Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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In contrast to the class A heat stress transcription factors (Hsfs) of plants, a considerable number of Hsfs assigned to classes B and C have no evident function as transcription activators on their own. In the course of my PhD work I showed that tomato HsfB1, a heat stress induced member of class B Hsf family, is a novel type of transcriptional coactivator in plants. Together with class A Hsfs, e.g. tomato HsfA1, it plays an important role in efficient transcrition initiation during heat stress by forming a type of enhanceosome on fragments of Hsp promoter. Characterization of promoter architecture of hsp promoters led to the identification of novel, complex heat stress element (HSE) clusters, which are required for optimal synergistic interactions of HsfA1 and HsfB1. In addition, HsfB1 showed synergistic activation of the expression of a subset of viral and house keeping promoters. CaMV35S promoter, the most widely expressed constitutive promoter turned out to be the the most interesting candidate to study this effect in detail. Because, for most house-keeping promoters tested during this study, the activators responsible for constitutive expression are not known, but in case of CaMV35S promoter they are quite well known (the bZip proteins, TGA1/2). These proteins belong to the acidic activators, similar to class A Hsfs. Actually, on heat stress inducible promoters HsfA1 or other class A Hsfs are the synergistic partners of HsfB1, whereas on house-keeping or viral promoters, HsfB1 shows synergistic transcriptional activation in cooperation with the promoter specific acidic activators, e.g. with TGA proteins on 35S promoter. In agreement with this the binding sites for HsfB1 were identified in both house-keeping and 35S promoter. It has been suggested during this study that HsfB1 acts in the maintenance of transcription of a sub-set of house-keeping and viral genes during heat stress. The coactivator function of HsfB1 depends on a single lysine residue in the GRGK motif in its CTD. Since, this motif is highly conserved among histones as the acetylation motif, especially in histones H2A and H4,. It was suggested that the GRGK motif acts as a recruitment motif, and together with the other acidic activator is responsible for corecruitment of a histone acetyl transferase (HAT). So, the effect of mammalian CBP (a well known HAT) and its plant orthologs (HAC1) was tested on the stimulation of synergistic reporter gene activation obtained with HsfA1 and HsfB1. Both in plant and mammalian cells, CBP/HAC1 further stimulated the HsfA1/B1 synergistic effect. Corecruitment of HAC1 was proven by in vitro pull down assays, where the NTD of HAC1 interacted specifically both with HsfA1 and HsfB1. Formation of a ternary complex between HsfA1, HsfB1 and CBP/HAC1 was shown via coimmunoprecipitation and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). In conclusion, the work presented in my thesis presents a new model for transcriptional regulation during an ongoing heat stress.
In an attempt to search for potential candidate molecules involved in the pathogenesis of endometriosis, a novel 2910 bp cDNA encoding a putative 411 amino acid protein, shrew-1 was discovered. By computational analysis it was predicted to be an integral membrane protein with an outside-in transmembrane domain but no homology with any known protein or domain could be identified. Antibodies raised against the putative open-reading frame peptide of shrew-1 labelled a protein of ca. 48 kDa in extracts of shrew-1 mRNA positive tissues and also detected ectopically expressed shrew-1. In the course of my PhD work, I confirmed the prediction that shrew-1 is indeed a transmembrane protein, by expressing epitope-tagged shrew-1 in epithelial cells and analysing the transfected cells by surface biotinylation and immunoblots. Additionally, I could show that shrew-1 is able to target to E-cadherin-mediated adherens junctions and interacts with the E-cadherin-catenin complex in polarised MCF7 and MDCK cells, but not with the N-cadherin-catenin complex in non-polarised epithelial cells. A direct interaction of shrew-1 with beta-catenin could be shown in an in vitro pull-down assay. From this data, it could be assumed that shrew-1 might play a role in the function and/or regulation of the dynamics of E-cadherin-mediated junctional complexes. In the next part of my thesis, I showed that stable overexpression of shrew-1 in normal MDCK cells. causes changes in morphology of the cells and turns them invasive. Furthermore, transcription by ²-catenin was activated in these MDCK cells stably overexpressing shrew-1. It was probably the imbalance of shrew-1 protein at the adherens junctions that led to the misregulation of adherens junctions associated proteins, i.e. E-cadherin and beta-catenin. Caveolin-1 is another integral membrane protein that forms complexes with Ecadherin- beta-catenin complexes and also plays a role in the endocytosis of E-cadherin during junctional disruption. By immunofluorescence and biochemical studies, caveolin-1 was identified as another interacting partner of shrew-1. However, the functional relevance of this interaction is still not clear. In conclusion, it can be said that shrew-1 interacts with the key players of invasion and metastasis, E-cadherin and caveolin-1, suggesting its possible role in these processes and making it an interesting candidate to unravel other unknown mechanisms involved in the complex process of invasion.
Zahnwale sind die einzige Säugetiergruppe, die umfassend an ein Leben im Wasser angepasst ist und dabei ein aktives Sonarsystem zur Orientierung nutzt. Wahrscheinlich produzieren alle Zahnwalarten sonische oder ultrasonische Klicklaute, deren Echos die Tiere zu einem drei-dimensionalen "akustischen Bild" zusammensetzen. Im Gegensatz zu den meisten anderen Säugetieren produzieren Zahnwale diese Laute im Nasen-Komplex durch einen pneumatisch betriebenen Mechanismus. Jedoch spielt auch der Kehlkopf dabei eine wichtige Rolle, indem er den nötigen Luftdruck in der Nase erzeugt. Die Ergebnisse werden in Bezug auf die physikalischen Voraussetzungen eines Bio-Sonars in einer aquatischen Umwelt interpretiert. Um die morphologischen Eigenschaften (Struktur, Form, Topographie) der Organe im Kopf verschiedener Zahnwalarten vollständig zu erfassen, wurden diese mittels Computertomographie und Magnetresonanztomographie gescannt. Daraufhin wurden die Köpfe makroskopisch präpariert und histologische Schnitte von Gewebeproben angefertigt. Schließlich wurden die Ergebnisse durch digitale dreidimensionale Rekonstruktionen vervollständigt. Diese Studie basiert zum größten Teil auf der Untersuchung von Schweinswalen (Phocoena phocoena) und Pottwalen (Physeter macrocephalus). Zum Vergleich wurden fetale und postnatale Individuen anderer Zahnwalarten herangezogen wie Delphinartige (Delphinus delphis, Stenella attenuata, Tursiops truncatus), Flussdelphinartige (Pontoporia blainvillei, Inia geoffrensis) und der Zwergpottwal (Kogia breviceps). Im Allgemeinen konnte durch die morphologischen Daten dieser Studie die einheitliche "phonic lips-Hypothese der Schallproduktion bei Zahnwalen, wie sie von Cranford, Amundin und Norris [J. Morphol. 228 (1996): 223-285] aufgestellt wurde, bestätigt werden. Diese Hypothese beschreibt eine ventilartige Struktur in der Nasenpassage, den sogenannten "monkey lips/dorsal bursae complex" (MLDB) als Schallgenerator. Der pneumatische Mechanismus lässt die beiden Hälften des MLDB aufeinanderschlagen und erzeugt damit die initiale Schallschwingung im Gewebe ("phonic lips"). Diese Vibration wird über die Melone, einen großen Fettkörper in der vorderen Nasenregion der Zahnwale, fokussiert und in das umgebende Wasser übertragen. Die akzessorischen Nasensäcke und spezielle Schädel- und Bindegewebestrukturen können zu der Fokussierung beitragen. Obwohl die Echolotsignale der Schweinswale sehr spezialisiert zu sein scheinen, weisen die Übereinstimmungen in der Topographie und in der Form der Nasenstrukturen im Vergleich zu Delphinen und Flussdelphinartigen (Pontoporia und Inia) auf eine ganz ähnliche Funktion der Nase bezüglich der Produktion und Emission von Echolotschall hin. Allerdings gibt es einige anatomische Besonderheiten im Nasenkomplex des Schweinswals, welche die besondere Pulsstruktur der Sonarsignale erklären könnte. Diese werden in der Dissertation diskutiert. Bei einem Vergleich der Nasenmorphologie der Pottwale einerseits und der nicht-pottwalartigen Zahnwale andererseits fällt vor allem der Grad der Asymmetrie ins Auge. Im Gegensatz zu dem oben für Delphine und Schweinswale beschrieben Mechanismus betreiben Pottwale die Schallproduktion an den "monkey lips" mit Luft, die im rechten Nasengang unter Druck gesetzt wird (und nicht im nasopharyngealen Raum). Zudem könnte durch Änderung des Luftvolumens im rechten Nasengang die Schalltransmission zwischen den Fettkörpern, und somit die Schallemission, kontrolliert werden. In diesem theoretischen Szenario fungiert der breite rechte Nasengang als eine Art "akustische Schranke", welche zwischen zwei verschiedenen Modi der Klickproduktion wechselt: Der erste Modus mit luftgefülltem Nasengang führt zur Produktion der Kommunikationsklicks ("coda clicks") und der zweite Modus zur Aussendung von Echolotklicks, wenn der Nasengang kollabiert ist. Somit scheinen die zentrale Position und die nahezu horizontale Orientierung des rechten Nasengangs im Kopf der Pottwale als Schnittstelle (Schranke) zwischen den beiden großen Fettkörpern mit dem Mechanismus der Schallproduktion bei veränderten Luftvolumina korreliert zu sein. Die hier beschriebenen und andere Ergebnisse dieser Dissertation deuten darauf hin, dass die Gestalt und das Ausmaß der Nasenasymmetrie nicht mit der systematischen Zugehörigkeit der jeweiligen Art korrelieren, sondern durch den jeweiligen Typus des Sonarsystems als Ausdruck einer bestimmten ökologischen Anpassung bedingt sind. Bei Zahnwalen ist der Kehlkopf charakterisiert durch eine rostrale Verlängerung des Kehldeckels und der beiden Stellknorpel, die ein gänseschnabelartiges Rohr bilden, das von einem starken Sphinktermuskel umrundet und dabei in Position gehalten wird. Auf diese Weise ist das Atemrohr vollständig vom Digestionstrakt getrennt. Aus anatomischer Sicht ist es wahrscheinlich, dass die Schallerzeugung bei Zahnwalen durch eine Kolbenbewegung des Kehlkopfes in Richtung der Choanen zustande kommt, wodurch der Luftdruck im Nasenbereich erzeugt wird. Die Kontraktion des Sphinktermuskels als einem muskulösen Schlauch erzeugt wahrscheinlich die größte Kraft für diese Kolbenbewegung. Jedoch dürften die Muskelgruppen, die den Kehlkopf und das Zungenbein am Unterkiefer und an der Schädelbasis aufhängen, signifikant zur Druckerhöhung beitragen.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
Die Infrarotspektroskopie in Verbindung mit photoaktivierbaren Substraten wurde zur Untersuchung von Substrat-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Dabei wurden Konformationsänderungen der Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums bei Bindung des Nukleotids, der Phosphorylierung der ATPase und der Hydrolyse des Phosphoenzyms beobachtet. Verwender wurden das native Substrat ATP und seine Analoga ADP, AMPPNP, 2'-deoxyATP, 3'-deoxyATP, ITP, AMP, Pyrophosphat, Ribosetriphosphat und TNP-AMP beobachtet. Diese Analoga waren an spezifischen funktionellen Gruppen des Substrats ATP modifiziert. Modifikation der 2'- und 3'-OH Gruppe des Ribosetriphosphats, der beta- und gamma-Phosphatgruppe und der Aminogruppe des Adenins reduzieren das Ausmaß an bindungsinduzierten Konformationsänderungen. Ein besonders starker Effekt wird für die 3'-OH Gruppe und die Aminogruppe des Adenins beobachtet. Dies zeigt die strukturelle Empfindlichkeit des Nukleotid-ATPase Komplexes auf einzelne Wechselwirkungen zwischen dem Nukleotid und der ATPase. Die Wechselwirkungen einer bestimmten Ligandengruppe mit der ATPase hängen von Wechselwirkungen anderer Ligandengruppen mit die ATPase ab. Die TNP-AMP Bindung verursacht teilweise gegenläufige und kleinere Konformationsänderungen verglichen mit ATP. Die Bindungweise von TNP-AMP ist unterschiedlich zu der von ATP, AMPPNP und anderen Tri- und Diphosphat Nucleotiden. Die Phosphorylierung der ATPase wurde mit ITP und 2'-deoxyATP beobachtet. Ca2E1P wurde in gleichem Ausmaß mit ITP und 2'-deoxyATP wie mit ATP akkumuliert, obwohl das Ausmaß der Konformationsänderungen bei Ca2E1P-Bildung geringer ist. Änderungen der 2'- und 3'-OH des Ribosetriphosphats und der Aminogruppe des Adenins beeinflussen die Reaktionsgeschwindigkeit der Phosphorylierung der ATPase. Es gibt keine direkte Verbindung zwischen dem Ausmaß der Konformationsänderung bei Nukleotid- Bindung und der Rate der Phosphorylierung. Das volle Ausmaß der ATP-induzierten Konformationsänderung ist nicht zwingend für die Phosphorylierung. Die Konformationen von Ca2E1N und Ca2E1P hängen vom Nukleotid ab. Dies weist darauf hin, dass die Struktur von ATPase Zuständen heterogener ist, als bisher erwartet. Die Aussagekraft und der Reichtum an Informationen in den Infrarotspektren zeigen, dass hiermit eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung von Enzym-Substrat-Wechsel-Wirkungen und das räumliche Abtasten von Bindungstaschen zur Verfügung steht.
In the recent years, high-resolution conditions have been established in solid-state NMR by the combination of magic angle spinning, state-of-the-art r.f. pulse schemes and the introduction of ultra-high magnetic fields. Similar to what is now routine in solution-state NMR, this has opened the way for structure determination by HR-SSNMR methods. Complete structural or dynamical characterization of the biomolecule of interest is most easily achieved if multiple or even uniformly [13C, 15N]-labeled versions are studied. In a first step, experiments that allow the complete assignment of the 13C and 15N resonances have been recently designed. To date, nearly complete chemical shift assignments were reported for two well-ordered proteins, the ±-spectrin SH3 domain and the Crh protein. The SSNMR analysis of the later protein has been presented in Section 4.1. For SSNMR applications, not the molecular size or solubility, but the spectral resolution can be of crucial importance. Experimental parameters and sample inherent conditions such molecular disorder may reduce the overall spectral dispersion. In these circumstances, techniques that allow for spectral simplification without the need of elaborated biochemical procedures (of isotopelabeling) are of special importance. In Section 2, several spectral editing methods have been proposed. These methods not only select resonances due to changesin the physical and chemical environment of the nucleus but they can also directly probe molecular properties such as dynamics and conformational heterogeneity. Once the chemical shifts are available for the biomolecule of interest, methods that permit to obtain structural restraints can be applied. In the case of multiply isotope labeled proteins, such techniques can in principle result in multiple structural parameters. In Section 3.1, we have shown that, similar to solution-state NMR, secondary chemical shifts can be readily employed to study the local backbone conformation. Inaddition, distance constraints between protons may be encoded in high-resolution on rare spins like 13C and 15N and measured. Finally, carbon-carbon constraints may be probed by employing frequency selective r.f. pulse schemes. These dihedral and distance constraints may subsequently lead to the determination of protein secondary to tertiary structure from a single protein sample. In Section 4.2,we have shown that high-affinity ligand binding to membrane proteins can be investigated with solid-state NMR. Here, the neuropeptide neurotensin which binds to the Gprotein coupled receptor NTS1 in sub-nanomolar affinity was investigated.Except for the case of rhodopsin, there is currently no information on the high-resolution structure of any other GPCR or a corresponding high-affinity ligand.Our SSNMR results identify, for the first time, a distinct binding mode of neurotensin that could be of considerable relevance for further pharmacological studies. As exemplified in section 4.3, HR-SSNMR based structural studies can also assist in refining existing (X-ray or solution-state NMR) membrane-protein structures. The presented results provide, for the first time, direct experimental evidence for a double occupancy of the Q0 binding site in the ubiquinone-bc1 complex and may provide the basis for the complete 3D structural determination of the ubiquinone binding pocket. Advancements regarding sample preparation (for example, including modular labeling, in vitro expression and intein technology) and improvements in NMR hardware instrumentation could open up new areas of solid-state NMR research such as the investigation of large protein-protein complexes or the complete 3D characterization of larger membrane proteins. Solid-state NMR studies of multiply-labeled biomolecules will furthermore profit from improved procedures for calculating 3D structures, in particular in the presence of ambiguousor a limited number of structural constraints. Unlike X-ray crystallography, protein motion does not hinder solid-state NMR methods. In fact, complementary to solution-state NMR, it may provide a very efficient means to study protein folding, flexibility and function under biologically relevant conditions. Hand in hand with solution-state techniques and crystallographic methods, solid-state NMR could provide insight into protein function and the chemistry of life with unprecedented accuracy and flexibility.
Im ersten Teil dieser Arbeit sind Protein-Protein Docking-Studien dokumentiert. Bis heute konnten die meisten Protein-Komplex-Strukturen nicht experimentell aufgeklärt werden, so auch die beiden oben genannten Elektrontransfer-Komplexe. Nach einem erfolgreichen Test wurden verschiedene Cytochrom c Oxidase:Cytochrom c Paare mit der gleichen Methode gedockt: COX aus Paracoccus denitrificans mit Pferdeherz Cytochrom c und COX mit dem löslichen Fragment des membrangebundenen Cytochrom C552 (beide aus P. denitrificans). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die diffusive Annäherung des Cytochrom c an die Cytochrom c Qxidase mit der Brownschen Dynamik Methode simuliert. Die Diffusionsbewegung eines Brownschen Teilchens in wässriger Lösung wird durch die Langevin-Gleichung bestimmt. Der auf dieser Gleichung fußende Ermak-McCammon-Algorithmus ist Grundlage der Simulationsmethode. Die so ermittelten Raten für COX und Pferdeherz, sowie für COX und Cytochrom C552, wurden dann mit experimentell gewonnenen Raten verglichen. Da die Elektrostatik für den Annäherungsprozeß dieser Proteine eine so gewichtige Rolle spielt, wirken sich Mutationen, die mit einer Ladungsänderung einhergehen, merklich aus. Dies ist vor allem dann der Fall, wenn sich die Mutation in der Nähe der Bindungsstelle befindet. Aus dem gleichen Grund ist die Assoziationsrate auch stark von der Ionenstärke der umgebenden Lösung abhängig. Steigt die Ionenkonzentration wird die elektrostatische Komplementarität der Bindingsstellen der beiden Makromoleküle stärker abgeschirmt, und die Rate sinkt. Diese beiden relativen Trends konnten durch die Simulationen gut reproduziert und bestätigt werden. Allerdings liegen die absoluten Resultate merklich über den experimentell gemessenen Raten. Es ist sehr gut möglich, daß post-diffusive Effekte, die nicht in einer Brownschen Dynamik Simulation von starren Körpern berücksichtigt werden können, die Raten erniedrigen. Um den Einfluß der Membranumgebung auf die Wechselwirkung des Elektrontransportsystems zu untersuchen. wurde eine DPPC Doppelschicht um die Oxidase modelliert und energieminimiert. Mit Poisson-Boltzmann Rechnungen wurde das elektrostatische Potential dieses Nanosystems untersucht und mit dem der einzelnen Oxidase verglichen. Durch einen modifizierten Set-up konnten dann auch für dieses Membransystem Brownsche Dynamik Simulationen durchgeführt werden. Der Vergleich mit den vorhergehenden Simulationen ohne Membran erbrachte bemerkenswerte Ergebnisse. Während die Assoziationsraten für Pferdeherz Cytochrom c durch den Membraneinfluß erniedrigt wurden, stiegen sie im Fall des physiologischen Transferpartners c552. Pferdeherz Cytochrom c weist eine positive Nettoladung und einen ausgeprägten bipolaren Charakter auf. Eine große Zahl positiv geladener Seitenketten befindet sich auf der gleichen Hemisphäre wie die Bindungsstelle. Obwohl die DPPC Lipidmoleküle neutral sind, zeigten die Elektrostatikrechnungen, daß die Membranoberfläche abstoßend auf positive Ladungen wirkt. Da sich nun die Bindungsstelle der Oxidase für Cytochrom c nur etwa 10 Å oberhalb der Membran befindet, verringert sich die Wahrscheinlichkeit der Assoziation.
Periplasmic Sud protein encoded by the Wolinella succinogenes catalyses the transfer of bound polysulfide-sulfur to the active site of the membrane bound polysulfide reductase. The homodimeric protein consists of 131 residues per monomer, each with one cysteine residue in the active site. Polysulfide-sulfur is covalently bound to the catalytic Cys residues of the Sud protein. In order to understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by heteronuclear multidimensional NMR techniques are reported here. The first step of structure determination leads to resonance assignments using 15N/13C/2H- and 15N/13C-labeled protein. The sequential backbone and side chain resonance assignments have been successfully completed. Structure calculations were carried out using the ARIA program package. The structure is based on 2688 NOE-derived distance restraints, 68 backbone hydrogen bond restraints derived from 34 slow-exchanging backbone amide protons and 334 torsion angle restraints obtained from the TALOS program as well as 158 residual dipolar coupling restraints for the refinement of relative vector orientations. The three-dimensional structure of the Sud protein was determined with an averaged rootmean- square deviation of 0.72 Å and 1.28 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the poorly defined segment between residues 90-94 the average r.m.s.d. value drops down to 0.6 Å and 1.14 Å. The ensemble refined with residual dipolar coupling (rdc) restraints shows good convergence. The r.m.s.d. value for the backbone heavy atoms, excluding residues 90- 94, drops down from 0.97 to 0.66 for the rdc-refined ensemble. The relative orientation of the two monomers in the protein structures refined with residual dipolar coupling restraints are also different from those without residual dipolar coupling restraints. The structure determination of the dimeric protein has been hampered by the high molecular mass (30 kDa), severe peak degeneracy, and by the small number of experimental intermonomer NOEs (relative orientation problem of two monomers). For the resonance assignments of aliphatic side chain, many resonances were ambiguously assigned because of severe overlap of signals. The Sud dimer protein contains 17 Lys, 14 Leu and one His tag for each monomer. It complicated the resonance assignments. The conventional 3D 15N-separated TOCSY HSQC experiment failed because of the large molecular weight which results in line broadening and hence made the resonance assignments of side chains more difficult. The determined structure contains a five-stranded parallel ß-sheet enclosing a hydrophobic core, a two-stranded anti-parallel ß-sheet and seven a-helices. The dimer structure is stabilized predominantly by hydrophobic residues. Sud catalyses the transfer of the polysulfide-sulfur to cyanide, similar to rhodanese encoded by Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000). The two proteins are similar in the active site environment primarily owing to the main-chain conformation of the active-site loop with the cysteine residue and with respect to the surrounding positively charged residues. The active-site loop (residues 89-95) in the Sud protein appears to be flexible, reflected by few assigned proton resonances of residues 90-94 in the active site. Despite their similarity in function and their similar structure in active site, the amino acid sequences and the folds of the two proteins are remarkably different. The negatively charged polysulfide interacts with positively charged R46, R67, and R94 and hence may be stabilized in structure. The mutation of one of the three arginines that are also conserved in rhodanese from A. vinelandii leads to a loss of sulfur-transfer activity. The polysulfide chain extends from inside of Sud protein to outside, where Sud may form contacts with polysulfide reductase. These contacts provide the possible polysulfide-sulfur transfer from Sud protein to the active site of polysulfide reductase.