Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
Der Elektronentransfer von NADH zu Sauerstoff ist ein essentieller Bestandteil im Energiehaushalt der Zelle und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. Hohe Geschwindigkeit und Spezifität dieser Reaktionen sind dabei von großer Bedeutung. In der Atmungskette von Paracoccus denitrificans und Thermus thermophilus wird Sauerstoff durch Cytochrom c Oxidasen umgesetzt. Beide Enzymkomplexe erhalten die für diese Reaktion notwendigen Elektronen von einem Cytochrom c552 in einer sehr schnellen bimolekularen Reaktion bei hoher Selektivität für das Partnerprotein. Hauptziel dieser Arbeit war es, lösliche Module der elektronenakzeptierenden CuA-Domäne der Cytochrom c Oxidasen zu generieren, das Kupferzentrum zu rekonstituieren und die Proteine für Wechselwirkungsstudien mit den Cytochrom c-Partnern zugänglich zu machen. Die Charakterisierung der Elektronentransferreaktionen erfolgte durch stopped-flow Spektroskopie und ermöglichte die Bestimmung der bimolekularen Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten unter verschiedenen Ionenstärkebedingungen. Ein Vergleich zwischen dem mesophilen Reaktionspaar aus P. denitrificans mit dem thermophilen aus T. thermophilus zeigte die unterschiedlichen Interaktionsmechanismen auf. Während die Reaktion in T. thermophilus weitgehend auf Ladungsinteraktionen verzichtet, wurde für die Reaktanden aus P. denitrificans eine Beteiligung von 2 - 3 Ladungen mit entgegengesetztem Vorzeichen auf jedem Protein festgestellt. Die Interaktionen wurden weiterhin durch chemical-shift-perturbation Experimente mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert. Durch Isotopenanreicherung des Cytochroms c552 aus P. denitrificans konnten für dieses Protein Aminosäurereste identifiziert werden, die an einer direkten Bindung mit dem CuA-Partnerprotein beteiligt sind. In einem ähnlichen Ansatz wurde auch die Interaktionsfläche der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus charakterisiert. Für das Cytochrom c552 aus P. denitrificans konnte gezeigt werden, daß bei direkten Kontakten zwischen den Proteinen fast keine Ladungen beteiligt sind und primär ungeladene Reste die Wechselwirkung dominieren. Ein ähnliches Bild wurde auch für die Interaktion der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus mit ihrem Substrat ermittelt. Für die lösliche CuA-Domäne aus P. denitrificans konnte aufgrund der geringen Stabilität keine Zuordnung durchgeführt werden, so daß eine Charakterisierung der Interaktionsfläche nicht möglich war. Weiterhin wurde ein für T. thermophilus bisher nicht beschriebener Komplex III aufgrund von Sequenzdaten identifiziert. Eine lösliche Domäne des membranständigen Cytochrom c1 wurde in E. coIi heterolog exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die Elektronentransferkinetiken zum Cytochrom c552 wurden durch stopped-flow Spektroskopie aufgenommen, und das Cytochrom c1 wurde als effizienter Elektronendonor für das Protein identifiziert. Für spätere Mutageneseansätze wurde ein Plasmid-basiertes Expressionssystem für das extrem thermophile Eubakterium T. thermophilus etabliert, um Schwierigkeiten, die bei der Expression von Cofaktor-tragenden Membranproteinen auftreten können, zu umgehen. Durch Expression eines löslichen c-Typ Cytochroms und der ba3-Cytochrom c Oxidase in T. thermophilus konnte gezeigt werden, daß dieses homologe Expressionssystem funktional ist und damit rekombinante Proteine exprimiert werden können. Durch die Konstruktion von Histidin-Tags konnte die Aufreinigung der Proteine erleichtert werden und eine notwendige Abgrenzung von chromosomal kodierten Wildtyp-Formen erfolgen.
Funktionelle und strukturelle Untersuchungen an der Diisopropylfluorophosphatase aus L.vulgaris
(2003)
Das Ziel dieser Arbeit war, mittels gezielter Mutagenese den postulierten Reaktionsmechanismus der durch die DFPase katalysierten Reaktion zu untermauern und gegebenenfalls weitere an der Hydrolysereaktion beteiligte Reste zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Rolle der Ca-1 Liganden untersucht. Hierbei ergab sich, dass sowohl die Nettoladung an der Ca-1-Bindungsstelle als auch die Positionen der Ladungen für den Erhalt der katalytischen Aktivität des Enzyms von Bedeutung sind. Die Einführung einer dritten negativen Ladung in der Bindungsstelle führte zum nahezu kompletten Aktivitätsverlust, was, wie die kristallographischen Untersuchungen der N175D-Mutante ergaben, hauptsächlich auf die veränderte Elektrostatik in der Bindungsstelle zurückzuführen ist. Durch eine Reihe von Mutationen des für die katalytische Aktivität als essentiell beschriebenen His287-Restes konnte gezeigt werden, dass auch andere, hydrophobe Reste an dieser Position die Katalyse ermöglichen. Die Fähigkeit dieser Reste, Wasserstoffbrücken mit Trp244 auszubilden, könnte für die Katalyse zwar förderlich sein, ist aber nicht unbedingt notwendig. Außerdem scheint die vom His287 vermutlich durchgeführte Aktivierung des hydrolytischen Wassermoleküls ebenfalls nicht essentiell für die enzymatische DFP-Spaltung zu sein. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte der von Scharff et al. (2001a) vorgeschlagene Reaktionsmechanismus zumindest teilweise bestätigt werden. Gleichzeitig konnte jedoch gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion auch ohne einige der in der Wildtyp-DFPase gegebenen Voraussetzungen - wie das Bestehen einer Wasserstoffbrücke zwischen His287 und Trp244, sowie eine durch das His287 durchgeführte Wasseraktivierung - ablaufen kann. Es konnte außerdem mittels gezielter Mutagenese gezeigt werden, dass die hydrophoben Anteile in der gesamten Substratbindungstasche und speziell an der Position 173 für die Substratbindung und -umsetzung eine wichtige Rolle spielen. Wie bereits bekannt, ist das Ca-2 Ion für die Stabilität der DFPase von großer Bedeutung. Mit Hilfe einer Mutation an der Ca-2-Bindungsstelle konnte gezeigt werden, dass der Verlust einer negativen Ladung die Koordination des Ca-2 Ions offensichtlich abschwächt. Die Position des Calciumions konnte in der D232S-Mutante nicht eindeutig definiert werden, obwohl die Struktur und die Aktivität des Enzyms intakt geblieben sind. Außerdem wurden, bedingt durch die Einführung dieser Mutation, geringe strukturelle Veränderungen im aktiven Zentrum des Enzyms hervorgerufen, was auf Wechselwirkungen zwischen den beiden Calciumbindungsstellen hindeutet. Dies könnte auf das ausgedehnte Wasserstoffbrückennetzwek im Inneren des die DFPase durchspannenden Tunnels zurückzuführen sein. Die Untersuchung verschiedener anderer, im zentralen Tunnel der DFPase gelegener Reste deutet ebenfalls auf die Existenz eines solchen Wasserstoffbrückennetzwerks hin, welches für die Aufrechterhaltung der katalytischen Funktion sowie der Strukturstabilität der DFPase von erheblicher Bedeutung zu sein scheint. Die für die Reste His287, Glu37, Ser271 postulierte Beteiligung an der katalytischen Reaktion konnte durch die Bestimmung der kinetischen Parameter dieser Mutanten untermauert werden. Die H287N-Mutante besitzt sehr niedrige KM- und Vmax-Werte, was die Bedeutung dieses Restes für die Katalyse unterstreicht. Kinetische Messungen wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal mit dem rekombinanten Enzym und außerdem auch den DFPase-Substraten Sarin, Soman und Tabun durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Messungen haben gezeigt, dass die DFPase auch zur Dekontamination dieser letztgenannten Organophosphate effizient eingesetzt werden kann. Schließlich konnte mittels Gleichgewichtsdialyse das niederaffin gebundene Calciumion der DFPase gegen Co2+ und Tm3+ ausgetauscht werden. Da die Verwendung dieser Metalle für NMR-spektroskopische Messungen von "residual dipolar couplings" gedacht war, wurden 15N-angereicherte Proben des derivatisierten Proteins hergestellt, welche die für die NMR-Experimente notwendige Stabilität besassen.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient in mehrzelligen Organismen nicht nur als mechanische Stütze, sondern nimmt direkten Einfluss auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration. Die Discoidin-Domain-Rezeptoren (DDR) 1 und 2 sind die bisher einzig bekannten ECM-bindenden Rezeptoren mit einer intrinsischen Kinaseaktivität. Rezeptor- Tyrosinkinasen spielen bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle. Sie nehmen durch Bindung spezifischer Liganden Signale außerhalb der Zelle auf und initiieren eine Signalkaskade, die letzlich zur Transkription oder Repression von Zielgenen führt. Nach Bindung von nativem Kollagen an die Rezeptoren DDR1 und DDR2 kommt es zu einer Homodimerisierung, die zur Autophosphorylierung der Rezeptoren führt. Eine generierte DDR1-Knock-out-Maus zeigt einen Defekt in der Differenzierung der Brustdrüse und ist nicht in der Lage, ihre Jungen zu säugen, die genauen Ursachen hierfür sind jedoch bislang unbekannt. Ebenso sind die Zielgene der aktivierten Rezeptoren und insbesondere die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse bislang wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde nach Zielgenen, die durch die Signalkaskade von DDR1 und DDR2 in ihrer Transkription beeinflusst werden, gesucht. Außerdem wurde die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse im Detail analysiert. Zur Auffindung von Zielgenen wurden Zelllinien generiert, in denen die Expression von DDR durch Doxycyclin reprimierbar ist und mit Hilfe von Microarrays auf die Deregulation von Matrixgenen sowie Matrix-assoziierten und -modifizierenden Genen untersucht. Agrin und alpha 3-Integrin konnten als gemeinsame, reprimierte Zielgene von DDR1 und 2 identifiziert werden. Der P-Selectin-Ligand PSGL-1 und das Proteoglykan Decorin wurden von beiden Rezeptoren induziert. Weiterhin wurde das Brustdrüsengewebe trächtiger DDR1-Knock-out-Mäuse mit dem Brustdrüsengewebe heterozygoter Mäuse verglichen. Dazu wurden Microarrays verwendet, auf denen 15.000 Gene abgebildet waren. Die Analyse zeigte eine Repression von MDGI (Mammary derived growth inhibitor), Osteopontin und WDNMI in DDR1-Knock-out-Mäusen, während die Transkription des IGF-Bindeprotein IGFBP-5 erhöht war. Die Deregulationen konnten mittels Real-time-PCR verifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von DDR1 in der nichttransformierten Brustepithelzelllinie HC11 und in primären Brustepithelzellen aus DDR1-Knock-out Mäusen untersucht. Dabei konnte ein Defekt von DDR1-Knock-out Zellen in der terminalen Differenzierung beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu differenzierten DDR1 überexprimierende HC11-Zellen schneller als HC11-Wildtyp-Zellen und bildeten größere Mengen des Differenzierungsmarkers beta-Kasein. Die Analyse verschiedener Signalwege, die bei der Differenzierung von Brustepithelzellen angeschaltet werden, zeigte, dass DDR1 eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion von Stat5a/b spielt. Die Prolaktin induzierte Stat5a/b-Phosphorylierung war in DDR1 exprimierenden HC11 Zellen stärker und länger anhaltend als in parentalen HC11 Zellen. Dieser Effekt konnte nach Aktivierung von DDR1 durch Typ I Kollagen noch verstärkt werden. In der vorliegenden Arbeit konnten PSGL-1, Decorin, Agrin und Integrina3 als Zielgene in DDR1 und DDR2 überexprimierenden Zellen identifiziert werden. Ferner wurde im Brustdrüsengewebe von DDR1-Knock-out-Mäusen eine Repression von MDGI, Osteopontin und WDNMI sowie eine Induktion von IGFBP-5 gefunden. Die Analyse DDR1 überexprimierender HC11 Zellen und primärer DDR1-Knock-out-Brustepithelzellen zeigte, dass DDR1 eine essentielle Rolle in der terminalen Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Dabei konnte erstmals ein Einfluss von DDR1 auf die Prolaktin-induzierte Aktivierung von Stat5a/b gezeigt werden.
Durch Substitution der vier Cysteine des a-Amylase-Inhibitors Tendamistat wurden Disulfidmutanten erzeugt. Zur Herstellung wurde im Rahmen dieser Arbeit die statistische Mutagenese angewandt. Die beiden Mutanten 11H27I45R73T und 11H27N45S73D wurden mit einem kombinierten Verfahren aus Olignukleotidsynthese und PCR erzeugt. Dieses hat als Grundlage die Genkassette, die in pT136 und pAX5a enthalten ist. Durch die gleichzeitige Veränderung beider Cysteine einer Disulfidbrücke sind Probleme mit der Einschränkung in der Variantenvielfalt nicht vorhanden, sowie mehrfache Mutationszyklen nicht notwendig. Die 4-fach-Mutanten wurden in Streptomyces lividans kloniert und exprimiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß stabiles Tendamistat erhalten wird. Damit wurde Disulfidbrücken-freies Tendamistat erhalten, ohne zusätzliche Mutationen einführen zu müssen.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
Ziel dieser Arbeit war es, mit den Methoden der NMR-Spektroskopie die elektrostatischen Eigenschaften der Xylanase aus Bacillus agaradhaerens in Abhängigkeit vom pH-Wert zu charakterisieren. Für die vorliegende Arbeit wurde das Strukturgen der Xylanase in verschiedene Expressionsvektoren des pET-Systems kloniert, wobei das Enzym auf 207 Aminosäuren verkürzt wurde. Diese Länge entspricht der publizierten Kristallstrukur von Sabini et al. (1999). Die Expression in pET3a und die Aufreinigung des Genproduktes mit Ionenaustauschchromatographie wurde optimiert, sodass homogenes Protein mit guten Ausbeuten erhalten werden konnte. Die Xylanase wurde mit den Isotopen 15N und 13C markiert und heteronukleare, mehrdimensionale NMR-Spektren wurden für die Zuordnung der Resonanzen des Proteins aufgenommen. Die chemischen Verschiebungswerte des Proteinrückgrats und die der aliphatischen Seitenketten wurden vollständig zugeordnet. Als eine weitere Voraussetzung für eine pH-Titration wurden sequenzspezifisch die Resonanzen der Histidin- bzw. Carboxylatgruppen bestimmt. Die Lösungsstruktur der Xylanase wurde anhand mehrerer automatisierter Prozeduren errechnet, um die Zuordnung der Resonanzen zu validieren. Alle Strukturelemente, die bereits aus der Kristallstruktur bekannt sind, wurden korrekt wiedergegeben. Da die Lösungsstruktur mit einem backbone RMSD-Wert von 2.44 ± 0.29 Å hoch 2 als vorläufig zu betrachten war, wurde im Folgenden ausschließlich die Kristallstruktur zur Bewertung der Distanzbeziehungen verwendet. In Abwesenheit des Substrats wurden die pH-abhängigen Resonanzen der Histidin- und Carboxylatgruppen sowie der Amide des Proteinrückgrats gemessen. Die Auswertung ergab 220 Titrationsprofile der 15N- and 13C-Resonanzen in einem pH-Bereich von 3.2 bis 8.7. Durch nichtlineare Regression der gemessenen Werte an eine modifizierte Henderson-Hasselbalch Gleichung wurden die pK S-Werte der Seitenketten von Aspartat und Glutamat, sowie für das C-terminale Carboxylat und für die Histidingruppen bestimmt. Die Titrationskurven der katalytischen Dyade zeigten eine ausgeprägte gegenseitige Wechselwirkung. Die korrespondierenden pK S-Werte stimmen gut mit dem vorhergesagten enzymatischen Mechanismus überein (Sabini et al., 1999) und belegen, dass das Nukleophil Glu94 bei einem neutralem pH-Wert deprotoniert ist, während die Bronsted Säure/Base GIu184 zu ca. 30% protoniert ist. Um die Untersuchungen zur katalytischen Aktivität zu vervollständigen, wurden alle pH-abhängigen [15N]-Resonanzen der Amide des Proteinrückgrats wie auch die der lndolstickstoffe in der Substratbindungsspalte analysiert. Die Wendepunkte konnten dem Titrationsverhalten der benachbarten sauren Aminosäure-Seitenketten zugeordnet werden. Aber es erscheint sehr wahrscheinlich, dass ein wesentlich komplexerer Ablauf stattfindet. Die asymmetrische Wechselwirkung von Trptophan-Seitenketten bezüglich der katalytischen Dyade wie auch das wechselnde Monotonieverhalten der Titrationskurven deuten auf eine simultane Reorganisation der Seitenkettenkonformere bei pH ungefähr gleich 6 und/oder auf eine Änderung des Wasserstoffbrückennetzwerkes innerhalb der Bindungsspalte.
In dieser Arbeit wurde die Kinetik von zwei Ca2-plus-aktivierten Membranproteinen untersucht: zum einen des endogenen Ca2-plus-aktivierten Chloridkanals der Xenopus-Oozytenmembran, zum anderen des heterolog in Oozyten exprimierten Na-plus-Ca2-plus-Austauschers NCX1, kloniert aus dem Meerschweinchen-Herzen. Der Ca2-plus-aktivierte Chloridkanal wird durch intrazelluläres Ca2-plus im submikromolaren Konzentrationsbereich (KD = 0.5 µMCa2-plus) aktiviert und hat eine hohe Permeabilität für Chloridionen. In der ausgereiften Eizelle spielt er eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des Fertilisationspotentials und verhindert durch eine Depolarisation der Membran eine Polyspermie. Der Na-plus-Ca2-plus-Austauscher ist in der Herzmuskelzelle für die Ausbildung des Exzitations- Kontraktions-Zyklus von Bedeutung, indem er für die Aufrechterhaltung des Ca2-plus- Gradienten (freies Ca2 intrazellulär ungefähr gleich 100 nm, extrazellulär ungefähr gleich 2 mM) über die Plasmamembran verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen transportiert der Na-plus- Ca2-plus-Austauscher ein Ca2-plus-Ion im Austausch gegen drei Na-plus-Ionen aus der Zelle hinaus, und nutzt somit den Na-plus-Gradienten neben dem Membranpotential als treibende Kraft. Als Messmethode wurde die Patch-Clamp-Technik in der inside-out-Makro-Patch- Konfiguration verwendet. Die Patch-Clamp-Technik erlaubt definierte ionale Bedingungen auf beiden Seiten der Membran. Cytoplasmatische Ca2-plus-Konzentrationssprünge wurden zum einen durch Lösungswechsel, insbesondere aber durch die Photolyse von DM-Nitrophen, einem photolabilen Ca2-plus-Chelator, hervorgerufen. Die Photolyse von DM-Nitrophen erlaubte, im Vergleich zum Lösungswechsel, sehr schnelle Ca2-plus- Konzentrationssprünge (Ca2-plus-Freisetzungsrate mindestens 38000 s-1). Die kinetischen Untersuchungen am Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal haben neue, über bisherige aus dem Lösungswechselexperiment bekannte hinausgehende, Erkenntnisse ergeben: Nach einem schnellen Ca2-plus-Konzentrationssprung geht dem Signalanstieg auf einen stationären Wert eine deutlich schnellere Verzögerungsphase (lag-phase) voraus. Sowohl der Signalanstieg als auch die Verzögerungsphase zeigen eine starke Ca2-plus-Abhängigkeit, sind aber nur sehr schwach spannungsabhängig. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Signalanstieg den spannungsabhängigen Ca2-plus-Bindungs-/Dissoziationsschritt von mindestens zwei Ca2-plus-Ionen widerspiegelt, während das spannungsunabhängige Kanalöffnen/ -Schließen durch die Verzögerungsphase repräsentiert wird. Bei Spannungssprungexperimenten mit hoher Zeitauflösung konnte eine schnelle Inaktivierung nach einer Depolarisation der Membran gesehen werden, die in Gegenwart von sättigenden intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationen zu einer Einwärtsgleichrichtung der Strom-Spannungskennlinie des stationären Stroms führt. Mit diesen Erkenntnissen konnte ein Reaktionsmodell für den Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal aufgestellt werden, mit dem sich die experimentellen Daten simulieren ließen. Die heterologe Expression des Na-plus-Ca2-plus-Austauschers in Oozyten hat zu einem deutlich verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu früheren Messungen am nativen Austauscher in Cardio-Myocyten-Membranen geführt. Mit Hilfe der Photolyse von DM-Nitrophen konnte erstmals eine vollständige Ca2-plus- und Spannungsabhängigkeit des vorstationären Einwärtsstroms, hervorgerufen durch einen cytoplasmatischen Ca2-plus-Konzentrationssprung, durchgeführt werden. Sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus- Austauschmodus zeigt sich ein transientes Einwärtsstromsignal (Anstieg messtechnisch nicht auflösbar), das sehr schnell relaxiert. Im Ca2-plus-Ca2-plus-Austauschmodus zeigt sich nur ein transientes Stromsignal (kein Nettoladungstransport im stationären Zustand), während im Na-plus-Ca2-plus-Austausch sich ein stationärer Einwärtsstrom einstellt. Das transiente Stromsignal hat eine deutliche Ca2-plus-Abhängigkeit sowohl für den Spitzenstrom (KM = 30.9 ± 3.0 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 57 ± 10 µM im Ca2-plus- Ca2-plus-Austausch) als auch für die Geschwindigkeitskonstante 1/t des Signalabfalls (KM = 98.5 ± 21.3 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 76 ± 11 µM im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch) gezeigt. Die Relaxation des Stromtransienten erfolgt sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus-Austausch mit einer maximalen Geschwindigkeitskonstanten von ungefähr gleich 10000 s -1 nach sättigenden Ca2-plus-Konzentrationssprüngen. Der Signalabfall hat sich über den gesamten untersuchten Ca2-plus-Konzentrationsbereich als spannungsunabhängig herausgestellt, während der Spitzenstrom bei positiven Membranpotentialen deutlich abnimmt. Dies führt zu einer Spannungsabhängigkeit der verschobenen Ladung (Integral des transienten Stromsignals) im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch. Aus diesen Erkenntnissen konnte für den Ca2-plus- Translokationszweig (im Rahmen eines konsekutiven Transportmodells) folgendes Reaktionsschema aufgestellt werden: Einem spannungsunabhängigen, sehr schnellen Ca2-plus- Bindungs/-Dissoziationsschritt (diffusionskontrolliert) auf der intrazellulären Membranseite folgt ein ebenfalls spannungsunabhängiger, aber ratenlimitierender Schritt (intrazellulärer Okklusionsschritt, asymmetrische Raten: 10000 vs. 1000 s-1). Der nachfolgende Ca2-plus-Translokationschritt muss sehr hohe Hin- und Rückraten aufweisen (ungefähr gleich 20000 s-1). Die Ca2-plus-Dissoziation/-Bindung auf der extrazellulären wird als sehr schnell (diffusionskontrolliert) und spannungsunabhängig angenommen. Weitergehende Einblicke haben der Sr2-plus-Ca2-plus- und der Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch geliefert. Während der Sr2-plus-Ca2-plus-Austausch nahezu das gleiche Verhalten wie der Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch gezeigt hat, konnte nach einem intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationssprung im Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch erstmals eine zusätzliche langsame Phase im Abklingen des transienten Einwärtsstromsignals beobachtet werden. Das transiente Signal hat im Vergleich zum Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch eine signifikant höhere Ladungsverschiebung aufgewiesen. Dies deutet auf einen zusätzlichen elektrogenen Reaktionsschritt hin (extrazelluläre Ca2-plus-Okklusion). Weitere elektrogene Schritte müssen im Na-plus-Translokationszweig (Na-plus-Bindungs- und Na-plus-Translokationsschritt) liegen. Mit den aus diesen Erkenntnissen aufgestellten Reaktionsschemata ließen sich die experimentellen Daten erfolgreich simulieren. Die Gesamttransportrate im Na-plus-Ca2-plus- Austausch liegt demnach bei ungefähr gleich 1000 s-1 bei Raumtemperatur und stimmt damit mit Literaturwerten von mehreren 1000 s-1 bei physiologischer Temperatur überein.