll identifiziert werden, welcher der zahlreichen Vertreter einer Arzneistoffklasse sich letztlich auf dem Markt durchsetzen kann und ob bestimmte pharmakokinetische, pharmakodynamische, klinische oder praktische Substanzeigenschaften retrospektiv für den Markterfolg einer Substanz verantwortlich gemacht werden können. Zudem stellt sich die Frage, ob und in wie fern Analogpräparate einen Nutzen in der Arzneimitteltherapie mit sich bringen, obwohl ihnen zum Zeitpunkt ihrer Markteinführung nur ein geringer Innovationsgrad zugebilligt wurde. Um derartige Rückschlüsse ziehen zu können wurden exemplarisch folgende fünf Arzneistoffklassen untersucht, die sich durch eine Vielzahl an Vertretern auszeichnen: Arsphenamine, Sulfonamide, Benzodiazepine, Glucocorticoide sowie Betablocker. Der Untersuchungszeitraum bemisst sich folglich vom Anfang des 20. Jahrhunderts, als industriell gefertigte, chemisch definierte hochpotente Wirkstoffe die Therapie zu bestimmen begannen, bis etwa zum letzten Drittel des 20. Jahrhunderts als Preise und Kostenerstattungsfragen zusätzlich zu Substanzeigenschaften für den Markterfolg mitbestimmend wurden.
Capoeta damascina (Teleostei: Cyprinidae) is one of the most common freshwater fish species, found throughout the Levant, Mesopotamia, Turkey and Iran. According to the state of knowledge prior to this study, C. damascina, which is distributed over a wide range of isolated water bodies, was not a well-defined species. It was questionable whether it represents a single species or a complex of closely related species with high intraspecific and comparatively low interspecific variability. The goal of this study was to investigate the taxonomy, systematic position of the C. damascina species complex and the phylogenetic relationships among its members, based on morphological features as well as molecular phylogeny. Samples obtained from throughout the geographic range of this species complex were subjected to comparative morphological analyses in order to define, properly diagnose and separate species within the C. damascina complex. To elucidate phylogenetic relationships among members of the C. damascina species complex, samples were subjected to genetic analyses, using two molecular markers targeting the mitochondrial cytochrome oxidase I (COI, n = 103) and the two adjacent divergence regions (D1-D2) of the nuclear 28S rRNA genes (LSU, n = 65). Based on morphological and molecular genetic data, six closely related species were recognized within the C. damascina complex: C. buhsei, C. caelestis, C. damascina, C. saadii, C. umbla and an undescribed species, Capoeta sp.1. Analyses of the morphometric and meristic data obtained in this study revealed phenotypic variability among the various populations within a species and among the different species. Such differences in morphological characters reflect genetic differences, environmentally induced phenotypic variation or both, as the meristic phenotype of fish is sometimes a consequence of environmental parameters acting on the genotype. Based on phylogenetic analyses, two main lineages were identified within the C. damascina species complex: a western lineage represented by C. caelestis, C. damascina and C. umbla and an eastern lineage represented by C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1. The close phylogenetic relationships between C. damascina and C. umbla and the sharing of same haplotypes between one specimen of C. damascina from Euphrates and another of C. umbla from Tigris reflect one of three possibilites: recent speciation, mitochondrial introgression or a combination of both. The results obtained in this study indicate that speciation of the above-mentioned six taxa is quite recent and that their dispersal and present-day distribution can be related to Pleistocene events. The drying out of the Persian Gulf, probably during one of the first glacials of the Pleistocene, led the ancestor of the C. damascina species complex in Mesopotamia to reach the rivers of the Gulf and of Hormuz basins and differentiate there, giving rise to the eastern lineage (ancestor of C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1). As connections presumably existed among the different river drainages and basins in Iran during the wet periods of the Pleistocene, the ancestor of C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1 was subsequently able to colonize the various Iranian drainages and differentiate there, giving rise to C. buhsei, C. saadii and Capoeta sp.1. After the separation from the eastern lineage, the western lineage, represented by the ancestor of C. damascina, C. umbla and C. caelestis, most likely reached the Levant from the Tigris-Euphrates system during the Pleistocene glacials, when river connections existed in the regions of the upper courses of Ceyhan Nehri (southern Turkey) and some western affluents to the Euphrates. From Ceyhan Nehri, it dispersed into other rivers in southern Turkey during Pleistocene periods of low sea levels until it reached Göksu Nehri and evolved into C. caelestis. The sister population differentiated into C. damascina and C. umbla. Based on the results obtained in this study, it is likely that C. damascina colonized the Levant and southern Turkey during the Pleistocene glacials. This is well supported by the low genetic variability among the C. damascina populations. Direct connections existed among the river drainages in the Levant during the Pleistocene periods of low sea level, thus serving as a pathway for the dispersal of C. damascina. The results of this study provide a coherent picture of the taxonomic position, phylogenetic relationships and evolutionary history of the C. damascina species complex and explain present patterns of distribution considering paleogeographic events.
Chapter I of this work addressed the piggyBac (PB) transposon system, a non-viral genome engineering tool that is capable of efficiently performing stable integration of DNA sequences into a target cells genome and has already been used in clinical trials. However, the PB transposase has the problematic property of preferentially integrating transposons near transcriptional start sites (TSSs). This increases the likelihood of causing genotoxic effects, limiting its potential use as a tool in clinical applications. It has been shown in the past that the PB transposase shows physical interactions with BET proteins (e.g. BRD4) through Co-IP experiments. Representatives of these proteins are part of the transcriptional activation complex and are abundant at TSSs. Accordingly, it was previously proposed that this interaction is the underlying cause for the biased integration preference. For the first chapter of this thesis, the goal was to disrupt this interaction potentially modifying said integration preference. A secondary structure hypothesized to be mainly responsible for said interaction was extensively mutated resulting in several PB variants that were analyzed for their interaction capacity through a series of Co-IP experiments with BRD4. In total, seven substitutions were identified (E380F, V390K, T392Y, M394R, K407C, K407Q, and K407V) which exhibited reduced interaction capacity with BRD4. Each of the aforementioned mutants were used to generate integration libraries and, through NGS, it was determined if the integration preferences of the respective mutants had changed. In the immediate range 200 base pairs up- and downstream from known TSSs all mutants used exhibited a reduced integration bias. At a wider observation window 3 kbp up- and downstream from TSSs, further mutants with the substitutions M394R, T392Y and V390K showed a reduction in integration frequency of 17.3%, 1.5% and 5.4%, respectively, compared to the wildtype. Of particular note was the M394R mutant, which showed a reduction in all window sizes analyzed with a maximum of 65% less integration preference in the immediate vicinity of TSSs, theoretically generating a safety advantage over the wildtype transposase.
Chapter II was dedicated to the overall safety improvement for transposon-based gene modification and addresses the time point after the transgene has already been integrated and serious side effects may not be preventable. With this in mind, the aim was to develop a novel suicide-switch that can be stably introduced into cells via transposition, and reliably leads to cell death of the modified cells once activated. A system based on CRISPR/Cas9 was developed, where single guide RNAs were used to guide the Cas9 nuclease to Alu elements. These are short, repetitive sequences, which are distributed over the human genome in more than one million copies. Inducing double strand breaks within these elements would lead to genomic fragmentation and cell death. To be inducible, a transcriptional as well as post- translational control mechanism was added. Transcription of the Cas9 nuclease was regulated using a tet-on system, making expression dependent on doxycycline (DOX) supplementation. Furthermore, a version of the Cas9 nuclease called arC9 was used that allows double strand break generation only in the presence of 4-Hydroxytamoxifen (4-HT). Together with an expression cassette for the Alu-specific guide RNA and an expression cassette for the reverse tetracycline controlled transactivator all components were arranged between transposase-specific recognition sequences on a plasmid to allow transposon-system based gene transfer. The system was tested in HeLa cells. First, conditional expression of the arC9 nuclease was confirmed by addition of 1 μg/ml DOX. Second, the suicide-switch was further induced by adding 200 nM 4-HT and protein extracts were assayed for the KAP1 phosphorylation. Only upon induction with DOX and 4-HT phosphorylated KAP1 was detected, indicating DNA damage. Further, extensive growth and survival experiments were conducted to determine the effect of suicide-switch induction on cell proliferation and survival. Between 24 and 48 hours after induction, a halt in cell division was detected, after which extensive cell death was observed. Within 5 days post induction, >99% of all cells were eliminated. In the absence of both inducers, no significant differences in survival were observed compared to control cells line lacking Alu-specific guide RNAs. Microscopic examinations of the <1% surviving cell fraction revealed a senescence-associated phenotype and showed no signs of resumption of the cell division process. Accordingly, the second chapter of this thesis also achieved its goal in developing a functional suicide-switch that can be inserted into human cells via transposition, is highly dependent on the necessary induction signals, and exhibits excellent elimination capabilities in the context tested.
This thesis comprises the usage of two commonly known hinge-binding moieties in drug discovery. First, the quinazoline scaffold of gefitinib (5) was utilized in a macrocyclization strategy to introduce selectivity. In general, the quinazoline hinge-binding moiety is a commonly used scaffold which can be found in 14% of approved kinase inhibitors. The most familiar applications are EGFR inhibitors such as gefitinib (5), erlotinib (6), afatinib, or dacomitinib for the treatment of NSCLC. But other kinases like CDK2, CDK4, or p38 are reported targets as well.
The N-phenylquinazolin-4-amine moiety of gefitinib (5) was conserved however, the residues at the aromatic ring in the linker were modified, the residue targeting the solvent-exposed region was varied, and the linker at the C6 position of the quinazoline was adjusted to enable the macrocyclization. An overview of the structural modifications is shown in Figure 35A.
Kinome-wide screening of gefitinib (5) revealed several off-targets besides EGFR (Figure 35B), making it an excellent starting point for a macrocyclization strategy. Introducing a linker to the N phenylquinazoline-4-amine scaffold and retaining the residues on the aromatic ring as well as the methoxy group targeting the solvent-exposed region improved the selectivity profile and the efficacy towards EGFR WT and its mutants. Truncation of the linker moiety led to the mutant selective macrocycle 26f with an excellent kinome-wide selectivity profile (Figure 35B). An inhibitor that is effective on EGFR mutations while ineffective on the EGFR WT could represent an enhancement of patient treatment, as it potentially causes less side effects. Further studies could determine the effect of the most promising macrocycles in lung cancer cell lines. Additionally, the pharmacokinetic properties could be optimized, e.g. by introducing solubilizing groups, targeting the solvent-exposed region.
The second scaffold comprises the 3-aminopyrazole-based hinge-binding moiety. It is a privileged scaffold in medicinal chemistry for the development of kinase inhibitors. Previous publications report the anti-proliferative and anti-cancer potential of pyrazole-based molecules. They play a crucial role in the treatment of various diseases and cancer types like inflammation disorders, lymphoma, or breast cancer. This scaffold can be found e.g. in the aurora kinase inhibitor tozasertib or in the promiscuous kinase inhibitor 23, published by Statsuk et. al. Rescreening compound 23 in a comprehensive kinase panel against 468 human protein kinases confirmed the unselective behavior with a selectivity score of S35 = 0.56 (Figure 36B), making it a great starting point for further optimizations. The N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine scaffold was conserved however, the residues targeting the solvent-exposed region were varied and different linkers were attached.
The introduction of different residues at the pyrazole dramatically influenced the selectivity profile of the desired kinases. Ester moieties caused to a favorable combination of selectivity and potency towards the kinase of interest CDK16. The removal of additional residues at the pyrimidine, targeting the solvent-exposed region, increased the efficiency towards CDK16. Further optimization led to the highly potent and selective CDK16 inhibitor 98d (IC50 = 33 nM). NanoBRETTM screening against the complete CDK family revealed a preferred inhibition of the PCTAIRE and PFTAIRE subfamily with cellular IC50 values of 20 nM – 120 nM and 50 nM – 180 nM, respectively. A FUCCI cell cycle assay and viability assessment of 98d confirmed previously published results, reporting a G2/M cell cycle arrest followed by apoptosis and accumulation of p27 through knockout of CDK16 in SCC cells. Consequently, further studies could evaluate the anti-tumor activity of 98d in SCC and NSCLC or elucidate the effect of 98d in AMPK-related macroautophagy. 98d represents a novel tool compound to investigate the understudied kinases of the PCTAIRE family and enable to enlighten the biological role of those kinases.
Macrocyclization of the N-(1H-pyrazol-3-yl)pyrimidin-4-amine core resulted in the selective BMPR2 inhibitor 110a. It showed a good binding affinity towards BMPR2 with a KD value of 205 nM as well as a good potency with an IC50 value of 506 nM. A comprehensive selectivity screen against 468 kinases revealed an excellent selectivity profile with S35 = 0.01. As no BMPR2 inhibitors have been published so far, 110a represents a novel compound that may provide further insights into the canonical BMP pathway, noncanonical signaling, or its impact on BMPR2-associated diseases like PAH.
The introduction of additional residues targeting the solvent-exposed region shifted the selectivity towards the MST kinases. The exchange from the pyrimidine to a quinazoline moiety resulted in the highly potent and selective macrocyclic MST3 inhibitor 113c. NanoBRETTM measurements demonstrated the preferred inhibition of MST3 with IC50 values of 210 nM and 30 nM for intact and lysed cells, respectively. A weaker activity could be seen for MST4 with 1.8 µM and 510 nM, while MST1 and MST2 were not affected. To date, no selective MST3 inhibitors have been published, making 113c a valuable tool compound for further functional studies. As MST3 is influencing the cell cycle progression, 113c could be tested in a further cell cycle assay to elucidate the inhibitory effect of 113c on MST3 and consequently on the cell cycle. Furthermore, the anti-tumor activity of 113c in breast cancer could be determined, as Madsen et. al. reported a high MST3 and MST4 activity triggered by FAM40B mutations.
Cytochrome c oxidase (CcO), also called Complex IV of the aerobic respiratory chain, is located in the plasma membrane of prokaryotes and in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes. The redox energy of dioxygen reduction is used to translocate protons across the membrane resulting in an electrochemical proton gradient. The generated proton gradient is exploited by the adenosine-5’-triphosphate synthase. In this work, bacterial four-subunit aa3-Type CcO from Paracoccus denitrificans (ATCC 13543, 4 SU-wt ATCC CcO) was used for analyses. 1) The recombinant homologously produced 4 SU-wt CcO (4 SU-wt rec CcO) was functionally compared with the native 4 SU-wt ATCC CcO. The 4 SU-wt rec CcO showed functional deficiencies as determined by UV-vis spectroscopy and electron paramagnetic resonance (EPR) studies. Total X-ray Reflection Fluorescence measurements show in both wild type CcOs the same ratio of the redoxactive Fe and Cu (2 Fe : 3 Cu) indicating full complement of the functional metals. If CcO contains only subunit I and II, it loses its functional integrity during continuous turnover activity. The importance of subunit III for integrity of CcO was demonstrated using 2 SU-wt rec CcO. Crystallisation trials of suicide inactivated 2 SU-wt rec CcOs have been ineffective using standard crystallisation conditions. Crystals of active 2 SU-wt rec CcO (positive control) have been obtained under these conditions and this result indicates possible structural changes in suicide inactivated 2 SU-wt rec CcO. The structure of active 2 SU-wt rec CcO was determined to 2.25 Å resolution. 2) Terminal oxidases require four electrons for the cleavage of the dioxygen bond (O=O). In general, the catalytic cycle of CcO is described by the electron input and thus by the different redox states of the metal centres: the O, E, R, P and F state. The two-electron reduced R intermediate is able to donate four electrons for dioxygen reduction forming the P state. The P intermediate is an oxoferryl state implying the lack of an electron for the R -> P transition, because the metal centres can only provide three electrons (Fe+II forms Fe+IV and Cu+II forms Cu+I). The P state, where the dioxygen bond is already broken, shows an oxoferryl state (FeIV=O2-) and a nearby tyrosine is proposed to form a tyrosyl radical representing the donor of the missing electron. H2O2-induced artificial intermediates provide the opportunity to investigated different catalytic intermediates in detail. Mixing equimolar amounts of H2O2 to CcO in the O state induces the "two-electron" reduced PH state at high pH and the electronically equal "two-electron" reduced F• H state at low pH. The addition of an excess amount of H2O2 leads to the three-electron reduced FH state. Functional studies using the 4 SU-wt ATCC CcO have demonstrated a bound peroxide (O- - O-) intermediate during the catalytic cycle. Using EPR it was previously shown that Y167 hosts a radical species in PH/F• H state which suggests that Y167 could provide this "missing electron". While X-ray structural models of CcO and Fourier-transformed infrared (FTIR) measurements of oxygenated ("pulsed") 4 SU-wt ATCC CcO suggest a bound peroxide in the O state, UV-vis and EPR spectroscopic studies indicate that other intermediates may also contain such peroxide species. Equimolar and excess amounts of H2O2 induce the PH/F• H and FH states, respectively and catalase treatment of the FH state leads, contrary to the natural direction of the catalytic cycle, to the apparent transition of the FH -> PH/F• H states, which is accompanied by reappearance of an EPR signal from the Y167• radical. The novel PFH/F• FH states are presented here and we postulate that the FH state hosts a superoxide (or peroxide) adduct at CuB in the binuclear site. In addition, the novel P10 state is also introduced having a maximum at lambda = 612 nm in the difference absorption spectrum (minus the O state). The P10 state is induced by mixing CcO in the O state with a pH 10 buffer. This pH 10 induced state resembles standard P states such as PCO, PH and PR. However, the P10 state evolves out of the O state without addition of reduction equivalents. Using EPR spectroscopy it was shown that Y167 hosts a radical species in the P10 state such as in the PH state. In summary, all functional data presented here provide evidence for a peroxide bound during the O state. Finally, a new model for the natural catalytic cycle is proposed. If the O state contains a peroxide, it is also likely that the E and R state contain this species. Even the oxoferryl intermediates P and F states may complex a peroxide at CuB in the binuclear site. 3) The amino acid residue Y167, which hosts the radical in the PH/F•H states, is not directly part of the binuclear site of CcO. For identification of the primary electron donor, two tryptophan variants of CcO, W272F and W164F, which are located nearby the binuclear site, were produced. Evidence is provided that W272 is a kinetically fast electron donor for the O2 molecule. The electron is replenished by Y167, or probably by Y280 in the natural cycle. The Y167 radical is detectable by EPR spectroscopy after treatment with equimolar amounts of H2O2 in the active variant W164F, but is absent in the inactive variant W272F. 4) CcO contains two proton conducting pathways, the D- and the K-pathway. Proteoliposomes of the variants H28A and D30N, mutations located at the entrance of the D-pathway, both show the identical proton pumping activity as the 4 SU-wt rec CcO (pumped H+/e- = 1). The variant N113D shows abolished proton pumping (pumped H+/e- = 0), but a relative high cytochrome c oxidation activity (63 %). G196D displays no cytochrome c oxidation and proton pumping activity. Overall, the addition or removal of a negative charge within the D-pathway such as in D124N, N131D, N113D and G196D leads to a decoupled phenotype indicating the high degree of electrostatic coupling in CcO.
Across the entire animal kingdom, sociality, i.e. the tendency of individual animals to form a group with conspecifics, is a common trait. Environmental changes have to be met with corresponding, quick adaptations. For social species, the presence of conspecifics is important for survival and if social animals are deprived of access to conspecifics, this can lead to strong and lasting changes on a physiological level as well as behaviour. Gene expression changes responsible for these adaptations have so far not been understood in detail. As social isolation leads to changes on a neuronal level, it is important to investigate the gene expression changes that are induced in the brain. In this thesis, next-generation RNA-sequencing was applied to zebrafish, a well-established model organism characterized by its high degree of companionship. Within the entire brain, gene expression was analysed in zebrafish that were raised either with conspecifis or in isolation, ranging from 5 to 21 days post fertilization. Using this approach, several genes were identified that were downregulated by social isolation. In this thesis, I focused on one of these consistently downregulated genes, parathyroid hormone 2 (pth2). The expression of pth2 was demonstrated to be bidirectionally regulated by the number of conspecifics present and to be responsive to changes in the social environment within 30 minutes. Regulation of pth2 does not occur by visual or chemosensory access to conspecifcs, but is mediated by mechanosensory perception of other fish via the lateral line. In an experiment using an artificial mechanical stimulation paradigm, it was shown that the features necessary to elicit pth2 transcription closely mimick the locomotion of actual zebrafish. Other, similar stimulation paradigms are not capable to induce this transcriptional response.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ausgewählte Gruppen der Dekapoden (brachyure Krabben, Einsiedler und Porzellankrebse) des PersischArabischen Golfes und des Golfes von Oman taxo nomischfaunistisch zu erfassen, eine Abschätzung des Artenreichtums und der Faunenzusam mensetzung vorzunehmen und die zoogeographischen Beziehungen innerhalb der Golfregion und zu anderen Teilen des westlichen Indischen Ozeans zu analysieren. Die Dekapodenfauna der Golfregion war -- im Gegensatz zur sehr viel besser untersuchten des Roten Meeres -- bislang Gegenstand vergleichsweise weniger wissenschaftlicher Arbeiten, und der faunistischtaxonomische Kenntnisstand stellte sich als entsprechend lückenhaft dar. Dies erwies sich einerseits als Problem bei der Beurteilung des Zustands von Lebensgemeinschaften und Folgeschäden nach der Ölkatastrophe von 1991, andererseits als Hindernis für Faunen vergleiche und zoogeographische Studien. Um vor allem die bislang wenig bearbeiteten eulitoralen Lebensräume wie Watten und Man groven, aber auch Korallenriffe, intensiv zu beproben, wurden Sammelreisen in verschiedene Teile des PersischArabischen Golfes und den Golf von Oman durchgeführt. Daneben wurde umfangreiches Museumsmaterial der bedeutenden Sammlungen aus der Golfregion taxonomisch untersucht, mit Material aus anderen Regionen verglichen und neu bewertet. Insgesamt konnte für den PersischArabischen Golf das Vorkommen von 188 Arten brachy urer Krabben, 20 Pagurideen (Einsiedlerkrebse) und 18 Porcellaniden (Porzellankrebse) eindeutig belegt werden; 43 Arten (37 Brachyuren, 4 Pagurideen und 2 Porcellaniden) wurden erstmals für den Golf nachgewiesen. Bei 11 dieser Neunachweise handelt es sich um bislang unbeschriebene Arten. Ein faunistischer Vergleich zu anderen Teilen des Indischen Ozeans zeigt, daß der Golf für die untersuchten Taxa insgesamt deutlich artenärmer als das Rote Meer oder die ostafrikanische Küste ist. Dies ist vor allem auf die geringere Ausdehnung und schlechtere Entwicklung von Korallenriffen sowie das Fehlen von Tiefwasserhabitaten, aber auch auf das Vorherrschen extre mer ökologischer Bedingungen in weiten Teilen des Golfes zurückzuführen. Zwischen verschie denen systematischen und ökologischen Gruppen bestehen allerdings große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums. Während hartboden und korallenassoziierte Gruppen im Golf deutlich unterrepräsentiert sind, findet sich bei weichbodenbewohnenden Taxa eine vergleichs weise artenreiche Fauna. Besonders auffallend ist dabei der Artenreichtum der eulitoralen Ocypodidae, die mit 23 Arten im Golf eine weitaus höhere Artendiversität erreichen als im Roten Meer oder an der ostafrikanischen Küste und gemeinsam mit den ebenfalls vorwiegend in der Gezeitenzone leben den Grapsiden einen Schwerpunkt der Arbeit bildeten. Innerhalb der Golfregion zeigten sich für diese Familien große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums und der Faunenzusammen setzung. Die Wattgebiete und Mangroven des nördlichen und des südöstlichen PersischArabi schen Golfes sowie des Golfes von Oman fallen dabei durch ihre sehr diverse Fauna auf. Stark verarmt ist dagegen die eulitorale Fauna des südwestlichen und westlichen Teils des Persisch Arabischen Golfes. Der Grund für diese Verarmung ist dabei vor allem im hohen Salzgehalt des küstennahen Wasserkörpers zu sehen. Die Ergebnisse der faunistischtaxonomischen Auswertungen ermöglichten eine zoogeogra phische Analyse, bei der die Dekapodenfauna sowohl auf ihre Homogenität innerhalb der Golf region, als auch auf ihre Beziehungen zu der aus anderen Teilen des Indischen Ozeans untersucht wurde. Hierzu wurden Endemismusraten und Verbreitungsmuster der aus dem Golf nachgewie senen Arten betrachtet sowie Faunenähnlichkeiten mit Hilfe multivariater statistischer Methoden analysiert. Zoogeographisch stellt sich die Dekapodenfauna der Golfregion als Mischung unterschied licher zoogeographischer Elemente dar. Dies reflektiert die Lage des Golfes am Übergang zwischen westlichem Indischen Ozean und indischer bzw. indomalaiischer Region. Die Endemis musraten liegen bei 6 % für Porcellaniden, 7 % für Brachyuren und rund 10 % für Pagurideen. Für keine der Gruppen läßt sich daraus eine Begründung für eine eigene Faunenprovinz oder ein Endemismuszentrum ableiten. Neben den Endemiten beinhaltet die Fauna Arten unterschied licher geographischer Beziehungen. Den größten Anteil stellen weit verbreitete Arten, die je nach Gruppe zwischen der Hälfte und zwei Dritteln der im Golf vorkommenden Arten ausmachen. Für die Einsiedlerkrebse sind daneben vor allem Arten aus dem Roten Meer und dem Golf von Aden von Bedeutung, was auf eine enge Beziehung der Pagurideenfauna zu diesen Gebieten hin weist. Dagegen sind für die Brachyuren indopakistanische und indomalaiische Arten von weit aus größerer Bedeutung, was eine größere Ähnlichkeit der Krabbenfauna zu der Pakistans und Indiens andeutet. Innerhalb der Golfregion ergaben sich für die Brachyurenfauna, insbesondere für Ocypodi den, deutliche Unterschiede hinsichtlich der zoogeographischen Beziehungen. Während der von östlichen Faunenelementen dominierte nördliche und östliche Golf kaum westliche Faunen elemente aufweist, stellen diese im südlichen Golf und vor allem im westlichen Teil des Golfes von Oman einen erheblichen Anteil an der Gesamtfauna. Getrennt werden diese beiden Gebiete durch die Bereiche des südlichen und westlichen Golfes, in denen die extrem hohen Salzgehalte eine wirksame Verbreitungsbarriere darstellen. Zumindest für einige Taxa ist demnach die Golf region nicht als einheitliche faunistischzoogeographische Region zu betrachten. Während der nördliche und östliche Teil des PersischArabischen Golfes zoogeographisch eng mit Pakistan verbunden sind, zeigen sein südlicher Teil und der westliche Golf von Oman engere Beziehungen zum Golf von Aden und dem Roten Meer. Aufgrund der vergleichsweise guten Dokumentation der Faunenzusammensetzung in ver schiedenen Teilen des Indischen Ozeans ließ sich für Ocypodiden und Grapsiden ein überregio naler Faunenvergleich mit Hilfe multivariater Analysenmethoden durchführen und eine zoogeo graphische Unterteilung des Indischen Ozeans vornehmen. Innerhalb des westlichen Teils des Indischen Ozeans lassen sich dabei drei Regionen aufgrund ihrer Faunenähnlichkeit voneinander abgrenzen. Dies sind -- eine ost/südostafrikanische Region, die von der Nordostküste Südafrikas bis nach Somalia reicht -- eine west/südarabische Region bestehend aus Rotem Meer, Golf von Aden, der südarabi schen Küste und dem westlichen Golf von Oman, die auch in den südöstlichen Persisch Arabischen Golf hineinzieht -- eine ostarabischpakistanische oder iranischpakistanische Region, die den nördlichen und östlichen Teil des PersischArabischen Golfes, den östlichen Golf von Oman sowie Pakistan und Nordwestindien umfaßt Hinsichtlich der Besiedlungsgeschichte des PersischArabischen Golfes zeigen die Ergebnisse, daß eine Besiedlung durch eulitorale Krabben zum größten Teil von der indischen Seite aus entlang der iranischen Küste stattgefunden haben muß, während später eingewanderte westliche Elemente aufgrund der massiven Salinitätsbarriere und der Strömungsverhältnisse auf den süd östlichsten Teil beschränkt blieben. Vor allem die Gezeitenzonen des PersischArabischen Golfes weisen teilweise sehr diverse Lebensgemeinschaften auf, deren Artenzusammensetzung in ihrer Mischung unterschiedlicher zoogeographischer Elemente einzigartig ist und den Einfluß verschiedener Wasserkörper auf den Golf anzeigt. Für die Ocypodiden führt dies zu einer hohen regionalen oder gammaDiversität sowie einer über reine Artendiversität hinausgehenden Diversität der Lebensgemeinschaften. Während sich die Folgen des Golfkriegs als weniger gravierend als ursprünglich befürchtet erwiesen haben, könnten Habitatzerstörung und schleichende Verschmutzung die Lebensgemein schaften des PersischArabischen Golfes irreparabel schädigen.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Algorithmus für die automatische Optimierung einer NMR-Zuweisung des back bones in gelabelten Proteinen und seine Implementierung vorgestellt. Der Algorithmus ermöglicht eine Zuweisungsstrategie, die sich näher an der manuellen Vorgehensweise orientiert als vergleichbare Implementierungen von Lukin (LUK 11 ) [Lukin97] oder Leutner (PASTA) [Leutner98], da er die Entscheidung über konkurrierende Protospinsysteminterpretationen in die globale Optimierung der Zuweisung verlegt und die Benutzer nicht zwingt, sich vorzeitig auf eine Interpretation pro Aminosäure und Peak zu beschränken. Der Algorithmus löst daher nicht nur das Reihenfolgenproblem für einen schon vorgegebenen Satz von Protospinsystemen, sondern auch das Auswahlproblem zwischen verschiedenen, sich widersprechenden, Interpretationen der gleichen Peakgruppe. Durch das zusätzliche Auswahlproblem erhöht sich die Komplexität der Optimierungsaufgabe, der Lösungsraum wächst daher um mehrere Größenordnungen. Dies verlängert die Laufzeit für den einfachen RANDOM Algorithmus gegenüber einem vergleichbaren Reihenfolgeproblem. Es wurden daher verschiedene Methoden untersucht, um die Laufzeit wieder zu reduzieren. Die erzielten Verbesserungen führen nicht nur zu einer besseren Konvergenz, sondern ermöglichen auch erstmals eine echte parallele Implementierung des Algorithmus. Die algorithmischen Verbesserungen sind die Reduktion des Protospinsystemcaches und der GENETISCHe Algorithmus. Zusätzlich wurde eine verbesserte Konfiguration zur Kontrolle der Suboptimierer gefunden. Die Implementierung der zugrundeliegenden Datenstrukturen ermöglicht die Umsetzung zusätzlicher Nebenbedingungen für die Positionen der Protospinsysteme innerhalb der Zuweisung. Ein Beispiel für die Nebenbedingungen sind die knotenlokalen Filter und die Strukturfilter aus Kapitel 2. Ihre Effizienz wird am besten durch die Aminosäuretypenerkennung demonstriert, die die Größe des Lösungsraumes um 168 Größenordnungen für Trigger reduziert. Dadurch verringert sich die Laufzeit des RANDOM Algorithmus bis zu einem Faktor von 132. Für PASTA wurde in [Leutner98] statt dessen der umgekehrte Effekt auf die Laufzeit festgestellt. In ihrer Implementierung verlängert sich die Laufzeit auf das Doppelte. Der Unterschied kann nur durch eine unterschiedliche Nutzung der Aminosäuretypenerkennung im Protospinsystempool erklärt werden. PASTA nutzt diese Information anscheinend nicht, um den Pool und damit den Lösungsraum zu reduzieren, sondern nur bei der Bewertung der Zuweisung. Diese Konfiguration kann in RANDOM näherungsweise nachvollzogen werden, wenn man im AS-Cache jeder Aminosäure jedes Protospinsystem zuweist. Die Bewertung der Aminosäuretypen und den Austausch zwischen Pool und Individuum kann man aber nicht abschalten. Ein möglicher Nachteil der Reduktion des AS-Caches mittels der Aminosäuretypenerkennung ist die Möglichkeit, daß Aminosäuren mit untypischen Frequenzen der falschen Aminosäure zugewiesen werden oder nicht in den Cache für die theoretische Aminosäure aufgenommen werden. Um eine falsche Zuweisung durch die Reduktion auszuschließen oder zu überprüfen, kann man zuerst mit einem AS-Cache mit Typenerkennung optimieren und das Ergebnis in einer zweiten Optimierung mit einem AS-Cache ohne Typenerkennung nachoptimieren. Diese Möglichkeit wurde bei der Zuweisung von Trigger demonstriert. Für Trigger konnte durch den Wechsel des Caches gezeigt werden, daß auch mit dem reduzierten Cache eine stabile Zuweisung gefunden wird, die der Zuweisung ohne Aminosäuretypenerkennung weitgehend entspricht. Die Zuweisungen unterscheiden sich in Aminosäuren mit unsicherer Typenzuweisung. In Trigger wird nur ein Protospinsystem (Phe66,Ile67) aufgrund der Typeninformation von der Position im AS-Cache ausgeschlossen, der es in der manuellen und der Zuweisung ohne Reduktion zugewiesen wurde. In anderen Fällen führt erst die Typeninformation zur richtigen Zuweisung (zB. Thr60,Ile61), während die Zuweisung ohne Typenerkennung eine Fehlzuweisung erzeugt. Man sollte daher immer beide Versionen berechnen und dann vergleichen, da eine manuelle Zuweisung beide Defekte aufweisen kann, weil sie die Zuweisungsregeln nicht so strikt optimiert, wie es ein automatischer Algorithmus kann. Für beide Algorithmen wurde der Parameterraum untersucht und eine sowohl optimale als auch robuste Konfiguration gesucht. Dabei wurde der Einfluß jedes Parameters des Algorithmus auf die Laufzeit bis zur Konvergenz zum globalen theoretischen Maximum bestimmt. Bei RANDOM waren hauptsächlich die Zusammensetzung des Aktionsprofils und die minimale und maximale Lebenszeit der veränderten Zustände, minTTL und maxTTL, für die Laufzeit entscheidend. Alle drei kontrollieren, welche Pfade durch den Lösungsraum ab einem Zustand erlaubt sind. Die gleiche Untersuchung wurde auch für die Parameter der zu berechnenden Probleme (Proteine) durchgeführt. Für den Datensatz wurde sowohl der Einfluß der Proteingröße, des maximalen CA Abstandes zwischen den Peaks der benachbarten Aminosäuren und der Aufbereitung des Protospinsystemcaches auf die Laufzeit, als auch der Einfluß eines unvollständigen Datensatzes auf die Konvergenz untersucht. Der Algorithmus zeigte sich dabei sehr robust gegen fehlende Peaks, da bis zu 45% der theoretischen Peaks fehlen können, ohne daß die Konvergenz zum theoretischen Optimum verloren geht. Unterhalb von 55% hängt die Übereinstimmung der gefundenen Lösung mit der theoretischen Lösung von der Zusammensetzung der gebildeten Protospinsystemfragmente ab. Proteingröße und maximaler CA Abstand haben dagegen großen Einfluß auf die Laufzeit. Während die Parametrisierung des RANDOM Algorithmus sich auf die Untersuchung des Wertebereichs der Kontrollparameter beschränken kann, muß die Parametrisierung des GENETISCHen Algorithmus auch die verschiedenen Crossover Operatoren und die Kontrolle der Suboptimierer umfassen. In Kapitel 3 wurden die verschiedene Crossover Algorithmen und unterschiedliche Konfigurationsvarianten für den Suboptimierer im GENETISCHen Algorithmus untersucht. Die aus der Literatur bekannten Crossover Operatoren waren dabei den spezialisierten G Operatoren unterlegen. Auch die Varianten elitär und statistisch, die keinen genetischen Austausch zwischen verschiedenen Individuen zulassen, waren den speziellen Operatoren immer unterlegen. Selbst kleine Anteile eines Genaustausches bewirkten eine Verbesserung der Laufzeit und die Qualität der Lösung. Dabei verbesserte sich besonders die Konvergenz durch den genetischen Austausch. Die speziellen G Operatoren übertragen nur die Differenz der Eltern statt, wie im klassischen Crossover, blind irgendeinen zusammenhängenden Bereich zu kopieren. Dadurch vermeiden sie es, hauptsächlich identische Bereiche zu kopieren, sondern übertragen nur Protospinsysteme, die sich in den Eltern unterscheiden. Außerdem wurde die Effizienz der speziellen Operatoren noch weiter gesteigert, indem die übertragenen Informationen mit Hilfe von Filtern gezielt auswählt wurden. Die übertragene Differenz wird dazu aufgrund ihrer Nachbarn und der Verknüpfung mit den Nachbarn ausgewählt. Mit unterschiedlichen Filtern wurden so Bereiche mit einem unterschiedlich hohen lokalen Optimierungsgrad für die Übertragung ausgesucht. Die Laufzeituntersuchungen in Kapitel 3 zeigen, daß es eine Grenze für die Effizienzsteigerung durch die Übertragung lokal voroptimierter Bereiche gibt. Während es beim Wechsel von unkoordinierten, punktförmigen Übertragungen (s1) zur Übertragung von kurzen Strecken aus benachbarten Protospinsystemen, mit oder ohne Verknüpfung (s2), noch zu einer geringen Verbesserung der Laufzeit und der Konvergenz kommt, führt die zusätzliche Koordinierung der übertragenen Nachbarn durch die Nebenbedingung der Verknüpfung in den s3 Algorithmen sogar zu einer geringen Verschlechterung der Laufzeit. Die Gründe für die Verschlechterung konnten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Möglicherweise verringert sich die Anzahl der kopierbaren Bereiche durch die zusätzlichen Nebenbedingungen so sehr, daß nicht genügend unterschiedliche Differenzen für die Übertragung in die neuen Individuen gebildet werden. Die neuen Individuen erhalten dann hauptsächlich die gleichen neuen Gene. Dadurch kann es zu einer Verarmung des genetischen Pools, d.h. zum Verlust der genetischen Diversität in der Population kommen. Die neuen Individuen suchen dann identische Bereiche im Lösungsraum ab und nehmen dadurch die lokale Optimierung doppelt vor. Dadurch verschwendet diese Konfiguration CPU Zeit auf schon untersuchte Bereiche. Neben der direkten Übertragung zusammenhängender Bereiche gibt es noch einen weiteren Faktor der die spezialisierten Operatoren, gegenüber dem klassischen Crossover, verbessert. Die Differenzbildung im Crossover nimmt auf die Konkurrenz um die Peaks zwischen den Protospinsystemen keine Rücksicht. Dadurch befinden sich die neuen Individuen zuerst meist im illegalen Teil des Zustandsraumes S n . Nach dem Crossover wird daher ein Teil der ursprünglichen Protospinsysteme des neuen Individuums durch den Reparaturmechanismus gelöscht und dadurch schon optimierte Bereiche zerstört. Daher kommt dem Reparaturmechanismus für illegale Zustände die entscheidende Rolle zu, denn er erzwingt die Neuberechnung der Positionen, die vor dem Crossover durch einen Konkurrenten eines übertragenen Protospinsystems belegt waren. Die ehemaligen Zuweisungen in den zerstörten Bereichen sind dabei nur über die Resourcenkonkurrenz mit den im Crossover neu injizierten korreliert. Das Crossover mit Zerstörungen erweitert dadurch den erreichbaren Lösungsraum, statt ihn, wie beim klassischen Crossover, auf den Raum zwischen den Eltern einzuschränken! Die Zerstörungen sind für die Optimierung daher von Vorteil. Außerdem zeigte sich in Kapitel 3, daß für die speziellen Operatoren eine besondere Konfiguration des Suboptimierers besonders effizient ist, die den einzelnen Individuen nur die CPU-Zeit zuteilt, die sie, effizienter als ihre Konkurrenten, zu einer Verbesserung nutzen können. Diese Verteilung der Rechenzeit wird durch die sogenannte Ratenbegrenzung erreicht. Die veränderlichsten Individuen erhalten dabei die meiste Rechenzeit. Dies sind normalerweise die Individuen, die in einem der letzten genetischen Zyklen neu erzeugt wurden. Sobald ein Individuum in ein tiefes lokales Optimum, d.h. eine Sackgasse, geraten ist, erhält es weniger Rechenzeit, da seine Verbesserungsrate unter den Schwellwert sinkt. Dadurch darf man den einzelnen Individuen eine höhere maximale Laufzeit zuteilen, da sie sie nur nutzen können, wenn sie sich währenddessen verbessern. Die Kombination "ratenbegrenzt" mit Operator Gs2p2A verbraucht trotz des komplexeren Algorithmus weniger CPU-Zeit bei gesteigerter Konvergenzwahrscheinlichkeit und geringerer paralleler Laufzeit als jede andere Konfiguration. Sie ist damit die beste bekannte Konfiguration für GENETISCH. Im Praxistest in Kapitel 5 mit dem Proteinabschnitt Trigger M bestanden zwischen den automatischen Zuordnungen und der manuellen Zuweisung nur geringe Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den Optimierungen mit unterschiedlichen Caches entstehen hauptsächlich in den Bereichen, die an einem Ende keinen verknüpften Nachbarn haben oder bei denen die manuelle Zuweisung unsicher ist, wie im Bereich 10 - 20. Durch die automatische Zuweisung konnte die manuelle Zuweisung sogar an einigen Stellen vervollständigt werden. Sie ist daher einer manuellen Zuweisung gleichwertig. Darüber hinaus entsteht bei der automatischen Zuweisung immer eine Dokumentation über die Verwendung der Peaks, so daß man ungenutzte Spinsysteme leichter finden kann. Der genetische Algorithmus kann optimal auf einem Netzwerkcluster implementiert werden, daher bietet sich ein echte parallele Implementierung an. GENETISCH braucht dabei keine besondere Hardware, wie Vektorrechner, shared memory oder besonders schnelle Netzwerkverbindungen, sondern kann auf einer Gruppe von normalen Rechnern mit einer üblichen Ethernet100 Netzwerkverbindung implementiert werden, da nur zum Austausch der Individuen, bzw. ihrer Differenz, eine Kommunikation zwischen den Rechnern notwendig ist. Dadurch kann die Kommunikation auf wenige KB alle paar Sekunden beschränkt bleiben. GENETISCH sollte außerdem leicht zu skalieren sein, da man die Anzahl der Individuen leicht an größere Probleme anpassen kann. Eine echte parallele Implementierung erlaubt daher sowohl die Rechenzeit für komplexere Problem auf wenige Minuten zu reduzieren als auch größere und mehrdeutigere Spektren zuzuweisen. Außerdem kann man die Wahl der Prozessparameter selbst auch dem selben Optimierungsprozeß unterwerfen, der bisher für die Optimierung der Zuweisung verwendet wurde. Dadurch sollte es möglich sein, die Optimierungsparameter, analog dem Profil der Abkühlung im simulated annealing, dynamisch an die Phase der Optimierung anzupassen und den Individuen immer die optimalsten Optimierungsparameter zu bieten, ohne diese vorher von Hand suchen zu müssen. Diese Veränderung erfordert aber eine große Anzahl an Individuen und damit die echte parallele Implementierung.
Dissecting the complexities of mammalian heart development and regenerative capacity require thorough understanding of the underlying molecular mechanisms through the expression pattern of proteins and post-translational modifications. To obtain insights intoactivated signaling pathways that control the cellular phenotype during postnatal heart development, we generated a comprehensive map of phosphorylation sites. In total we identified 21,261 phosphorylation sites and 8985 proteins in developing mouse hearts by mass spectrometry. The in-vivo SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture) approach allowed robust quantification of phosphorylation sites and proteins, which are regulated during heart development. We found several activated pathways involved in cell cycle regulation and detected numerous kinases and transcription factors to be regulated on protein and phosphopeptide level. Most strikingly, we identified a novel mitochondrial protein, known previously as Perm1, as a highly phosphorylated factor regulated during heart development. We renamed Perm1 as MICOS complex subunit Mic85 since it shows robust physical interaction with MICOS complex subunits, including Mitofilin (Mic60), Chchd3 (Mic19), Chchd6 (Mic25) and the outer membrane protein Samm50. Moreover, Mic85 is localized to the mitochondrial inner membrane facing the intermembrane space and the dynamics of Mic85 protein expression is regulated by the ubiquitin-proteasomal system through phosphorylation of casein kinase 2 on its PEST motif. Silencing of Mic85 in cultured neonatal cardiomyocytes impairs mitochondrial morphology and compromises oxidative capacity. Our findings support a clear role for Mic85 in the maintenance of mitochondrial architecture and in its contribution to enhanced energetics during developing and adult mouse cardiomyocytes. The transgenic Mic85 knockout mouse generated with a GFP knock-in will support future in vivo investigations on the integrity of mitochondria and the function of Mic85 in cardiac development.
Nukleäre Rezeptoren (NRs) sind ligandengesteuerte Transkriptionsfaktoren, die sich aus einer Superfamilie von 48 humanen Mitgliedern zusammensetzt. Seit vielen Jahrzehnten stellen sie ein attraktives Forschungsgebiet für die Arzneistoffentwicklung dar, da sie eine bedeutende Rolle in zahlreichen Prozessen unseres Körpers spielen. Das Ziel dieser Forschungsarbeit bestand darin, neue innovative Liganden für den Peroxisomen-Proliferator-aktivierter-Rezeptor γ (PPARγ) sowie die Waisenrezeptoren Nervenwachtumsfaktor induzierter Klon B (Nur77) und Neuronen-abgeleiteter Waisenrezeptor (NOR-1) zu identifizieren.
Bei den Rezeptoren Nur77 und NOR-1 handelt es sich um noch unzureichend erforschte NRs der NR4A-Familie. Es fehlt insbesondere an Modulatoren dieser Rezeptoren als Werkzeuge, um ihr zum Teil noch unentdecktes Potential zu erforschen. Um diese Lücke zu schließen, wurde ein in vitro Screening durchgeführt und eine Arzneistoff-Fragment-Bibliothek mit 480 Fragmenten, die aus bekannten strukturellen Motiven zugelassener Arzneimittel stammen, auf ihre modulatorische Aktivität an Nur77 und NOR-1 gescreent. Durch das Screening und weitere Testungen konnten jeweils für Nur77 und für NOR-1 drei Verbindungen als Liganden identifiziert werden. Bei der weiteren Charakterisierung stellte sich insbesondere 41 als besonders vielversprechenden Ausgangspunkt für die Entwicklung von Liganden für Nur77 und NOR-1 heraus, der ein besseres Verständnis für die invers agonistische Aktivität lieferte und die Möglichkeit für eine agonistische Modulation aufzeigte. Zudem konnte durch ein weiteres Screening mit Computer-gestützten Verfahren auf Nur77 der Chemotyp von 41 noch weiter optimiert werden und führte zur Identifizierung von Verbindung 68 (EC50 = 2 ± 1 μM). Diese zeichnete sich durch eine hohe Potenz aus, die zu einer beachtenswerten Aktivierung von Nur77 (169 ± 18% maximale Aktivierung) führte. Die Untersuchung der strukturellen Erweiterung von 43 (IC50 = 47 ± 8 μM) führte zur Verbindung 75, die eine 3,5-fache Steigerung des inversen Agonismus auf NOR-1 zeigte. Die Erkenntnisse dieser Entdeckung ermöglichte den Rückschluss, dass das Einführen von voluminösen Resten, wie Brom oder Phenyl eine invers agonistische Potenz im unteren mikromolaren Bereich bewirkte. Die Identifizierung der Verbindungen 41 und 68 für Nur77 sowie 43 und 76 für NOR-1 könnten dazu beitragen, ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen hinter der Aktivierung von Nur77 und NOR-1 zu erlangen und einen vielversprechenden chemischen Ausgangspunkt für die Entwicklung von noch wirksameren und selektiveren Liganden bieten.
Im anderen Teil dieser Forschungsarbeit stand die Synthese eines selektiven allosterischen PPARγ-Liganden im Fokus, um mit diesem die allosterische Modulation von PPARγ zu charakterisieren. Den Ursprung der Idee lieferte Garcinolsäure, dass in der Lage ist, PPARγ orthosterisch und allosterisch zu binden. Aufgrund der komplexen biologischen Effekte und der geringen synthetischen Zugänglichkeit konnte 37 nicht als Ausgangspunkt für dieses Vorhaben dienen. Auf der Suche nach einer geeigneten Ausgangsverbindung wurde durch ein in vitro Screening mit einer hauseigenen Sammlung von synthetischen PPARγ-Modulatoren, bei dem die orthosterische Bindungsstelle von PPARγ durch den irreversiblen Antagonisten GW9662 blockiert wurde, Verbindung 39 identifiziert. Diese ist wie 37 in der Lage PPARγ ortho- und allosterisch zu binden, weist aber eine bessere synthetische Zugänglichkeit auf. Die Co-Kristallisation von 39 mit der PPARγ-Ligandenbindungsdomäne zeigte, dass die orthosterische Bindungstasche (BT) keinen Platz für eine Verlängerung des Moleküls bietet, die allosterische BT ist dagegen Lösungsmittel exponiert, wodurch eine Verlängerung möglich schien. Daraufhin wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Verlängerung von 39 eine orthosterische Bindung verhinderte und dadurch eine selektive allosterische Bindung ermöglichen könnte. Aus diesem Grund wurde eine modifizierte Struktur von 39 verwendet, um eine einfache Einbringung eines Linkers in das Molekül zu ermöglichen. Durch verschiedenste Modifikationen und Anpassungen wurde 104 als potenzieller selektiver allosterischer Ligand synthetisiert. Die Testung von 104 im Reportergenassay zeigte eine schwache Aktivierung von PPARγ allein, jedoch offenbarte sich bei der Kombination mit dem orthosterischen Agonisten Pioglitazon eine dosisabhängige Steigerung der Aktivität von PPARγ. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass trotz der Bindung von 104 eine Bindung von 33 in die orthosterische BT immer noch möglich war. Diese Annahme konnte anschließend auch durch zellfreie Experimente (Isotherme Titrationskalorimetrie, MS-basierte-PPARγ-Ligandenbindungs-Assay) bestätigt werden. Der eindeutige Beweis für die selektive allosterische Bindung von 104 lieferte die Co-Kristallisation von 104 mit der PPARγ-LBD. Zusätzlich offenbarte sich, durch den strukturellen Vergleich der Bindungsmodi von anderen PPARγ-Liganden, der außergewöhnliche Bindungsmodus von 104, da 104 im Vergleich zu anderen Liganden selektiv die allosterische BT, ohne Überlappung in die orthosterische BT, besetzte. Weitere Untersuchungen, wie der Einfluss von 104 auf die Rekrutierung von Co-Regulatoren, die Differenzierung von adipozytären Stammzellen und die Genexpression zeigten eine bisher einmalige Modulation von PPARγ, die auf die selektive allosterische Modulation zurückzuführen war. Mit 104 wurde ein innovatives und vielfältig einsetzbares Werkzeug zur Erforschung der allosterischen Modulation von PPARγ entdeckt, dessen Geschichte an diesem Punkt noch nicht zu Ende ist.
In the past century, scientists have realized that venoms are a source of a number of natural substances presenting a wide range of pharmacological properties and often displaying a high specificity for their targets. Thus, the field of toxinology came into being, which is defined as the study of toxic substances of biological origin. Toxins are found in a wide variety of animals, including fish, cone snails, scorpions, snakes, and even some mammals. To be classified as venom, these must contain substances, i.e. toxins, which disturb physiological processes and must be deliberately delivered to the target animal. Snakes have evolved one of the most sophisticated mechanisms for venom delivery. Envenomation by snakebite can induce and inhibit aggregation/agglutination of platelets as well as inhibit/activate hemostasis, but also disrupt other physiological functions via neurotoxins and angioneurin growth factors. Snake venoms contain a substantial amount of C-type lectin-related proteins (CLRPs) which are known to function, notably, as integrin inhibitors. CLRPs are heterodimers composed of homologous α and β subunits which can assemble either covalently or noncovalently to oligomers, resulting in αβ, (αβ)2 and (αβ)4 structures. Some of the main targets of CLRPs are membrane receptors, coagulation factors, and proteins essential to hemostasis. The platelet collagen receptors GPVI and α2β1 integrin as well as the von Willebrand factor receptor GPIb play important roles in platelet activation and aggregation and are considered main targets of antithrombotic drugs. In this thesis, the integrin α2β1 is particularly considered as it is the sole collagen-binding integrin on platelets. Reduced expression of this platelet receptor results in dysfunction of platelet responses. Equivalently, overexpression of α2β1 integrin results in an increased risk of thrombosis. As a result, selective inhibitors of the collagen-α2β1 interaction could give rise to effective antithrombotic drugs. Integrins are large receptors which mediate cell-cell contacts and the binding of cells to the extracellular matrix (ECM). Therefore, they play a role in physiological processes, e.g. hemostasis and immunity, as well as in pathological processes, e.g. tumor angiogenesis and atherosclerosis. 18 α and 8 β integrin subunits, with nine α subunits containing an additional A domain, associate non-covalently to form 24 heterodimers with distinct binding specificities. Integrin collagen receptors are a subclass of four receptors which all utilize the β1 subunit. The α2β1 integrin is a collagen-binding receptor expressed not only on platelets, but also on endothelial and epithelial cells. Consequently, this integrin is also essential for cell adhesion and migration playing a role in angiogenesis as well as tumor metastasis. To date, there are five known antagonists of α2β1 integrin: EMS16, rhodocetin, vixapatin, and most recently rhinocetin and flavocetin-A. The first four have been shown to be specific for the integrin α2A domain, the major collagen-binding domain. All these antagonists are CLRPs and present new leads for drug design. In the past few years, many insights into the structure and function of rhodocetin were obtained. Monoclonal antibodies proved to be advantageous in disclosing this information, making them not only useful as therapeutic agents, but also as tools for protein characterization. The venom of the Vipera palaestinae snake was recently shown to contain an α2β1 integrin inhibitor, which prevented the integrin from binding collagen. This inhibitor, called vixapatin, was the initial focus of this dissertation. Vixapatin’s interaction with the α2β1 integrin needed further characterization on a molecular and cellular level to assess its medical potential and monoclonal antibodies were to be used as a tool. Originally, vixapatin had been isolated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. To avoid the stringency of this method, for this study, it was replaced with gentler chromatographic methods. First, the α2β1 integrin inhibitor was isolated from the crude snake venom with affinity chromatography using the α2A domain as bait, establishing a method to quickly screen venoms for α2β1-binding proteins which affect the collagenintegrin interaction. The applicability of this method to other snake venoms was shown by isolating an α2A domain-specific toxin from the venom of Trimeresurus flavoviridis. To allow further characterization of both these toxins, gel filtration and ion exchange chromatography were employed to purify the protein without the α2A domain. These classical protein purification methods resulted in similar separation patterns of both the V. palaestinae and T. flavoviridis venom proteins. Purified proteins exhibiting the potential of inhibiting integrinbinding to collagen were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Both VP-i and flavocetin-A, the integrin inhibitors from V. palaestinae and T. flavoviridis, respectively, were shown to have more complex structures than was evident from the purification. Each consisted of four low-molecular-weight proteins which assembled into two bands (for VP-i) or one single band (for flavocetin-A) under non-reducing conditions. Mass spectrometry analyses revealed VP-i to belong to the family of CLRPs, just like vixapatin does. However, these two proteins differed in their primary sequences and only showed homology to one another. The toxin purified from T. flavoviridis revealed this toxin to be flavocetin-A, a heterodimeric CLRP which had so far only been shown to have GPIb-binding activity. At the time of flavocetin-A’s purification, flavocetin-B was co-purified; flavocetin-B consists of the same two α and β subunits, plus an additional γ subunit. As no sequence information is known to date for the γ subunit, it may be one of the additional proteins purified here, along with an additional δ subunit. Therefore, the toxin isolated here may actually consist of four different subunits forming a tetramer of two different heterodimers, generating an (αβ)2(γδ)2 structure. This proposed (αβ)2(γδ)2 flavocetin-A structure has binding sites for both α2β1 integrin and GPIb, with no sterical overlap, as shown by affinity chromatography using the α2A domain and the extracellular domain of the GPIb receptor. The potential of VP-i and flavocetin-A to inhibit integrin-binding to type I collagen was shown during purification: Both toxins efficiently bind to the integrin α2A domain; also, VP-i and vixapatin bind to the A domain with the same affinity. Surface plasmon resonance showed the interaction of flavocetin-A with the α2β1 integrin to be extremely strong and association to be very fast. Furthermore, both toxins were shown to inhibit binding of the wildtype integrin to collagen: VP-i and flavocetin-A acted antagonistically on cell adhesion and cell migration. Initially, the interaction between VP-i and α2β1 integrin was to be further characterized with the help of monoclonal antibodies. However, this proved problematic, the procedure requiring various optimizations. Although, after expert consultation, some monoclonal antibodies could be obtained, the cells were extremely sensitive and gave unsatisfactory results when tested as detection tools in Western blot and immunoassays. Concluding, two novel α2β1 integrin inhibitors were discovered: VP-i and flavocetin-A, which were purified using the same procedure and which have similar functions. Both are Ctype lectin-related proteins which effectively inhibit cell adhesion and migration. This underlines that nature has instrumentalized CLRPs to specifically inhibit α2β1 integrin. Further characterization of VP-i and flavocetin-A will be able to provide leads for future drug development.
Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Um die glycinerge Erregungsübertragung zu sichern, muss die Glycinkonzentration an Synapsen präzise reguliert werden. Hierfür sind die Glycintransporter, GlyT1 und GlyT2, verantwortlich. Der GlyT2 ist ein präsynaptisches Protein, das in glycinergen Nervenendigungen nahe der aktiven Zone lokalisiert ist. Das über den Transporter aus dem extrazellulären Raum aufgenommene Glycin steht anschließend für die Befüllung der synaptischen Vesikel durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) zur Verfügung. Die GlyT2-Defizienz führt in Mäusen zu einem letalen Phänotyp und verdeutlicht die Notwendigkeit eines hochaffinen Glycinaufnahmesystems in glycinergen Neuronen. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die zur präzisen Lokalisation des GlyT2 in der Präsynapse führen, wurde das PDZ-Domänenbindungsmotiv (PDZ-DBM) am extremen C-Terminus bzw. die lange N-terminale Domäne dieses Transporters deletiert. Durch biochemische und pharmakologische Analysen von transfizierten HEKT-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Verlust des PDZ-DBM oder der N-terminalen Domäne die Proteinexpression, die Glykosylierung und die Transportaktivität des GlyT2 nicht beeinflussten. Längere Deletionen des N-Terminus (ΔAA1-184) setzten jedoch die Effizienz der Glycinaufnahme herab und ergaben im Vergleich zum wt-Protein einen um 60% reduzierten vmax-Wert, während die apparente Glycinaffinität (KM-Wert) unverändert blieb. Lokalisationsstudien und Oberflächenbiotinylierungen zeigten GlyT2 wt-Immunreaktivität an der Plasmamembran, die sich qualitativ und quantitativ nicht von denen der N- und C-terminalen Mutanten unterschied. Das PDZDBM und die N-terminale Domäne spielen folglich in der Prozessierung und der Transportfunktion des GlyT2 eine untergeordnete Rolle. Möglicherweise reduziert die fast vollständige Deletion der N-terminalen Domäne jedoch die Stabilität des GlyT2. In transfizierten hippocampalen Neuronen wurde der Einfluss des PDZ-DBM und der N-terminalen Domäne hinsichtlich der GlyT2 Lokalisation analysiert. Die transfizierten Mutantenproteine zeigten eine diffuse Verteilung mit partiellen Anreicherungen von GlyT2-Immunreaktiviät. Das wt-Protein kolokalisierte mit Synaptophysin, exzitatorischen synaptischen Markern wie PSD95 und mit den inhibitorischen Markern Gephyrin und VIAAT. Nach Deletion des PDZ-DBM hingegen zeigte der GlyT2 eine um ca. 50% verminderte Kolokalisation mit allen untersuchten synaptischen Markern. Damit konnte hier erstmals eine Funktion des PDZ-DBM für die Anreicherung von GlyT2 an Synapsen gezeigt werden. Mit N-terminalen Deletionsmutanten transfizierte hippocampale Neurone wiesen kolokalisierende GlyT2ΔN-PSD95-Puncta zumeist in MAP2-positiven Neuriten auf, während das wt-Protein zumeist in MAP2-negativen Neuriten kolokalisierte. MAP2 ist ein mikrotubuli-assoziertes Protein, das in Dendriten, aber nicht in Axonen, auftritt und somit eine Unterscheidung derselben ermöglicht. Aufgrund der Überexpression in transfizierten Neuronen war die GlyT2-Immunreaktivität aber sowohl in axonalen als auch dendritischen Neuriten zu beobachten. Zusätzlich zu der in größeren Clustern gefundenen synaptischen GlyT2ΔN-Immunreaktivität war eine Färbung hauptsächlich in sehr kleinen Strukturen (<= 1 μm) nachzuweisen, die Transportvesikeln entsprechen könnten. Dies ist mit einem längeren Verbleib der Deletionsmutanten in intrazellulären Strukturen erklärbar. Im Hippocampus wird GlyT2 endogen nur sehr schwach in einer Subpopulation von putativ glycinergen Neuronen exprimiert. Um die Lokalisation der N-terminalen GlyT2-Proteine in Zellen zu untersuchen, die eine hohe endogene GlyT2-Expression aufweisen, wie spinalen Neuronen, die sich aber nur schlecht transfizieren lassen und in Kultur keine adulte GlyT2-Lokalisation aufweisen, wurden BAC-transgene Mäuse generiert, die myc-markierte GlyT2ΔN-Proteine unter Kontrolle des GlyT2-Promotors exprimieren. Der Vorteil von BAC-transgenen Mauslinien ist, dass sie aufgrund der Verwendung des endogenen Promotors das Transgen nur schwach überexprimieren. Founder-Mäuse, in denen der jeweilige modifizierte BAC-Klon (mGlyT2 wt, ΔAA14-174 oder ΔAA14-184) integriert wurde, wurden identifiziert und mit C57BL/6J-Mäusen verpaart, um so transgene Mauslinien zu etablieren und die Lokalisation der mutierten GlyT2-Proteine zu analysieren. Zusätzlich wurde eine BAC-transgene Cre-Mauslinie generiert, die die Cre-Rekombinase in GlyT2-positiven Zellen exprimiert. Durch die Verpaarung mit konditionalen oder transgenen Mauslinien soll mit diesen GlyT2/Cre-Mäusen die Funktion einzelner Genprodukte in glycinergen Zellen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Glycinrezeptor (GlyR) α-Untereinheiten (UE) in GlyT2-defizienten Mäusen untersucht. GlyT2 -/- Tiere sterben in der zweiten postnatalen Woche nach der Geburt und zeigen einen starken neuromotorischen Phänotyp. Da in demselben Zeitraum ein Austausch der embryonalen α2- durch die adulte α1-UE erfolgt, wurde die Entwicklung der α1- und der Gesamt-α- Immunreaktivität in Rückenmarksschnitten von wt und GlyT2 -/- Tieren analysiert und miteinander verglichen. Die Daten zeigen, dass der α-UE-Austausch in den GlyT2-defizienten Tieren ähnlich wie in wt Tieren erfolgt. In α1-GlyRs ist die Öffnungszeit des aktivierten Kanals kürzer als bei α2-GlyRs. Zusammen mit der geringeren Ausschüttung an Glycin aufgrund der GlyT2-Defizienz lässt sich so das Auftreten des Krampf-Phänotyps der GlyT2 -/- Mäuse nach erfolgtem UE-Austausch erklären.
In der vorliegenden Arbeit wurden marine Schwämme der Gattungen Agelas und Stylissa von den Florida Keys und Bahamas untersucht. Dabei lag das Hauptinteresse neben der Isolierung und Strukturaufklärung der Schwamminhaltsstoffe vor allem auf der ökologischen Funktion der Sekundärstoffe. Die Chemie dieser Schwämme ist sehr charakteristisch und wird von bromierten Derivaten der Pyrrol-2-carbonsäure bestimmt. Insgesamt wurden 17 bromierte Pyrrol-Alkaloide isoliert, von denen die Verbindungen N-alpha-(4-Brompyrrolyl-2-carbonyl)-L-homoarginin (isoliert aus Agelas wiedenmayeri), Bromsceptrin (Agelas conifera), N-Methyl-dibromisophakellin (Stylissa caribica), Monobromisophakellin (Agelas sp.) und Sventrin (Agelas sventres) erstmals beschrieben wurden. Die Strukturaufklärung erfolgte mit spektroskopischen Methoden (2D NMR, MS, IR, UV, CD) und durch Vergleich mit literaturbekannten Daten. Im Fall von N-alpha-(4-Brompyrrolyl-2-carbonyl)- L-homoarginin gelang die Bestimmung der absoluten Konfiguration erst nach Synthese der Verbindung und anschließendem Vergleich der CD-Spektren von Naturstoff und synthetischer Verbindung. Insgesamt wurden die Dichlormethan/Methanol-Rohextrakte von 125 Schwämmen der Gattung Agelas, die an verschiedenen Standorten der Bahamas gesammelt wurden, mittels HPLC qualitativ untersucht und die Hauptsekundärmetaboliten quantitativ bestimmt. In sämtlichen Schwämmen konnten Brompyrrol-Alkaloide nachgewiesen werden, wobei sich drei charakteristische Inhaltsstoffmuster zeigten. Während die Rohextrakte von 71 Proben der Schwämme Agelas cervicornis, Agelas clathrodes, Agelas dispar und Agelas wiedenmayeri durch die beiden Alkaloide Oroidin und 4,5-Dibrompyrrol-2-carbonsäure gekennzeichnet sind, bestimmen dimere Pyrrol-Imidazol-Alkaloide vom Sceptrin- und Ageliferin-Typ, wobei Sceptrin stets dominiert, das Inhaltsstoffmuster von 50 untersuchten Proben der Schwämme Agelas cerebrum, Agelas conifera, Agelas dilatata und Agelas sceptrum. Ein drittes Inhaltsstoffmuster wurde für vier Proben des Schwamms Agelas sp. gefunden, welches durch bromierte Pyrrol-Alkaloide vom Phakellin- und Isophakellin-Typ charakterisiert ist. Zur Untersuchung der ökologischen Bedeutung von Brompyrrol-Alkaloiden wurde die fraßabschreckende Wirkung gegenüber Fischen getestet. In Aquarium- und Freilandversuchen konnte gezeigt werden, daß die fraßhemmende Wirkung der Rohextrakte gegenüber Fischen im Fall von Agelas conifera auf bromierte Pyrrol-Alkaloide vom Sceptrin- und Ageliferin-Typ bzw. Isophakellin-Typ für Stylissa caribica zurückzuführen ist. Erstmals wurden Reinsubstanzen vom Sceptrin-, Ageliferin- und Isophakellin-Typ getestet. Sceptrin und N-Methyl-dibromisophakellin sind bei natürlichen Konzentrationen fraßabschreckend. In weiteren ökologischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß die bromierten Pyrrol-Alkaloide Oroidin, 4,5-Dibrompyrrol-2-carbonsäure und Sceptrin neben einem fraßabschreckenden Potential gegenüber Fischen auch besiedlungshemmend auf Fäulnisbakterien wirken. Bromierte Pyrrol-Alkaloide erfüllen somit mindestens zwei ökologische Funktionen, die das Überleben von Agelas-Schwämmen sichern und sie zu einer der erfolgreichsten Arten in Lebensgemeinschaften karibischer Riffe machen.
In dieser Arbeit, deren Hauptanliegen die Erstellung eines pflanzensoziologischen Systems war, wurde die Segetalvegetation der Sudanzone Westafrikas durch vegetationskundliche Aufnahmen erfasst. Zu den Aufnahmen wurden Bodenproben entnommen und Befragungen über die Anbaumethoden sowie Nutzung der Segetalarten durchgeführt. Um ein repräsentatives Bild der Segetalvegetation zu erreichen, wurden Regionen in Burkina Faso, Nigeria, Benin, Senegal und Mali zur Analyse ausgewählt, die in der Süd-, Nordsudanzone sowie in angrenzenden Gebieten der Sahelzone lagen. 601 Arten aus 70 Familien wurden identifiziert. Vier Familien, nämlich Poaceae, Leguminosae- Papilionaceae, Cyperaceae und Asteraceae dominieren in der Segetalflora und stellen die Hälfte der Arten, während die übrigen Familien, mit oft nur einem Vertreter, weniger repräsentiert sind. Corchorus tridens, Mitracarpus scaber und Leucas martinicensis, die drei häufigsten Segetalarten in der Sudanzone stammen jedoch nicht aus den vier oben genannten Familien. Die meisten Arten sind Therophyten und haben eine in den Tropen eingeschränkte Verbreitung. Es sind entweder pantropische (42 %), afrikanische Arten (32) oder paläeotropische Arten (20 %). Aus den 1120 Aufnahmen wurden 65 Gesellschaften beschrieben. Ein Vergleich dieser Gesellschaften führte zur Erarbeitung einer synoptischen Tabelle, deren Einheiten zur Herausarbeitung von pflanzensoziologischen Syntaxa dienten. Dabei wurden die bis dato beschriebenen Einheiten der Segetal- sowie Ruderalvegetation in den Tropen zum Vergleich einbezogen. Ein pflanzensoziologisches System der Segetalvegetation in der Sudanzone wurde erstellt. Zwei neue Klassen wurden definiert: die Leucetea martinicensis und die Caperonietea palustris. Die Leucetea martinicensis kommen auf den trockenen Böden vor und enthalten zwei Ordnungen: die Commelinietalia benghalensis auf gedüngten und die Polycarpeaetalia corymbosae auf ungedüngten Feldern. Die Commelinietalia benghalensis bestehen aus zwei Verbänden, dem Celosion trigynae und dem Tridaxion procumbentis. Der erste Verband ist sowohl in der Nord- als in der Südsudanzone anzutreffen, während der zweite nur in der Südsudanzone zu beobachten ist. Die Polycarpeaetalia corymbosae beinhalten drei Verbände: das Brachiarion distichophyllae, das Merremion tridentatae und das Jacquemontion tamnifoliae. Das Brachiarion distichophyllae kommt überall in der Sudanzone vor und bevorzugt die häufigen pisolithenreichen Böden. Das Merremion tridentatae ist auch in der gesamten Sudanzone verbreitet. Es ist überwiegend auf ausgesprochen sandigen Böden zu finden. Das Jacquemontion tamnifoliae hat einen eindeutigen Schwerpunkt in der Sahelzone und den Übergangsgebieten zur Sudanzone. Das ist der Verband, der auf den Hirsefeldern der Dünen in der Sahelzone wächst. Die Caperonietea palustris sind eine edaphisch stark geprägte Klasse. Sie wachsen auf den extrem tonreichen Vertisolen. Da diese eine Seltenheit in der Sudanzone sind, stellen die Caperonietea palustris eine ganz besondere Vegetation in der Sudanzone dar. Darin wurden zwei Assoziationen beschrieben: das Sorghetum arundinaceum und das Hygrophiletum auriculatae. Die Segetalvegetation auf den Reisfeldern in den Senken gehört zur neuen Ordnung Melochietalia corchorifoliae, die den Phragmitetea TÜXEN
Locomotion, the way animals independently move through space by active muscle contractions, is one of the most apparent animal behaviors. However, in many situations it is more beneficial for animals to actively prevent locomotion, for instance to briefly stop before reorienting with the aim of avoiding predators, or to save energy and recuperate from stress during sleep. The molecular and cellular mechanisms underlying such locomotion inhibition still remain elusive. So, the aim of this study was to utilize the practical genetic model organism Caenorhabditis elegans to efficiently tackle relevant questions on how animals are capable of suppressing locomotion.
Nerve cells, mostly called neurons, are known to control locomotion patterns by activating some and inhibiting other muscle groups in a spatiotemporal manner via local secretion of molecules known as neurotransmitters. This study particularly focuses on whether neuropeptides modulate such neurotransmission to prevent locomotion. Neuropeptides are small protein-like molecules that are secreted by specific neurons and that act in the brain by activating G protein-coupled receptors (GPCRs) expressed in other target neurons. They can act as hormones, neuromodulators or neurotransmitters. DNA sequences coding for neuropeptides and their cognate receptors are similar across diverse species and thus indicate evolutionary conservation of their molecular signaling pathways. This could potentially also imply that regulatory functions of specific neuropeptides are also similar across species and are thus meaningful to unravel more general mechanisms for instance underlying locomotion inhibition.
Specifically, we find that the modulatory interneuron RIS constitutes a dedicated stop neuron of which the activity is sufficient to initiate rapid locomotion arrest in C. elegans while maintaining its body posture. Similar to its known function in larval sleep, RIS requires RFamide neuropeptides encoded by the flp 11 gene for this activity, in addition to GABA. Furthermore, we find that spontaneous calcium activity transients in RIS are compartmentalized and correlated with locomotion stop. These findings illustrate that a single neuron can regulate both stopping and sleeping phenotypes.
Secondly, we show that C. elegans RPamide neuropeptides encoded by nlp-22 and nlp-2 regulate sleep and wakefulness, respectively. We unexpectedly find that these peptides activate gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-like receptors dose dependently and we highlight their sequence resemblance to other bilaterian GnRH-like neuropeptides. In addition, we show that these receptors are expressed in distinct subsets of neurons that are associated with motor behavior. Finally, we show that nlp 22 encoded peptides signal through GNNR 6 receptors to regulate larval sleep and that nlp 2 encoded peptides require both GNRR 3 and GNRR 6 receptors to promote wakefulness.
In sum, we find that locomotion inhibition in C. elegans is regulated by multiple, but evolutionary conserved RFamide and GnRH-like RPamide neuropeptidergic signaling pathways.
Nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclised antimicrobial non-ribosomal peptides
(2020)
A solution to ineffective clinical antimicrobials is the discovery of new ones from under-explored sources such as macrocyclic non-ribosomal peptides (NRP) from nematophilic bacteria. In this dissertation an antimicrobial discovery process –from soil sample to inhibitory peptide– is demonstrated through investigations on six nematophilic bacteria: Xenorhabdus griffiniae XN45, X. griffiniae VH1, Xenorhabdus sp. nov. BG5, Xenorhabdus sp. nov. BMMCB, X. ishibashii and Photorhabdus temperata. To demonstrate the first step of bacterium isolation and species delineation, endosymbionts were isolated from Steinernema sp. strains BG5 and VH1 that were isolated directly from soil samples in Western Kenya. After genome sequencing and assembly of novel Xenorhabdus isolates VH1 and BG5, species delineation was done via three overall genome relatedness indices. VH1 was identified as X. griffiniae VH1, BG5 as Xenorhabdus sp. nov. BG5 and X. griffiniae BMMCB was emended to Xenorhabdus sp. nov. BMMCB. The nematode host of X. griffiniae XN45, Steinernema sp. scarpo was highlighted as a putative novel species. To demonstrate the second step of genome mining and macrocyclic non-ribosomal peptide structure elucidation, chemosynthesis and biosynthesis, the non-ribosomal peptide whose production is encoded by the ishA-B genes in X. ishibashii was investigated. Through a combination of refactoring the ishA-B operon by a promoter exchange mechanism, isotope labelling experiments, high resolution tandem mass spectrometry analysis, bioinformatic protein domain analysis and chemoinformatic comparisons of actual to hypothetical mass spectrometry spectra, the structures of Ishipeptides were elucidated and confirmed by chemical synthesis. Ishipeptide A was a branch cyclic depsidodecapeptide macrocyclised via an ester bond between serine and the terminal glutamate. It chemosynthesis route was via a late stage macrolactamation and linearised Ishipeptide B was synthesised via solid phase iterative synthesis. Ishipeptides were not N-terminally acylated despite being biosynthesised from the IshA protein that had a C-starter domain. It was highlighted that more than restoration of the histidine active site of this domain is required to restore N-terminal acylation activity.
To demonstrate the final step of determination of antimicrobial activity, minimum inhibitory concentrations of Ishipeptides and Photoditritide from Photorhabdus temperata against fungi and bacteria were determined. None were antifungal while only the macrocyclic compounds were inhibitory, with Ishipeptide A inhibitory to Gram-positive bacteria at 37 µM. The cationic Photoditritide, a cyclic hexapeptide macrocyclised via a lactam bond between homoarginine and tryptophan, was 12 times more inhibitory (3.0 µM), even more effective than a current clinical compound, Ampicillin (4.2 µM). For both, macrocyclisation was hypothesised to contribute to antimicrobial activity. Ultimately, this dissertation demonstrated not only nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclic antimicrobial non-ribosomal peptides but also a process of antimicrobial discovery–from soil sample to inhibitory peptide– from these useful bacteria genera. This is significant for the fight against antimicrobial resistance.
Nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclised antimicrobial non-ribosomal peptides
(2020)
A solution to ineffective clinical antimicrobials is the discovery of new ones from under-explored sources such as macrocyclic non-ribosomal peptides (NRP) from nematophilic bacteria. In this dissertation an antimicrobial discovery process –from soil sample to inhibitory peptide– is demonstrated through investigations on six nematophilic bacteria: Xenorhabdus griffiniae XN45, X. griffiniae VH1, Xenorhabdus sp. nov. BG5, Xenorhabdus sp. nov. BMMCB, X. ishibashii and Photorhabdus temperata. To demonstrate the first step of bacterium isolation and species delineation, endosymbionts were isolated from Steinernema sp. strains BG5 and VH1 that were isolated directly from soil samples in Western Kenya. After genome sequencing and assembly of novel Xenorhabdus isolates VH1 and BG5, species delineation was done via three overall genome relatedness indices. VH1 was identified as X. griffiniae VH1, BG5 as Xenorhabdus sp. nov. BG5 and X. griffiniae BMMCB was emended to Xenorhabdus sp. nov. BMMCB. The nematode host of X. griffiniae XN45, Steinernema sp. scarpo was highlighted as a putative novel species. To demonstrate the second step of genome mining and macrocyclic non-ribosomal peptide structure elucidation, chemosynthesis and biosynthesis, the non-ribosomal peptide whose production is encoded by the ishA-B genes in X. ishibashii was investigated. Through a combination of refactoring the ishA-B operon by a promoter exchange mechanism, isotope labelling experiments, high resolution tandem mass spectrometry analysis, bioinformatic protein domain analysis and chemoinformatic comparisons of actual to hypothetical mass spectrometry spectra, the structures of Ishipeptides were elucidated and confirmed by chemical synthesis. Ishipeptide A was a branch cyclic depsidodecapeptide macrocyclised via an ester bond between serine and the terminal glutamate. It chemosynthesis route was via a late stage macrolactamation and linearised Ishipeptide B was synthesised via solid phase iterative synthesis. Ishipeptides were not N-terminally acylated despite being biosynthesised from the IshA protein that had a C-starter domain. It was highlighted that more than restoration of the histidine active site of this domain is required to restore N-terminal acylation activity.
To demonstrate the final step of determination of antimicrobial activity, minimum inhibitory concentrations of Ishipeptides and Photoditritide from Photorhabdus temperata against fungi and bacteria were determined. None were antifungal while only the macrocyclic compounds were inhibitory, with Ishipeptide A inhibitory to Gram-positive bacteria at 37 µM. The cationic Photoditritide, a cyclic hexapeptide macrocyclised via a lactam bond between homoarginine and tryptophan, was 12 times more inhibitory (3.0 µM), even more effective than a current clinical compound, Ampicillin (4.2 µM). For both, macrocyclisation was hypothesised to contribute to antimicrobial activity. Ultimately, this dissertation demonstrated not only nematophilic bacteria as a source of novel macrocyclic antimicrobial non-ribosomal peptides but also a process of antimicrobial discovery–from soil sample to inhibitory peptide– from these useful bacteria genera. This is significant for the fight against antimicrobial resistance.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit unterschiedlichen Aspekten der Faltung von Tendamistat, einem aus 74 Aminosäuren bestehenden a-Amylase lnhibitor aus Streptomyces tendae. Bei der oxidativen Rückfaltung des Tendamistats konnten bisher drei kinetische Phasen (t1, t2 und t3) identifiziert werden. Die mittlere (t2) bzw. langsame (ti) kinetische Phase, resultiert als Folge einer cis/trans lsomerisierung um eine der drei Xaa-Pro Bindungen im Tendamistat. Wie im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, entsteht die prolinabhängige lsomerisierungsreaktion während der Rückfaltung (t3) als Folge einer trans -> cis Umlagerung um die A1a49-Pro50 Amidbindung nach Entfaltung des Proteins. Der Nachweis einer solchen lsomerisierung gelang auf rekombinantem Weg, durch gezielten Austausch der einzelnen Proline. Im Gegensatz dazu resultiert die mittlere kinetischen Phase (t2) als Folge einer Prolin-unabhängigen cis/trans-lsomerisierungsreaktion um mindestens eine vorhandenen nicht-Prolinbindungen im Protein. Diese Schlußfolgerung konnte durch Vergleich mit zahlreichen Literaturdaten und Experimenten weiter gestützt werden. Tendamistat ist damit das erste Protein in der Literatur, bei dem es gelang, eine solche Prolin-unabhängige lsomerisierungsreaktion experimentell nachzuweisen. Wie mit Hilfe von weiteren Substitutionsexperimenten im zweiten Teil der Arbeit gezeigt werden konnte, tragen hydrophobe Oberflächencluster entscheidend zur Stabilisierung des lnhibitors bei. Die dabei gemessenen Stabilisierungsbeiträge stehen in einem linearen Verhältnis zum Seitenkettenvolumen der eingeführten Aminosäurereste (Alanin << Valin << Isoleucin). Hierdurch ließ sich zeigen, daß der stabilisierende Einfluß solcher Cluster im Wesentlichen auf das Vorhandensein von hydrophoben Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Für die Faltung von Proteinen, die wie das Tendamistat ausschließlich aus ß-Faltblättern bestehen, spielt die Bildung von ß-Hairpinstrukturen eine entscheidende Rolle Die in dieser Arbeit untersuchten ß-Hairpinmutanten L14A bzw. N25A zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine extreme Destabilisierung der ß-Faltblattstruktur. Durch Vergleich der Aktivierungsenergien (DeltadeltaGD-TS) mit den freien Enthalpien (DeltadeltaG0N-D) konnte die strukturelle Entwicklung des ß-Hairpins im Übergangszustand an den beiden Positionen 14 bzw. 25 mitverfolgt werden (~-Wert Analyse). Entgegen den Erwartungen zeigen diese Untersuchungen, daß beide Positionen im Übergangszustand noch weitestgehend solvatisiert vorliegen. Damit scheint die nativ-ähnliche Zusammenlagerung des ersten ß-Hairpins erst nach Erreichen des Übergangszustands stattzufinden. Alle in dieser Arbeit vorgelegten Daten über die Faltung des alpha-Amylase lnhibitors sind konsistent mit dem Nukleations-Kondensations Modell. Analog der Tröpfchenbildung bei unterkühlten Gasen kommt es nach dem kollabieren der Proteinkette als Reaktion auf die veränderten Lösungsmittelbedingungen zur intramolekularen Suche nach Nukleationsstellen. Der Übergangszustand wird erreicht, wenn sich eine kritische Zahl stabilisierender Kontakte (unspezifische Nukleation) ausbilden konnte. Ob an einem solchen Nukleationskern stets bestimmte Seitenketten beteiligt sind (spezifische Nukleation), bleibt an dieser Stelle noch offen.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
In vorliegender Studie wurde lebend und tot gesammeltes Schalenmaterial der Europäischen Flussperlmuschel Margaritifera margaritifera verschiedener Lokalitäten in Schweden, Finnland und Deutschland (bzw. Frankreich) sklerochronologisch und isotopengeochemisch untersucht. Sauerstoffisotopen-Zeitreihen, trendbereinigte und standardisierte stabile Kohlenstoffisotopen-Zeitreihen (SSCI) sowie jährliche Zuwachsraten (SGI-Zeitreihen) jeder der acht Populationen sind zu Compound-Chronologien zusammengefasst und auf Zusammenhänge mit Temperatur, Sonnenflecken-Zyklen und Niederschlag untersucht sowie auf Korrelationen mit verschiedenen Klimaindizes (z.B. dem Dipol der Meeres-Oberflächenwasser Temperatur-Anomalien im Nordatlantik, NADP-SST, und der Nordatlantischen Oszillation, NAO) getestet worden. Im Vergleich ergaben sich für die geglätteten Zeitreihen (25-Jahresfilter) Korrelationskoeffizienten von r = 0,57 (SGI Master-Chronologie und NAO) bzw. r = 0,59 (Master-Chronologie) und NADP-SST. Obwohl weder Isotopendaten noch Zuwachschronologien der Muscheln auf hochfrequenten Signalen hohe Korrelationen mit instrumentellen Messdaten aufweisen, sind dekadische Klimaoszillationen deutlich repräsentiert. Mit zunehmendem Lebensalter nimmt der Schalenzuwachs exponentiell ab. Gleichzeitig nähern sich die d13C-Werte der Schale dem d13CDIC-Wert des Wassers, der bei den hier untersuchten Lokalitäten zwischen -9,3 ‰ und -12,7 ‰ lag. Erst im hohen Lebensalter findet also die Schalenbildung nahezu im kohlenstoffisotopischen Gleichgewicht mit dem umgebenden Medium statt. In der Jugend der Tiere hingegen wirken sich lokalitätsspezifische Trends aus. Extrinsische Faktoren führen zu drei Mustern: 1) Trends hin zu stärker negativen d13C-Werten (um etwa -4,5 ‰) in den Bächen Nuortejaurbäcken (NJB) und Grundträsktjärnbäcken (GTB), 2) Trends hin zu weniger stark negativen d13C-Werten (um etwa +4,5 ‰) in den großen Flüssen (GJ: Görjeån, NWS: Tarn/Frankreich) und 3) Schwankungen um etwa ±1,5 ‰ um einen Mittelwert (RG: Regnitz). Der Einfluss auf die d13C-Trends könnte möglicherweise in Veränderungen der Bioproduktivität begründet sein, da sich diese unmittelbar auf den DIC-Pool des umgebenden Milieus und des Habitats auswirkt. In den Sauerstoffisotopen spiegelte sich die geographische Herkunft des untersuchten Materials wider. Die Chronologien der am nördlichsten gelegenen Populationen wiesen d18OMittelwerte von -11,5 ‰ (GJ), bzw. -9,5 ‰ (NJB, GTB) auf, die RG-Chronologie von -7,9 ‰ und die Zeitreihe der NWS von -5,3 ‰. Im Gegensatz zu anderen Arbeiten zeigten die untersuchten Individuen jedoch keinen statistischen Zusammenhang mit annuellen Temperaturdaten. Als beeinflussende Faktoren kommen die Schneeschmelze und die isotopengeochemische Ausprägung des Habitats (See, Fluss, Bach) in Frage. Eine sehr hohe Korrelation von r = -0,74 (25-Jahresfilter) wurde zwischen der Görjeån-Chronologie (d18OAragonit) und Niederschlagsraten für das in der Nähe des Flusses gelegene Jokkmokk festgestellt.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine aggressive Erkrankung des Knochenmarks, welche die Hämatopoese beeinträchtigt und zu Knochenmarksversagen führt. Trotz des Fortschritts in der AML-Therapie bleibt die Prognose für die meisten Patienten schlecht, sodass neue Therapieansätze für die Behandlung dringend benötigt werden. Autophagie, ein kataboler Abbauprozess von zellulären Komponenten, ist nachweislich an der Entstehung von AML beteiligt. Als zentraler Regulator von Zellüberleben, Homöostase und Stoffwechsel, dient die Autophagie als Nährstoffquelle durch die Wiederverwertung von Makromolekülen während begrenzter Energieversorgung. AML-Zellen benötigen ein konstantes Nährstoff- und Energieniveau, um ihre Vermehrung aufrechtzuerhalten. Dies wird durch eine Umstellung von Stoffwechselwegen, insbesondere des mitochondrialen Stoffwechsels einschließlich der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) und des Tricarbonsäurezyklus (TCA), erreicht.
Mehrere Studien haben die Hemmung der Autophagie für die Behandlung von Krebs als vielversprechenden Ansatz vorgestellt. Doch eine Monotherapie mit Autophagie-Inhibitoren erzielte nur eine geringfügige Wirksamkeit. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die Entstehung von Kompensationsmechanismen, die zum Ausgleich der Autophagie-Hemmung in Krebszellen entstehen. Bis heute sind diese Kompensationsmechanismen kaum untersucht. Ziel dieser Arbeit ist es, ein geeignetes Autophagie-Gen zu identifizieren, mit dem sich die Rolle der Autophagie-Hemmung für das Überleben von AML-Zellen untersuchen lässt. Zusätzlich sollen die kompensatorischen Mechanismen, die durch die Autophagie-Hemmung in AML-Zellen entstehen können, untersucht werden, um neue metabolische Angriffspunkte zu identifizieren, die für Kombinationstherapien genutzt werden können.
Zu Beginn der Arbeit wurde ein gezielter CRISPR/Cas9 Screen in zwei humanen AML-Zelllinien durchgeführt, um Autophagie-Gene zu identifizieren, deren Verlust eine Proliferationsstörung in AML-Zellen verursacht, welche überwunden werden kann. Validierungsexperimente zeigten, dass der Verlust von ATG3 das Zellwachstum signifikant verminderte. Außerdem zeigte die Messung des Autophagie-Fluxes, dass der Verlust von ATG3 die Autophagie stark beeinträchtigte. Dies wurde durch eine Western-Blot-Analyse, die eine beeinträchtigte LC3-Lipidierung zeigte, und durch eine Immunfluoreszenzanalyse der Autophagosomen-Bildung mittels konfokaler Mikroskopie, die eine geringere Anzahl von Autophagosomen in ATG3-defizienten Zellen ergab, bestätigt. Deshalb wurde der Knockdown von ATG3 in AML Zellen verwendet, um die Mechanismen, die zum Ausgleichen der Autophagie-Hemmung entstehen, zu untersuchen. Zuerst wurde die Zellproliferation in fünf verschiedenen AML Zelllinien über sieben Tage betrachtet. In allen Zellenlinien führte der Verlust von ATG3 mittels small hairpin RNA zu verminderter Zellproliferation. Diese Ergebnisse zeigen die wichtige Rolle von ATG3 in der Autophagie und dass Autophagie-Hemmung durch ATG3-Verlust das Wachstum von AML-Zellen beeinträchtigt.
Da der Verlust von ATG3 die Proliferation von AML-Zellen beeinträchtigte, wurde eine Zellzyklusanalyse durchgeführt. Eine reduzierte S-Phase bestätigte die verminderte Proliferation in ATG3-depletierten AML-Zellen, doch der Zellzyklus war grundsätzlich nicht gestoppt. Darüber hinaus ergab die Analyse der Apoptose, dass diese unter dem Verlust von ATG3 erhöht war, aber etwa 50% der Zellen blieben vital. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass AML-Zellen trotz des Verlusts der ATG3-abhängigen Autophagie weiter proliferieren können.
Um die Mechanismen zur Kompensation der Autophagie-Hemmung zu untersuchen, wurden die Auswirkungen des ATG3-Verlusts auf die mitochondriale Homöostase untersucht. Die Mitophagie sowie das mitochondriale Membranpotenzial und die Masse unterschieden sich zwischen Kontroll- und ATG3-depletierten AML-Zellen nicht, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale Homöostase durch den Verlust von ATG3 nicht beeinträchtigt ist. Als nächstes wurde die mitochondriale Funktion durch Messung des ATP-Spiegels und der OXPHOS untersucht. Die ATP-Level und die OXPHOS waren nach dem Verlust von ATG3 in AML-Zellen erhöht, was auf eine gesteigerte mitochondriale Aktivität bei Autophagie-Defizienz hinweist.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
Seit mehr als 200 Jahren gibt es durch die Wissenschaftler der Wetterstation auf dem Hohenpeißenberg systematische Wetterbeobachtungen, doch erst seit wenigen Jahren gibt es unter den Klimaforschern einen Konsens, dass sich das Klima durch anthropogene Einflüsse schon verändert hat – und weiter verändern wird. Die bisherigen Auswirkungen, wie zum Beispiel ein globaler Temperaturanstieg von 0,85°C seit Beginn der Industrialisierung, sind heute gut belegbar. Mögliche zukünftige Entwicklungen des Klimas werden heute ebenso erforscht wie die Auswirkungen des Klimawandels auf Mensch und Umwelt. Zu diesen Auswirkungen gehören unter anderem Folgen für die Landwirtschaft. Durch veränderte Niederschläge und den Temperaturanstieg werden sich die Lebensbedingungen von Bodenorganismen und Anbaubedingungen für Pflanzen ändern. Letztendlich ist aufgrund dieser Veränderungen auch ein verstärkter Einsatz von Pestiziden zu erwarten. Allerdings wurde bisher kaum untersucht, ob der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft unter den Bedingungen des Klimawandels (konkret durch die Interaktion von klimatischen und chemischen Faktoren) ein erhöhtes Umweltrisiko für Bodenorganismen darstellt. Bisher werden klimatische Faktoren bei den Tests für die Zulassung von Pestiziden nicht berücksichtigt.
Daher wurde diese Fragestellung in der hier vorliegenden Dissertation am Beispiel der Effekte von zwei zugelassenen Pestiziden auf Bodenorganismen unter verschiedenen klimatischen Bedingungen untersucht. Konkret wurden dazu mit Labor- und Halbfreilandversuchen die Wirkung eines Insektizids und eines Fungizids in Interaktion von Temperatur und Bodenfeuchte auf Vertreter zweier Invertebratengruppen (Collembola: zwei Arten; Enchytraeidae: eine Art) untersucht.
In einem modifizierten Standardtest mit Collembolen erhöhte sich die Toxizität des Insektizids Lambda-Cyhalothrin, wenn die Exposition der beiden Arten bei einer erhöhten Bodenfeuchte stattfindet. Die kühl adaptierte Art Folsomia candida reagierte bei erhöhter Testtemperatur am empfindlichsten auf diese Testsubstanz: Die EC50 aus diesem Experiment lag bei 2,84 mg (a.s.)/kg Boden Trockengewicht (dw). Unter Standardbedingungen, wie sie in Tests für die Zulassung von Pestiziden angewandt werden, lag die EC50 von F. candida dagegen bei 8,65 mg a.s./kg dw.
Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch das Fungizid Pyrimethanil an Collembolen getestet. Hier erwies sich die Testsubstanz für beide Arten bei
gleichzeitigem Trockenstress und / oder erhöhter Temperatur als toxischer im Vergleich zu den Standard-Testbedingungen. Dabei zeigte F. candida mit einer EC50 von 28,3 mg a.s./kg dw die höchste Empfindlichkeit. Ohne die veränderten klimatischen Faktoren, betrug die EC50 von F. candida 52,3 mg a.s./kg dw.
In Reproduktionstests mit der Enchytraeen-Art Enchytraeus bigeminus wurde die Bodenfeuchte als klimatischer Faktor in Kombination mit jeweils einer Testsubstanz untersucht. Bei beiden Chemikalien reagierte E. bigeminus in trockenem Boden empfindlicher. Die ermittelten EC50 betrugen 1,34 mg a.s./kg dw für Lambda-Cyhalothrin und 437 mg a.s./kg dw für Pyrimethanil. Getestet unter Standardbedingungen lagen die EC50-Werte bei 3,79 bzw. 499 mg a.s./kg dw.
Neben den Laborexperimenten wurden Tests in „Terrestrischen Modellökosystemen“ (TME) mit den gleichen Chemikalien in Kombination mit variierender Bodenfeuchte als klimatischer Faktor vorgenommen. Diese Experimente wurden in Deutschland und in Portugal durchgeführt, um die Reaktion einer zentraleuropäischen und einer mediterranen Artengemeinschaft zu untersuchen. Aus der terrestrischen Lebensgemeinschaft wurden verschiedene Organismengruppen untersucht. Die Effekte auf Enchytraeen aus dem Experiment mit Pyrimethanil waren als Veröffentlichung Teil dieser Dissertation. In der portugiesischen Halbfreilandstudie wurden keine Effekte auf die Enchytraeen durch Pyrimethanil bei umweltrelevanten Konzentrationen festgestellt, jedoch beeinflusste die Bodenfeuchte die Zusammensetzung der Artengemeinschaft. Im deutschen TME-Experiment wurde eine verstärkte Wirkung des Fungizids in trockenem Boden festgestellt, d.h. die jeweiligen Effektkonzentrationen (niedrigste EC50 3,48 mg a.s./kg dw für Fridericia connata in trockenem Boden) lagen deutlich unterhalb der aus den Labortests mit Enchytraeus bigeminus bekannten Werten (499 mg a.s./kg dw).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass klimatische Faktoren die Effekte von Pflanzenschutzmittel auf Bodenorganismen beeinflussen können. Für Laborversuche ist eine generelle Berücksichtigung von klimatischen Faktoren im Zulassungsverfahren aus heutiger Sicht zu weit gegriffen. Die TME-Versuche zeigten sich als geeignetes Testverfahren, interaktive Effekte von Pestiziden und Klima bzw. multiplen Stressoren generell auf Artengemeinschaften zu untersuchen. Für TME-Experimente wäre unter Beachtung der Vielzahl möglicher Fragestellungen, Endpunkte und moderner statistischer Auswerteverfahren eine internationale Richtlinie wünschenswert.
Compared to all other organisms with 1 to 3 heat stress transcription factors (Hsfs) or Hsf-related factors, plants have extraordinarily large Hsf families with more than 20 Hsfs. Plant Hsfs are classified into three classes according to their oligomerization domains which is built of hydrophobic heptad repeats (HR) in two parts, HR-A and HR-B. Both parts may be immediately adjacent (class B), or they are separated by insertion of 21 (class A) and 7 amino acid residues (class C). In plant Hsf family, detailed investigations are so far limited to Hsfs A1a, A2, A3, A4d, A9, and B1. They strongly indicate functional diversification to be the main reason for the coexistence of multiple Hsfs. As an example the functional triad of HsfA1a, HsfA2, and HsfB1 is essential for all three phases of the hs response, (i) the triggering of the response by HsfA1a as master regulator, (ii) the maintenance and high efficiency of hs gene transcription by cooperation of HsfA1a with Hsfs A2 and B1, and finally, (iii) the restoration of house-keeping gene transcription during the recovery phase mediated by HsfB1 in cooperation with house-keeping transcription factors. The results presented in this thesis for Hsfs A4 and A5 open completely different aspects of functional diversification and cooperation of Hsfs. HsfA4 and HsfA5 homooligomerize and bind to corresponding HSE motifs. But in contrast to the highly active HsfA4, HsfA5 is completely inactive as transcriptional activator. Yeast two hybrid and GST pull-down techniques showed that both Hsfs have strong tendency for heterooligomerization. Using fluorescence microscopy the HsfA4/A5 heterooligomers were found to localize in the nucleus. These complexes are transcriptionally inactive due to the impairment of DNA binding. The repressor function of HsfA5 requires only its OD and no additional factors, e.g. a putative co-repressor recruited by the C-terminal domain, are involved. Evidently, the repressor effect mainly results from the interference with the oligomeric state of HsfA4b, which is essential for efficient DNA binding and activator functions. EST database search revealed that plants have a single HsfA5 and usually two A4-type Hsfs. Using bioinformatics tools, Hsfs A4 and A5 were found to be phylogenetically closely related and clearly distinct from the other members of the Hsf family. On the basis of RT-PCR and Microarray data the representatives of the A4/A5 group are well expressed in different plant tissues albeit at very different levels which change with the developmental stages and stress conditions In rice and Arabidopsis, HsfA4 functions as an anti-apoptotic factor for stress induced oxidative damages. Based on my results, I hypothesize that HsfA5 functions as a novel type of selective repressor, regulating the function of A4-type Hsfs in plants. Considering the high sequence conservation with in plant Hsf family, it is tempting to speculate that this role of Hsf4/A5 pair is a fundamental feature of the Hsf system in plants.
Trait-dependent effects of biotic and abiotic filters on plant regeneration in Southern Ecuador
(2024)
Tropical forests have always fascinated scientists due to their unique biodiversity. However, our understanding of ecological processes shaping the complexity of tropical rainforests is still relatively poor. Plant regeneration is one of the processes that remain understudied in the tropics although this is a key process defining the structure, diversity and assembly of tropical plant communities. In my dissertation, I combine experimental, observational and trait-based approaches to identify processes shaping the assembly of seedling communities and compare associations between environmental conditions and plant traits across plant life stages. By working along a steep environmental gradient in the tropical mountains of Southern Ecuador, I was able to investigate how processes of plant regeneration vary in response to biotic and abiotic factors in tropical montane forests.
My dissertation comprises three complementary chapters, each addressing an individual research question. First, I studied how trait composition in plant communities varies in relation to the broad- and local-scale environmental conditions and across the plant life cycle. I measured key traits reflecting different ecological strategies of plants that correspond to three stages of the plant life cycle (i.e., adult trees, seed rain and recruiting seedlings). I worked on 81 subplots along an elevational gradient covering a large climatic gradient at three different elevations (1000, 2000 and 3000 m a.s.l.). In addition, I measured soil and light conditions at the local spatial scale within each subplot. My findings show that the trait composition of leaves, seeds and seedlings changed similarly across the elevational gradient, but that the different life stages responded differently to the local gradients in soil nutrients and light availability. Consequently, my findings highlight that trait-environment associations in plant communities differ between large and small spatial scales and across plant life stages.
Second, I investigated how seed size affects seedling recruitment in natural forests and in pastures in relation to abiotic and biotic factors. I set up a seed sowing experiment in both habitat types and sowed over 8,000 seeds belonging to seven tree species differing in seed size. I found that large-seeded species had higher proportions of recruitment in the forests compared to small-seeded species. However, small-seeded species tended to recruit better in pastures compared to large-seeded species. I showed that high surface temperature was the main driver of differences in seedling recruitment between habitats, because it limited seedling recruitment of large-seeded species. The results from this experiment show that pasture restoration requires seed addition of large-seeded species and active protection of recruiting seedlings in order to mitigate harmful conditions associated with high temperatures in deforested areas.
Third, I examined the associations between seedling beta-diversity and different abiotic and biotic factors between and within elevations. I applied beta-diversity partitioning to obtain two components of beta-diversity: species turnover and species richness differences. I associated these components of beta-diversity with biotic pressures by herbivores and fungal pathogens and environmental heterogeneity in light and soil conditions. I found that species turnover in seedling communities was positively associated with the dissimilarity in biotic pressures within elevations and with environmental heterogeneity between elevations. Further, I found that species richness differences increased primarily with increasing environmental heterogeneity within elevations. My findings show that the associations between beta-diversity of seedling communities and abiotic and biotic factors are scale-dependent, most likely due to differences in species sorting in response to biotic pressures and species coexistence in response to environmental heterogeneity.
My dissertation reveals that studying processes of community assembly at different plant life stages and spatial scales can yield new insights into patterns and processes of plant regeneration in tropical forests. I investigated how community assembly processes are governed by abiotic and biotic filtering across and within elevations. I also experimentally explored how the process of seedling recruitment depends on seed size-dependent interactions, and verified how these effects are associated with abiotic and biotic filtering. Identifying such processes is crucial to inform predictive models of environmental change on plant regeneration and successful forest restoration. Further exploration of plant functional traits and their associations with local-scale environmental conditions could effectively support local conservation efforts needed to enhance forest cover in the future and halt the accelerating loss of biodiversity.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare neurological disorders that may be of genetic or infectious origin, but most frequently occur sporadically in humans. Their outcome is invariably fatal. The infectious agent has been defined as prion (from proteinaceous infectious only) in 1992 by Stanley B. Prusiner and represent mainly, if not solely, an abnormal, protease-resistant isoform (PrPSc) of a cellular protein, the prion protein or PrPC. According to the “protein only” hypothesis, the prion is devoid of informational nucleic acids and consists of an “infectious” protein that is capable of converting the normal host protein PrPC into a likeness of itself. TSEs can be distinguished from other neurodegenerative diseases because of their infectivity and transmission capability. The only organ system in which severe histopathological damage can be demonstrated as a consequence of infection with prions is the nervous system. The communal lesions are neuronal loss, spongiosis and astrogliosis, accompanied by an intra- and extracellular accumulation of PrPSc, occasionally in form of amyloid plaques. Even if a strong activation of microglia and astrocytes occurs, no immunological response is usually detectable as consequence of prion infection. Despite the considerable attention for its involvement in TSEs, the physiological role of the cellular, nonpathogenic isoform of PrPC, has not yet been determined. In the last years, several putative cellular functions have been attributed to PrPC: its localization in “lipid rafts” is consistent with a possible role in cell adhesion, transmembrane signalling or as a recognition molecule. Furthermore, PrPC has been implicated in protection against oxidative stress, copper metabolism, apoptosis, cell proliferation and in the regeneration of blood precursors stem cells in the adult. It has also been shown that PrPC interacts with the neuronal cell adhesion molecule NCAM, promoting neurite outgrowth. However, both the PrPC-mediated effects and the role of PrPC-dependent pathways on neuronal differentiation are still not elucidated. First objective of this Ph.D thesis was the establishment of a novel in vitro cellular model for the study of the role of PrPC in neuronal differentiation and neurite outgrowth. Furthermore, an additional goal of this project was the indentification of the PrPC domains responsible for the induction of neuronal differentiation. A novel PrPC-depleted cell line (PrP0/0 ML) was derived from murine primary PrP-knockout neuronal cells by SV40 large T antigen-mediated immortalization. A temperature sensitive form of this oncogenic protein was used, allowing a temperature-mediated regulation of its expression. This cell line was then characterised for its growth potential, for the expression of specific cellular markers and for its ability to differentiate. It was found that, under culture conditions promoting the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen, the cells expressed nestin, a specific marker of neuronal precursor cells. Therefore, the PrP0/0 ML cell line was identified as a potential neuronal stem cell line. In fact, under nonpermissive culture conditions when the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen is downregulated, the PrP0/0 ML cells differentiated into neurons. Noteworthy, maintenance of the cells in conditions that promote cell differentiation induced a progressive reduction in the expression levels of nestin, an event that strongly correlated with the appearance of the specific neuronal markers MAP-2b and NeuN. In order to investigate the role of PrPC in the process of neuronal differentiation, the PrP0/0 ML cells were then reconstituted for the expression of either the full-length PrP or a N-terminal truncated PrPC form (PrPdel32-134). The differentiation potential of both reconstituted cell lines under nonpermissive culture conditions was then compared with that of the parenteral PrP0/0 ML cells. This in vitro study clearly highlights that PrPC expression in the PrP0/0 ML cell line accelerates neuronal differentiation and that the N-terminal domain of the prion protein is not necessary for this PrP-mediated function. Prion diseases like BSE, vCJK, Kuru and the majority of iatrogenic cases of CJK are caused by a peripheral infection. Infectious prions accumulate in the central and peripheral nervous system as well as in extracerebral tissues, such as the secondary lymphoid organs and muscles. The prion pathogenesis is a dynamic process which can be defined temporary and spatially in different phases: i) infection and peripheral replication, ii) neuroinvasion, transport of prions from the periphery to the central nervous system (CNS), and iii) neurodegeneration. In the last years, progresses in the elucidation of the peripheral prion pathogenesis were achieved. The identification of the cell types involved in the lymphoreticular prion replication phase and the recognition of the role of the peripheral nervous system in the process of prion spread from the periphery to the CNS have elucidated some of the cellular mechanisms that are involved in prion uptake, replication and propagation. However, relatively little information is available about the mechanism(s) underlying intercellular prion transfer and tissue-to tissue prion spread. Microvesicles (MVs) are submicron vesicles (0,03-1 microm.) with a single membrane and are shed from most eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. The segregation of specific proteins is followed by blebbing of the membrane surface, leading to the formation of MVs and their release in the extracellular environment. MVs can be also secreted upon fusion of multivesicular endosomes with the plasma membrane (exosomes). The secretion of MVs is the result of a complex cellular process involving changes in the metabolism of lipids and proteins. The functional role of MVs is still largely unknown. However, there is evidence showing that they are important modulators of cell-to-cell communication, participate in a variety of intracellular adhesion processes and are able to induce cellular response(s). The release of PrPC and infectious PrPSc by prion infected epithelial, neuroglial and neuronal cells in association with exosomes has recently been highlighted. Furthermore, it has been shown that exosomes can propagate prion infectivity both in vitro and in vivo, suggesting that PrPSc-bearing exosomes may provide a mechanism for intercellular transmission of infectious prions in addition to cell-to-cell contact. Second objective of this Ph.D thesis was to determine the possible role of plasma membrane-derived microvesicles in the propagation and transmission of prions. The release of MVs was first studied in different murine neuronal cell lines. Here it is shown for the first time that neurons also shed plasma membrane derived MVs, in addition to exosomes. Immunoelectron microscopy and immunoblot analyses clearly demonstrated the presence of PrPC on the membrane of MVs released from PrPC-expressing cells. Characterization of lipid rafts components in MVs highlighted the presence of the ganglioside GM2, the tyrosine kinase p59Fyn, flotillin-2 and the neuronal protein GAP-43. In order to investigate whether MVs are involved in the intercellular transmission of prions, MVs were first isolated from two prion infected murine neuronal cell lines, namely the Neuro-2a PK1 and the N2a58 cells, and then used for in vitro and in vivo infection assays. Immunoblot analyses after proteinase K treatment demonstrated the association of PrPSc with the secreted MVs. The PrPSc-bearing MVs were then used to perform infection experiments on noninfected cells. By the use of cell blot assay, a method that allows the detection of PrPSc-amplification and -accumulation in cultured cells, the kinetic of prion infection in the de novo infected cells was followed. Noteworthy, it was found that PrPSc-bearing MVs were capable to transmit prions in vitro and to stably infect the recipient cells. In order to investigate the role of MVs in the transmission of infectivity in vivo, PrPSc-bearing MVs as well as MVs isolated from noninfected cells (as negative control) were injected intracerebrally in PrPC-overexpressing indicator mice (tga20). The development of clinical disease was followed in a time-dependent manner. Clinical symptoms could be observed only in the group of indicator mice inoculated with the PrPSc-bearing MVs, which then succumbed to desease. These findings clearly demonstrated that MVs are biological carriers of both PrPSc and prion infectivity. MVs could therefore participate in vivo in the processes of intercellular prion transmission and propagation.
Apoptotic cell (AC)-derived factors alter the physiology of macrophages (M Phi s) towards a regulatory phenotype that is characterized by enhanced production of anti-inflammatory mediators, an attenuated pro-inflammatory cytokine profile and reduced nitric oxide (NO) formation. Impaired NO production in response to ACs or AC-conditioned medium (CM) is facilitated by arginase II (ARG II) expression, which competes with inducible NO synthase for L-arginine. In this study, I investigated the signaling pathway that allowed CM to upregulate ARG II in M Phi s. A sphingolipid, further identified as sphingosine-1-phosphate (S1P), was required but authentic S1P alone only produced small effects. S1P acted synergistically with a so far unidentified factor to elicit high ARG II expression. S1P signaled through S1P receptor 2 (S1P2), since the S1P2-antagonist JTE013 and siRNA knock-down of S1P2 prevented ARG II upregulation. Further, inhibition and knock-down of extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) attenuated CM-mediated ARG II protein induction. Exploring ERK5-dependent transcriptional regulation, promoter deletion and luciferase reporter analysis of the murine ARG II promoter (mpARG II) suggested the involvement of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) responsive element binding protein (CREB). This was confirmed by EMSA analysis and decoyoligonucleotides scavenging CREB, thereby preventing it from activating target genes and thus, blocking ARG II expression. I concluded that AC-derived S1P binds to S1P2 and acts synergistically with other factors to activate ERK5 and concomitantly CREB. This signaling cascade shapes an anti-inflammatory M Phi phenotype by ARG II induction. Further investigations of ERK5-dependent CREB activation suggested an indirect mechanism implying that ERK5 inhibited phosphodiesterase 4 (PDE4) and thus, prevented hydrolysis of cAMP. Since S1P-dependent ERK5 activation presumably inhibited PDE4, subsequent cAMP accumulation led to enhanced PKA activity and CREB-mediated transcription. The unidentified factor(s) besides S1P probably provoked the required elevation of cAMP production in M Phi s. Indeed, pharmacological inhibition of cAMP-producing adenylyl cyclase with SQ22536 as well as cAMP-dependent protein kinase A (PKA) with KT5720 suggested cAMP to be involved in CM-mediated ARG II up-regulation. Furthermore, forskolin-dependent activation of adenyly cyclase and simultaneous rolipram-mediated inhibition of PDE4 mimicked CM-induced ARG II expression. Considering these findings, I propose that one or several unidentified factors in CM provoke cAMP production in M Phi s. In parallel, AC-derived S1P activates ERK5, which inhibits PDE4-dependent cAMP hydrolysis, further raising intracellular cAMP levels. Thus, unrestricted continuous cAMP signaling via PKA/CREB, results in a time-dependent and sustained ARG II induction.
Mitochondrial membrane dynamics is increasingly implicated in various human diseases. Numerous studies show that the protein OPA1 plays a central role in determining mitochondrial ultrastructure and apoptotic remodeling of the inner mitochondrial membrane during Cytochrome c release and apoptosis. Crista junctions are crucial for the regulation of apoptotic Cytochrome c release. Previous publications suggest that OPA1 is required to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. The protein MIC60 (Mitofilin) appears to be an essential physical constituent of crista junctions and is also crucial for the general determination of mitochondrial ultrastructure. Furthermore, recent studies suggest that MIC60 is also implicated in Cytochrome c release during apoptosis.
In this regard, the question whether OPA1 is essential for crista junction formation was investigated. In addition to that, the interplay between OPA1 and MIC60 and its physiological role were analyzed. Electron microscopy of OPA1+/- and OPA1+/+ mice, as well as of OPA1-/- and OPA1+/+ MEFs clearly showed that OPA1 plays a role but is not essential for crista junction formation. In contrast to that, the results indicate that OPA1 is crucial to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. Immunogold experiments fit well to these observations as OPA1 was found equally distributed throughout the cristae membrane with only a minor part located at crista junctions. MIC60 localization studies showed a clear enrichment at crista junctions. Interaction studies revealed that endogenous OPA1 and MIC60 physically interact with each other. Analysis of protein levels upon OPA1 or MIC60 depletion indicate that both proteins play a dual role in cristae- and crista junction formation in which MIC60 is a physical constituent of crista junctions essential for their formation while OPA1 primarily has a regulatory impact on MIC60 function. Finally, apoptosis assays and cell viability measurements showed that knockout of OPA1 in MEFs leads to increased cellular resistance suggesting that the interplay of these proteins is important for the regulation of crista junction remodeling during apoptosis.
Besides its role in determining mitochondrial ultrastructure, OPA1 mediates inner membrane fusion of mitochondria thereby contributing to mitochondrial quality control. Additionally, proteolytic processing is crucial for the ability of OPA1 to distinguish between functional and dysfunctional mitochondria. Functional mitochondria are fused while dysfunctional mitochondria are not, a process termed selective mitochondrial fusion. Dysfunctional mitochondria were shown to be degraded by mitophagy in a fission-dependent manner. Numerous studies suggest that OPA1 and mitophagy are directly linked. However, this idea is still under debate. Mitophagy is also crucial for mitochondrial quality control, which directly impacts mitochondrial integrity. Furthermore, mitochondrial quality control has been linked to neurodegeneration as demonstrated by the observation that mutations in OPA1 cause the disorder ADOA-1.
In order to analyze a potential link between OPA1 and mitophagy, mitochondrial colocalization with LC3 was analyzed microscopically in primary adult skin fibroblasts isolated from OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner. Fibroblasts from young OPA1+/- mice showed increased colocalization of mitochondria with autophagosomes compared to fibroblasts from young wild type mice suggesting that OPA1 exerts an inhibitory role in mitophagy. This effect was even more pronounced in old mice, which also displayed higher mitophagy levels in general than young mice, consistent with the finding that old mice had higher Parkin levels than young mice. Mitochondrial fragmentation was elevated in fibroblasts from young and old OPA1+/- mice compared to control fibroblasts. However, extensive mitochondrial fusion, which occurred in fibroblasts from old wild type mice, was prevented in old OPA1+/- mice. Furthermore, old wild type mice had decreased numbers of crista junctions compared to young wild type mice, an effect that was not observed in OPA1+/- mice. Despite the observed age-dependent phenotypes in mitochondrial quality control and mitochondrial integrity, deletion of one allele of OPA1 had no influence on the life span in vivo. Analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice, which was performed in collaboration with Ansgar Poetsch and Carina Ramallo-Guevara from Bochum, showed that OPA1-dependent aging is accompanied by a reduction of proteins involved in autophagy. In contrast to that, a switch from glucose to fatty acid metabolism and alterations in apoptotic proteins were observed in both OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner indicating that the changes in proteins implicated in autophagy could be a compensatory response to the diminished inhibitory effect of OPA1 on mitophagy. On the other hand, increased mitochondrial degradation by mitophagy could be a cellular response to itself compensating for the loss of OPA1 mediated fusion thereby contributing to the observation that OPA1+/- and OPA1+/+ mice had no differences in life span. Furthermore, analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice revealed that OPA1, besides its role in mitochondrial fusion, could interact with the fission machinery: MFF and Neuronal pentraxin 1, two proteins involved in mitochondrial fission, were up-regulated in 12-month-old OPA1+/- mice suggesting that a reduced fission activity could contribute to mitochondrial hyperfusion in aged wild- type mice. Nonetheless, the exact nature of the possible interplays between OPA1 and these candidates remains to be investigated.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
Synaptopodin is the founding member of a family of actin-associated proline-rich proteins. It is present in a subset of telencephalic dendritic spines, where it is tightly associated with the dendritic spine apparatus, a putative calcium store. Synaptopodin-deficient mice lack the spine apparatus and show deficits in long-term potentiation and spatial memory. Thus, synaptopodin appears to play a role in synaptic plasticity. In the present thesis, three major questions were addressed: (1) What is the distribution of synaptopodin and the spine apparatus in identified hippocampal neurons? (2) Is the distribution of synaptopodin affected by denervation? (3) Is synaptopodin involved in the regulation of denervation-induced spine loss? The major findings of this thesis are: (1) Immunohistochemistry in the hippocampus of wildtype and EGFP-transgenic mice revealed significant layer-specific differences in the prevalence of synaptopodin at the level of individual neurons. (2) Light and electron microscopic analysis also revealed the presence of synaptopodin in axon initial segments of cortical and hippocampal principal neurons. There, it was found to be an essential component of the cisternal organelle, a putative axonal homologue of the dendritic spine apparatus. (3) Immunohistochemistry in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation revealed changes in synaptopodin expression in denervated and non-denervated layers of the hippocampus, suggesting that the distribution of synaptopodin in hippocampal neurons is regulated by presynaptic signals. (4) The dynamics of denervation-induced spine plasticity were studied in vitro using confocal live imaging of organotypic entorhino-hippocampal slice cultures. Whereas spines were remarkably stable under control conditions, spine loss and spine formation were seen following denervation. No significant differences were observed between cultures from wildtype and synaptopodin-deficient mice, suggesting that synaptopodin is not involved in lesion-induced spine plasticity. (5) Finally, a set of transgenic mice expressing fluorescently tagged synaptopodin were generated to facilitate future experiments on the dynamics and function of synaptopodin. In summary, this thesis presents novel findings on (1) the subcellular distribution of synaptopodin in spines and the axon initial segment, (2) the molecular composition of the cisternal organelle, and (3) the dynamics of spines and the spine apparatus organelle following deafferentation in vivo and in vitro.
Panama, a small country between the major continents of North and South America, is one of the lesser studied regions in Central America, but is recognized for its mega-biodiversity. This is particularly true for Eastern Panama, which I am considering as the easternmost portion of the country, covering the area from the Chepo, which is also the beginning of the San Blas mountain range, towards east, up to the Darien Mountain range on the border with its neighboring country Colombia. In the lowland region I visited two physiographic areas: the Isthmian-Atlantic Moist Forests (IAMF) and the Chocó-Darién Moist Forests (CDMF). In the IAMF I worked at the localities of Río Mono, Wacuco, La Moneda, Arretí, Metetí, Filo del Tallo, and Laguna de Matusagaratí. In the CDMF I visited the localities of Cruce de Mono, Cana, Garachiné, Sambú, and Pavarandó. And I have worked in the highlands of Darién (DM), Majé (MM), Jingurudó-Sapo (JSM), Pirre (PM) and San Blas (SSM) in the highlands.
Before my research, 138 reptile and 104 amphibian species had been reported for EP. From 2008 to 2013, I collected specimens to evaluate the diversity of amphibians and reptiles for this region. I applied an integrative approach to evaluate the taxonomy, diversity, biogeography, and conservation of the herpetofauna of EP. I included analyses of morphometrics, molecular genetics (e.g. barcoding), biogeography, bioacoustics (in anurans), hemipenial morphology (in squamates), and ecology. This is the first regional evaluation of the biodiversity in EP applying integrative taxonomy. Aside from morphological and bioacoustic data, my work is based on the barcoding of 608 specimens, from which I obtained 16S mtDNA for 486 specimens and COI mtDNA for 455. In total I have got sequences for 69.2 %of the amphibian and 48.6 % of the reptile species present in EP. For the morphological analyses, I compared 1597 specimens, including my samples complemented by specimens obtained from various museums. The bioacoustic data were obtained from the analysis of 1504 calls of 27 species of frogs. Based on specimens collected in EP and according to external morphology, I could identify 65 species of amphibians and 72 reptiles, but after applying an integrative approach these numbers increased to 79 amphibians and 88 reptiles described species within my collected specimens. Additionally, I uncovered 33 taxonomic units that could not be assigned to any described species until now, 22 of them represent confirmed candidate species (CCS), and 11 were classified as Unconfirmed candidate species (UCS). Thus, increasing the known species of amphibian by 19.4 % and of reptiles by 4.8 %. Currently, there are 145 reptiles and 129 amphibians known to occur in EP. Based on my results, I have initiated several projects to solve taxonomic uncertanties, including the species of the genera Bolitoglossa, Diasporus, Dactyloa, Ecnomiohyla, Lepidoblepharis, and the taxonomic status of the species Pristimantis caryophyllaceus and Norops tropidogaster.
Out of the 22 CCS I found, I described nine species new to science with type locality in EP, six amphibians and four reptiles. Among these is a new species of Bolitoglossa described from Cerro Chucantí, Cordillera de Majé, Provincia de Darién, Panama. Additionally, I include comments on the other species of congeneric salamanders known to occur in the region. Among the tink frogs, only Diasporus quidditus was known to occur in EP. During my field work I collected six additional species of this genus, four of which are new to science, plus two species new for this region.
I also described one new species of Dactyloa (giant anole lizards) related to the former D. chocorum. I synonymized D. chocorum with D. purpurescens, and included information about the other species of the group from EP. The new species of Dactyloa resembles D. ibanezi, D. limon, and D. purpurescens in external morphology but differs from these species in dewlap coloration, dorsal color pattern, morphometrics, and scalation. I discovered one species of the genus Ecnomiohyla, which exhibits significant genetic distances (16S mtDNA gene) and morphological differences to all known Ecnomiohyla species. Along with the description of the new Ecnomiohyla species, I provide detailed comparisons of morphological and molecular characters of almost all members of the genus in Lower Central America, as well as an identification key for the entire genus. Two new species of the genus Lepidoblepharis from EP were described. In the corresponding work, I include an analysis of Lepidoblepharis spp. in the region, including phylogeography and taxonomy. One of the new species, Lepidoblepharis emberawoundule, can be differentiated from most species in the genus by its small size and its low number of lamellae under the fourth toe and finger. The other species described from EP, Lepidoblepharis rufigularis, can be differentiated from all species in the genus by its small size and the reddish throat in males.
For thousands of years, S. cerevisiae has been employed by humans in brewing and baking. Nowadays, this budding yeast is more than that: it is a well investigated model organism and an established workhorse in biotechnology. S. cerevisiae serves as a production host for various applications such as i) bioethanol production ii) the biosynthesis of hormones including insulin or iii) cannabinoid biosynthesis. Hereby, the robustness of S. cerevisiae and its high tolerances regarding pH and salt concentrations qualifies it for a wide range of industrial applications. Moreover, products of S. cerevisiae are generally recognised as safe (GRAS), enabling diverse biotechnological applications. Various mechanisms for genetic engineering of S. cerevisiae are applicable and the engineering process itself is straightforward since methods are established and widely known. Due to the wide range of industrial applications of S. cerevisiae, this organism is an ideal candidate for applied research and implementation of the recombinant biosynthesis of tocochromanols in this study.
Tocochromanols encompass tocotrienols and tocopherols, which are lipid-soluble compounds that are commonly associated with vitamin E activity. Hereby, α-tocopherol is the most prevalent form, as it is an essential nutrient in the diet of humans and animals. Naturally, tocochromanols are almost exclusively synthesised by photoautotrophic organisms such as plants or cyanobacteria. They consist of an aromatic head group and a polyprenyl side chain which is saturated in tocopherols and 3-fold unsaturated in tocotrienols. The methylation status of the chromanol ring distinguishes α-, β-, γ- and δ-tocochromanol. All forms of tocochromanols represent a group of powerful antioxidants, scavenging reactive oxygen species (ROS) and preventing the propagation of lipid oxidation in lipophilic environments. Recently, attention has been drawn to tocotrienols, due to their benefits in neuroprotection as well as cholesterol-lowering and anti-cancer properties. Consequently, tocochromanols are valuable additives in the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries.
The metabolic engineering strategy of S. cerevisiae to enable tocochromanol biosynthesis was started in a preceding master thesis with the provision of the aromatic moiety, homogentisic acid (HGA), from the aromatic amino acid biosynthesis. Hereby, the upregulation and redirection of the native pathway was essential. Therefore, a strain with an engineered aromatic amino acid pathway for improved 4 hydroxyphenylpyruvate (HPP) production (MRY33) was utilised from Reifenrath and Boles (2018). Furthermore, a heterologous hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) was required to convert HPP into HGA. Thus, several heterologous HPPDs were expressed and characterised regarding their HGA production within the previous study. The best variant originated from Yarrowia lipolytica, YlHPPD, and was integrated into the genome of MRY33. The resulting strain JBY2, produced 435 mg/L HGA in a shake flask fermentation.
This work was started with the genetically highly modified strain JBY2, whose genome already contained a large number of genes artificially expressed behind strong promoters. For further strain development, it was advantageous to maintain a high degree of sequence variability in order to prevent genomic instabilities due to sequence homologies. Thus, 17 artificial promoters (AP1-AP17) were characterised regarding their strength of expression by the yellow fluorescent protein (YFP). These sequences were also part of a patent that was filed during this work (WO2023094429A1).
The key point of this study was the development of a metabolic engineering strategy for the strain JBY2. First, the sufficient supply of the second precursor, the polyprenyl side chain, was investigated. Natively, S. cerevisiae produces the precursor, geranylgeranyl diphosphate (GGPP), from the isopentenyl diphosphate pathway. However, without further engineering, GGPP was barely detectable in JBY2 (< 0.1 mg/L). Thus, engineering of the isopentenyl diphosphate biosynthesis was necessary. The limiting enzyme of the mevalonate pathway was the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR), which is encoded by HMG1. Therefore, a truncation for feedback-resistance and its overexpression by a promoter exchange was performed. Furthermore, the promoter of the gene for the squalene synthase (pERG9) was exchanged by the ergosterol sensitive promoter pERG1 to limit the metabolic flux of the mevalonate pathway into the ergosterol pathway. The native GGPP synthase (BTS1) was another limitation that was observed throughout this study. To overcome this bottleneck, plasmid-based and integrative overexpression of the native BTS1 and a codon optimised BTS1 were investigated. Other strategies to improve GGPP production were the deletion of the gene for the diacylglycerol pyrophosphate phosphatase (DPP1) to prevent excessive dephosphorylation of GGPP to geranylgeraniol (GGOH), and the overexpression of the farnesyl pyrophosphate synthetase, encoded by ERG20. However, the best improvements of the GGPP biosynthesis, inferred through GGOH measurements, were achieved from the screening of several heterologous GGPP synthases in S. cerevisiae. The best performing strain was JBY61 (JBY2, hmg1Δ::pTDH3-HMG1tr[1573–3165], pERG9Δ::pERG1, ChrIV-49293-49345Δ::pTDH3-XdcrtE-tSSA1_LEU2), bearing the heterologous GGPP synthase crtE of Xanthophyllomyces dendrorhous and produced 64.23 mg/L GGOH. Consequently, this engineering strategy improved the GGOH production by a factor of 642 compared to the parent strain JBY2.
The simultaneous inhibition of HDACs and BET proteins has shown promising anti-proliferative effects against different cancer types, including the difficult to treat pancreatic cancer. In this work, the strategy of concurrently targeting HDACs and BET proteins was pursued by developing different types of dual inhibitors.
By developing a novel scaffold that selectively inhibits HDAC1/2 together with BET proteins in cells, an effective tool for the investigation of pancreatic cancer, and other diseases which are sensitive to epigenetic processes, was created. The compound’s small size further gives the opportunity to further develop the inhibitor towards optimized pharmacokinetic properties, potentially resulting in a drug for cancer treatment.
A second novel approach that was pursued, was the development of a small-molecule degrader, targeting HDACs and BET proteins. Through synthesizing a variety of different molecules, a compound that was capable of lowering BRD4 levels and, at the same time, increasing histone acetylation was developed. While additional mechanistic investigations are needed to verify the degradation, the potent antiproliferative effects in pancreatic cancer cells encourage further studies following this alternative new strategy.
H. salinarum ist einer von zwei archaealen Organismen, die synchronisiert werden können. Die Synchronisations-Methode konnte in dieser Arbeit optimiert werden. Nahezu 100 % aller Zellen teilen sich in einer Zeitspanne von einem Viertel der Generationszeit. Die Analyse zweier aufeinanderfolgender Zellzyklen zeigte, dass die Zellen sich auch im zweiten Zyklus synchron teilen. Die Zellsynchronisation wurde angewendet, um zellzyklusabhängige Vorgänge in H. salinarum auf unterschiedlichen Ebenen zu charakterisieren. Mittels DNA-Mikroarrays wurden Transkriptomänderungen untersucht. Nur 87 Gene zeigten zellzyklusspezifische Regulationen. Dies entspricht 3 % aller vorhergesagten offenen Leserahmen und ist somit im Vergleich zu allen anderen Organismen, deren Transkriptome untersucht wurden, deutlich geringer. Die Transkriptmengen von 15 ausgewählten Genen wurden mit Northern Blot Analysen verifiziert. Die regulierten Gene konnten in sieben Gruppen mit unterschiedlichen Transkriptprofilen eingeordnet werden. Gruppenspezifische DNA-Sequenzmotive wurden gefunden, von denen angenommen wird, dass sie in die zellzyklusspezifische Transkriptionsregulation involviert sind. Überraschenderweise wurden die meisten als Zellzyklusgene annotierten Gene konstitutiv transkribiert. Die Analyse zellzyklusabhängiger Proteomänderungen erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. 1200 Proteine konnten reproduzierbar detektiert werden. Die meisten Proteine wurden konstitutiv exprimiert. Nur 30 Proteine zeigten eine zellzyklusabhängige Regulation. Dies entspricht 2,5 % der reproduzierbar detektierten Proteine. Es konnten unterschiedliche Expressionsprofile gefunden werden. Aus den Transkriptom- und Proteomanalysen folgt, dass auf Ebene der Genexpression nur wenige zellzyklusabhängige Regulationen existieren. Sekundäre Botenstoffe spielen eine wesentliche Rolle bei Signaltransduktionen und sind an Regulationen von Zellzyklen beteiligt. Eine Methode zur Messung intrazellulärer cAMP-Konzentration in H. salinarum konnte etabliert werden. Die basale cAMP-Konzentration von 200 µM in haloarchaealen Zellen ist bedeutend höher als die von Hefe. Synchrone Kulturen wurden auf die Oszillation des sekundären Botenstoffes hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Konzentration zellzyklusabhängig zweimal kurzfristig signifikant erhöht wird. Die cAMP-Konzentration steigt einmal vor und einmal direkt nach der Zellteilung an. cAMP könnte daher ein wichtiges Signal für das Fortschreiten des Zellzyklusses sein. Es konnte eine Methode zur Analyse der Replikation in H. salinarum entwickelt werden. Hierfür wurde das Basenanalogon BrdU und ein spezifischer Antikörper gegen dieses verwendet. Die Analyse synchroner Kulturen zeigte das überraschende Ergebnis, dass die Zellen ihre DNA während des gesamten Zellzyklusses zu replizieren scheinen. Vor allem die DNA-Synthese in synchronen Kulturen während der Teilungsphase der Zellen stellt einen völlig neuartigen Zellzyklusablauf dar. Für in vivo Analyse von Zellzyklusproteinen können diese mit GFP markiert und fluoreszenzmikroskopisch analysiert werden. Mit dieser Methode konnten wichtige zellzyklusabhängige Aspekte in anderen Arten aufgeklärt werden. Für einen GFP-Modellversuch wurde in dieser Arbeit ein Fusionsgen bestehend aus den offenen Leserahmen von bop (bacterio-opsin) und gfp (green fluorescent protein) erstellt. Die Expression des chromosomalen bop Gens und des plasmidkodierten bop-gfp Fusionsgens wurde mit Northern Blot Analysen nachgewiesen. Die Purpurmembranbiogenese wurde fluoreszenzmikroskopisch in lebenden H. salinarum Zellen untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung der Purpurmembran ca. 15 Stunden nach Eintritt der Zellen in die stationäre Wachstumsphase beginnt. Innerhalb der folgenden sieben Stunden stieg sowohl die Anzahl an Zellen mit fluoreszierenden Signalen als auch die durchschnittliche Anzahl an Signalen pro Zelle gleichmäßig an. Die Ergebnisse zeigen, dass GFP-Fusionsproteine in H. salinarum z. B. zur Charakterisierung von differentieller Genexpression verwendet werden können. Des Weiteren könnten sie für die Untersuchung zellzyklusabhängiger Proteinlokalisation und für die Analyse der intrazellulären Verteilung putativer Cytoskelettproteine eingesetzt werden.
Octanoic acid (C8 FA) is a medium-chain fatty acid which, in nature, mainly occurs in palm kernel oil and coconuts. It is used in various products including cleaning agents, cosmetics, pesticides and herbicides as well as in foods for preservation or flavoring. Furthermore, it is investigated for medical treatments, for instance, of high cholesterol levels. The cultivation of palm oil plants has surged in the last years to satisfy an increasing market demand. However, concerns about extensive monocultures, which often come along with deforestation of rainforest, have driven the search for more environmentally friendly production methods. A biotechnological production with microbial organisms presents an attractive, more sustainable alternative.
Traditionally, the yeast Saccharomyces cerevisiae has been utilized by mankind in bread, wine, and beer making. Based on comprehensive knowledge about its metabolism and genetics, it can nowadays be metabolically engineered to produce a plethora of compounds of industrial interest. To produce octanoic acid, the cytosolic fatty acid synthase (FAS) of S. cerevisiae was utilized and engineered. Naturally, the yeast produces mostly long-chain fatty acids with chain lengths of C16 and C18, and only trace amounts of medium-chain fatty acids, i.e. C8-C14 fatty acids. To generate an S. cerevisiae strain that produces primarily octanoic acid, a mutated version of the FAS was generated (Gajewski et al., 2017) and the resulting S. cerevisiae FASR1834K strain was utilized in this work as a starting strain.
The goal of this thesis was to develop and implement strategies to improve the production level of this strain. The current mode of quantification of octanoic acid includes labor-intensive, low-throughput sample preparation and measurement – a main obstacle in generating and screening for improved strain variants. To this end, a main objective of this thesis was the development of a biosensor. The biosensor was based on the pPDR12 promotor, which is regulated by the transcription factor War1. Coupling pPDR12 to GFP as the reporter gene on a multicopy plasmid allowed in vivo detection via fluorescence intensity. The developed biosensor enabled rapid and facile quantification of the short- and medium-chain fatty acids C6, C7 and C8 fatty acids (Baumann et al., 2018). This is the first biosensor that can quantify externally supplied octanoic acid as well as octanoic acid present in the culture supernatant of producer strains with a high linear and dynamic range. Its reliability was validated by correlation of the biosensor signal to the octanoic acid concentrations extracted from culture supernatants as determined by gas chromatography. The biosensor’s ability to detect octanoic acid in a linear range of 0.01-0.75 mM (≈1-110 mg/L), which is within the production range of the starting strain, and a response of up to 10-fold increase in fluorescence after activation was demonstrated.
A high-throughput FACS (fluorescence-activated cell sorting) screening of an octanoic acid producer strain library was performed with the biosensor to detect improved strain variants (Baumann et al., 2020a). For this purpose, the biosensor was genomically integrated into an octanoic acid producer strain, resulting in drastically reduced single cell noise. The additional knockout of FAA2 successfully prevented medium-chain fatty acid degradation. A high-throughput screening protocol was designed to include iterative enrichment rounds which decreased false positives. The functionality of the biosensor on single cell level was validated by adding octanoic acid in the range of 0-80 mg/L and subsequent flow cytometric analysis. The biosensor-assisted FACS screening of a plasmid overexpression library of the yeast genome led to the detection of two genetic targets, FSH2 and KCS1, that in combined overexpression enhanced octanoic acid titers by 55 % compared to the parental strain. This was the first report of an effect of FSH2 and KCS1 on fatty acid titers. The presented method can also be utilized to screen other genetic libraries and is a means to facilitate future engineering efforts.
In growth tests, the previously reported toxicity of octanoic acid on S. cerevisiae was confirmed. Different strategies were harnessed to create more robust strains. An adaptive laboratory evolution (ALE) experiment was conducted and several rational targets including transporter- (PDR12, TPO1) and transcription factor-encoding genes (PDR1, PDR3, WAR1) as well as the mutated acetyl-CoA carboxylase encoding gene ACC1S1157A were overexpressed or knocked out in producer or non-producer strains, respectively. Despite contrary previous reports for other strain backgrounds, an enhanced robustness was not observable. Suspecting that the utilized laboratory strains have a natively low tolerance level, four industrial S. cerevisiae strains were evaluated in growth assays with octanoic acid and inherently more robust strains were detected, which are suitable future production hosts.
...
Hodgkin-Lymphom-Biopsien und abgeleitete Zelllinien sind charakterisiert durch die konstitutive Aktivität verschiedener Komponenten des JAK/STAT-Signalweges. Dennoch ist die Bedeutung dieser Signalvermittler für die Pathogenese des klassischen Hodgkin-Lymphoms nicht vollständig geklärt. Gegenstand dieser Arbeit war die Bedeutung der JAK/STAT-Signalkaskade, sowie insbesondere die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen. Zu diesem Zweck kamen zwei verschiedene synthetische Kinase-Inhibitoren (AG490, Cucurbitacin I) zum Einsatz. Beide Substanzen blockieren die Kaskade auf Ebene der Kinasen und sind als JAK2/STAT3-spezifische Inhibitoren beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit beiden Substanzen das Wachstum der malignen Zellen hemmte. Gelretardierungsexperimente ergaben jedoch, dass beide Inhibitoren in allen HL-Zelllinien immer mehr als nur ein STAT-Molekül hemmten. Somit konnte keine Aussage über die Bedeutung einzelner STATs getroffen werden. Um die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen wurden daher spezifische siRNAs mittels lentiviraler Vektoren exprimiert. Die Rolle von STAT3 bei der Entstehung verschiedenster Krebsarten ist bereits gut charakterisiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass STAT3 auch in HL-Zellen ein wichtiger Regulator von Proliferation und Apoptose ist. Darüber hinaus konnte auch STAT6 als Vermittler proliferations-fördernder, anti-apoptotischer Signale identifiziert werden. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine alleinige Hemmung von STAT6 ausreicht um Apoptose in einigen HL-Zellen auszulösen. Diese Induktion von Apoptose wurde durch Caspasen vermittelt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und um STAT6-Zielgene zu identifizieren, die anti-apoptotisch wirken, wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt. Eine weitere Möglichkeit die Aktivierung der JAK/STAT-Signalkaskade zu beeinflussen bieten die SOCS-Proteine. Diese sind direkte Zielgene der STATs und regulieren die Signalvermittlung in einer negativen Rückkopplung. In vielen unterschiedlichen Krebsarten ist diese Negativregulation ausgefallen oder fehlerhaft. Das kann zu einer konstitutiven Aktivierung des JAK/STAT-Signalweges beitragen. Die Bedeutung der SOCS-Proteine im klassischen Hodgkin-Lymphom ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Es wurden unterschiedliche Mengen endogenes SOCS1 und SOCS3 in verschiedenen HL-Zelllinien und in HL-Biopsien detektiert. In Überexpessionsexperimenten mit SOCS1 und SOCS3 konnte gezeigt werden, dass sowohl SOCS1, als auch SOCS3 nur in Zellen, die wenig endogene SOCS besitzen, die Aktivität von STAT3 und STAT6 inhibieren konnten. Die Überexpression resultierte in einem Wachstumsarrest und einem erhöhten Anteil toter Zellen. In Zellen, die bereits viel SOCS besaßen, konnten weder STAT3 noch STAT6 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wurde ein Modell, das potentielle Möglichkeiten zum Umgehen einer Negativregulation durch die SOCS-Proteine darstellt, diskutiert. Darüber hinaus konnte in Gelretardierungsexperimenten gezeigt werden, dass SOCS3 zusätzlich zu STAT3 und STAT6 in Zellen, die wenig SOCS besaßen, auch NF?B-Aktivierung hemmte. Da NF?B bereits als wichtiger Überlebensfaktor für HL-Zellen beschrieben wurde, trägt dessen Inhibition wahrscheinlich zu einer Hemmung des Wachstums bei. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit STAT3 und STAT6 als potentielle Ziele für therapeutische Ansätze für das klassische Hodgkin-Lymphom identifiziert werden. Einen weiteren Angriffspunkt für zukünftige Strategien liefern die SOCS-Proteine, die eine signalweg-übergreifende Hemmung von Transkritionsfaktoren erlauben.
Die vorliegende, publikationsbasierte Dissertation, bestehend aus den drei Einzelpublikationen Bayer (2011, 2012) und Bayer und Schönhofer (2012), verfolgte das Ziel, die Spinnenfamilie Psechridae zu revidieren. Weiterhin sollten die phylogenetische Position dieser Familie im System der höheren Webspinnen (Araneomorphae) sowie die phylogenetischen Beziehungen der einzelnen Arten innerhalb der beiden Gattungen der Psechridae untersucht werden. In Form von morphologisch-taxonomischen Bearbeitungen wurden die beiden die Psechridae bildenden Gattungen Psechrus und Fecenia revidiert, wobei sämtliches Typus-Material sowie reichhaltiges, weiteres Material eingehend beschrieben, illustriert und diagnostiziert wurde. Hierbei wurden auch intraspezifische Variabilität sowie die Prä-Epigynen subadulter Weibchen, die in taxonomischen Arbeiten bislang nur eine unwesentliche Rolle gespielt haben, beschrieben, illustriert und taxonomisch ausgewertet. Zudem wurden im Rahmen dieser Untersuchungen bereits Überlegungen über mögliche Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der beiden Gattungen angestellt. ...
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
European pea crabs - taxonomy, morphology, and host-ecology (Crustacea: Brachyura: Pinnotheridae)
(2010)
Pinnotherids are small crabs symbiotic to a variety of invertebrates. The European species infest bivalves and sea squirts. Their way of life is parasitic and poses a threat to commercially exploited bivalves. While juveniles of both sexes still look very similar - being agile swimmers and partially free living - a metamorphosis takes place in the female after mating and results in a conspicuous sexual dimorphism. Thereafter, the female settles in its host definitely and is morphologically strongly adapted to the parasitic life phase. A very high reproductive output was demonstrated among several pea crab species infesting bivalves. Despite from that, hardly any information is present in the literature on the pinnotherids’ reproductive biology and the underlying morphology.
Due to their cryptic way of life, the sexual dimorphism, and the different morphotypes of the female, the taxonomy of the Pinnotheridae is a serious challenge. Two widely accepted species are recognized on European coasts: Pinnotheres pisum and Nepinnotheres pinnotheres. Pinnotheres pectunculi was so far only known from the bivalve Glycymeris glycymeris in its type locality Roscoff (France), while Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni were described as living exclusively in ascidians without careful comparison with the previously described species. In order to produce standardized comparative descriptions, pea crabs were collected and studied from different hosts and localities in the Northeast Atlantic and in the Mediterranean. Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum were redescribed with consideration to characters of female and male. According to our morphological analysis, Pinnotheres ascidicola and Pinnotheres marioni are junior synonyms of Nepinnotheres pinnotheres, whereas the status of Pinnotheres pectunculi as a valid species was ascertained. Important characters are the mouthparts, the male gonopods, and especially chelipeds that showed consistent characteristics among different crab stages of both sexes.
Based on our sampling, we estimated the host-range of the European species. Nepinnotheres pinnotheres lives in ascidians and in the pen shell Pinna nobilis. Pinnotheres pisum infests numerous bivalve species - Pinna nobilis included. For Pinnotheres pectunculi novel host records are presented, all from the bivalve family Veneridae. Furthermore, feeding of the Pinnotheres-species was observed. They use a setae comb ventrally on the claw to brush mucus (and the accumulated food particles) from the bivalve gills. Feeding strategies and host-ecology will be thoroughly discussed in consideration to other Pinnotheridae.
We investigated the reproductive systems of European pinnotherids by histological methods, scanning and transmission electron microscopy, and confocal laser scanning microscopy.
The Eubrachyura have internal fertilization: paired vaginas enlarge into storage structures, the spermathecae, which are connected to the ovaries by oviducts. Sperm is stored until the oocytes are mature and transported into the spermathecae, where fertilization takes place. In the investigated pinnotherids, the vagina is of the ‘concave pattern’. Musculature is attached alongside flexible parts of the vagina-wall to control the dimension of its lumen. The genital opening is closed by a muscular mobile operculum.
The spermatheca can be divided into two distinct regions by function and morphology. The ventral part includes the connection with vagina and oviduct and is regarded as the zone where fertilization takes place. It is lined with cuticle except where the oviduct enters the spermatheca by the ‘holocrine transfer tissue’. At ovulation, the oocytes have to pass through this multi-layered glandular epithelium, which has a holocrine mode secretion. The dorsal part of the spermatheca is lined by a highly secretory apocrine glandular epithelium, which was to date only found in fiddler crabs of the genus Uca.
The male internal reproductive system consists of paired testes and corresponding vasa deferentia. The sperm morphology of pinnotherids conforms to other thoracotremes, with slight differences between Nepinnotheres pinnotheres and Pinnotheres pisum. Spermatozoa become enveloped into spermatophores in the secretory proximal vas deferens. The medial vas deferens is strongly enlarged and stores spermatophores embedded in seminal plasma. The distal vas deferens holds tubular appendices, which extend into the ventral cephalothorax and slightly into the pleon. These appendices produce and store vast quantities of seminal plasma. The copulatory system of the Brachyura is formed by paired penes and two pairs of gonopods, which function in sperm transfer. In pinnotherids, the long first gonopods transfers the sperm mass to the female. It holds the ejaculatory canal inside, which opens proximally and distally. The second gonopod is solid, short and conical. During copulation, the penis and the second gonopod are inserted into the base of the tubular first gonopod. The second gonopod functions in the transport of the sperm mass inside the ejaculatory canal towards its distal opening. The specific shape of the second gonopod is strongly adapted for a sealing of the tubular first gonopod with longitudinal cuticle foldings that interlock inside the first gonopod. The presented results are discussed concerning their function in reproduction and in respect of the systematic account.
The role of secretion in sperm transfer, storage and fertilization among the Brachyura is still under debate. It is notable that structure and function of secretion are more complex in pinnotherids and probably more efficient than in other brachyuran crabs, which will be discussed, in view of the parasitic way of life and the high fecundity of pinnotherids.
Echolocation allows bats to orientate in darkness without using visual information. Bats emit spatially directed high frequency calls and infer spatial information from echoes coming from call reflections in objects (Simmons 2012; Moss and Surlykke 2001, 2010). The echoes provide momentary snapshots, which have to be integrated to create an acoustic image of the surroundings. The spatial resolution of the computed image increases with the quantity of received echoes. Thus, a high call rate is required for a detailed representation of the surroundings.
One important parameter that the bats extract from the echoes is an object’s distance. The distance is inferred from the echo delay, which represents the duration between call emission and echo arrival (Kössl et al. 2014). The echo delay decreases with decreasing distance and delay-tuned neurons have been characterized in the ascending auditory pathway, which runs from the inferior colliculus (Wenstrup et al. 2012; Macías et al. 2016; Wenstrup and Portfors 2011; Dear and Suga 1995) to the auditory cortex (Hagemann et al. 2010; Suga and O'Neill 1979; O'Neill and Suga 1982).
Electrophysiological studies usually characterize neuronal processing by using artificial and simplified versions of the echolocation signals as stimuli (Hagemann et al. 2010; Hagemann et al. 2011; Hechavarría and Kössl 2014; Hechavarría et al. 2013). The high controllability of artificial stimuli simplifies the inference of the neuronal mechanisms underlying distance processing. But, it remains largely unexplored how the neurons process delay information from echolocation sequences. The main purpose of the thesis is to investigate how natural echolocation sequences are processed in the brain of the bat Carollia perspicillata. Bats actively control the sensory information that it gathers during echolocation. This allows experimenters to easily identify and record the acoustic stimuli that are behaviorally relevant for orientation. For recording echolocation sequences, a bat was placed in the mass of a swinging pendulum (Kobler et al. 1985; Beetz et al. 2016b). During the swing the bat emitted echolocation calls that were reflected in surrounding objects. An ultrasound sensitive microphone traveling with the bat and positioned above the bat’s head recorded the echolocation sequence. The echolocation sequence carried delay information of an approach flight and was used as stimulus for neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus of the bats.
Presentation of high stimulus rates to other species, such as rats, guinea pigs, suppresses cortical neuron activity (Wehr and Zador 2005; Creutzfeldt et al. 1980). Therefore, I tested if neurons of bats are suppressed when they are stimulated with high acoustic rates represented in echolocation sequences (sequence situation). Additionally, the bats were stimulated with randomized call echo elements of the sequence and an interstimulus time interval of 400 ms (element situation). To quantify neuronal suppression induced by the sequence, I compared the response pattern to the sequence situation with the concatenated response patterns to the element situation. Surprisingly, although the bats should be adapted for processing high acoustic rates, their cortical neurons are vastly suppressed in the sequence situation (Beetz et al. 2016b). However, instead of being completely suppressed during the sequence situation, the neurons partially recover from suppression at a unit specific call echo element. Multi-electrode recordings from the cortex allow assessment of the representation of echo delays along the cortical surface. At the cortical level, delay-tuned neurons are topographically organized. Cortical suppression improves sharpness of neuronal tuning and decreases the blurriness of the topographic map. With neuronal recordings from the inferior colliculus, I tested whether the echolocation sequence also induced neuronal suppression at subcortical level. The sequence induced suppression was weaker in the inferior colliculus than in the cortex. The collicular response makes the neurons able to track the acoustic events in the echolocation sequence. Collicular suppression mainly improves the signal-to-noise ratio. In conclusion, the results demonstrate that cortical suppression is not necessarily a shortcoming for temporal processing of rapidly occurring stimuli as it has previously been interpreted.
Natural environments are usually composed of multiple objects. Thus, each echolocation call reflects off multiple objects resulting in multiple echoes following the calls. At present, it is largely unexplored how neurons process echolocation sequences containing echo information from more than one object (multi-object sequences). Therefore, I stimulated bats with a multi-object sequence which contained echo information from three objects. The objects were different distances away from each other. I tested the influence of each object on the neuronal tuning by stimulating the bats with different sequences created from filtering object specific echoes from the multi-object sequence. The cortex most reliably processes echo information from the nearest object whereas echo information from distant objects is not processed due to neuronal suppression. Collicular neurons process less selectively echo information from certain objects and respond to each echo.
For proper echolocation, bats have to distinguish between own biosonar signals and the signals coming from conspecifics. This can be quite challenging when many bats echolocate adjacent to each other. In behavioral experiments, the echolocation performance of C. perspicillata was tested in the presence of potentially interfering sounds. In the presence of acoustic noise, the bats increase the sensory acquisition rate which may increase the update rate of sensory processing. Neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus could strengthen the hypothesis. Although there were signs of acoustic interference or jamming at neuronal level, the neurons were not completely suppressed and responded to the rest of the echolocation sequence.
Die lösliche Guanylyl Zyklase (sGC) ist das Schlüsselenzym, das die Stickstoffmonoxid (NO)-induzierte Vasodilatation über eine Erhöhung des intrazellulären zyklischen 3´5´-Guanosinmonophosphats (cGMP) vermittelt. Obwohl die sGC oft als "Haushalts"-Gen bezeichnet wurde, dessen Aktivität nur akut durch die verfügbare NO-Menge reguliert wird, zeigen einige neuere Befunde, dass eine Regulation auch auf Ebene der Gen-Expression stattfindet. Z.B. wurde in zwei Rattenmodellen, der Nitrat-Toleranz (Mülsch et al., 2001) bzw. des chronischen Herzversagens (Bauersachs et al., 1999), eine zwei- bis dreifache Induktion der sGC-Expression beobachtet. Bei der Nitrat-Toleranz wurde zudem ein Anstieg der Endothelin- 1 (ET-1)-Expression beobachtet (Münzel et al., 1995). In dieser Arbeit wurde deshalb untersucht, ob ET- 1 einen Einfluss auf die sGC-Expression und die sGC/cGMP vermittelte Relaxation von Rattengefäßen hat. Um den möglichen Einfluss von ET-1 auf die Transkription der sGC zu untersuchen sollten die Promotoren der beiden Untereinheiten (UE) a1 und ß1 der Ratte kloniert werden. Dazu wurde zuerst eine Bestimmung der Transkriptionsstarts für beide UE durchgeführt. Es konnte gezeigt werde, dass die Sequenz der bis dahin bekannten 5´ Untranslatierten Region (5´ UTR) der a1-UE (Nakane et al., 1990) nicht korrekt war. Die ersten 213 bp dieser Sequenz konnten nicht gefunden werden. Für die ß1-UE konnte der 5´ UTR um 30 bp, im Vergleich zu der von Nakane (1990) publizierten Sequenz, verlängert werden. Letztlich konnten mit Hilfe einer PCR-Technik 2864 bp (a1) und 1287 bp (ß1) in 5´ Richtung des Transkriptionsstarts kloniert und sequenziert werden. Beide Promotoren zeigten eine basale Aktivität, die sich mit zunehmender Verkürzung der Bereiche in Richtung Transkriptionsstart erhöhte. Die basale Aktivität der beiden UE-Prornotoren zeigte, dass die Gene der beiden UE nicht in Tandemorganisation, wie im Medakafisch (Mikami et aI., 1999) vorliegen, sondern ähnlich wie bei der Maus (Sharina et al., 2000) beide UE unabhängig voneinander reguliert werden. Beide Promotoren ließen sich durch eine 6 stündige Stimulation mit ET-1 [10nM] um das ca. 1,6 bis l,9fache aktivieren. Bei Verkürzung des a1-Promotors wurde zudem festgestellt, dass das kürzeste Fragment sich nicht mehr durch ET-1 stimulieren ließ. In den 146 bp, die diesem Konstrukt fehlten, befinden sich mögliche Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren PEA3, NF-Il6 und E2A. In kultivierten glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte konnte mit Hilfe der RT-PCR gezeigt werden, dass ET-I (10 nM, 6 Std.) die Expression beider UE auf mRNA-Ebene um das ca. dreifache erhöht. Zudem konnte für die ß1-UE mit Hilfe der Real-Time-PCR (TaqManTM) und für die ET-Rezeptortypen spezifische Antagonisten gezeigt werden, dass dieser ET-1 Effekt über den ETA-Rezeptor vermittelt wird. Bei isometrischen Kontraktionsmessungen an Endothel-freien Rattengefäßen konnte gezeigt werden, dass eine 4 stündige Vorstimulation mit 10 nM ET-1 die für eine 50%ige Relaxation der Gefäße nötige Konzentration des NO-Donors Natriumnitropussuid (SNP) um ca. eine Zehnerpotenz verringert. ET-1 erzeugt also eine deutliche Sensitivierung der Gefäße gegenüber NO. Durch Versuche mit einem stabilem cGMP-Analogon (8-Bromo-cGMP) konnte zudem gezeigt werden, dass nachfolgenden Elemente der NO/cGMP Signalkette nicht durch die ET-1 Stimulation beeinflusst wurden. Auch Teile der Signalkette, die die cAMP-induzierte Relaxation vermitteln, wurden nicht durch ET-1 beeinflusst. Schließlich konnte in in-vitro Versuchen gezeigt werden, dass ET-1 sowohl in Endothel-freien Rattenaorten und Koronargefäßen des Schweins, als auch in kultivierten, glatten Rattengefäßmuskelzellen eine signifikante Steigerung der spezifischen NO-induzierten sGC-Aktivität bewirkt. Die in dieser Arbeit gezeigte Steigerung der Promotoraktivität, der mRNA-Mengen und der enzymatischen Aktivität der sGC durch ET-1 deutet auf einen biologischen Rückkoppelungsmechanismus hin. Dieser würde einer übermässigen Vasokontraktion und den mitogenen Effekten von ET-l bei einer Überexpression entgegen wirken und wäre somit ein wichtiges Element der Feineinstellung der ET-1 Wirkung.
Reggie-1 und Reggie-2 stellen eine über diverse Spezies konservierte Proteinfamilie dar und werden in den meisten Geweben exprimiert. Die physiologische Funktion dieser Proteine ist bisher nicht geklärt. Die Reggie-Proteine wurden zunächst im Zusammenhang mit der Regeneration von Axonen retinaler Ganglienzellen des Goldfisches beschrieben. In diesen Zellen wird die Expression beider Proteine nach Läsion des Nervs hochreguliert. Unabhängig davon wurden Reggies aufgrund ihres Sedimentationsverhaltens in Dichtegradienten als Flotilline beschrieben. Dabei ist Reggie-1 identisch mit Flotillin-2 und Reggie-2 mit Flotillin-1. Beide Reggie-Proteine sind Raft-assoziiert. Bei Rafts handelt es sich um Membran-Mikrodomänen, deren Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Endozytose und dem Transport von Proteinen beschrieben wurde. Strukturell zeichnen sich Rafts durch einen im Vergleich zur restlichen Membran erhöhten Anteil an Cholesterol und Sphingolipiden aus, der unter anderem in einer herabgesetzten lateralen Beweglichkeit der beteiligten Moleküle resultiert, und so Sortierungs- und Signalvorgänge innerhalb der Zelle begünstigt. Aus der Beobachtung, dass Reggie-2 mit dem Struktur-Vorläuferprotein des Rotavirus interagiert, ergab sich die Fragestellung zu dieser Arbeit. Das Ausschleusen von Rotaviren aus infizierten Zellen ist von Rafts abhängig. Die strukturellen Eigenschaften des Rotavirus-Proteins ähneln Gag, dem Struktur-Vorläuferprotein des Humanen Immundefizienz-Virus und verwandter Retroviren. Das HIV Gag-Protein ist außerhalb des viralen Kontext nach Expression in der Lage, an zellulären Membranen zu assemblieren und Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Die molekularen Abläufe dieses Vorgangs, der als budding bezeichnet wird, sind noch nicht im Detail verstanden. Sie werden jedoch sowohl für Gag allein, als auch für die Virusproduktion in infizierten Zellen mit Rafts in Verbindung gebracht. Ein Hinweis darauf ergibt sich aus der Tatsache, dass HIV-infizierte Zellen nach Cholesterol-Depletion kein produktives Virus mehr abschnüren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 mit HIV-1 Gag interagiert und sich Veränderungen der Reggie-2 Expressions sowohl auf die zelluläre Lokalisation von Gag als auch auf die Produktion Virus-ähnlicher Partikel auswirkt. Die Überexpression von Reggie-2 in HeLa-Zellen führt zu einer Umverteilung von Gag mit erhöhter Lokalisation an der Plasmamembran, an der es dann stark mit Reggie-2 kolokalisiert. Die Verminderung der Reggie-2 Expression mittels siRNA resultiert in einer erhöhten Freisetzung Virus-ähnlicher Partikel aus Gag-transfizierten HeLa-Zellen und in einer eher löslichen Lokalisation des viralen Proteins im Zytoplasma. Der Ort des buddings von HIV ist Zelltyp-abhängig und involviert die zelluläre ESCRT-Maschinerie, die physiologisch für das Sortieren von Proteinen in multivesicular bodies (MVBs) zuständig ist. Gag rekrutiert das ESCRT-System, indem es über ein kurzes Aminosäuremotif an das ESCRT-I Protein TSG101 bindet und dabei die Eigenschaft des zellulären Proteins HRS nachahmt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 in HeLa-Zellen mit Komponenten der ESCRT-Maschinerie kolokalisiert. Dabei ist denkbar, dass eine Verbindung zwischen ESCRT und Reggie-Proteinen besteht, da Rafts als Signal- und Sortier-Plattformen die physiologischen Prozesse begünstigen könnten, die bei der Funktion von MVBs eine Rolle spielen. Im Gegensatz zu Reggie-2 findet keine Interaktion von Gag mit Reggie-1 statt. Beide Reggie-Proteine sind jedoch biochemisch in produktiven Viren infizierter primärer T-Zellen nachweisbar. Des Weiteren zeigen Immunfluoreszenz-Studien infizierter Lymphozyten, dass beide Reggies in diesen Zellen in einem großen Ausmaß mit Gag kolokalisieren. Der Grund dafür ist wahrscheinlich die Fähigkeit der Reggies zur Homo- und Heterooligomerisierung. Die direkte und spezifische Interaktion von Gag mit dem Raft-assozierten Protein Reggie-2 konnte mit verschiedenen Methoden gezeigt werden. Dabei können die Ergebnisse als Grundlage für ein besseres Verständnis der HIV-Pathogenese dienen, und zusätzlich gibt die mögliche Verbindung von Reggies zum ESCRT-Komplex neue Hinweise auf die zelluläre Funktion dieser Raft-Proteine.
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.
Entwicklung neuer Multikomponentenreaktionen zur Synthese von Amin- und α-Aminosäurederivaten
(2016)
Die Entwicklung neuer Synthesemethoden ist von enormer Bedeutung hinsichtlich der Darstellung von neuen Verbindungen mit speziellen, anwendungsorientierten Eigenschaften und in Bezug auf die Suche nach ökologisch verträglicheren und effizienteren Herstellungsmethoden. Multikomponentenreaktionen (MCRs) bieten hierbei eine gute Ansatzmöglichkeit. Gegenüber den klassischen, linear verlaufenden 2-Stufen-Reaktionen weisen MCRs eine hohe Atom-Ökonomie und effiziente Bindungsbildung auf, können zur Minimierung von Zeit-, Energie-, Material- und Kostenaufwand sowie zur geringeren Generierung von Abfallmengen beitragen und ermöglichen einen schnellen Aufbau diverser Molekülstrukturen. Vor diesem Hintergrund gelang im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Entwicklung mehrerer 3-Komponentenreaktionen basierend auf der nukleophilen Addition von Arylboronsäuren an in situ gebildete N-Acyl- bzw. N-Sulfonylimine, womit die Synthese von diversen alpha-substituierten Amiden, chiralen, alpha-substituierten Sulfonamiden, chiralen alpha-Arylglycinen sowie von Arylmethylsulfonamiden erfolgte. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Umsetzung hinsichtlich der Methode mit Amiden war die Verwendung eines dualen Katalysatorsystems aus Lewis-Säure und Pd(II) sowie die Anwesenheit von Wasser. Die enantioselektiven Varianten konnten mittels Sulfonamide anstelle der Amide sowie unter Einsatz von Pd(II) und einem chiralen Oxazolin-Liganden erreicht werden. Die neuen Methoden sind einfach in der Durchführung, weisen einen breiten Substrat-bereich auf und im Falle der asymmetrischen Varianten hohe Enantioselektivitäten.
Allerdings besitzt die Reaktionsführung über Organoboronsäuren zwei entscheidende Nachteile: Zum einen bedarf es der Verwendung vorfunktionalisierter Boronsäuren und zum anderen werden stöchiometrische Mengen borhaltiger Abfälle erzeugt. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Prozesse untersucht, bei denen hinsichtlich der Atom-Ökonomie keine unnötig vorfunktionalisierten Startmaterialien eingesetzt werden und bei denen keine oder nur ökologisch vollkommen unbedenkliche Nebenprodukte entstehen. Ein erster Ansatz in diese Richtung gelang dabei mit der Entwicklung einer neuen 3-Komponentenreaktion basierend auf einer Brønsted-Säurekatalysierten, benzylischen C–H-Bindungsfunktionalisierung von 2-Alkylazaarenen.
Biotechnological processes offer better production conditions for a wide variety of goods of industrial interest. The production of aromatic compounds, for example, involves molecules of great value for cosmetic, plastic, agrochemical and pharmaceutic industries. However, the yield of such processes frequently prevents a proper implementtation that would allow the replacement of traditional production processes.
Numerous rational engineering approaches have been attempted to enhance metabolic pathways associated with desired products. Unfortunately, genetic modifications and heterologous pathway expression often lead to a higher metabolic burden on the producing organisms, ultimately leading to reduced production levels and fitness.
This project utilised adaptive laboratory evolution to better understand the development of synthetic cooperative consortia, using S. cerevisiae as a model organism. Specifically, a synthetic cooperative consortium was developed around the exchange of lysine and tyrosine, which was subjected to adaptive laboratory evolution aiming to induce mutations that would improve the system’s fitness either by enhanced production or upgraded stress resistance. Consequently, the mutant strains isolated after the evolution rounds were sequenced to identify relevant variations that could be related to the growth and production phenotypes observed.
The insights derived from this project are expected to contribute to further developing synthetic cooperative consortia with utilitarian purposes.
Resistance in glucocorticoid-induced apoptosis is associated with poor prognosis for long term survival in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). As Smac mimetics have been shown to reactivate apoptosis by antagonizing Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins, we investigate the potential of the Smac mimetic BV6 to overcome glucocorticoid-resistance in ALL. This study shows that BV6 synergistically cooperates with glucocorticoids to trigger apoptosis and to suppress clonogenic growth of pediatric ALL cells. Of note, the BV6/glucocorticoid combination treatment also induces cell death in cells having defects in the apoptotic signaling cascade by inducing a switch from apoptotic to necroptotic cell death. The clinical relevance of our novel combination treatment is underscored by parallel experiments in primary pediatric ALL samples, in which glucocorticoids and BV6 act together to induce cell death in a synergistic manner. Importantly, the addition of BV6 enhances the anti-leukemic effects of glucocorticoids in an in vivo mouse model of pediatric ALL without causing substantial side effects, highlighting the potency of a BV6/glucocorticoid combination treatment. In contrast, BV6 does not increase cytotoxicity of glucocorticoids against several non-malignant cell types of the lympho-hematopoietic system. Furthermore, we have identified the novel underlying mechanism of BV6/glucocorticoid-induced apoptosis by showing that BV6 and glucocorticoids synergistically act together to promote assembly of the ripoptosome, a RIP1/FADD/caspase-8-containing cell death complex. Ripoptosome assembly is critically required for BV6/Dexamethasone-induced cell death, since genetic silencing of its members, i.e. RIP1, reduces ROS production, caspase activation and most importantly cell death induction. BV6/glucocorticoid combination treatment promotes ripoptosome assembly by inhibition of both of its negative regulators, IAP proteins and cFLIP. Thus, we identify that BV6 and glucocorticoids cooperate together to reduce cIAP1, cIAP2 and XIAP protein levels and cFLIP expression. Ripoptosome formation occurs independently of autocrine/paracrine loops of death receptor ligands, since blocking antibodies for TNFα, TRAIL or CD95L or genetic silencing of their corresponding receptors fail to rescue BV6/glucocorticoid-induced cell death. In summary, this study shows that the Smac mimetic BV6 sensitizes for glucocorticoid-induced apoptosis by promoting ripoptosome assembly with important implications for the treatment of childhood ALL.
Koalas are popular zoo animals, but difficult in husbandry. In addition to their specialised diet of eucalyptus leaves, they are prone to “stress” and disease. Particularly in European zoos, themonitoring of theirwell-being has high priority and they are protected from possible stressors. However, stress signs in koalas are vague and monitoring techniques like weighing might result in discomfort itself. Additionally, husbandry routines are planned according to keeper’s schedule, not to the endogenous rhythms of the koalas. Therefore it is necessary to investigate activity pattern in captive koalas and the signals influencing them. These signals have to be assessed on the strength and quality of their impact. A total of 17 koalas have been observed in three zoological gardens in Australia and Europe. Koalas kept in outdoor enclosures with little human contact (Koala Walkabout, Taronga Zoo, Sydney) showed a uniform activity pattern, which was clearly entrained by light. Activity levels were higher during the night, and there was a pronounced resting period in the morning which corresponds with low body temperature measured by Degabriele and Dawson (1979). Activity peaks were related to twilight and changed during the year related to day lengths. However, there was a clear influence from the introduction of fresh browse which resulted in a distinct feeding peak in the afternoon. With short day lengths, this stimulus competed with dusk. Activity patterns from koalas in indoor enclosures (Zoo Duisburg, Vienna Zoo) varied between individuals and in some cases lacked a detectable rhythm. Though activity peaks were related to light, entrainment to sunlight was weak. In winter, koalas reacted primarily to the artificial light, but some also showed activity peaks related to sunlight. Activity patterns in these koalas were less structured and differed severely from patterns expected according to literature. Activity was often related to the keeper’s presence and food introduction. Frequency of feeding bouts was considerably higher at Vienna Zoo compared to the other zoos and the bouts were shorter in duration. Time budgets of the koalas were within the range given in free-range studies. Feeding showed seasonal changes and was increased in lactating females. Koalas at Vinna Zoo had a high level of locomotor activity compared to the size of the enclosure. Koalas at Koala Walkabout were not used to handling, so they resisted the keeper. The koalas at the two European zoos were handled regularly and settled down quickly. However, handling took place in the morning; in most koalas, there was no activity prior to it. In Vienna, resting periods were interrupted daily due to weighing. Food introduction at KoalaWalkabout took place in the afternoon. It was preceded by locomotor activity and triggered a long feeding bout in the koalas. It is not clear, whether food had true Zeitgeber properties or masked the endogenous rhythm. In the two European zoos, food was introduced in the morning. The peaks related to this were smaller than those at Koala Walkabout. Activity was rarely observed prior to food introduction. The koalas at Koala Encounter, Taronga Zoo (Sydney),were regularly confronted with visitors, though no contact was allowed. Direct observation by the keepers did rarely show any stress signs. Activity patterns at night were strikingly similar to Koala Walkabout, but differed dramatically during the day. Food was introduced three times a day, which usually resulted in activity that interrupted a resting period. Generally, the koalas at Koala Encounter were more active than those at KoalaWalkabout. They also displayed a high level of locomotor activity, especially on the ground, which is an accepted sign of discomfort in koalas (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001; Yusuf& Rosenthal unpublished data). In summary, this chronoethological study of the captive koalas showed that there are several problems with koala husbandry. Artificial light regimes for koalas are not sufficient for entrainment and result in unstructured activity pattern. This is especially the case in winter, when the day in Europe is artificially extended. Due to the mainly nocturnal behaviour of koalas, such an extension might not be necessary and therefore should be avoided. Handling in Europe took place during the physiological resting time of the koalas. Interruptions of resting times are considered as stressors (Wood 1978) and should be avoided. Handling in the afternoon would be more suitable for the koalas and triggered activity in the two koalas at Vienna Zoo. It is also arguable if daily weighing is necessary to monitor health in captive koalas or if the frequent interruption of resting countervail the advantages of constant monitoring. Frequent contact with visitors, evenwithout the so-called cuddling, has a considerable impact on activity patterns and time budget of koalas, even if no immediate stress signs are displayed. Such contact should therefore be reduced to a minimum and chronoethological observations of the koalas should be used. A study on koalas with direct visitor contact is also advisable to revise the current legislation on “koala cuddling”. Koalas frequently rested in living trees if they had access to it. Since no food-poisoning has been reported from koalas using living non-food trees, the provision of living trees with an appropriate canopy should be included in the husbandry guidelines. Increased locomotor activity has been shown to be related to conditions of discomfort or stress and possibly to oestrus. This is in accordance with literature (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001). Further observation, combined with hormone analysis, are advisable to establish this parameter for evaluation of well-being. Chronoethology has proven to be useful for the evaluation of husbandry conditions and group dynamics. Different to other, traditional ethologicalmethods, it indicated problems and enabled me to advise more appropriate times for handling and food introduction. It is desirable that zoos already using 24-hour video observation include chronoethological aspects into their analysis.
Taxa under scrutiny in this thesis are Halophytophthora-like oomycetes. The genus Halophytophthora, proposed in 1990, is an assemblage of unrelated species grouped together on the basis habitat preference, i.e. the mangrove or saltmarsh biome, and morphological similarity to Phytophthora. The premise “Phytophthora-like species from the mangrove environment” became the genus concept for Halophytophthora and lasted for almost 2 decades which resulted to the addition of several species (i.e. H. elongata, H. exoprolifera, H. porrigovesica, H. kandeliae, H. masteri, and H. tartarea). At the onset of molecular phylogenetics, Halophytophthora was inferred as a highly polyphyletic taxon and the genus concept was found to be unsuitable. This thesis adds to this, since six Phytophthora spp. were isolated from the mangrove environment, two of which were found in the Philippines (Phytophthora elongata and Phytophthora insolita). After a thorough assessment of the morphologic and phylogenetic data of taxa included in this thesis, several taxonomic novelties were introduced – a new family (Salispinaceae), a new genus (Calycofera), new species (Calycofera cryptica, Phytopythium dogmae, Phytopythium leanoi, Salisapilia coffeyi, and Salispina hoi), and new combinations (Calycofera operculata, Salisapilia bahamensis, S. elongata, S. epistomia, S. masteri, S. mycoparasitica). In addition, Salisapiliaceae and Salisapilia were emended.
1. Das Dissoziations- und Reaggregationsverhalten von Epidermiszellen der Larven von Xenopus laevis wird unter verschiedenen Bedingungen in vitro mit Hilfe des Zeilrafferfilmes untersucht. Die Kultur der Schwänze erfolgt in Salzlösung nach STEINBERG und Serum hämolysierten Kälberblutes. Für die Reaggregation werden serumfreie Salzlösungen verwendet. 2. Am Auswandern der Zellrasen beteiligen sich alle dem Deckglas anliegenden Zellen. Sie bilden einen Plasmasaum in die Richtung aus, in der sie sich fortbewegen. Der Zusammenhalt zwischen den Zellen wird hierbei nicht gelöst. 3. Die Zellrasen lassen sich mit 0;05%igem EDTA in Einzelzellen auflösen; dabei tritt eine Trennung des Zellplasmas in ein zentral gelegenes granuliertes Plasma und einen hyalinen Plasmasaum auf. Bei längerer Einwirkung des EDTA werden die hyalinen Säume eingezogen. Die Zellen sind dann abgekugelt; es brechen blasenförmige "Lobopodien" aus den Zellen hervor und verschwinden wieder: "Blubbern". 4. In Gegenwart von Ca++ breiten sich die Zellen wieder auf dem Deckglas aus. Die Bildung "stabilisierter Aggregate" erfolgt in Ringerlösung (mit 0,02% CaCl2), in isotonischer Calciumchlorid-Lösung, in isotonischer Kochsalz- und Kaliumchlorid-Lösung, wenn Calciumchlorid mindestens 0,02%ig enthalten ist. Es wird angenommen, daß die einwertigen Kationen für die Zellbewegung und Reaggregation nur als Ladungsträger wirksam sind. In KCN-haltiger (2,5 X 10-3 M) und in PCMB-haltiger (2,5 X 10-3 M) Ringerlösung ist ebenfalls Reaggregation möglich. Unter dem Einfluß von PCMB ist die Stabilisierung der Zollgrenzen jedoch nicht von Dauer. Die Aggregate werden wieder aufgelöst; die Zellen zeigen keine Kontakthemmung mehr, sie wandern übereinander. 5. Wird das Calciumchlorid der Ringerlösung durch die äquimolare Menge Magnesiumchlorid ersetzt, so werden die Kontakte nicht stabilisiert, sondern "sliding sheets" gebildet. Keine Reaggregation ist in Calcium-haltiger Natrium- oder Kaliumchlorid-Lösung einer Konzentration unter 0,33 M und in Ringerlösung unter pH 4,0 möglich. Die Zellen sind dann auch zu keiner Ortsbewegung mehr fällig. Selbst kurze (3 min) Trypsinbehandlung (2%) verhindert die Reaggregation der Zellen im serumfreien Medium. 6. Besonders die Versuche zur Störung des Energiehaushaltes der Zellen legen nahe, daß die dabei zu beobachtenden Viskositätsänderungen im Hyaloplasmasaum auf einer Änderung des Kontraktionszustandes in ihm enthaltener kontraktiler Proteine beruhen. Die Auswirkungen von PCMB, niederem pH und geringer Ionenstärke deuten auf die Beteiligung eines Membranpotentials an der Steuerung der Viskositätsänderung hin. Diese Hypothese wird zu Ergebnissen der Muskelphysiologie in Beziehung gesetzt.
This dissertation constitutes a series of successive research papers, starting with the characterization of various optogenetic tools up to the establishment of purely optical electrophysiology in living animals.
Optogenetics has revolutionized neurobiology as it allows stimulation of excitable cells with exceptionally high spatiotemporal resolution. To cope with the increasing complexity of research issues and accompanying demands on experimental design, the broadening of the optogenetic toolbox is indispensable. Therefore, one goal was to establish a wide variety of novel rhodopsin-based actuators and characterize them, among others, with respect to their spectral properties, kinetics, and efficacy using behavioral experiments in Caenorhabditis elegans. During these studies, the applicability of highly potent de- and hyperpolarizers with adapted spectral properties, altered ion specificity, strongly slowed off-kinetics, and inverted functionality was successfully demonstrated. Inhibitory anion channelrhodopsins (ACRs) stood out, filling the gap of long-sought equivalent hyperpolarizing tools, and could be convincingly applied in a tandem configuration combined with the red-shifted depolarizer Chrimson for bidirectional stimulation (Bidirectional Pair of Opsins for Light-induced Excitation and Silencing, BiPOLES). A parallel study aimed to compare various rhodopsin-based genetically encoded voltage indicators (GEVIs) in the worm: In addition to electrochromic FRET-based GEVIs that use lower excitation intensity, QuasAr2 was particularly convincing in terms of voltage sensitivity and photostability in C. elegans. However, classical optogenetic approaches are quite static and only allow perturbation of neural activity. Therefore, QuasAr2 and BiPOLES were combined in a closed-loop feedback control system to implement the first proof-of-concept all-optical voltage clamp to date, termed the optogenetic voltage clamp (OVC). Here, an I-controller generates feedback of light wavelengths to bidirectionally stimulate BiPOLES and keep QuasAr’s fluorescence at a desired level. The OVC was established in body wall muscles and various types of neurons in C. elegans and transferred to rat hippocampal slice culture. In the worm, it allowed to assess altered cellular physiology of mutants and Ca2+-channel characteristics as well as dynamical clamping of distinct action potentials and associated behavior.
Ultimately, the optogenetic actuators and sensors implemented in the course of this cumulative work enabled to synergistically combine the advantages of imaging- and electrode-based techniques, thus providing the basis for noninvasive, optical electrophysiology in behaving animals.
Hyperparasitic fungi on black mildews (Meliolales, Ascomycota) : hidden diversity in the tropics
(2023)
Meliolales (Sordariomycetes, Ascomycota) is a group of obligate plant parasitic microfungi mainly distributed in the tropics and subtropics. Meliolalean fungi are commonly known as “black mildews”, as they form black, superficial hyphae on the surface of vegetative and reproductive organs of vascular plants. They are considered biotrophic parasites, and the infections caused by black mildews can lead to a decrease in the photosynthetic activity of plants, as well as to an increase in the temperature and respiration rate of their leaves.
Meliolales are frequently parasitized by hyperparasitic fungi, i.e., parasitic fungi that have parasitic hosts. These hyperparasites are all Ascomycota and belong mainly to the Dothideomycetes and Sordariomycetes. Although hyperparasites represent a megadiverse group, species were only described by morphology until 1980, and the systematic position of more than 60 % of known species is still unclear. In addition, there are no DNA reference sequences available in public databases for any of the species of hyperparasites of Meliolales, and no ecological studies have been done up to now.
Before this study, no exact number of hyperparasitic fungi growing on colonies of black mildews existed. Here, we present a checklist including 189 species of fungi known to be hyperparasitic on Meliolales, but the number of existing species is likely to be even higher. The elaboration of this species checklist laid the foundations for this investigation, as it helped to understand the present state of knowledge of hyperparasitic fungi on Meliolales worldwide.
For the present study, fresh specimens of leaves infected with colonies of Meliolales and hyperparasites were opportunistically collected at 32 collection sites in Western Panama and Benin, West Africa, in 2020 and 2022, respectively. In total, 100 samples of plant specimens infected with black mildews were collected, of which 58 samples were parasitized by hyperparasitic fungi. 31 species and morphospecies of hyperparasitic fungi were identified. In addition, 35 historical specimens, including 12 type specimens, were examined for the present work.
DNA of hyperparasitic fungi was isolated directly from conidia, synnemata, apothecia, perithecia or pseudothecia of fresh and dried specimens. The main challenges faced by scientists in doing molecular studies of hyperparasitic fungi are related to the fact that the hyperparasitic fungi are intermingled with tissues of the meliolalean hosts and other organisms present in a given sample. This makes the isolation of DNA exclusively from the hyperparasite difficult. Moreover, hyperparasitic fungi on Meliolales are biotrophs and cannot be grown axenically. The hosts themselves are also biotrophic, further complicating DNA isolation from either partner. These factors have contributed to a lack of reference sequences in public databases. After more than 100 attempts, DNA of 20 specimens of hyperparasitic fungi, representing seven species, has been isolated in the context of the present investigation. Three partial nuclear gene regions were amplified and sequenced: nrLSU, nrSSU and nrITS. The datasets were assembled for phylogenetic analyses applying Maximum Likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) methods. DNA sequences of hyperparasitic fungi on Meliolales were generated for the first time in the context of the present investigation.
Hyperparasitic fungi on Meliolales do not represent a single systematic group, but a polyphyletic ecological guild of fungi. Because of this huge diversity, only the systematics of species of perithecioid hyperparasites, as well as of the species of the genera Atractilina and Spiropes known to be hyperparasitic on black mildews was discussed in this thesis, as they represented the most common groups of fungi found in Benin and Panama. The results indicated, for example, the systematic position of Dimerosporiella cephalosporii and Paranectriella minuta in the Sordariomycetes and Dothideomycetes, respectively. In addition, the first record of a hyperparasitic fungus of black mildews in the Lecanoromycetes, namely Calloriopsis herpotricha, is reported here. The systematics of Atractilina parasitica and of some species of Spiropes is also discussed here.
In the context of the present investigation, four species new to science were described. They are presented with detailed descriptions, photos and scientific illustrations. Taxonomic studies of this thesis also generated seven new synonyms, nine new records for Benin, seven for Panama, one for Africa and two for mainland America, as well as the confirmation of one anamorph-teleomorph connection by molecular sequence data.
The ecology of hyperparasitic fungi on Meliolales is complex and far from being completely understood. The hypothesis of host specificity between hyperparasitic fungi, their meliolalean hosts and their plant hosts was tested for the first time, through a tritrophic network analysis. Results indicate that hyperparasites of Meliolales are generalists concerning genera of Meliolales, but apparently specialists at the level of order. In addition, hyperparasitic fungi tend to be found alongside their meliolalean hosts, suggesting a pantropical distribution.
Die forensische Entomologie nutzt nekrophage Insekten, hauptsächlich Dipteren und ihre juvenilen Stadien, zur Schätzung der minimalen Leichenliegezeit. Dem liegt zugrunde, dass nekrophage Dipteren binnen Minuten nach dem Todeseintritt potentiell in der Lage sind, einen Leichnam zu detektieren und zu besiedeln. Das anschließende Wachstum und die Entwicklung der juvenilen Stadien erfolgt als Funktion von der Art und der Umgebungstemperatur.
Mit Hilfe von Laborstudien konnten bislang für einige forensisch relevante Fliegenarten Entwicklungsdaten erhoben werden, die eine Altersbestimmung der sich an einem Leichnam entwickelnden Larven und Puppen erlauben und so eine Schätzung der minimalen Leichenliegezeit ermöglichen. Als Nährsubstrat für Laborstudien werden tierische Gewebe verwendet. Eine Übertragbarkeit der Daten auf humanes Gewebe wurde aber bislang nicht verifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde das larvale Wachstum und die juvenile Entwicklungsgeschwindigkeit der forensisch relevanten Schmeißfliege Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) auf humanem Muskelgewebe untersucht und mit dem Wachstum auf Schweineleber, magerem Schweinemuskelfleisch und Schweinehackfleisch verglichen. Die auf humanem Gewebe heranwachsenden Individuen waren mit bis zu 3,5 mm signifikant länger als die Individuen, die sich auf Leber und dem mageren Schweinemuskelfleisch entwickelten. Bei der Verwendung von Hackfleisch vom Schwein zeigte sich kein Unterschied. Darauf basierend wird die Empfehlung ausgesprochen, für zukünftige Entwicklungsstudien Schweinehackfleisch als Ersatz für humanes Gewebe zu verwenden.
Zahlreiche Anleitungen zur Asservierung forensisch-entomologischer Spuren empfehlen das Sammeln getrennt nach Körperregionen eines Leichnams. Dies soll eine mögliche gewebespezifische Entwicklungsrate berücksichtigen. Das für die vorliegende Arbeit durchgeführte systematische Absammeln von Fliegenlarven von 51 Leichnamen getrennt nach Körperregionen zeigte keine artspezifischen Präferenzen für bestimmte Gewebe oder Körperregionen. Das Artenspektrum entsprach größtenteils dem aufgrund von Studien an Schweinekadavern zu erwartendem Artenspektrum für Deutschland und Mitteleuropa. Insgesamt konnten 15 Schmeißfliegenarten nachgewiesen werden, von denen in der Regel mehrere gleichzeitig an einem Leichnam zu finden waren. Dies zeigt, dass ein Faktor wie interspezifische Konkurrenz in Zukunft mehr Beachtung in der Forschung erhalten sollte.
Bislang wurde in der forensischen Entomologie die minimale Leichenliegezeit durch die Untersuchung juveniler Stadien von Fliegen eingegrenzt. Eine eventuell mögliche Ausweitung dieses Zeitfensters könnte durch eine Altersbestimmung der adulten Fliegen oder der leeren Puparien gelingen. Der Nachweis, dass die dafür untersuchten Fliegen bzw. Puparien tatsächlich von dem fraglichen Leichnam stammen, war bislang nicht möglich. Die forensische relevante Schmeißfliege Lucilia sericata wurde in der vorliegenden Arbeit auf humanem Gewebe und Gewebe von elf weiteren Tierarten großgezogen. Durch die Analyse stabiler Kohlen- und Stickstoffisotope konnte ein von diesen elf Tierarten abgrenzbares humanes Isotopenprofil sowohl für die adulten Fliegen von L. sericata, als auch für ihre leeren Puparien detektiert werden. Dieses Profil spiegelte die Nahrungszusammensetzung der Wirte wider.
Die vorliegende Arbeit erhebt Daten zur Entwicklung einer forensisch relevanten Schmeißfliegenart auf humanem Gewebe, belegt das bislang lediglich am tierischen Modell erhobene Schmeißfliegeninventar als für menschliche Leichen relevant und hinterfragt die gewebespezifische Asservierungsempfehlung als ein akademisches Artefakt. Auf dieser Basis konnten Empfehlungen für die Weiterzucht fallrelevanter entomologischer Spuren ausgesprochen werden, die gerichtsverwertbar sind und die Verwendung von tierischem Gewebe oder Tierkadaver in der forensisch-entomologischen Forschung legitimieren. Die Analyse stabiler Isotope legt darüber hinaus einen neuen, innovativen Grundstein für die routinemäßige Spurenzuordnung älterer Entwicklungsstadien und ist damit Vorreiter auf dem Gebiet der forensischen Entomologie.
Ziel dieser Arbeit war es, mit den Methoden der NMR-Spektroskopie die elektrostatischen Eigenschaften der Xylanase aus Bacillus agaradhaerens in Abhängigkeit vom pH-Wert zu charakterisieren. Für die vorliegende Arbeit wurde das Strukturgen der Xylanase in verschiedene Expressionsvektoren des pET-Systems kloniert, wobei das Enzym auf 207 Aminosäuren verkürzt wurde. Diese Länge entspricht der publizierten Kristallstrukur von Sabini et al. (1999). Die Expression in pET3a und die Aufreinigung des Genproduktes mit Ionenaustauschchromatographie wurde optimiert, sodass homogenes Protein mit guten Ausbeuten erhalten werden konnte. Die Xylanase wurde mit den Isotopen 15N und 13C markiert und heteronukleare, mehrdimensionale NMR-Spektren wurden für die Zuordnung der Resonanzen des Proteins aufgenommen. Die chemischen Verschiebungswerte des Proteinrückgrats und die der aliphatischen Seitenketten wurden vollständig zugeordnet. Als eine weitere Voraussetzung für eine pH-Titration wurden sequenzspezifisch die Resonanzen der Histidin- bzw. Carboxylatgruppen bestimmt. Die Lösungsstruktur der Xylanase wurde anhand mehrerer automatisierter Prozeduren errechnet, um die Zuordnung der Resonanzen zu validieren. Alle Strukturelemente, die bereits aus der Kristallstruktur bekannt sind, wurden korrekt wiedergegeben. Da die Lösungsstruktur mit einem backbone RMSD-Wert von 2.44 ± 0.29 Å hoch 2 als vorläufig zu betrachten war, wurde im Folgenden ausschließlich die Kristallstruktur zur Bewertung der Distanzbeziehungen verwendet. In Abwesenheit des Substrats wurden die pH-abhängigen Resonanzen der Histidin- und Carboxylatgruppen sowie der Amide des Proteinrückgrats gemessen. Die Auswertung ergab 220 Titrationsprofile der 15N- and 13C-Resonanzen in einem pH-Bereich von 3.2 bis 8.7. Durch nichtlineare Regression der gemessenen Werte an eine modifizierte Henderson-Hasselbalch Gleichung wurden die pK S-Werte der Seitenketten von Aspartat und Glutamat, sowie für das C-terminale Carboxylat und für die Histidingruppen bestimmt. Die Titrationskurven der katalytischen Dyade zeigten eine ausgeprägte gegenseitige Wechselwirkung. Die korrespondierenden pK S-Werte stimmen gut mit dem vorhergesagten enzymatischen Mechanismus überein (Sabini et al., 1999) und belegen, dass das Nukleophil Glu94 bei einem neutralem pH-Wert deprotoniert ist, während die Bronsted Säure/Base GIu184 zu ca. 30% protoniert ist. Um die Untersuchungen zur katalytischen Aktivität zu vervollständigen, wurden alle pH-abhängigen [15N]-Resonanzen der Amide des Proteinrückgrats wie auch die der lndolstickstoffe in der Substratbindungsspalte analysiert. Die Wendepunkte konnten dem Titrationsverhalten der benachbarten sauren Aminosäure-Seitenketten zugeordnet werden. Aber es erscheint sehr wahrscheinlich, dass ein wesentlich komplexerer Ablauf stattfindet. Die asymmetrische Wechselwirkung von Trptophan-Seitenketten bezüglich der katalytischen Dyade wie auch das wechselnde Monotonieverhalten der Titrationskurven deuten auf eine simultane Reorganisation der Seitenkettenkonformere bei pH ungefähr gleich 6 und/oder auf eine Änderung des Wasserstoffbrückennetzwerkes innerhalb der Bindungsspalte.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide nicht nur eine strukturgebende Funktion in der Plasmamembran aufweisen, sondern ebenfalls als Botenstoffe intra- und extrazellulär aktiv sind. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) bildet dabei einen Schlüssel-Metaboliten, da es verschiedene Zellfunktionen wie Wachstum und Zelltod beeinflusst. Es wird durch zwei Isoformen der Sphingosinkinasen, SK1 und SK2, gebildet. Die SK1 wurde bereits gut untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle beim Zellwachstum einnimmt und einen entscheidender Regulator bei inflammatorischen Erkrankungen und Krebs darstellt. Über die SK2 ist soweit wenig bekannt und die Ergebnisse sind zum Teil kontrovers. Sowohl pro-proliferative als auch anti-proliferative Funktionen der SK2 wurden beschrieben. Andererseits handelt meine Arbeit von Nierenfibrose, da beschrieben wurde, dass Sphingolipide einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen nehmen. Nierenfibrose stellt das Endstadium chronischer Nierenerkrankungen dar und führt zu einer Akkumulation der Extrazellulärmatrix, Organvernarbung und zum Verlust der Nierenfunktion. Die SK1 spielt dabei eine protektive Rolle bei der Entstehung von Nierenfibrose. Deshalb sollte in dieser Arbeit die Rolle der Sk2 bei der Entstehung von Nierenfibrose untersucht werden.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde das Mausmodell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) verwendet, welches zur Entwicklung einer tubulointerstitiellen Nephritits und nachfolgender Fibrose führt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass sowohl die Protein-Expression als auch die Aktivität der SK2 im fibrotischen Nierengewebe gesteigert wurden. Allgemein wiesen die SK2-/--Mäuse eine verminderte Fibrose in Folge des UUO auf im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Dies wurde bestätigt durch eine reduzierte Kollagenakkumulation, sowie eine verminderte Protein-Expression von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, connective tissue growth factor (CTGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1 (PAI-1). Diese Effekte gingen einher mit einer gesteigerten Protein-Expression des inhibitorischen Smad7 und erhöhten Sphingosin-Spiegeln in SK2-/--UUO-Nieren. Auf mechanistischer Ebene vermindern die erhöhten Sphingosin-Spiegel die durch transforming growth factor-β (TGFβ) induzierte Kollagenakkumulation, die PAI-1- und CTGF-Expression, aber induzieren die Smad7-Expression in primären Nierenfibroblasten. In einem komplementären Versuch mit hSK2 tg-Mäusen wurde eine verstärkte Entstehung von Nierenfibrose mit erhöhter Kollagenakkumulation, sowie erhöhte Protein-Expressionen von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, CTGF und PAI-1 festgestellt. Die Smad7-Expression dagegen war vermindert.
Im zweiten Teil meiner Arbeit stand der glomeruläre Teil der Niere im Fokus und es wurde untersucht, ob die Überexpression der SK2 zu einer phänotypischen Veränderung der glomerulären Mesangiumzellen führt. Mesangiumzellen wurden dazu aus den hSK2 tg-Mäuse isoliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass hSK2 und mSK2 in den transgenen Zellen hauptsächlich in der zytosolischen Fraktion lokalisiert sind, während S1P ausschließlich im Kern akkumulierte. Weiterhin konnte eine verminderte Proliferation unter normalen Wachstumsbedingungen der hSK2 tg-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen beobachtet werden. Die Zellen reagierten auch sensitiver auf Stress-induzierte Apoptose. Auf molekularer Ebene konnte dies durch eine reduzierte ERK- und Akt/PKB-Aktivierung erklärt werden. Nach Staurosporin-Behandlung wurde Apoptose durch den intrinsischen, mitochondrialen Apoptosesignalweg induziert. Dabei konnte eine reduzierte anti-apoptotische Bcl-xL-Expression und vermehrte Prozessierung von Caspase-9 und Caspase-3 und PARP beobachtet werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine verminderte tubulointerstitielle Fibrose-Entstehung durch die Deletion der SK2, sowie anti-proliferative und Apoptose-induzierende Effekte durch die SK2 in Mesangiumzellen nachgewiesen werden konnten. Somit könnten SK2-Inhibitoren die Entstehung tubulointerstitieller Fibrose und mit Proliferation assoziierte Erkrankungen wie mesangioproliferative Glomerulonephritis positiv beeinflussen.
Spatio-temporal dynamics of primary lymphoid follicles during organogenesis and lymphneogenesis
(2007)
Primary lymphoid follicles are structures which are important for adaptive immune responses in mammals. Within the follicles follicular dendritic cells (FDC) are maintained by constant stimuli provided by B cells. It is thought that the FDC are important for immune response. It is of interest to know how lymphoid follicles are regulated in order to understand their role in various autoimmune diseases in which these follicles are created ectopically. With the help of a tissue simulation relying on an agent-based cell model on top of a regular triangulation various scenarios suggested by the available experimental data have been investigated. In order to cope with the complexity in the simulation of immune tissue the regular triangulation has been implemented for the use on parallel computers. The algorithms for kinetic and dynamic regular triangulation have been created newly. Also the cell model underlying the simulation has been designed newly in many aspects. The simulations allowed to identify common factors that regulate the formation of lymphoid follicles normally during organogenesis in development and lymphneogenesis in the course of diseases. The generation of FDC from local stromal populations under the influence of B cell aggregates is shown to be possible with the given experimental parameters. The sequence of the organogenesis and lymphneogenesis can be described with regard to the morphology of the B and T zone. Tests for the stability of the primary lymphoid follicle system constraints the regulation of the B cell efflux. The required lymphatic vessels around the lymphoid follicle are shown to be negatively correlated with the FDC network. Moreover it is shown that the adjacent T zone consisting of its own stromal population and T cells has similar regulation principles. This easily explains the intermediate ring of B cells found around the T zone during development and certain signaling molecule deficiencies. A major result of this thesis is that the generation of FDC needs negative regulation while a number of other possible mechanisms is incompatible with the available experimental data. Moreover the observed microanatomy was brought into a functional relationship with data on the cellular level finally culminating in the proposal of new experiments that shed light on the dynamics of the primary lymphoid follicle. One conclusion is that the FDC directly or indirectly influence the angiogenesis and lymphangiogenesis processes in secondary lymphoid tissues. The work presented here may help to guide experiments with the help of computers in order to reduce the amount of experiments and design them in a way to maximize the amount of information about biological systems.
P2X receptors represent the third superfamily of ligand gated ion channels with ATP as their natural ligand. Most of the mammalian P2X receptors are non-selective cation channels, which upon activation, mediate membrane depolarization and have physiological roles ranging from fast excitatory synaptic transmission, modulation of pain-sensation, LTP to apoptosis etc. In spite of them being an attractive drug target, their potential as a drug target is limited by the lack of basic understanding of the structure-function relationship of these receptors. In my thesis, I have investigated the behavior of homomeric P2X receptor subunits with the help of photolabeling and fluorescence techniques coupled to electrophysiological measurements using Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. Concurrent photolabeling by BzATP and current recordings from the same set of receptors in real time has revealed that the gating process in homomeric P2X receptors is contributed individually by each subunit in an additive manner. Our study for the first time describes the agonist potency of Alexa-ATP (a fluorescent ATP analog) on P2X1 receptors. The use of Alexa-ATP in our experiments elucidated that receptor subunits are not independent but interacting with each other in a cooperative manner. The type of cooperativity, however, depended on the type and concentrations of allosteric/competing ligands. Based on our results, in my thesis we propose an allosteric model for ligand-receptor interactions in P2X receptors. When simulated, the model could replicate our experimental findings thus, further validating our model. Further, correlation between occupancy of P2X1 receptors (determined using binding curve for Alexa-ATP) with the steady-state desensitization suggests that binding of three agonist molecules per receptor are required to desensitize P2X1 receptors. We further extended the approach of fluorescence with electrophysiological measurement to assign the role for different domains in P2X1 receptors with the help of environmental sensitive, cysteine reactive fluorophore (TMRM). Cysteine rich domain-1 of P2X1 receptors (C117-C165) was found to be involved in structural rearrangements after agonist and antagonist binding. In contrast to the present understanding, that the binding of an antagonist cannot induce desensitization in P2X1 receptors and the receptors need to open first before undergoing desensitization, we propose based on our results that a competitive antagonist can also induce desensitization in P2X1 receptors by bypassing the open state. We have attempted to answer few intriguing questions in the field of P2X receptor research and we think that our answers provide many avenues to the basic understanding of functioning of P2X receptors.
In contrast to the class A heat stress transcription factors (Hsfs) of plants, a considerable number of Hsfs assigned to classes B and C have no evident function as transcription activators on their own. In the course of my PhD work I showed that tomato HsfB1, a heat stress induced member of class B Hsf family, is a novel type of transcriptional coactivator in plants. Together with class A Hsfs, e.g. tomato HsfA1, it plays an important role in efficient transcrition initiation during heat stress by forming a type of enhanceosome on fragments of Hsp promoter. Characterization of promoter architecture of hsp promoters led to the identification of novel, complex heat stress element (HSE) clusters, which are required for optimal synergistic interactions of HsfA1 and HsfB1. In addition, HsfB1 showed synergistic activation of the expression of a subset of viral and house keeping promoters. CaMV35S promoter, the most widely expressed constitutive promoter turned out to be the the most interesting candidate to study this effect in detail. Because, for most house-keeping promoters tested during this study, the activators responsible for constitutive expression are not known, but in case of CaMV35S promoter they are quite well known (the bZip proteins, TGA1/2). These proteins belong to the acidic activators, similar to class A Hsfs. Actually, on heat stress inducible promoters HsfA1 or other class A Hsfs are the synergistic partners of HsfB1, whereas on house-keeping or viral promoters, HsfB1 shows synergistic transcriptional activation in cooperation with the promoter specific acidic activators, e.g. with TGA proteins on 35S promoter. In agreement with this the binding sites for HsfB1 were identified in both house-keeping and 35S promoter. It has been suggested during this study that HsfB1 acts in the maintenance of transcription of a sub-set of house-keeping and viral genes during heat stress. The coactivator function of HsfB1 depends on a single lysine residue in the GRGK motif in its CTD. Since, this motif is highly conserved among histones as the acetylation motif, especially in histones H2A and H4,. It was suggested that the GRGK motif acts as a recruitment motif, and together with the other acidic activator is responsible for corecruitment of a histone acetyl transferase (HAT). So, the effect of mammalian CBP (a well known HAT) and its plant orthologs (HAC1) was tested on the stimulation of synergistic reporter gene activation obtained with HsfA1 and HsfB1. Both in plant and mammalian cells, CBP/HAC1 further stimulated the HsfA1/B1 synergistic effect. Corecruitment of HAC1 was proven by in vitro pull down assays, where the NTD of HAC1 interacted specifically both with HsfA1 and HsfB1. Formation of a ternary complex between HsfA1, HsfB1 and CBP/HAC1 was shown via coimmunoprecipitation and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). In conclusion, the work presented in my thesis presents a new model for transcriptional regulation during an ongoing heat stress.
In an attempt to search for potential candidate molecules involved in the pathogenesis of endometriosis, a novel 2910 bp cDNA encoding a putative 411 amino acid protein, shrew-1 was discovered. By computational analysis it was predicted to be an integral membrane protein with an outside-in transmembrane domain but no homology with any known protein or domain could be identified. Antibodies raised against the putative open-reading frame peptide of shrew-1 labelled a protein of ca. 48 kDa in extracts of shrew-1 mRNA positive tissues and also detected ectopically expressed shrew-1. In the course of my PhD work, I confirmed the prediction that shrew-1 is indeed a transmembrane protein, by expressing epitope-tagged shrew-1 in epithelial cells and analysing the transfected cells by surface biotinylation and immunoblots. Additionally, I could show that shrew-1 is able to target to E-cadherin-mediated adherens junctions and interacts with the E-cadherin-catenin complex in polarised MCF7 and MDCK cells, but not with the N-cadherin-catenin complex in non-polarised epithelial cells. A direct interaction of shrew-1 with beta-catenin could be shown in an in vitro pull-down assay. From this data, it could be assumed that shrew-1 might play a role in the function and/or regulation of the dynamics of E-cadherin-mediated junctional complexes. In the next part of my thesis, I showed that stable overexpression of shrew-1 in normal MDCK cells. causes changes in morphology of the cells and turns them invasive. Furthermore, transcription by ²-catenin was activated in these MDCK cells stably overexpressing shrew-1. It was probably the imbalance of shrew-1 protein at the adherens junctions that led to the misregulation of adherens junctions associated proteins, i.e. E-cadherin and beta-catenin. Caveolin-1 is another integral membrane protein that forms complexes with Ecadherin- beta-catenin complexes and also plays a role in the endocytosis of E-cadherin during junctional disruption. By immunofluorescence and biochemical studies, caveolin-1 was identified as another interacting partner of shrew-1. However, the functional relevance of this interaction is still not clear. In conclusion, it can be said that shrew-1 interacts with the key players of invasion and metastasis, E-cadherin and caveolin-1, suggesting its possible role in these processes and making it an interesting candidate to unravel other unknown mechanisms involved in the complex process of invasion.
Lysosomes are major degradative organelles that contain enzymes capable of breaking down proteins, nucleic acids, carbohydrates, and lipids. In the last decade, new discoveries have traced also important roles for lysosomes as signalling hubs, affecting metabolism, autophagy and pathogenic infections. Therefore, maintenance of a healthy lysosome population is of utmost importance to the cell to respond to both stress conditions and also homeostatic signalling. For example, for minor perturbations to the lysosomal membrane, the cell activates repair processes which seal membrane nicks. For more extensive damage, autophagy is activated to remove damaged organelles from the cell. on the other hand, during pathogen invasion host cells have also evolved mechanisms to hijack the endolysosomal pathway to facilitate their own growth and replication in host cells.
The first part of the thesis work focuses on a lysosomal regeneration program which is activated under conditions where the entire lysosomal pool of the cell is damaged. Upon extensive membrane damage induced by the lysosomotropic drug LLOMe, the cell activates a regeneration pathway which helps in the formation of new functional lysosomes by recycling damaged membranes. I have identified the molecules important for this novel pathway of lysosomal regeneration and showed how the protein TBC1D15 orchestrates this process to regenerate functional organelles from completely damaged membrane masses in the first 2 hours following lysosomal membrane damage. This process resembles the process of auto- lysosomal reformation (ALR)- involving the formation of lysosomal tubules which are extended along microtubules and cleaved in a dynamin2 dependent manner to form proto-lysosomes which develop into fully functional mature lysosomes. These lysosomal tubules are closely associated with ATG8 positive autophagosomal membranes and require ATG8 proteins to bind to the lysophagy receptor LIMP2 on damaged membranes. This process is physiologically important under conditions of crystal nephropathy where calcium oxalate crystals induce damage to lysosomal membranes in nephrons in kidney disease.
The second part of the thesis shows how the endolysosomal system of the cell is hijacked by the bacteriaLegionella pneumophila. During Legionella infection the formation of conventional ATG8 positive autophagosomes are blocked due to the protease activity of the bacterial effector protein RavZ which cleaves lipidated ATG8 proteins from autophagosomal membranes. The SidE effectors of Legionella modify STX17 and SNAP29 by the process of non-canonical ubiquitination called phosphoribose-linked serine ubiquitination (PR-Ub). These proteins are essential for the formation of the autophagosomal SNARE complex which is used for fusion of the autophagosome with the lysosome. Upon Legionella infection, PR-UB of STX17 aids in formation of autophagosome-like replication vacuoles. ThesevacuolesdonotfusewiththelysosomebecauseSNAP29isalsoPR-Ubmodified. PR-UbofSTX17 and SNAP29 sterically blocks the formation of the autophagosomal-SNARE complex thereby preventing fusion of the autophagosome with the lysosome. As a result, Legionella can replicate in autophagosome- like vacuoles which do not undergo lysosomal degradation. In absence of PR-Ub modified STX17, bacterial replication is compromised when measured by bacterial replication assays in lung epithelial (A549) cells.
Taken together, this thesis highlights two important aspects of the autophagy-lysosomal system- how it responds to extensive membrane damage and its importance in Legionella pneumophila infection. Extensive damage to lysosomal membranes triggers a rapid regeneration process to partially restore lysosomal function before the effects of TFEB dependent lysosomal biogenesis becomes apparent. On the other hand, Legionella pneumophila infection segregates the lysosomes from the rest of the endo-lysosomal system by blocking autophagosome-lysosome fusion. Though lysosomes remain active, they are incapable of degrading pathogens since pathogen containing vacuoles do not fuse with the lysosome.
Die mittelamerikanische Jagdspinne Cupiennius salei Keys. zeigt nach Reizung ventraler Tasthaare auf den proximalen Beingliedern in freier Natur und auch im Labor das relativ einfache, reflektorische Verhalten des „Körperanhebens“. Ziel der vorliegenden Arbeit war, den am Körperanheben maßgeblich beteiligten Coxamuskel c2 hinsichtlich seiner Anatomie, seiner funktionellen Faserzusammensetzung und Innervation sowie seiner Aktivität beim „Körperanheben“ und bei weiteren Bewegungsweisen der Spinne zu untersuchen. (1) Der c2-Muskel liegt im Prosoma der Spinne und setzt für jedes Bein am anterioren Coxarand an. In den 1. - 3. Beinpaaren liegt c2 zweigeteilt (apodemaler und tergaler Anteil), im Hinterbeinpaar dagegen einteilig (nur tergaler Anteil) vor. (2) Histochemische Nachweisreaktionen (Glykogengehalt, relative Succinatdehydrogenase- und relative myofibrilläre Adenosintriphosphatase-Aktivität) ergeben eine heterogene Faserzusammensetzung des c2-Muskels aus 4 Muskelfasertypen (A, B, C, D). Der apodemale c2-Anteil besteht homogen aus A-Fasern. (3) Messungen mit Laserdiffraktometrie zeigen für die A- und B-Fasern signifikant kürzere Sarkomerlängen als für die C- und D-Fasern. (4) Sodium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese weist als Besonderheit für die A- und B-Fasern eine Paramyosin-Isoform P1 (107 kDa), eine Isoform der leichten Ketten des Myosins LC2 (22 kDa) und vermehrt eine Troponin-Isoform T4 (46 kDa) nach. In den Cund D-Fasern kommt allein eine 43-kDa-Bande und vermehrt eine Troponin-Isoform T2 (50 kDa) vor. (5) Der c2-Muskel der Vorder- und Hinterbeine wird durch einen eigenen Nerv innerviert. Retrograde Anfüllungen („Backfills“) des Nervs mit neuronalen Tracern legen eine polyneurale Innervation des c2-Muskels aller Beine dar, höchstwahrscheinlich jeweils durch 6 Motoneurone. Zwei davon sind jeweils positiv GABA (Gamma-Amino-Buttersäure) -immunreaktiv; dies ist ein Hinweis auf eine mögliche inhibitorische Innervation des c2-Muskels. (6) Wie Elektromyogramme freilaufender Spinnen zeigen, besteht das Körperanhebeverhalten aus zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen: einer lokalen c2-Kontraktion im taktil gereizten Bein, die eine Bewegung im zugehörigen Prosoma-Coxa-Gelenk verursacht, und einer durch diese aktive Bewegung hervorgerufenen plurisegmentalen Reaktion im c2 der übrigen 7 Beine. Wird eine Coxa passiv bewegt, kann auch in festgelegten Spinnen eine plurisegmentale Reaktion aller 8 Beine ausgelöst werden. (7) Sowohl bei der lokalen als auch bei der plurisegmentalen Reaktion des „Körperanhebens“ rekrutiert c2 die gleichen neuromuskulären Einheiten. Dies deutet auf die gleiche zentalnervöse Endstrecke beider Reaktionen hin. Die Anzahl der elektrophysiologisch unterscheidbaren neuromuskulären Einheiten stimmt mit der der anatomisch nachgewiesenen Motoneuronen und Fasertypen überein. (8) Der tergale c2-Anteil ist immer, der apodemale Anteil nur bei schnellem Körperanheben, schnellen Laufstarts und bei Schreckreaktionen (Flucht) der Spinne aktiv. Hierbei rekrutiert der apodemale Teil nur zu Beginn der Verhaltensweise schnelle phasische Einheiten. (9) Ich diskutiere bei welchen Bewegungsweisen der Spinne die 4 Fasertypen vermeindlich zum Einsatz kommen, wie sie höchstwahrscheinlich innerviert werden und welche Konsequenzen die c2-Zweiteilung in den vorderen Beinpaaren (1 - 3) auf die Beinbewegung im Verhalten haben könnte. Am wahrscheinlichsten ist eine verstärkte Druckerhöhung zur Beinextension durch schnelle anfängliche Kontraktionen des „apodemalen Hebels“ und eine vektorielle Kräfteaddition der zwei Muskelteile. (10) Anhang II behandelt den internen Gelenkrezeptor R0 im Prosoma-Coxa-Gelenk. Ausschaltversuche weisen R0 als unentbehrlich für das Zustandekommen der plurisegmentalen Reaktion aus. Lage und Anordnung der R0-Sinneszellen sind in den Beinpaaren 1 - 3 und den Hinterbeinen verschieden.
The mammalian family of bears (Ursidae) comprises eight extant species, occurring on four different continents. Among them are the iconic and well-known brown and polar bears, both widely distributed across the Northern hemisphere. Their intraspecific genetic structuring has been extensively investigated, albeit with a focus on genetic markers from maternally inherited parts of their genomes (mitochondrial DNA). The evolutionary relationship and divergence time between brown and polar bears have recently triggered an extensive debate, while less focus has been put on to other parts of the ursid phylogeny, particularly to a clade of three Asian bear species. To date, whole genomes of more than 100 bear individuals from four different species have been sequenced. Yet, one fundamental part of the genome has been largely omitted from specific analyses, in bears as well as in most other mammals: the Y chromosome.
The mammalian Y chromosome provides a unique perspective on the evolutionary history of organisms due to its distinct features, and specifically reflects the patriline because of its male-specific inheritance. The characteristics of this chromosome make it well suited to complement and contrast evolutionary inferences based on other genetic markers, and to uncover processes like sex-biased gene flow and hybridization. The unique insights that can be gained from analyses of Y-linked genetic variation made me utilize this part of the genome to investigate the evolution of male lineages in bears. Studying the patriline is particularly promising in this taxonomic group because of male-biased dispersal and a complex and fast radiation of bears. The analysis of Y-chromosomal genetic markers is thus the common theme of this dissertation: I present the identification of large amounts of Y-chromosomal sequence, the development of male-specific markers from such sequences, and the application of these markers to trace the evolution of male lineages of different bear species.
Specifically, I developed a molecular sex determination system based on the detection of two Y-linked fragments that allows to reliably discriminate between females and males from seven different bear species (Bidon et al. 2013). The approach is highly sensitive, bear-specific, and can be applied in standard molecular laboratories. This makes it valuable in conservation genetics and forensic applications, e.g. to analyze non-invasively collected samples.
Furthermore, I used Y-linked markers in a comprehensive and range-wide sample of brown and polar bears, and show that male-biased gene flow plays an important role in distributing genetic material throughout the ranges of both species (Bidon et al. 2014). In brown bears, I detected a lack of paternal population structuring which is in strong contrast to the detailed structuring of the matriline.
Analyzing Y-chromosomal sequences from all eight bear species, I present a phylogeny of the patriline that largely resembles the topology from other nuclear markers but is different from the topology of the mitochondrial gene tree (Kutschera et al. 2014). This discordance among loci generates interesting hypotheses about inter-species gene flow, particularly among American and Asiatic black bears.
With the identification of almost two million basepairs of Y-chromosomal sequence and the analysis of an unprecedented large male-specific dataset in polar bears, a high-resolution view on the distribution of their intraspecific variation was obtained (Bidon et al. 2015). In particular, two clades that are divergent but do not show pronounced phylogeographic structure were detected, confirming the great dispersal capacity of males of this high arctic species.
This dissertation thus represents a comprehensive investigation of Y-linked genetic variation on the intra- and interspecific level in a non-model organism. With my research, I contribute to an increased understanding of the complex evolutionary history of bears. In particular, I show that male-biased gene flow strongly influences the distribution of nuclear genetic variation, and that the contrast between phylogenies of differentially inherited markers can help to understand interspecific hybridization between closely related species. Moreover, my findings demonstrate the potential of Y-chromosomal markers to uncover unknown evolutionary patterns and processes. This applies not only to bears but to many species, even such that are generally well known and well described.
Wolinella succinogenes reduziert Fumarat mit H2 oder Formiat als Elektronendonor. Der Elektronentransport wird von der membranständigen Hydrogenase oder Formiat-Dehydrogenase und der Fumarat-Reduktase katalysiert. Redoxmediator zwischen beiden Enzymen ist Menachinon. Der Elektronentransport ist mit der Erzeugung eines elektro-chemischen Protonenpotentials (Dp) gekoppelt. Ziel dieser Arbeit war, den Mechanismus der Dp-Entstehung durch Rekonstitution der gekoppelten Fumarat-Atmung in Liposomen aufzuklären. Aus Wolinella succinogenes isolierte Hydrogenase und Fumarat-Reduktase wurden in Liposomen eingebaut, die Menachinon enthielten. Die resultierenden Proteoliposomen kataly-sierten die Reduktion von Fumarat mit H2. Die Wechselzahl der Enzyme im Elektronentrans-port von H2 zu Fumarat war etwa 10 % von der in Bakterien. In den Proteoliposomen waren sowohl Hydrogenase als auch Fumarat-Reduktase ausschließlich nach außen orientiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Proteoliposomen sphärische Vesikel mit einem mittleren Außendurchmesser von 88 nm waren. Die Proteoliposomen enthielten statistisch 8,4 Hydrogenasemoleküle und 72 Fumarat-Reduktasemoleküle. Alle aktiven Enzymmoleküle waren in der Proteoliposomenmembran zufällig verteilt eingebaut und nahmen am Elektronentransport von H2 zu Fumarat teil. Der aus dem Protonenpermeabilitätskoeffizienten (PH = 8,1·10-3 cm·s-1) berechnete unspezifische Protonenfluß über die Proteoliposomenmembran war etwa 20mal langsamer als der durch den Elektronentransport von H2 zu Fumarat katalysierte Protonenfluß. Während der Fumarat-Reduktion mit H2 entstand ein elektrisches Protonenpotential über der Proteoliposomenmembran (Dø = -0,19 V; innen negativ), das die gleiche Richtung und Größe hatte wie das Dø während der Fumarat-Atmung in Zellen von W. succinogenes. Der H /e--Quotient für die Fumarat-Reduktion mit H2 war in Proteoliposomen in Gegenwart von Valinomycin und externem K etwa 1. Das gleiche Dø und der gleiche H /e--Quotient waren mit der Reduktion von 2,3-Dimethyl-1,4-naphthochinon (DMN) durch H2 verbunden, wenn die Proteoliposomen Menachinon und Hydrogenase mit oder ohne Fumarat-Reduktase enthielten. Proteoliposomen, die Menachinon und Fumarat-Reduktase mit oder ohne Hydrogenase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat durch DMNH2, die aber nicht mit der Entstehung von Dp gekoppelt war. Proteoliposomen, die Formiat-Dehydrogenase, Menachinon und Fumarat-Reduktase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat oder DMN durch Formiat. Beide Reaktionen erzeugten über der Proteoliposomenmembran ein Dø von -0,13 V (innen negativ). Der H /e--Quotient der Formiat-Oxidation durch Menachinon oder DMN war nahezu 1. Die Entstehung von Dø war von der Art des in die Proteoliposomen eingebauten Chinons abhängig. Während der Reduktion von DMN durch H2 entstand ein Dø, wenn die Proteoliposomenmembran Menachinon, Vitamin K2 oder das aus W. succinogenes isolierte Methylmenachinon enthielt. Proteoliposomen ohne Chinon oder mit Vitamin K1 erzeugten kein Dø während der DMN-Reduktion mit H2. Die Fumarat-Atmung mit H2 war nur in Gegenwart von Menachinon oder Vitamin K2 mit der Entstehung von Dø gekoppelt. In dieser Arbeit wurde erstmals die gekoppelte Fumarat-Atmung mit aus W. succinongenes isolierten Elektronentransportenzymen in Lipsomen rekonstituiert. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass das durch die Fumarat-Atmung erzeugt Dp ausschließlich durch die Menachinon-Reduktion mit H2 oder Formiat entsteht, während die Menachinol-Oxidation mit Fumarat ein elektroneutraler Prozeß ist.
Anthropogene Landnutzung in ariden Savannen verändert die strukturelle Diversität der Vegetation und bedroht damit die Artenvielfalt der Flora und Fauna von etwa 20% der Landoberfläche der Erde. Ziel meiner Dissertation war es, den Einfluss von Landnutzung auf die Abundanz und Diversität von Kleinkarnivoren und ihrer Beutetiere zu untersuchen. Dabei sollten Bioindikatoren identifiziert werden, die eine Einschätzung der Diversität im Farmmosaik der südlichen Kalahari ermöglichen. Entlang eines Weideintensitätsgradienten analysierte ich mit Hilfe freilandökologischer Methoden die komplexen Zusammenhänge zwischen Beweidungsintensität, struktureller Diversität der Vegetation, Beuteverfügbarkeit und Diversität von Kleinkarnivoren. Nach den Ergebnissen dieser Studie in der südlichen Kalahari kann ich folgende Aussagen über die anthropogene Störung der Integrität von ariden Savannensystemen durch Beweidung treffen: 1. Eine Steigerung der Bestockungsdichten von Weidetieren führte zu drastischen Veränderungen der Zusammensetzung und strukturellen Diversität der Vegetation. Dabei sank mit zunehmendem Beweidungsdruck der Anteil an Gräsern an der Vegetationsbedeckung bei gleichzeitigem Anstieg der Strauchvegetation. Die Heterogenität des Habitats, gemessen in Anzahl von Strauchpatches (ø>4m) pro Hektar, zeigte einen unimodalen Verlauf bei steigender Strauchbedeckung und damit bei steigender Weideintensität. Maximale Habitatheterogenität wurde bei einer Strauchbedeckung von ca. 20% festgestellt. 2. Die beobachteten Veränderungen der Vegetation wirkten sich sowohl auf Tierarten aus, die sich direkt von pflanzlicher Kost ernähren als auch auf solche am Ende einer Nahrungskette: Die Effekte zunehmender Strauchbedeckung (und damit steigender Beweidungsintensität) auf die relative Häufigkeit der wichtigsten Beutetiere von Kleinkarnivoren unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen. Es bestand eine lineare negative Korrelation für Orthopteren, während unimodale Antwortmuster für Käfer mit maximaler Abundanz bei einer Strauchbedeckung von ca. 15% und für Nagetiere bei ca. 12,5% festgestellt wurden, wohingegen keine Korrelation für Termiten ermittelt werden konnte. 3. Am Beispiel der Nagetiergemeinschaft konnte die wesentliche Bedeutung der räumlichen Skala für das Auflösungsvermögen von Abundanz- und Diversitätsmuster gezeigt werden. Ihre Muster und damit die Auswirkungen von Beweidung wurden ausschließlich auf einer großen räumlichen Skala (250ha) identifiziert, nicht jedoch auf der Skala des mittleren Aktionsraums (1ha). Ein wichtiges Fazit dieser Ergebnisse ist, dass zuerst diejenige räumliche Skala identifiziert werden muss, auf der ein Organismus mit Habitatstrukturen (Z.B. geeigneten Nahrungsplätzen) interagiert, um die Effekte von Veränderungen der strukturellen Zusammensetzung von Habitaten verstehen zu können. Dabei führte steigende Grasbedeckung zu einer exponentiellen Sättigung der Gesamtabundanz sowie der Diversität der Nagetiere. Dagegen wurde bei Zunahme der Strauchbedeckung ein unimodales Muster für Gesamtabundanz und Diversität festgestellt. 4. Obwohl ein hoher Strauchanteil sich durchgehend negativ auf die Beuteverfügbarkeit auswirkte, haben Sträucher eine besondere Bedeutung für die Artenvielfalt in diesem Lebensraum, da sie als Schutz- und Nistplatz wichtige Funktionen erfüllen. Am Beispiel von Fuchsmangusten (Cynictis penicillata) konnte ich exemplarisch die zentralen Funktionen von Sträuchern und ihren Einfluss auf den Reproduktionserfolg dieser Art zeigen. Interessanterweise waren die Auswirkungen von Sträuchern inkonsistent für unterschiedliche räumliche Skalen. Im Mikrohabitat haben Strauchstrukturen positive Eigenschaften (Schutzfunktionen). Fuchsmangusten legten ihre Bauten meistens unter Sträuchern an, um ein Einstürzen durch Huftrampeln zu verhindern und ihr Prädationsrisiko durch Greifvögel zu reduzieren. Für die Anlage ihrer Reproduktionsbauten wählten sie Strauchstrukturen mit einem Durchmesser von mindestens sechs Metern (bevorzugt der Art Acacia hebeclada) und außerdem, wenn sich im Umkreis von 10 Metern kein weiterer Strauchpatch befand. Auf einer größeren räumlichen Skala (im Umfeld von einem Hektar um Reproduktionsbauten) wurden Flächen mit einer Strauchbedeckung präferiert, die geringer war, als zufällige Flächen im Habitat. Dabei wirkte sich zunehmende Strauchbedeckung auch negativ auf die Gruppengröße und den Reproduktionserfolg dieser Art aus. Für eine erfolgreiche Reproduktion bei Fuchsmangusten scheint die Strauchbedeckung im Umfeld von einem Hektar um die Reproduktionsbauten einen Schwellenwert zwischen 10 und 15% nicht überschreiten zu dürfen. Dies ist mit der sinkenden Beuteverfügbarkeit (Nagetiere und Arthropoden) bei zunehmender Strauchbedeckung zu begründen. 5. Aufgrund der dramatischen Auswirkungen von Verbuschung auf die Beuteverfügbarkeit von Kleinkarnivoren unterschieden sich die Abundanzen der einzelnen Kleinkarnivoren deutlich zwischen diesen Farmen. Die Abundanz der jeweiligen Einzelarten konnte über Regressionsmodelle mit Vegetationsparameter oder Beutetierverfügbarkeit erklärt werden. Im Gegensatz dazu war die Strauchbedeckung die beste erklärende Variable für Gesamtabundanz und Diversität der Gilde. Sie integriert habitatspezifische Eigenschaften, wie die Verfügbarkeit von vier Beutetiergruppen, die Konnektivität von Nahrungspatches mit hoher Qualität, das Prädationsrisiko durch Greifvögel sowie das Nistplatzangebot. Dabei sank mit zunehmender Strauchbedeckung die Gesamtabundanz, während für die Diversität ein unimodales Muster mit maximaler Diversität bei einer Strauchbedeckung von ca. 12,5% festgestellt wurde. Für eine Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren eignet sich die Ginsterkatze (Genetta genetta) als Indikatorart. Interessanterweise war die Strauchbedeckung ein noch besserer Bioindikator für die Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren. 6. Die Schlussfolgerung meiner Ergebnisse ist, dass die Diversität der Kleinkarnivoren einen Großteil der Biodiversität der Untersuchungsflächen in der südlichen Kalahari widerspiegelt. Dabei integriert die Kleinkarnivorengilde als Indikatorvariable neben der zoologischen Diversität (i) auch die strukturelle Diversität der Vegetation (ii) sowie die strukturelle Organisation im Nahrungsnetz (iii). Kleinkarnivoren erhalten dadurch einen Status einer Indikatorgilde und eignen sich damit sehr gut zur Beurteilung der südlichen Kalahari oder einer anderen Weidelandschaft arider Savannen. 7. Das für den Naturschutz wichtigste Ergebnis meiner Arbeit ist, dass höchste Diversität aller Untersuchungsorganismen bei einer Strauchbedeckung zwischen 10 und 15%, also einer mittleren Beweidungsintensität von ca. 3,5 LSU/ l00ha, festgestellt wurde. Daher wirken sich mäßige Bestockungsdichten durchaus positiv auf die Diversität aus, während eine Überbeweidung einen dramatischen Rückgang der Artenvielfalt in diesem Lebensraum verursacht.
Carotinoide sind Pigmente, die in Pflanzen, Algen, einigen Pilzen und Bakterien vorkommen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Photosynthese durch Absorption von Licht und beim Lichtschutz. Sie sind verantwortlich für die braunen, roten, orangen und gelben Farben von Obst, Gemüse, Herbstblättern und die Farbe einiger Blumen und Algen. Tiere können keine Carotinoide synthetisieren, daher ist ihre Anwesenheit auf die Nahrungsaufnahme zurückzuführen. Carotinoide sind Tetraterpenoide (40C), die aus Isoprenoidmolekülen (5C) synthetisiert werden. Der Methylerythritol-phosphatweg ist der Carotinoid-Vorläuferweg, der die Isoprenoideinheiten bildet. Carotinoide haben aufgrund ihrer gesundheitlichen Vorteile das Interesse der Nutrazeutika-Industrie geweckt.
Fucoxanthin ist ein Carotinoid, das nur in Kieselalgen, Braunalgen, Haptophyten und einigen Dinoflagellaten vorkommt. Aufgrund seiner Vorteile zur Vorbeugung von Krebs, kognitiven Erkrankungen und Fettleibigkeit sowie seiner antioxidativen Eigenschaften ist Fucoxanthin ein sehr interessantes Molekül fur die Nutrazeutikabranche.
Fucoxanthin hat eine komplexe chemische Struktur mit einer Allenbindung und einer Epoxyketogruppe. Daher wäre seine chemische Synthese kompliziert, da es auch eine stereokontrollierte Synthese erfordert86. Aus diesem Grund ist die Extraktion aus Makroalgen oder Mikroalgen die Methode der Wahl für die kommerzielle Herstellung von Fucoxanthin.
In dieser Arbeit bestand das Ziel darin, die Fucoxanthin-Produktivität in Kieselalgen mit gentechnischen Methoden zu steigern, damit die Zellen mehr Fucoxanthin produzieren. Zu diesem Zweck wurde der Effekt der Insertion zusätzlicher Kopien von Genen in das Genom untersucht, die für geschwindigkeitsbestimmende oder Schlüsselenzyme im Carotinoid- und MEP-Weg kodieren.
Zu Beginn wurden diese Effekte bei einzelnen Mutanten beobachtet. Letztendlich ist es jedoch das Ziel, eine Mutante zu erzeugen, die mehrere geschwindigkeitsbestimmende Enzyme überexprimiert, um auf diese Weise Engpässe zu vermeiden. In früheren Studien erreichten Eilers et al.54 durch die einmalige Überexpression der psy- und dxs-Gene in der Kieselalge P. tricornutum einen 2.4- und 1.8-fachen Anstieg der Fucoxanthin-Spiegel.
In dieser Arbeit führte die Insertion zusätzlicher Kopien der Gene idi und pds2 nicht dazu, dass die Zellen mehr Fucoxanthin produzieren. Im Gegensatz dazu erreichten die Mutanten mit zusätzlichen Kopien der Gen ggpps und mit zusätzlichen Kopien sowohl von psy als auch von dxs seine um 28% bzw. 10% höhere Fucoxanthin-Produktivität pro Million Zellen. Bei diesen Mutanten ist die Gesamtproduktivität jedoch geringer als beim Wildtyp, da ihr Wachstum langsamer als beim Wildtyp ist.
Unter Berücksichtigung der besten Zielgene wurden Mutanten erzeugt, die gleichzeitig zusätzliche Kopien von psy, dxs und ggpps enthielten. Die Mutanten hatten unter sehr niedriegen Lichtbedingungen eine um bis zu 61% höhere Produktivität pro Million Zellen als der Wildtyp. Ausnahmsweise wurden diese Mutanten bei sehr schwachem Licht (10 µE m-2 s-1) gezüchtet, da sie sehr gestresst waren und als Zellklumpen wuchsen. Obwohl die Gesamt-Fucoxanthin-Spiegel in diesen Mutanten unter diesen Bedingungen höher sind als im Wildtyp, sind sie daher niedriger als die Fucoxanthin-Spiegel bei den in anderen Experimenten verwendeten Lichtbedingungen (50 µE m-2 s-1). Als Ergebnis dieser Experimente kann gesagt werden, dass die Belastung der Zellen nach den genetischen Veränderungen untersucht werden muss, da dies zu einer Abnahme der Biomasse und folglich zu einer Abnahme der Fucoxanthinproduktion führt. Alternativ könnte auch eine 2-Stufen-Kultur etabliert werden, in der in einem ersten Schritt eine hohe Biomasse erreicht wird und im zweiten Schritt die Expression der interessierenden Gene induziert wird.
Aufgrund der antioxidativen Eigenschaften von Carotinoiden besteht eine übliche Strategie zur Akkumulation von Carotinoiden darin, die Zellen unter oxidative Stressbedingungen zu setzen. Diese Strategie ist jedoch nicht wirksam für die Anreicherung von Fucoxanthin unter hohen Salzkonzentrationen oder hohen Lichtbedingungen. Bessere Versuchspläne könnten jedoch eine 2-Stufen-Kultur oder adaptive Laborbedingungen gewesen sein.
Eine andere mögliche Strategie zur Erhöhung des Fucoxanthinspiegels wäre die Durchführung einer zufälligen Mutagenese der Zellen. Auf diese Weise sind keine Vorkenntnisse über den Carotinoidsyntheseweg und seine Regulation erforderlich und es kann zu Veränderungen in Genen führen, die keine offensichtlichen Ziele sind.
Experimente mit zufälliger Mutagenese erfordern ein Hochdurchsatz-Screeningsystem, da Hunderte oder sogar Tausende von Mutanten erhalten werden. Eine mögliche Strategie, um die Kultivierung der hohen Anzahl von Mutanten zu vereinfachen, ist die Einkapselung dieser Mutanten in Alginatkügelchen. Auf diese Weise können alle Mutanten in demselben Gefäß kultiviert werden. Die eingekapselten Zellen können dann beispielsweise mit einem Durchflusszytometer auf große Partikel durch Fluoreszenz- oder Absorptionsmessungen gescreent werden.
...
Eine in vivo Modifizierung von Blutstammzellen wäre für eine Reihe gentherapeutischer Therapieansätze vorteilhaft. Dies würde voraussetzen, dass retrovirale Vektoren gezielt auf Blutstammzellen ausgerichtet werden können. Für dieses sogenannte Zelltargeting bietet sich das vom Milznekrose-Virus von Vögeln (SNV) abgeleitete Vektorsystem an, bei dem die Rezeptorbindungsdomäne des Env-Proteins modifiziert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein SNV-basierter retroviraler Zelltargeting-Vektor entwickelt werden, der einen selektiven Gentransfer in die primären humanen CD34-positiven hämatopoetischen Zellen ermöglicht. Zur weitergehenden Charakterisierung des SNV-Vektorsystems sollte geklärt werden, ob das Env-Protein des SNV ein mit anderen gamma-retroviralen Env-Proteinen vergleichbares R-Peptid aufweist, dessen mögliche Rolle bei viralem Zelleintritt ebenfalls untersucht werden sollte. Um eine Zielzell-Spezifität des SNV-Vektors zu erreichen, wurde die gesamte SU-Domäne des SNV-Env-Proteins mit einem einkettigen Antikörperfragment (scFv) ersetzt, das gegen das CD34 Molekül gerichtet ist,. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [(antiCD34-TM)SNV]-Vektorpartikel herzustellen, die spezifisch CD34-positive Zellen transduzierten. Essentiell für die Erzeugung solcher Vektoren war die Etablierung einer stabilen Verpackungszelllinie, die Vektorpartikel mit einem Titer von 2x105 i.E./ml produzierte. In Transduktionsexperimenten mit verschiedenen Zelllinien wurde gezeigt, dass [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren eine deutliche Präferenz für CD34+-Zellen und nicht für CD34--Zellen besitzen, wobei der Unterschied in der Transduktionseffizienz zwischen CD34-positiven und –negativen Zellen um den Faktor 100 lag. [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren waren in der Lage, den Reportergentransfer auch in primäre humane Stammzellen zu bewirken. Hierzu wurde ein Transduktionsprotokoll so optimiert, dass die aus dem Nabelschnurblut isolierten CD34+-Zellen transduziert werden konnten. Der für diese Zielzellen bestimmte Vektortiter betrug bis zu 2x106 i.E./ml. In einem Gemisch von primären CD34+- und CD34--Zellen konnte der Vektor zwischen dem Target- und Nontarget-Zellen unterscheiden. Somit wurde zum ersten Mal nicht nur Spezifität, sondern auch Selektivität des SNV-Vektorsystems demonstriert. Dieses Ergebnis ist für eine Weiterentwicklung des Vektors für die in vivo Anwendung in Rahmen einer Gentherapie eine wichtige Voraussetzungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Fusionsvorgang bei Virus-Eintritt näher untersucht. Anlass dafür war die experimentelle Beobachtung, dass das Env-Protein des SNV bei der Virusknospung von einer viralen Protease innerhalb der zytoplasmatischen Domäne proteolytisch gespalten wird. Ein Sequenz-Vergleich des SNV TM-Proteins mit dem MLV TM-Protein ergab Hinweise darauf, dass es sich um die Abspaltung des sogenannten R-Peptides analog zu MLV handeln könnte. Die Expression von SNV-Env- Mutanten mit einem entsprechend verkürzten C-Tail (Env delta R) führte zur Synzytien-Bildung. Die bildung hochfusogener Oberflächenhüllproteine durch die Abspaltung des R-Peptids konnte auch für andere gamma-Retroviren gezeigt werden. Die Synzytienbildung konnte quantitativ unter den Env delta R-Varianten verschiedener gamma-Retroviren in einem etablierten Fusionsassay verglichen werden. Das Env delta R des endogenen Retrovirus des Schweins (PERV) des Typs A erwies sich als potentestes Fusionsagens. Als Folge der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde postuliert, dass die Abspaltung des R-Peptides ein allgemeiner Mechanismus bei der Partikelreifung der gamma-Retroviren ist und eine fusionsregulierende Rolle besitzt. Eine Weiterentwicklung fusionsaktiver Env-Varianten als mögliche therapeutische Gene für eine Tumor-Gentherapie ist somit diskutierbar.
Get3 in Arabidopsis
(2021)
Der guided entry of tail-anchored proteins (GET) Biogenese-Weg vermittelt den Transport und die Insertion von tail-anchor (TA) Proteinen in die Doppellipidschicht des Endoplasmatischen Retikulums (ER). TA Proteine sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Transmembran Domäne (TMD) in den letzten 50 Aminosäuren ihrer Sequenz beherbergen. Diese TMD enthält die notwendigen Informationen, mit denen die Proteine an ihren jeweiligen subzellulären Zielort transportiert werden können. TA Proteine erfüllen eine Vielzahl von essentiellen biologischen Prozessen, sie fungieren zum Beispiel als Rezeptoren, sind maßgeblich an der Fusion von Vesikeln beteiligt sowie an der Initiation von Apoptose. Durch ihren modularen Aufbau können TA Proteine nicht mit dem Signalerkennungspartikel interagieren und müssen deshalb posttranslational zum ER geleitet werden. Im Modellorganismus Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) ist der GET Biogenese-Weg am besten beschrieben und läuft wie folgt ab: Nach der Termination der Translation bindet das Protein SgtA das TA Protein und händigt es über den Adapter-Komplex, bestehend aus Get4 und Get5, an die zytosolische ATPase Get3 aus. Get3 ist der zentrale Zielsteuerungsfaktor des GET Biogenese-Weges. Sobald sich ein Komplex aus Zeilsteuerungsfaktor und TA Protein gebildet hat, wird dieses zur Membran des ERs überführt. Dort wird das TA Protein an den Rezeptorkomplex bestehend aus Get1 und Get2 übergeben, welcher anschließend die Insertion des TA Proteins in die Doppellipidschicht des ERs initiiert.
Get3 hat im zellulären Kontext noch eine weitere Funktion. Unter oxidativem Stress oder Energie depletierenden Bedingungen wird Get3 zu spezifischen Foci rekrutiert, an denen sich noch weitere durch Stress -induzierbare Proteine, wie z.B. die der Familie der Hitze Stress Proteine (HSPs) versammeln. Analysen haben gezeigt, dass Get3 unter den oben genannten Bedingungen, Konformationsänderungen durchläuft und dann als ATP unabhängige Holdase fungiert. Diese kann die exponierten, hydrophoben Anteile von Proteinen binden, um dadurch die Proteostasis aufrechtzuhalten.
Durch die Bedeutsamkeit der TA Proteinen ist die zentrale ATPase Get3 in allen Domänen des Lebens hochgradig konserviert. Phylogenetische Analysen ergaben, dass sich Get3 im Allgemeinen in eine „A“ Gruppe sowie eine „BC“ Gruppe aufspaltet. Im Modellorganismus Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) wurden drei Orthologe zu Get3 identifiziert. Eins davon gehört zu der „A“ Gruppe und befindet sich im Zytoplasma. Die anderen zwei Orthologe befinden sich in den Organellen endo-symbiotischen Ursprungs und gehören der „BC“ Gruppe an. Untersuchungen an verschiedenen Deletionsmutanten in A. thaliana haben gezeigt, dass die Mutationen einzelner GET Komponenten zu einer signifikanten Verkürzung der Haarwurzeln führen, obwohl der restliche Habitus der Pflanze unverändert bleibt. Diesbezüglich wurde SYP123 als einziges TA Proteine identifiziert, dessen Abundanz durch die Deletion von GET Komponenten beeinflusst werden kann. Von den anderen beiden Orthologen organellären Ursprungs ist, abgesehen von ihrer Lokalisation nichts weiter bekannt
Vier Orthologe Gruppen in Pflanzen
Da bislang nicht mehr als zehn Pflanzenarten für phylogenetische Analysen herangezogen wurden, wurden in dieser Arbeit die taxonomischen Beziehungen von Get3 zu einander in 50 Spezies der Viridiplantae auf Basis der Orthologie sowie Homologie untersucht. Dies führte zur Identifizierung einer zytolischen (AtGet3a), einer plastidären (AtGet3b), einer mitochondriellen (AtGet3c) sowie einer Monokotyledone spezifischen Gruppe (SBGet3). Die Lokalisation der ersten drei Gruppen wurde in selektierten Pflanzen, sowohl homolog als auch heterolog, der unterschiedlichen Spezies mittels saGFP untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass mehrere Get3 Orthologe mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen eine unter Pflanze häufig auftretende Eigenschaft ist. Das Weitern konnte gezeigt werden, dass manche Komponenten des Präzielsteuerungskomplexes (SgtA und Get4) sowie des Rezeptorkomplexes (Get1) in fast allen der 50 untersuchten Pflanzenarten vorhanden sind. Dies weist auf eine Konservierung des gesamten GET Biogenese-Weges in Pflanzen hin.
Get3a in Arabidopsis thaliana
Da die molekulare Zusammensetzung des Präzielsteuerungskomplexes für AtGet3a in A. thaliana nicht bekannt ist, habe ich Co-Immunpräzipitationen mit Zellextrakten aus weißer Zellkultur und einen von mir selbst aufgereinigten Antikörper gegen AtGet3a durchgeführt. Nach anschließender Gelelektrophorese und einer Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue ließ sich ein reproduzierbares Muster aus Proteinbanden erkennen, welche ausgeschnitten und mittels LC-MS/MS analysiert wurden. Dadurch wurde ein putativer Kandidat für Get5 identifiziert sowie eine Assoziation mit Chaperonen und proteasomalen Untereinheiten.
Um die Zielsteuerungseffizienz und Topologie von ER-Membranproteinen zu analysieren habe ich (i) die rekombinante Synthese eines Modell-TA Proteins mit glykosylierbarem opsin bovine glycosylation Tag (OPG) etabliert sowie (ii) eine Methode etabliert um in isolierten Protoplasten die Richtigkeit der Insertion zu überprüfen. Mit Hilfe dieser Methoden können nun verschiedene Mutanten auf ihre Insertions-Wirksamkeit untersucht werden. Desweitern können durch Mutationsanalysen die notwendigen physikochemischen Eigenschaften für die Erkennung des Substrates ermittelt werden.
Eine weit verbreitete Methode im GET Feld ist die tail-anchor translocation (TAT). Bei dieser Methode werden isolierte mikrosomale Fraktionen des rauen ERs mit rekombinanten Komplexen bestehend aus Zielsteuerungsfaktor und TA Protein inkubiert. Durch einen rekombinanten OPG, der im Lumen des ERs post-translational modifiziert werden kann, ist die Beobachtung einer zeitabhängigen Kinetik der Glykosylierung möglich. Dieses System wurde bislang nur für Komponenten aus Säugern oder Hefen benutzt, aber noch nie mit einem System auf pflanzlicher Basis. Um dies zu verwirklichen, habe ich die rekombinante Proteinexpression soweit optimiert, dass der Großteil des synthetisierten Proteins sich im löslichen Anteil des Lysats statt in den Inclusion Bodies befand. Mittels dieser Optimierung konnte ich die Ko-Expression von Zielsteuerungsfaktor mit TA Protein als löslichen Komplex etablieren. Ergänzend zu den löslichen Komplexen habe ich eine geeignete Methode etabliert um mittels Saccharosegradienten mikrosomale Fraktionen aufzutrennen in denen AtGet3a angereichert ist. Leider müssen noch die Parameter der Reaktion optimiert werden, aber die Akquirierung alle nötigen Bestandteile ist etabliert.
My PhD work employed genetic and pharmacological manipulations, coupled with highresolution live imaging, to understand intercellular communications during zebrafish cardiovascular development. The heart is the first organ to form, and it is composed of several tissues, among which interactions are crucial. I identified two important interactions between muscular and non-muscular tissues in poorly characterized contexts, and the molecules required for the signalling. First, I discovered an important cellular and molecular crosstalk orchestrating the development of the cardiac outflow tract (i.e., the aortic root in mammals).
Endothelial-derived TGF-beta signalling controls the generation of the local extracellular matrix (ECM). The ECM in turn affects endothelial proliferation as well as smooth muscle cell organization (Boezio et al, 2020; Bensimon-Brito*, Boezio* et al, 2020). In my second project, I investigated the crosstalk between the epicardial layer and the myocardial wall. By generating epicardial-impairment models, I identified a novel role for the epicardium in regulating cardiomyocyte volume during heart development (Boezio et al, 2021). Ultimately, this research contributed to our understanding of how paracrine signalling controls the multicellular interactions integral to organogenesis.
Dicer and Drosha are the major enzymes involved in microRNA processing. Using siRNA targeting Dicer and Drosha, thereby downregulating a substantial number of microRNAs in EC, we demonstrate a crucial role of both enzymes in angiogenic processes. Interestingly, Dicer inhibition exerts more profound effects on processes like migration and viability of EC in comparison to Drosha inhibition. Moreover, Dicer effects in vivo angiogenesis, a process which is unaffected by Drosha. This discrepancy might be partially due to the involvement of Dicer in other cellular processes like heterochromatin formation and to the fact that Dicer and Drosha target mainly different subsets of microRNAs. In addition, we identified miR-92a as a novel endogenous repressor of the angiogenic program in EC, which impairs their angiogenic functions in vitro and in vivo. Consistent with these data, blocking miR-92a by systemic infusion of antagomirs enhances neovascularization and functional recovery after ischemia in vivo. At first sight, the anti-angiogenic function of miR-92a in EC appears to contradict the previously identified anti-apoptotic and pro-angiogenic activities of the miR-17~92 cluster in tumor cells. However, this apparent discrepancy might be well rationalized by a predominant function of miR-18a and miR-19a in tumor cells, which are responsible for the tumorigenic and non-cell autonomous pro-angiogenic functions of the miR-17~92 cluster. Instead, miR-92a expression is specifically upregulated in ischemic tissues and appears to cell-autonomously repress the angiogenic potential of EC. Among the various targets and verified regulated genes identified by microarray, we confirmed the downregulation of Integrin a5 in vitro and in vivo. The relevance of this miR-92a target is evidenced by severe vascular defects in the absence of Integrin a5. In addition, endothelial miR-92a interferes with the expression pattern of genes controlling key EC functions at various levels, some of which, e.g. eNOS, might be secondarily affected by directly targeted genes. Obviously, our data do not formally exclude effects of antagomir-92a on perivascular and other cell types, but surely include effects on EC. Regardless of this, the capacity of miR-92a to target various downstream effectors might be an advantage of miRNA-based therapeutic strategies and may overcome the limited therapeutic capacity of single growth factor or single gene therapies in ischemic diseases, since the highly organized process of vessel growth, maturation and functional maintenance is well known to require the fine-tuned regulation of a set of genes.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
Taxonomy, phylogeny and zoogeography of the hexaploid Torini of the Middle East and North Africa
(2017)
Fishes of the tribe Torini Karaman, 1971 (Teleostei: Cyprinidae) are a diverse group of primary freshwater fishes, distributed in Africa, the Middle East, and Indomalaya. They are an important component of the native freshwater-fish fauna of the Middle East and North Africa, and occur in most large river systems of the Levant, Arabia, Mesopotamia, southern Iran, and Morocco. They belong to the subfamily Cyprininae, are characterised by being tetraploid or hexaploid, having large scales, and a smooth and ossified last unbranched ray in the dorsal fin. As primary freshwater fishes they are not able to tolerate marine conditions and depend on direct freshwater connections for their dispersal. This makes them an ideal model for zoogeographic studies.
Prior to this study, the diversity of the Torini species in the Middle East and North Africa was not well understood. The validity of several genera and species was unclear, and the generic assignment of several species changed frequently.
In this PhD project the taxonomy, phylogeny, and zoogeography of the Torini of the Middle East and North Africa were investigated with morphological, as well as molecular methods. More than 1550 fish specimens were examined morphologically. Some of the specimens, including the types of most nominal species, were already available from museum collections. The remaining specimens were collected during expeditions to Ethiopia, Iran, Jordan, Morocco and Syria. Tissue samples were collected for molecular genetic analyses. The mitochondrial genes for cytochrome b, NADH dehydrogenase subunit 4 and the tRNAs for serine and histidine were sequenced from more than 120 specimens, representing 20 species of Torini and two small, diploid African barbs (Cyprinidae, tribe Smiliogastrini). Molecular data were analysed with Bayesian inference and other methods.
The analyses confirmed that the hexaploid Torini of Africa and the Middle East form a monophyletic group. In the Middle East and North Africa the Torini are represented by the genera Arabibarbus, Carasobarbus, Mesopotamichthys, and Pterocapoeta. These genera are each morphologically diagnosable, monophyletic, and genetically distinct. The species 'Labeobarbus' reinii cannot be assigned to any of these genera, because it is morphologically dissimilar and genetically clearly separated from each of them. A generic name for this species is presently not available and until the description of a new genus it is preliminarily assigned to the genus 'Labeobarbus'.
Out of the 28 species-group taxa described from the Middle East and North Africa until now, 15 are valid: Arabibarbus arabicus, A. grypus, A. hadhrami, Carasobarbus apoensis, C. canis, C. chantrei, C. exulatus, C. fritschii, C. harterti, C. kosswigi, C. luteus, C. sublimus, Mesopotamichthys sharpeyi, Pterocapoeta maroccana, and 'Labeobarbus' reinii.
The phylogenetic relationships between the Middle Eastern and North African Torini are well resolved, based on the analysis of mitochondrial DNA sequences from nearly all relevant species.
The interspecific and intraspecific morphological and genetic diversity is shaped by the zoogeographic history. Conclusions can be drawn about the events that shaped the evolution of this group. The Torini originated in the Indomalayan biogeographical realm and colonised the Middle East and Africa during the Miocene via the Gomphotherium landbridge. The Indomalayan Torini are tetraploid, whereas those of the Middle East and Africa are hexaploid. Molecular phylogenetic analyses showed that the hexaploid Torini cluster within the tetraploid Torini. This makes the tetraploid Torini a paraphyletic group with respect to the hexaploid Torini. Morocco was colonised in two independent waves. The first came from sub-Saharan Africa and is represented by Pterocapoeta maroccana. The second originated in the Middle East and gave rise to C. fritschii, C. harterti, and probably 'L.' reinii. The Tigris-Euphrates system is the largest freshwater system in the Middle East. Its central position between the Orontes River and Jordan River in the West, the Iranian tributaries to the Persian Gulf in the East, and the Arabian Peninsula in the South made it an important crossroad for the colonisation of the Middle East by Torini and other freshwater biota. During the Miocene the predecessors of the Jordan and Orontes rivers were connected to the Tigris-Euphrates system. The Jordan River was separated from the Euphrates before the Orontes. Arabia was colonised in two waves. The first (A. arabicus, A. hadhrami, C. exulatus) dates to the Pliocene, whereas the second (C. apoensis) ended as recently as the late Pleistocene or early Holocene.
Angesichts heutiger Umweltprobleme ist die Stärkung positiver Mensch-Natur-Beziehungen wichtiger denn je. Zeitgenössische Umweltbildung zielt darauf ab, Motivation und Einstellungen zu fördern sowie eine grundlegende Wissensbasis zu schaffen (IUCN, UNEP, & WWF, 1991; Potter, 2010), um einen selbstbestimmten, verantwortungsvollen Umgang mit der Natur zu ermöglichen. Positiver Naturbezug und Umwelteinstellungen gelten als Basis für aktiven Umweltschutz. Direkte Naturerfahrungen gelten dabei als didaktische Möglichkeit, die Motivation für Umweltschutz zu festigen (Kaiser, Roczen, & Bogner, 2008). Einstellungen verändern sich im Laufe des Lebens und so kann das Alter eine wichtige Rolle bezüglich der Effektivität von Umweltbildungsprogrammen spielen (Ernst & Theimer, 2011). Auch Umweltwissen gilt als Grundlage von Umwelthandeln. Denn sinnliche Erfahrungen allein führen nicht zum Verständnis ökologischer Zusammenhänge (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004; Liefländer, Bogner, Kibbe, & Kaiser, 2015). Die biologiedidaktische Forschung sieht Fakten-, Handlungs- und Effektivitäts-wissen als zentral für die Genese von Umwelthandeln (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004). Isoliertes Fachwissen wiederum führt nach aktueller Erkenntnis auch nicht zur Entwicklung von Haltungen und Wertvorstellungen, welche unser Handeln beeinflussen (Barr, 2003; Finger, 2010; Leiserowitz, Kates, & Parris, 2005).
Bis heute sind altersbasierte Unterschiede bei Schülerinnen und Schülern bezüglich ihrer Naturverbundenheit und Umwelteinstellungen nicht hinreichend untersucht. Auch ist die nötige Dauer der Naturerfahrungen noch nicht nachgewiesen. Es gibt bislang keine Studie, die Umwelteinstellungen, -wissen und –handeln von Kindern verschiedener Regionen der Erde untersucht und Daten auf internationaler Ebene erhoben und ausgewertet hat. Die gezielte Integration der drei Umweltwissensarten in ein solch globales Umweltbildungsprojekt stellt eine zusätzliche bislang nicht angegangene Aufgabe dar. Die vorliegende Arbeit schließt diese Forschungslücken, indem sie auf internationaler Ebene jene Variablen mit einbezieht, die einen nahezu vollständigen Eindruck der Effektivität von Umweltbildung in verschiedenen Regionen, Sozialisationen und Altersklassen zulässt. So wird der Einfluss eines umfassenden Umweltbildungsprogramms auf Naturverbundenheit, Umwelteinstellungen und -wissen der verschiedenen Typen untersucht und ein Bezug zur eventuellen Veränderung des Umwelthandelns hergestellt. Dabei stehen sowohl traditionelle als noch unerforschte mögliche Einflussfaktoren im Fokus. Die Studie umfasst insgesamt 1454 Schülerinnen und Schüler aus Bangladesch, Malaysia, Deutschland und Singapur, die alle an dem Umweltbildungsprojekt „Global denken, lokal handeln – wir schützen unsere Umwelt!“ bzw. “Think global, act local – we protect our environment!“ teilgenommen haben.
Zur Messung der Naturverbundenheit diente Schulz’ INS-Skala (Inclusion of Nature in Self) (2002). Umwelteinstellungen wurden mit dem 2-MEV-Modell (Two Major Environmental Values) gemessen (Johnson & Manoli, 2011). Eine Skala zur Erhebung von Umweltwissen wurde eigens erstellt und hinsichtlich der drei Wissenstypen nochmals modelliert. Eine Skala zur Ermittlung von Umwelthandeln wurde auf Grundlage von Bögeholz (1999) erstellt. Alle Skalen waren Teil eines Fragebogens, welcher in Form eines Pre-, Post- und Follow-up-Test eingesetzt wurde. Kinder aus Parallelklassen, die nicht am Projekt teilnahmen, aber Klassenunterricht zu den jeweiligen Themen erhielten, dienten als Kontrollgruppen.
Die Ergebnisse bestätigen einen positiven Effekt außerschulischer Umweltbildung bezüglich der Entwicklung der untersuchten Variablen. So wurde nach der Teilnahme am eintägigen und auch nach dem fünftägigen Umweltbildungsprogramm eine signifikante Verstärkung des Naturbezugs gemessen, wohingegen die Kontrollgruppen keine messbare Veränderung zeigten. Jedoch nur die fünftägige Intervention führte auch zu nachhaltigen Veränderungen. Hierbei am stärksten beeinflusst wurden Kinder zwischen sieben und neun Jahren.
Bei der Untersuchung demographischer Einflussfaktoren auf Umwelteinstellung, -wissen und –handeln stellten sich das Wohnsitzland sowie die städtische bzw. ländliche Prägung der Wohngegend als entscheidend heraus. So waren dies die einflussreichsten Determinanten zur Vorhersage des Grundvorhandenseins sowie Veränderungen der untersuchten Variablen in Folge der Bildungsmaßnahme. Einzig bei der Entwicklung des Umwelthandelns schien die direkte Naturerfahrung unwesentlich, zeigten die Kontrollgruppen ähnlichen Wandel in ihrem aktiven Einsatz für die Umwelt. Im internationalen Vergleich scheint die komplexe Verkettung diverser einflussnehmender Faktoren, wie der Wohlstand des jeweiligen Staates, das generelle politische System sowie spezifische bildungspolitische Begebenheiten, den Erfolg von Umweltbildungsprogrammen mit zu bestimmen.
Die Daten zeigen, dass Faktenwissen Grundlage für Handlungs- und Effektivitätswissen ist. Alle Dimensionen wurden durch die Intervention signifikant gesteigert. Effektivitätswissen wuchs am stärksten. Auch das Umweltverhalten wurde positiv verstärkt. Jedoch ließen sich nur schwache Korrelationen zwischen den einzelnen Wissenstypen und Handeln feststellen. Zusammenfassend war das durchgeführte Bildungsprojekt erfolgreich in der Förderung von Naturverbundenheit sowie Umwelteinstellungen, -wissen und- handeln. Die Ergebnisse werden im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf ihre Bedeutung für die schulische Umweltbildung sowie die didaktische Forschung erörtert.
In this study I analysed past and recent Daphnia populations from Lake Constance and Greifensee. Herefore, I first established a set of microsatellite markers applicable to European Hyalodaphnia species (chapter 1). Primers were also identified for species specific fragment lengths. 32 markers were then available to characterize the resting egg banks of Daphnia galeata and D. hyalina. Chapter 2 presents the reconstruction of the taxonomic composition in these two ecologically different lakes. This part of my work shows that the eutrophication that occurred in both lakes in the mid of the last century has strongly influenced the Daphnia populations. In both lakes Daphnia galeata established and hybridized with the indigenous D. hyalina. Interspecific hybridization resulted in introgression on the mitochondrial and nuclear level. In chapter 3 resting eggs from the sediments of the 1960s, 1970s, 1980s, 1990s and 2000s were characterized with microsatellite markers. The aim was to specify the extent of interspecific hybridization and nuclear introgression assuming that the genetic exchange between both species has an impact on their adaptation to their habitat. In life history experiments D. galeata and D. galeata x hyalina clones hatched from different time periods showed significant differential responses to food quality. Therefore, the question had to be answered how the Daphnia resting egg bank and the planktonic population are connected. In chapter 4 hatching experiments were conducted to bridge this gap of scientific knowledge in the life cycle of cyclic parthenogenetic waterfleas. Only D. galeata individuals were able to establish a clonal lineage after maturity. All observed recombinant individuals did not reproduce at all or firstly went through another sexual phase of reproduction i.e. produced resting eggs. In order to compare the findings of chapter 4 with the taxon composition of the recent planktonic population of Daphnia in Lake Constance, samples were taken over one season (between May 2005 and September 2006). During the season, the taxonomic composition of Daphnia changes severely with D. galeata being most abundant during the warm season and D. hyalina in the cold season. Moreover, some individuals were detected, that did not follow this pattern. With mitochondrial analysis those individuals were identified as mitochondrial introgressants and processed to life history experiments. Significant differences in the somatic growth rate under different temperatures (5°C, 12.5°C and 20°C) were related to the origin of the mitochondrial genome rather than the nuclear taxonomic assignment of the individual.
The findings of this study show that all organisms exposed to rapid ecological changes and their microevolutionary reaction to those.
Beta-Barrel-Membranproteine der Omp85-Familie besitzen essentielle Funktionen in der Lipidbiogenese und der Proteinintegration und -assemblierung in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien. Auch in endosymbiotisch erworbenen Organellen der Eukaryoten übernahmen Vertreter dieser Proteinfamilie wichtige Rollen, wie bei der Translokation von Vorstufenproteinen durch die äußere Hüllmembran von Chloroplasten und der Assemblierung von Proteinkomplexen in der äußeren Hüllmembran von Mitochondrien. Eine phylogenetische Analyse der bekannten Vertreter dieser Proteinfamilie wies auf eine Aufspaltung der Omp85-Familie in zwei Hauptzweige hin. Während der Toc75-Zweig aus plastidären und cyanobakteriellen Omp85-Proteinen besteht, bilden mitochondrielle Proteine sowie die Omp85-Vertreter der Proteobakterien eine zweite Unterfamilie, den Sam50-Zweig. In dieser Arbeit wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von pro- und eukaryotischen Vertretern beider Unterfamilien verglichen. Zu diesem Zweck wurde ein elektrophysiologischer Messstand konstruiert, mit dem diese Kanalproteine mittels der Lipid-Bilayer-Technik untersucht werden konnten. Die Analyse der experimentellen Daten der verwendeten Omp85-Proteine zeigte deutliche Gemeinsamkeiten der gesamten Proteinfamilie hinsichtlich ihrer Kationenselektivität. Hingegen ergab ein Vergleich der Kanalleitwerte signifikante Unterschiede zwischen beiden Unterfamilien. So lagen die aus den Leitwerten berechneten Porendurchmesser bei den Mitgliedern des Toc75-Zweigs um das Zwei- bis Dreifache über den für die Vertreter des Sam50-Zweigs bestimmten Werten. Topologievorhersagen ergaben, dass die Mitglieder der Omp85-Familie aus zwei Domänen aufgebaut sind. Durch die Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften von Teilkonstrukten, die aufgrund dieser Vorhersagen erstellt wurden, konnte gezeigt werden, dass die C-terminale Domäne die Porenregion des beta-Barrel-Proteins bildet. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Omp85-Proteine werden allerdings durch die N-terminale Domäne moduliert. Aufgrund der in dieser Arbeit erzielten elektrophysiologischen Ergebnisse und unter Berücksichtigung der phylogenetischen Analyse der Omp85-Familie konnte eine Hypothese zur evolutionären Entwicklung dieser sehr alten Proteinfamilie aufgestellt werden.
Zelluläre Immuntherapien mit hochaufgereinigten allogenen NK-Zellen sind eine mögliche Therapieoption um den GvL/T-Effekt nach haploidenter SZT bei pädiatrischen Hochrisikopatienten mit malignen Erkrankungen zu verstärken. Im Rahmen der in Frankfurt a. M. laufenden klinischen Phase I/II NK-Zell-Studie wurden 16 pädiatrische Patienten sowohl mit unstimulierten (NK-DLI(unstim), 9 Patienten) als auch mit zehn Tage ex vivo IL-2 (1000 U/ml) stimulierten Spender-NK-Zellen (NK DLI(IL-2 stim), 9 Patienten) an den Tagen (+3), +40 und +100 nach haploidenter SZT behandelt. Bisher gibt es kaum Daten über den Verbleib der transfundierten Zellen und den Einfluss der NK-DLI Immuntherapie auf sowohl zelluläre als auch humorale Komponenten des Immunsystems der Patienten. Da die Patienten zudem nach haploidenter SZT zur GvHD-Prophylaxe das immunsuppressive Medikament Mycophenolat-Mofetil (MMF) erhalten, sind Untersuchungen zum Einfluss von MMF auf die Funktionalität der Spender-NK-Zellen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe eines studienbegleitenden, nichtinvasiven in vivo Immunmonitorings erstmalig ein unterschiedlicher Einfluss von NK-DLI(unstim) im Vergleich zu NK-DLI(IL-2 stim) auf zelluläre Bestandteile und auf die Zytokin/Chemokin-Spiegel des peripheren Blutes der Patienten vor und 10 min, 1 h, 4 h und 24 h nach der Zelltherapie beschrieben. Mittels durchflusszytometrischen single platform Analysen konnten sowohl Spender-NK-Zellen als auch patienteneigene NK-Zellen phänotypisch und funktionell charakterisiert und unterschieden werden. So wurden neben einer gesteigerten zytotoxischen Aktivität IL-2 stimulierter NK-Zellen auch Unterschiede hinsichtlich der Expression des Oberflächenmoleküls CD56, des Aktivierungsmarkers CD69, des Natürlichen Zytotoxizitäts-Rezeptors (NCR) NKp44 und des Lymphknoten Homing Moleküls CD62L beobachtet. Des Weiteren führte die Applikation von NK-DLI(IL-2 stim) zu einer signifikanten Zellmigration in der peripheren Blutzirkulation der Patienten. Während sich die Zahl der neutrophilen Granulozyten innerhalb von 4 h im peripheren Blut vervierfachte wurde unmittelbar 10 min nach NK-DLI(IL-2 stim) ein massiver Zellverlust von eosinophilen Granulozyten, Monozyten, dendritischen Zellen und vor allem der NK-Zellen beobachtet. Eine ausgeprägtere Reduktion der immunregulatorischen CD56(bright)CD16(dim/-) NK-Zellen hatte zudem eine Verschiebung in der prozentualen Verteilung der NK-Zell-Subpopulationen zur Folge. In den folgenden 24 h normalisierten sich alle Zellzahlen wieder zu den Werten vor NK-DLI. Anhand der beschriebenen phänotypischen Unterscheidungsmerkmale konnte gezeigt werden, dass dabei nur patienteneigene NK-Zellen in die periphere Blutbahn zurückkehrten. Die Zellmigration war zudem in vivo von einem signifikanten Anstieg der proinflammatorisch- und chemotaktisch-wirkenden Zytokine/Chemokine IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ, MCP-1 und MIP-1β im peripheren Blut der Patienten 10 min nach NK-DLI(IL-2 stim) Applikation begleitet. Die Applikationen von NK-DLI(unstim) zeigten im Gegensatz dazu keine vergleichbaren Effekte. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob eine Therapie mit dem Immunsuppressivum MMF nach haploidenter SZT die Funktionalität dieser hochaktivierten Spender-NK-Zellen beeinträchtigt und somit die Effektivität der Immuntherapie gefährdet. Es konnten Einschränkungen in der ex vivo Funktionalität der NK-Zellen durch therapeutisch relevante Konzentrationen (1 bis 10 µM) des aktiven Metaboliten Mycophenolsäure (MPA) gezeigt werden. Die MPA-Inkubation führte zu einer dosisabhängigen aber reversiblen Inhibition der IL-2 bedingten ex vivo NK-Zell-Proliferation. Auch die während des ex vivo Expansionsprozesses induzierte Zytokin/Chemokin-Sekretion wurde signifikant gehemmt. Eine 24-stündige MPA-Inkubation der IL-2 stimulierten NK-Zellen führte zudem zu einer eingeschränkten Mobilität der NK-Zellen. Dies korrelierte mit einer signifikant reduzierten zytotoxischen Aktivität gegen K-562 Tumorzellen, was jedoch nicht mit einer Oberflächenreduktion der NCRs und des NKG2D Rezeptors assoziiert war. Auch die durch die IL-2 Stimulation verursachte Hochregulierung der in Aktivierung und Migration involvierten Oberflächenmoleküle CD25, LFA-1, ICAM-1, CCR5, CXCR7, DNAM-1 und CD62L wurde durch MPA inhibiert. Im Gegensatz dazu hatte eine 24-stündige oder 4-tägige MPA-Behandlung bereits vorstimulierter NK-Zellen keinen Einfluss. Zudem konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass die IL-2 induzierte intrazelluläre Signaltransduktion durch MPA beeinflusst wird. Dies äußerte sich in einer partiell bis vollständig inhibierten Phosphorylierung zentraler Signalmoleküle wie STAT-3, -4 und -5, der MAP-Kinase ERK1/2 und der Proteinkinase AKT. Dadurch wurden die durch IL-2 geförderten Zellprozesse wie das Überleben, die Proliferation und die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen drastisch gehemmt. Dies steht vermutlich im Zusammenhang mit einer reduzierten Expression der IL-2R Untereinheit (CD25), wodurch die Ausbildung des hochaffinen IL-2-Rezeptors auf der Zelloberfläche verhindert wurde. Demzufolge scheint die eingeschränkte NK-Zell-Effektorfunktion Ursache einer durch MPA gestörten IL-2 Signaltransduktion zu sein. Zusammenfassend scheinen NK-DLI(IL-2 stim) durch die gesteigerte Zytotoxizität, die geringere Sensitivität gegenüber der MPA-Exposition sowie durch die mutmaßliche Extravasation der stimulierten NK-Zellen aus der peripheren Blutbahn einen Vorteil gegenüber NK-DLI(unstim) zu haben. Ob dies auch in einer Steigerung der Effektivität der Immuntherapie resultiert und damit die Prognose der Patienten verbessert werden kann, werden jedoch erst zukünftige Studien mit größeren Patientenkohorten abschließend zeigen können.
Die Parkinson Erkrankung ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung in industrialisierten Ländern. Die charakteristischen Symptome sind schwere Beeinträchtigungen des Bewegungsablaufes welche auf den Verlust dopaminerger Neurone der Substantia nigra und der damit einhergehenden Reduktion des striatalen Dopamin Gehaltes zurückzuführen sind. Alpha-Synuklein (SNCA) ist ein Protein welches zum einen mit sporadischen aber auch mit idiopathischen Erkrankungen assoziiert ist. Mutationen welche einen Funktionsgewinn von SNCA zur Folge haben konnten mit autosomal dominanten Varianten der Parkinson Erkrankung assoziiert werden und genetische Veränderungen an beiden Genenden agieren als Risikofaktor für sporadische Formen der Erkrankung. Des Weiteren wird SNCA als Hauptbestandteil der Lewy Körperchen gefunden, einem pathologischen Kennzeichen der parkinsonschen Erkrankung. Die charakteristischen Bewegungsstörungen können mittels L-DOPA, einer metabolischen Vorstufe von Dopamin, behandelt werden. Neben dem enorm positiven Effekt auf die Bewegungsstörungen, geht die Behandlung mit L-DOPA jedoch auch mit ernsten Nebenwirkungen einher, welche als Levodopa induzierte Dyskinesien (LID) beschrieben werden.
Ziel der Arbeit war die Analyse von Effekten eines SNCA Funktionsgewinns sowie des Pink1 Funktionsverlustes auf molekulare Signalwege der synaptischen Plastizität unter Verwendung dreier PD Mausmodelle (A53T-SNCA überexprimierendes Modell (PrPmtA), Pink1KO Modell sowie A53T-SNCA + Pink1KO Doppelmutante (DM)). Es wurden Kandidatengene welche eine Rolle für synaptische Plastizität spielen in 6 Monate alten Mäusen aller drei PD Mauslinien untersucht. Die Analyse von PrPmtA zeigte erhöhte mRNA Spiegel von Glutamatrezeptor-Untereinheiten und von Kandidatengenen welche eine Rolle bei der synaptischen Signalweiterleitung spielen, sowie reduzierte mRNA Spiegel von IEGs und Transkriptionsfaktoren. Die Analyse der DM zeigte nur geringe Expressionsänderungen der Glutamatrezeptor-Untereinheiten und die Analyse von IEGs und Transkriptionsfaktoren zeigte erneut reduziert mRNA Spiege. In Pink1KO Tieren konnten nur minimale Expressionsveränderungen der Kandidatengene gefunden werden, was den Schluss zulässt, dass die zuvor beschriebenen Expressionsveränderungen in PrPmtA und DM Mäusen eindeutig auf den SNCA Funktionsgewinn zurückzuführen sind. Um frühe Effekte des SNCA Funktionsgewinns zu studieren wurde die Analyse auf 3 Monate alte PrPmtA Mäuse ausgeweitet. Diese ergab, Expressionsveränderungen für Homer1, cFos, NOR1, Nurr1 und Nur77.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde die Auswirkung des SNCA Funktionsgewinns auf das Verhalten sowie auf molekulare Parameter nach Apomorphin Behandlung analysiert. Die Analyse ergab ein erhöhtes Niveau an unwillkürlichen Bewegungsmustern mit stereotypen und dystonischen Eigenschaften in PrPmtA im Vergleich zu Wildtypen (wt). Die molekulare Analyse von striatalem Gewebe wurde zu zwei Zeitpunkten durchgeführt, 30 min nach Apomorphin Injektion und 100 min nach Injektion. Die Analyse von striatalem Gewebe welches zum Zeitpunkt 30 min nach Injektion entnommen wurde ergab eine erhöhte Apomorphin abhängige Phosphorylierung von ERK1/2, sowie eine erhöhte Apomorphin abhängige Expression von Dusp1, Dusp6 und cFos in transgenen und wt Tieren. Genotyp abhängige Unterschiede ergaben sich für cFos, welches signifikant höher in PrPmtA induziert wurde. 100 min nach Apomorphin Injektion ergab die gleiche Analyse eine erhöhte Apomorphin abhängige Phosphorylierung von ERK1 und eine erhöhte Apomorphin abhängige Expression von Dusp1, Dusp6, cFos und Nur77 in PrPmtA im Vergleich zu wt. Die Daten unterstreichen die fundamentale Rolle von SNCA auf die Neurotransmission und synaptische Plastizität und zeigen auf, dass PrPmtA ein zuverlässiges Modell für die Analyse von präsynaptischer Dysfunktion in Frühstadien der Parkinson Erkrankung darstellt.
Der letzte Versuchsansatz stellt die Charakterisierung des DM-Mausmodells welches sich durch einen starken Phänotyp auszeichnet, sowie die Analyse des Pink1 Effektes auf die SNCA induzierte Neurotoxizität dar. DM-Tiere zeigen deutlich reduzierte Spontanmotorik im Alter von 3 Monaten sowie einer progressiven Lähmung der Hinterläufe, was Anlass zu einer immunhistologischen Charakterisierung mittels Schnitten des Gehirns und Rückenmarks gab. Die histologische Analyse zeigte pSer129-SNCA, p62/SQSTM1 und Ubiquitin positive Aggregate innerhalb der grauen Substanz des Rückenmarks sowie innerhalb einer neuronalen Zellpopulation welche dorsal der Substantia nigra angeordnet ist. Das histologische Erscheinungsbild wurde spezifisch in gelähmten DM-Tieren gefunden und nicht in Einzelmutanten oder DM-Tieren ohne Lähmung. Dieses Modell stellt ein wertvolles Instrument für die Identifizierung von pathologischen Mechanismen und Signalkaskaden welche beiden Parkinson relevanten Genen gemeinsam sind, dar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene metabolische Anpassungsmechanismen des humanpathogenen Bakteriums Acinetobacter baumannii an seinen Wirt untersucht. Im ersten Teil wurde die Rolle von verschiedenen Trimethylammoniumverbindungen (Cholin, Glycinbetain und Carnitin) und den zugehörigen Aufnahmesystemen, sowie ihren Stoffwechselwegen während dieses Prozesses analysiert. Für die Analyse der Transportsysteme wurde eine markerlose Vierfachmutante (Δbcct) von A. baumannii generiert, sodass alle bekannten Transportsysteme für die genannten Verbindungen deletiert vorlagen. Wachstumsversuche mit dieser Mutante zeigten, dass es in A. baumannii keine weiteren Transporter für die Aufnahme von Cholin gibt, jedoch weitere primär aktive oder sekundär aktive Transporter für die Aufnahme von Glycinbetain. Weiterhin konnten innerhalb dieser Arbeit die KM-Werte der Transporter bestimmt werden. Verschiedene Virulenz- und Infektionsanalysen führten zu dem Schluss, dass die Transporter keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielen. In Genomanalysen konnten die Gene, die für die Enzyme des Oxidationsweges von Cholin zu Glycinbetain kodieren identifiziert werden (Cholin-Dehydrogenase (betA), GlycinbetainAldehyd-Dehydrogenase (betB) und ein potenzieller Regulator (betI)). Es wurden Deletionsmutanten innerhalb dieses Genclusters generiert, mit dessen Hilfe gezeigt werden konnte, dass Cholin unter Salzstress ausschließlich als Vorläufer für das kompatible Solut Glycinbetain fungiert und nicht als kompatibles Solut von A. baumannii genutzt werden kann. Virulenz- und Infektionsstudien mit den Deletionsmutanten zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielt.
Die Cholin-Dehydrogenase BetA wurde zusätzlich in E. coli produziert und anschließend mittels NiNTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die biochemische Charakterisierung des Enzyms zeigte, dass BetA membranständig ist und die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von 9,0 hat. Salze wie NaCl oder KCl hatten keinen Effekt auf die Aktivität des Enzyms, während Glutamat die Aktivität stimulierte.
Weiterhin konnte FAD als Cofaktor identifiziert werden und der KM-Wert ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain unter isoosmotischen Bedingungen zu einem Anstieg der ATP-Konzentration in A. baumannii-Zellsuspensionen führt und damit, dass Cholin als alternative Energiequelle genutzt wird. Das Phospholipid Phosphatidylcholin konnte als natürliche Cholinquelle identifiziert werden. Eine Rolle der Phospholipasen D bei der Abspaltung der Cholin-Kopfgruppe des Phosphatidylcholins konnte ausgeschlossen werden. Die Gene für die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain werden ausschließlich in Anwesenheit von Cholin exprimiert, jedoch unabhängig von der extrazellulären Salzkonzentration. Diese Studien zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg eine Rolle in der metabolischen Adaptation von A. baumannii an den Wirt spielt. Phosphatidylcholin kann hier als natürliche Cholinquelle im Wirt genutzt werden, da die Wirtsmembranen aus bis zu 70 % Phosphatidylcholin bestehen. Transportstudien mit Carnitin führten zu dem Schluss, dass der Transporter Aci01347 aus A. baumannii neben Cholin ebenfalls Carnitin transportiert. Wachstumsversuche mit einer aci01347-Mutante bestätigen, dass Aci01347 essenziell für die Aufnahme und anschließende Verwertung von Carnitin als Kohlenstoffquelle ist. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass das Transportergen mit essenziellen Genen für den Carnitin-Abbau in einem Operon liegt. Für die Analyse des Abbauweges von Carnitin wurden markerlose Deletionsmutanten innerhalb des Operons generiert. In Wachstumsstudien mit diesen Mutanten konnte der Abbauweg aufgeklärt werden und der Regulator des Operons identifiziert werden. Carnitin wird hier über Trimethylamin und Malat-Semialdehyd zu D-Malat umgewandelt und anschließend über Pyruvat in den TCA-Zyklus eingespeist. Der Regulator wurde zusätzlich in E. coli produziert und mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mithilfe von EMSA-Studien konnte die Bindestelle des Regulators auf eine 634 Bp lange DNA-Sequenz stromaufwärts des CarnitinOperons eingegrenzt werden. Durch Transkriptomanalysen konnte gezeigt werden, dass bei Wachstum mit Acetylcarnitin, Carnitin und D-Malat die Expression des Carnitin-Operons induziert wurde. Darüber hinaus wurden die Gene konservierter Aromatenabbauwege wie z. B. des Homogentisatweges, des Phenylacetatweges und des Protocatechuat-Abbaus, verstärkt exprimiert. In G. mellonellaVirulenzstudien konnte eine Rolle des Abbaus von Carnitin bei der Virulenz von A. baumannii nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte dieser Effekt dem entstehenden Trimethylamin zugesprochen werden...
Erstmals konnte eine zCarotinDesaturase einer höheren Pflanze nach heterologer Expression in E. coli in nativer Form gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Dazu wurde die cDNA der CapsicumZDS in einen Expressionsvektor kloniert, der die ZDS als rekombinantes Polypeptid mit 6 Nterminalen Histidinen exprimierte. Dadurch konnte das Enzym in nur zwei Schritten über eine Kombination von Ammoniumsulfatfällung und MetallionenAffinitätschromatographie selektiv aus E. coli separiert werden. Die ZDS wurde ohne eine mutmaßliche Transitsequenz als ein Polypeptid von 59 kDa exprimiert. Das pH Optimum der ZDSAktivtität liegt bei 7,2 in der Nähe der rechnerisch ermittelten pIWertes von 7,4. Die ZDS führt zwei Desaturierungsschritte ausgehend von zCarotin zu Lycopin als ein monomeres Protein durch. Unter Verwendung des TwoHybridSystems, einer Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen und einer Gelfiltration der nativen ZDS, konnte gezeigt werden, daß die ZDS als Monomer und als Dimer vorliegen kann. Die Dimerisierung der ZDS ist jedoch für deren enzymatischer Aktivität und für die Durchführung beider Desaturierungsschritte nicht notwendig. Für die Substratcarotinoide zCarotin und Neurosporin, wurden die Km Werte von 8,4 µM und 9,0 µM bestimmt. Die CapsicumZDS zeigt von ihrer Aminosäuresequenz her eine große Ähnlichkeit zu den cyanobakteriellen zCarotinDesaturasen und eine geringere Ähnlichkeit zu den pflanzlichen Phytoendesaturasen. Eine diskutierte phylogenetische Verwandtschaft der zCarotin und Phytoendesaturase aus höheren Pflanzen und Cyanobakterien wird durch die Verwendung des gleichen Kofaktors Plastochinon und durch die gemeinsame Hemmbarkeit mit den zCarotinDesaturaseHemmstoffen J852 und LS80707 unterstützt. Eine Kofaktoruntersuchung ergab, daß Plastochinon sowohl der Kofaktor der ZDS aus Capsicum, als auch der Phytoendesaturasen aus Gentiana lutea (gelber Entian), aus dem Cyanobakterium Synechococcus sp. PCC 7942, sowie der z CarotinDesaturase aus Synechocystis sp. PCC 6803 ist. Der Km Wert von Decyl Plastochinon wurde für die CapsicumZDS zu 0,4 µM bestimmt. Der Kofaktor der z CarotinDesaturase Plastochinon, sowie die Entdeckung einer plastidären terminalen Oxidase (Carol et al., 1999) ermöglicht die Entwicklung eines Modells der Übertragung der bei der Desaturierung von zCarotin gewonnenen Elektronen über Plastochinon auf Sauerstoff, wie es bereits für die pflanzliche Phytoendesaturase postuliert wurde (Carol
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Eine verzögerte und mitunter unvollständige Immunrekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) birgt ein erhöhtes Risiko für Infektionen und das Auftreten eines Rezidivs. Adoptive Immuntherapien können dazu beitragen, die Immunrekonstitution zu beschleunigen. Die Indikation hierzu ist jedoch streng geregelt, da eine zusätzliche Immuntherapie mit Risiken, wie z.B. dem Auftreten einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD), verbunden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf das Auftreten von Komplikationen und das Überleben nach SZT. Dazu wurde ein multivariates Normwertmodell entwickelt, das die Beurteilung der Rekonstitution verschiedener Leukozytensubpopulationen ermöglicht. Der Einfluss der Regeneration spezifischer Immunzellen wie Cytomegalievirus-spezifischer T-Zellen (CMV-CTLs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs) auf den Verlauf nach SZT wurde insbesondere hinsichtlich CMV-bedingter Komplikationen, GvHD und Rezidiv untersucht.
Bei inflammatorischen Schmerzen kann durch Hemmung der COX-2 im Rückenmark die zentrale Sensibilisierung reduziert werden. Da die Hemmung der gesamten COX-2 vermittelten Prostaglandinsynthese jedoch zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wird in jüngster Zeit diskutiert, ob eine selektive Hemmung der PGE2 Synthese auf Ebene der mPGES-1 für die Therapie passagerer Schmerzen sinnvoller ist. Um die funktionellen Rollen von COX-2 und mPGES-1 im Rückenmark zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit die Folgen einer COX-Inhibierung und mPGES-1-Deletion auf den spinalen Eicosanoidmetabolismus, die neuronale Erregbarkeit, die Synthese proinflammatorischer Zytokine und das nozizeptive Verhalten untersucht. Das proinflammatorische Zytokin TNFa induzierte in primären Rückenmarksneuronen eine COX-2- und mPGES-1-Expression und eine erhöhte PGE2 Synthese. Diese Induktion der PGE2 Synthese konnte durch den selektiven COX-2 Inhibitor Rofecoxib und den „selektiven COX-1 Inhibitor“ SC-560 gleichermaßen potent gehemmt werden. Da der Effekt von SC-560 unerwartet war, wurde sein Wirkmechanismus genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen weder die COX-2 und mPGES-1 Expression, die PLA2 Aktivität, die mPGES-1 Aktivität noch den PGE2 Transport hemmte. Durch Experimente mit Zellen aus COX-1-/- Mäusen konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen die COX-2 unabhängig von COX-1 in nanomolaren Konzentrationen inhibiert. Da dieses Ergebnis den postulierten COX-1-selektiven Eigenschaften von SC-560 widersprach, wurde nach der Ursache für den Verlust der COX-1-Selektivität gesucht. Es zeigte sich, dass SC-560 in einer zellfreien in vitro Synthese und im Vollbluttest mit klarer Selektivität COX-1 hemmt. In kultivierten Rückenmarkszellen, RAW-Makrophagen und Blutzellen (Monozyten und Thrombozyten) inhibiert SC-560 allerdings d beide COX-Isoformen potent. Es wurde dadurch deutlich, dass die zelluläre Einbindung von COX-2 sowie ein niedriger Proteingehalt im extrazellulären Medium die halbmaximalen Konzentrationen (IC50) für die COX-2-Hemmung durch SC-560 stark reduzieren kann und hierdurch die COX-1-Selektivität der Substanz verloren geht. Neben einer COX-2 Hemmung verursachte auch eine mPGES-1-Deletion in Rückenmarkskulturen sowie im adulten Rückenmark eine Reduktion der PGE2 Synthese. Überrachenderweise bewirkte jedoch die mPGES-1-Defizienz im Gegensatz zur COX-2 Hemmung durch Etoricoxib im Zymosanmodell keine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie. Um die Ursache für die unterschiedliche antihyperalgetische Wirkung der COX-2-Hemmung und mPGES-1-Deletion zu finden, wurden zunächst die Konsequenzen für die gesamte Prostaglandinsynthese untersucht. Die Analyse mittels LC-MS/MS zeigte, dass im Rückenmark mPGES-1-defizienter Mäuse verstärkt PGI2, PGF2a und PGD2 synthetisiert wird. Da für alle drei Prostaglandine bereits pronozizeptive Effekte beschrieben wurden, wurde die Expression von den entsprechenden Rezeptoren im Rückenmark und die Konsequenzen der Rezeptoraktivierung auf die neuronale Erregbarkeit untersucht. Mittels „calcium imaging“ wurde demonstriert, dass selektive IP Rezeptoragonisten in Rückenmarksneuronen eine PKA und PKC vermittelte Phosphorylierung der NMDA Rezeptoren verursachen und die Aktivierbarkeit der NMDA Rezeptoren sensibilisieren. Eine Verstärkung des NMDA induzierten Calciumeinstromes konnte nach Applikation der anderen Prostaglandine nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen daher, dass in mPGES-1-defizienten Mäusen durch die Umleitung der Prostaglandinsynthese zu Prostacyclin die exzitatorischen NMDA Rezeptoren sensibilisiert und hierdurch die antihyperalgitische Wirkung von PGE2-Synthesehemmung kompensiert werden kann. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass mPGES-1 als Zielmolekül für die Schmerztherapie eher nicht eignet ist. mPGES-1-defiziente Tiere zeigten in inflammatorischen Schmerzmodellen ein normales nozizeptives Verhalten. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es nach einer mPGES-1 Deletion im Rückenmark zwar zur Reduktion der PGE2 Synthese aber auch gleichzeitig zur verstärkten Synthese anderer pronozizeptiv wirkender Prostaglandine kommt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte 5’- und 3’-untranslatierte Regionen (UTRs) von mRNAs aus H. volcanii bestimmt. Dieses Datenset wurde verwendet um (1) haloarchaeale UTRs zu charakterisieren, (2) Konsensuselemente für die Transkrikptionsinitiation und -termination zu verifizieren und (3) den Einfluss haloarchaealer UTRs auf die Initiation und Regulation der Translation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Transkripte nichtprozessierte 3’-UTRs mit einer durchschnittlichen Länge von 45 Nukleotiden besitzen. Darüber hinaus konnte ein putatives Transkriptionsterminationssignal bestehend aus einem pentaU-Motiv mit vorausgehender Haarnadelstruktur identifiziert werden. Die Analysen der Regionen stromaufwärts der experimentell bestimmten Transkriptionsstarts führten zur Identifizierung dreier konservierter Promotor Elemente: Der TATA-Box, dem BRE-Element und einem neuen Element an Position -10/-11. Überraschenderweise bestand die TATA-Box nur aus vier konservierten Nukleotiden. Die Untersuchung der UTRs ergab, dass die größte Anteil der haloarchaealen Transkripte keine 5’-UTR besitzt. Falls eine 5’-UTR vorhanden ist, besitzen unerwarteterweise nur 15% der 5’-UTRs aus H. volcanii eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene native und artifizielle 5’-UTRs ohne SD-Sequenz sehr effizient in vivo translatiert werden. Außerdem hat die Sekundärstruktur der 5’-UTR und die Position struktureller Elemente offenbar einen entscheidenden Einfluss auf die Translatierbarkeit von Transkripten. Die Insertion von Strukturelementen nahe des Startkodons führte zu einer vollkommenen Repression der Translation, während die proximale Insertion des Motivs an das 5’-Ende der 5’-UTR keinen Einfluss auf die Translationsseffizienz hatte. Zusammenfassend kann sowohl der eukaryotische Scanning-Mechanismus als auch die bakterielle Initiation der Translation über die SD-Sequenz für haloarchaeale Transkripte mit 5’-UTR ohne SD-Sequenz ausgeschlossen werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Identifizierung eines entsprechenden dritten Mechanismus zur Initiation der Translation in H. volcanii. Eine aktuelle Studie zur globalen Analyse der Translationsregulation zeigte, dass der Anteil translational regulierter Gene in H. volcanii genauso hoch ist wie bei Eukaryoten (Lange et al., 2007). Um die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Regulation der Translation zu charakterisieren, wurden die UTRs zweier ausgewählter translationsregulierter Gene untersucht. Es stellte sich heraus, dass nur die Anwesenheit beider UTRs, 5’- und 3’-UTR, zu einer Wachstumsphasen-abhängigen Regulation der Translation führt. Dabei hat die 3’-UTR allein keinen Einfluss auf die Translationseffizienz, während die 5’-UTR die Translationseffizienz in beiden Wachstumsphasen reduziert. Es zeigte sich außerdem, dass die 3’-UTR für die „Richtung“ der Regulation auf Translationsebene verantwortlich ist und putative Strukturelemente möglicherweise in den Regulationsmechanismus involviert sind. Zusammengefasst ergibt sich folgendes Modell der Translationsregulation in H. volcanii: Strukturierte 5’-UTRs führen zu einer Herabsetzung der konstitutiven Translationseffizienz. Dies kann differentiell durch regulatorische Faktoren kompensiert werden, welche spezifische Elemente der 3’-UTR binden. Sowohl natürliche als auch artifizielle Aptamere und allosterische Ribozyme stellen effektive Werkzeuge zur exogen kontrollierten Genexpression dar. Daher wurde die Anwendbarkeit eines Tetracyclin-induzierbaren Aptamers und eines konstitutiven Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii untersucht. Es stellte sich allerdings heraus, dass das Aptamer bereits ohne Tetracyclin starke inhibitorische Sekundärstrukturen ausbildet. Als Alternative wurden Reportergenfusionen mit einem selbstspaltenden Hammerhead-Ribozym konstruiert. Die selbstspaltende Aktivität des Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii konnte erfolgreich in vivo demonstriert werden, was die Grundlage zur Entwicklung konditionaler Expressionssysteme basierend auf dem Hammerhead-Ribozym in H. volcanii bildet.
Hämophilie A ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die aufgrund von Mutationen innerhalb des Gens von Gerinnungsfaktor VIII (FVIII) zum funktionellen Defekt oder zum Fehlen des körpereigenen FVIII führt. FVIII zirkuliert als Heterodimer und besteht aus einer schweren Kette mit der Domänenstruktur A1-A2-B und einer leichten Kette mit der Domänenstruktur A3-C1-C2. Bei Patienten unter Prophylaxe wird durch regelmäßige Substitution mit rekombinanten oder aus Plasma gewonnenen FVIII-Präparaten die Hämostase wiederhergestellt. Allerdings entwickeln hierbei etwa 30% der Patienten mit einer schweren Hämophilie eine FVIII-spezifische Immunantwort in Form von neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren). Die sogenannte Immuntoleranz-Therapie (engl. immune tolerance induction therapy, ITI) ist bisher die einzige etablierte Therapie, die zu einer dauerhaften Eradikation der FVIII-Inhibitoren und Induktion von Toleranz gegenüber FVIII führen kann. Die Therapie beruht auf einer meist täglichen Gabe hoher FVIII-Dosen, welche sich, je nach Behandlungsdauer, über Wochen bis hin zu Jahren erstrecken kann. Bei etwa 30% der Patienten ist diese Therapie nicht erfolgreich. Für solche Patienten besteht die Gefahr lebensbedrohlicher, unkontrollierbarer Blutungen und erheblicher Gelenkschäden.
Die spezifische Ansteuerung des Membran-gebundenen Immunglobulin G (mIg) des B-Zellrezeptors (BZR) mithilfe von Immuntoxinen ist eine mögliche Option zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen und somit zur Eradikation von FVIII-Inhibitoren. Solche Immuntoxine bestehen aus einer zellbindenden und einer zytotoxischen Domäne, welche nach Internalisierung zur Apoptose der Zielzelle führen soll. Da FVIII aufgrund der Größe als zellbindende Domäne ungeeignet ist, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Entwicklung und Evaluierung alternativer Immuntoxine zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen. Die FVIII-spezifische Immunantwort ist zwar polyklonal, jedoch vor allem gegen A2- und die C2-Domäne gerichtet. Aus diesem Grund wurden die humane A2- und C2-Domäne (hA2, hC2) als zellbindende Domäne verwendet und jeweils genetisch an eine verkürzte Version des Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa fusioniert, bei welcher die natürliche zellbindende Domäne entfernt wurde. Die rekombinanten Proteine wurden bakteriell produziert und im Anschluss an die Aufreinigung biochemisch charakterisiert. Während das bakterielle Expressionssystem für hA2-ETA nicht geeignet war, konnte hC2-ETA neben weiteren Kontrollproteinen mit korrekter Konformation der hC2-Domäne hergestellt und aufgereinigt werden.
Die Fähigkeit zur selektiven Eliminierung hC2-spezifischer B-Zellen wurde im weiteren Verlauf sowohl in vitro mithilfe einer hC2-spezifischen Hybridomazelllinie als auch ex vivo und in vivo mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen untersucht.
Durch Inkubation der hC2-spezifischen Hybridomazelllinie mit hC2-ETA konnten ca. 38 % der Zellen eliminiert werden. Weitere Untersuchungen der Zelllinie ergaben, dass diese keinen vollständigen funktionalen B-Zellrezeptor auf der Oberfläche exprimierte, welcher für die Bindung und die korrekte Internalisierung des Immuntoxins notwendig ist. Aufgrund dessen eignet sich diese Zelllinie nicht als Modell für eine genauere Analyse der in vitro Eliminierungseffizienz von hC2-ETA.
Weitere Analysen mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen haben jedoch gezeigt, dass durch ex vivo Inkubation der Splenozyten mit hC2-ETA, alle hC2-spezifischen B-Zellen vollständig, selektiv und konzentrations-abhängig eliminiert werden konnten. Auch die mehrfache Applikation von hC2-ETA in FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen führte bei der Hälfte der Tiere zur vollständigen Eliminierung aller hC2-spezifischen B-Zellen. Eine Reduktion des hC2-spezifischen Antikörpersignals konnte nach Gabe von hC2-ETA in allen behandelten Tieren beobachtet werden. Die unvollständige Eliminierung in der Hälfte der Tiere ist vermutlich auf die Präsenz hC2-spezifischer Antikörper zurückzuführen, die einen Teil des applizierten Immuntoxins neutralisiert haben, sodass nicht alle hC2-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen erreicht und eliminiert werden konnten. Um die Eliminierungseffizienz von hC2-ETA weiter zu erhöhen, müsste das Behandlungsprotokoll geändert werden. Sowohl eine Verlängerung des Behandlungszeitraums als auch eine kombinierte Therapie aus FVIII und hC2-ETA sollte zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit des Toxins und dadurch zu einer gesteigerten Eliminierungseffizienz führen.
Die Ausweitung des hier vorgestellten Ansatzes auf weitere FVIII-Domänen ist generell möglich, jedoch muss hierzu ein alternatives Expressionssystem aufgrund des eukaryotischen Ursprungs von FVIII in Betracht gezogen werden. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen dennoch, dass FVIII-Domänen-Immuntoxine ein wirkungsvolles Mittel sind, um FVIII-spezifische B-Zellen selektiv zu eliminieren. Die Anpassung der Gabe von FVIII-Domänen-Immuntoxinen an die individuelle Immunantwort des Patienten könnte das Auftreten von Nebenwirkungen minimieren. Außerdem könnte eine kombinierte Therapie aus ITI und FVIII-Domänen-Immuntoxinen die Zeit bis zur Induktion von Toleranz verkürzen und die Chancen für den generellen Therapieerfolg erhöhen.
Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved cytosolic isobutanol biosynthesis
(2021)
The finite nature of fossil resources and the environmental problems caused by their excessive usage requires alternative approaches. The transformation from a fossil based economy to one based on renewable biomass is called a “bioeconomy”. To substitute fossil resources, various microorganisms have already been modified for the biosynthesis of valuable chemicals from biomass. However, the development of such efficient microorganisms at an industrial scale, remains a major challenge. The most prominent and robust microorganism for industrial production is the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is known to produce ethanol that is used as renewable biofuel. However, S. cerevisiae is also naturally able to produce isobutanol in small amounts. Isobutanol is favoured as a biofuel compared to ethanol due to its higher octane number and lower hygroscopicity, which makes it more suitable for application in conventional combustion engines. In S. cerevisiae, the biosynthesis of isobutanol is permitted by the combination of mitochondrial valine synthesis (catalysed by Ilv2, Ilv5 and Ilv3) and its cytosolic degradation (catalysed by Aro10 and Adh2). The different compartmentalisation of the two pathways limit isobutanol biosynthesis. Thus, Brat et al. (2012) were able to increase the isobutanol yield up to 15 mg/gGlc by cytosolic re localisation of the enzymes Ilv2Δ54, Ilv5Δ48 and Ilv3Δ19 (cyt-ILV), with simultaneous deletion of ilv2. This corresponds to approximately 3.7% of the theoretical yield of 410 mg/gGlc, implying existing limitations in isobutanol biosynthesis, which have been investigated in this work.
For yet unknown reasons, isobutanol was only produced by S. cerevisiae in a valine free medium, according to Brat et al. (2012). This work shows that this can be attributed to the catalytic activity of Ilv2Δ54, which acted as growth inhibitor to S. cerevisiae. By this logic, a negative selection on the ILV2∆54 gene was exerted, which made the ilv2 deletion and simultaneous valine exclusion necessary to maintain the functional expression of toxic ILV2∆54. Furthermore, it was shown that valine exclusion is not mandatory due to the feedback regulation of Ilv2, permitted by Ilv6. Rather, increased isobutanol yield was observed when cytosolic Ilv6∆61 was expressed in the valine free medium, which is explained by the enhanced regulation of Ilv2Δ54 by Ilv6∆61 when BCAA are absent. Isobutanol biosynthesis is neither redox nor NAD(P)H co factor balanced. It was seen that co factor imbalance could be mitigated by the expression of an NADH oxidase (NOX), but not by expression of the NADH dependent ilvC6E6, since the latter showed low in vivo activity. Furthermore, it was seen that NAD(H) imbalance did already limit isobutanol biosynthesis, but the NADP(H) imbalance did not. Another limitation of cytosolic isobutanol biosynthesis is the secretion of the intermediate 2‑dihydroxyisovalerate, which then no longer is taken up by S. cerevisiae, causing a reduced isobutanol yield. This is attributed to insufficient Ilv3∆19 activity, due to poor iron sulphur cluster apo protein maturation. Therefore, it was aimed to replace Ilv3∆19 by heterologous dihydroxyacid dehydratases. Even though some of the enzymes were functionally expressed, none showed better in vivo activity than Ilv3∆19. Therefore, the Ilv3∆19 apo protein maturation was improved. This was achieved by the genomic deletion of fra2 or pim1 as well as by the cytosolic expression of Grx5∆29.
In addition to the isobutanol pathway, S. cerevisiae was optimised for isobutanol biosynthesis by rational and evolutionary engineering. For this purpose, the genes which are necessary for isobutanol production were integrated into the ilv2 locus, and the resulting strain was evolved in a medium containing the toxic amino acid analogue norvaline. Evolved single colonies were isolated, which presented improved growth and increased isobutanol yields (0.59 mg/gGlc) in a valine free medium, as compared to the initial strain. This is explained by a gene dosage effect which occurred during the evolutionary engineering experiment. In collaboration with Dr. Wess, the genes ilv2, bdh1/2, leu4/9, ecm31, ilv1, adh1, gpd1/2 and ald6 were cumulatively deleted in CEN.PK113 7D to block competing metabolic pathways. The resulting strain JWY23 achieved isobutanol yields up to 67.3 mg/gGlc, when expressing the cyt ILV enzymes from a multi copy vector. The most promising approaches of this work, namely the deletion of fra2 and the expression of Grx5∆29, Ilv6∆61, and NOX, were confirmed in this JWY23 strain. The highest isobutanol yield from this work was observed at 72 mg/gGlc for Ilv6∆61 and cyt ILV enzymes expressing JWY23, which corresponds to 17.6% of the theoretical isobutanol yield.
Isobutyric acid (IBA) is a by product of isobutanol biosynthesis, but it is also considered a valuable platform chemical. Therefore, the approaches that improved isobutanol biosynthesis were applied to the biosynthesis of IBA in S. cerevisiae. The highest IBA yield of 9.8 mg/gGlc was observed in a valine free medium by expression of cyt ILV enzymes, NOX and Ald6 in JWY04 (CEN.PK113 7D Δilv2; Δbdh1; Δbdh2; Δleu4; Δleu9; Δecm31; Δilv1). This corresponded to an 8.9 fold increase compared with the control and is, to our best knowledge, the highest IBA yield reported to date for S. cerevisiae.
Untersucht wurde die spätpleistozäne und holozäne Diatomeenflora aus drei Teilgebieten der westlichen Ostsee, dem Kattegat, der Kieler Bucht und der Pommerschen Bucht. Die Ergebnisse bestätigen die hervorragende Eignung der Diatomeen als Indikatororganismen in der Paläoökologie. Anhand der Mikroflora war es möglich, die wechselhafte Geschichte der verschiedenen Ostsee-Teilgebiete detailliert nachzuvollziehen. Es konnten Lage und Ausdehnung der Paläogewässer während der verschiedenen Stadien der Ostsee-Entwicklung sowie verschiedene abiotische Faktoren der Paläoumwelt - Salinität, pH-Wert, Trophie, Temperatur und Wassertiefe - rekonstruiert werden. Zur Rekonstruktion von Salinität, Trophie und pH-Wert kamen erstmals verschiedene Indikationssysteme - der Halobienindex nach ZIEMANN (1971), das Trophie-Indikationssystem nach HOFMANN (1994) und die pH-Rekonstruktion nach ARZET (1987) - zur Anwendung. Kattegat Der Schwerpunkt der Untersuchung lag auf dem südwestlich der Insel Anholt gelegenen Teil des Kattegats. In den 22 Kernprofilen konnten insgesamt 596 Diatomeentaxa registriert werden. In den Ablagerungen des Spätglazials waren im gesamten Untersuchungsgebiet keine silifizierten Mikrofossilien nachweisbar. Die anhand der seismoakustischen Untersuchungen aufgestellte Gliederung der holozänen Sedimente in die Abschnitte Holozän 1 (H1), Holozän 2 (H2) und Holozän 3 (H3) konnte durch die Analyse der Diatomeenfloren bestätigt werden. Die Ablagerungen des Sedimentabschnitts H1 entstanden während einer Transgressionsphase. Das in Alleröd und Jüngerer Dryas trockengefallene Untersuchungsgebiet wurde zu Beginn des Präboreals vollständig transgrediert. Durch das Auftreten halobionter Diatomeentaxa konnte der Beginn der Transgression im Untersuchungsgebiet auf den Anfang des Präboreals und ein Alter von 10.200 Jahren BP datiert werden. Für die Hauptphase der Transgression wurde ein Alter von rund 9.700 bis 9.300 Jahren BP ermittelt. In Übereinstimmung mit den seismoakustischen Befunden und den Ergebnissen der Makrofossil-Analyse konnte der Sedimentabschnitt H2 als Ablagerung aus dem Mündungsgebiet eines Fließgewässers identifiziert und auf ein Alter von rund 9.300 bis 8.300 Jahren BP datiert werden; wahrscheinlich entwässerte der Ancylus-See zumindest zeitweilig über den großen Belt in diesen Abschnitt des Paläokattegats. Die Diatomeenflora indiziert eine überwiegend durch den Einstrom von Süßwasser beeinflusste Paläoumwelt und ein alkalisches und eutrophes Milieu. Das charakteristische Merkmal der Thanathozönosen ist der hohe Anteil an allochthonen Schalen. Die Analyse der autökologischen Präferenzen zeigt, dass durchschnittlich 30 % der Taxa ursprünglich aus anderen Gewässertypen stammen. Mithilfe der Diatomeenflora konnte der Sedimentabschnitt H2 in drei Abschnitte untergliedert werden. Der Abschnitt H2a wurde während der Bildung einer Landzunge abgelagert, die die Mündung des Fließgewässers vom Paläokattegat trennte. Die Thanathozönosen indizieren die zunehmende Beeinflussung durch den Einstrom von Süßwasser. Der Abschnitt H2b wurde vor rund 8.800 Jahren BP deponiert, während die Landzunge ihre größte Ausdehnung und Isolationskraft erreichte. Die Diatomeenflora indiziert die maximale Beeinflussung durch den Zustrom von Süßwasser. Im Sedimentabschnitt H2c indizieren die Thanathozönosen die Verlagerung der Landzunge infolge küstendynamischer Prozesse und eine zunehmende Beeinflussung durch Meerwasser. Der Sedimentabschnitt H3, der während einer erneuten Transgression vor ca. 8.300 Jahren BP deponiert wurde, ist in weiten Bereichen vollständig frei von silifizierten Mikrofossilien. Eine autochthone, aus überwiegend halobionten Taxa zusammengesetzte Diatomeenflora ließ sich lediglich in einem der Kernprofile nachweisen. Das charakteristische Taxon der Transgressionsfloren in den Sedimentabschnitten H1 und H3 ist Paralia sulcata. Typisch sind des Weiteren Actinoptychus senarius, Cymatosira belgica, Dimeregramma minor, Ehrenbergia granulosa und Plagiogramma staurophorum. Kieler Bucht Aus der Kieler Bucht stand ein Kernprofil zur Verfügung. In diesem Profil konnten insgesamt 344 Diatomeentaxa nachgewiesen werden. Die brackischen Ablagerungen entstanden in der Mastogloia-Phase und konnten mithilfe der Diatomeenflora in zwei Abschnitte - Mastogloia 1 (M1) und Mastogloia 2 (M2) - untergliedert werden. Der Sedimentabschnitt M1 wurde deponiert, während das Milieu des Paläogewässers durch sporadische Ingressionen über den Großen Belt beeinflusst wurde. Die Diatomeenflora indiziert einen Paläosalzgehalt von maximal 9 Promille, ein eutrophes und alkalisches Paläomilieu und eine geringe Wassertiefe. Die Veränderungen im Artgefüge der Thanathozönosen innerhalb des Sedimentabschnitts M2 belegen einen kontinuierlichen Anstieg der Salinität um mindestens 8 Promille und das Auftreten starker Strömungen. Die Sedimentation erfolgte während des Übergangs vom brackigen Mastogloia-Stadium zur marinen Littorina-Phase. Mithilfe der Diatomeenflora konnte nachgewiesen werden, dass sich in dem Paläogewässer der Kieler Bucht frühestens vor 7.100 Jahren BP marine Verhältnisse etablierten. Die Flora indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 17 und maximal 30 Promille. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Sedimentanalyse konnten die Ablagerungen der Littorina-Phase anhand der Diatomeenflora in zwei Subzonen - Littorina 1 (L1) und Littorina 2 (L2) - untergliedert werden. Während das Artgefüge in dem Abschnitt L1 auf große Strömungsgeschwindigkeiten während der Sedimentation hinweist, belegt die Flora in dem Abschnitt L2 eine deutliche Abnahme der Strömungsintensität. Pommersche Bucht In den neun Kernprofilen aus der Pommerschen Bucht konnten insgesamt 265 Diatomeentaxa identifiziert werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der geologischen Untersuchungen zeigt die Diatomeenflora, dass sich der südliche Abschnitt der Pommerschen Bucht nach dem Rückzug des Eisschildes bis in das Atlantikum hinein unabhängig vom nördlichen Teil entwickelte; erst während der Littorina-Phase wurde auch der südliche Abschnitt transgrediert. Mithilfe der Diatomeenflora wurde belegt, dass sich im Spätglazial vor ca. 12.000 Jahren BP im Süden der Pommerschen Bucht ein alkalischer, meso- bis schwach eutropher Süßwassersee etablierte. Die Thanathozönosen indizieren erhebliche Milieuunterschiede zwischen diesem See und dem Baltischen Eisstausee, der zeitweise den nördlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht bedeckte. Im frühen Holozän entwickelte sich im südlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht an gleicher Position wie im Spätglazial wiederum ein Süßwassersee, während der nördliche Abschnitt der Pommerschen Bucht vom Ancylus-See bedeckt war. Die Diatomeenfloren belegen, dass sich die Umweltbedingungen in beiden Paläogewässern ähnelten; sowohl im Norden als auch im Süden lag ein alkalisches und überwiegend eutrophes Milieu vor. Der Beginn der Mastogloia-Phase ist durch einen drastischen Wechsel im Artgefüge der Diatomeenflora gekennzeichnet; Taxa mit höherer Salinitätstoleranz, z. B. Epithemia turgida und Diploneis didyma, ersetzten die rein oligohalobe Ancylus-Flora. Die Veränderungen indizieren einen schwachen aber deutlichen Anstieg der Salinität im Norden der Pommerschen Bucht. Das charakteristische Taxon der Littorina-Phase ist die polyhalobe Planktonart Thalassionema nitzschioides. Es indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 13 Promille. Des Weiteren belegen die Diatomeen den stetig steigenden Wasserspiegel zu Beginn der Littorina-Phase. Chrysophyceen-Zysten, Chaetoceros-Sporen und die Skelette des Silicoflagellaten Distephanus speculum stellen in der Pommerschen Bucht wichtige Leitfossilien dar. Während Chrysophyceen-Zysten typisch für die Sedimente der Mastogloia-Phase sind, haben Chaetoceros-Sporen und Distephanus speculum charakteristischerweise ihren Verbreitungsschwerpunkt in den Ablagerungen des Littorina-Meers.